Способ получения липосомально-иммунопероксидазного конъюгата


 


Владельцы патента RU 2500813:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (RU)

Изобретение относится к области биохимии. Используют липосомы в качестве матрицы для активированного фермента - пероксидазы хрена. К 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы хрена добавляют 1 мл суспензии липосом в 0,01 М растворе карбонатно-бикарбонатного буфера при рН 9,5. Подвергают ультразвуковой обработке в течение 1 мин. Инкубируют 1 ч. Иммобилизуют с иммуноглобулинами в концентрации 5 мг в течение 2 ч при температуре 22±4°С. Стабилизируют 5 мг боргидрида натрия с последующей гель-хроматографической очисткой. Изобретение позволяет получить липосомально-иммунопероксидазный конъюгат для индикации возбудителей инфекционных заболеваний в иммуноферментном анализе и увеличить срок годности препарата до 6 лет. 1 табл., 3 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве иммунопероксидазных конъюгатов для индикации возбудителей инфекционных заболеваний в иммуноферментном анализе (ИФА).

Ферменты - специфические белковые вещества, обладающие способностью ускорять химические реакции, имеющие слабожесткую структуру и подверженные отрицательному влиянию температурных, буферных изменений, концентрации водородных ионов и т.д. Срок их годности ограничен и составляет от 6 месяцев (для жидких препаратов, при температуре хранения минус 4°С) до 1 года (для лиофилизированных, при температуре хранения 4-6°С).

Известен способ получения иммуноферментного конъюгата, включающий активирование фермента и иммобилизацию с иммуноглобулинами [1].

Известен способ получения иммуноферментного конъюгата, включающий лиофилизацию иммунопероксидазного конъюгата в растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) и хранение при температуре 4°С [2].

Недостатком способов является ограниченный срок хранения - до 1 года.

Цель изобретения - увеличение срока годности иммунопероксидазного конъюгата с сохранением его физико-химических и иммунологических показателей путем подбора параметров иммобилизации фермента с матрицей.

Технический результат изобретения достигается тем, что в качестве матрицы используются липосомы (обладающие регулируемым составом, размером, поверхностными свойствами, отсутствием токсичности, не инактивирующие фермент, позволяющие функционировать с высокой активностью и т.д.), иммобилизованные с активированной пероксидазой хрена, связанные с иммуноглобулинами, очищенные от несвязавшихся компонентов.

Необходимо разработать и подобрать метод иммобилизации и определить влияние последнего на фермент. Известно, что фермент способен выполнять роль специфического катализатора при соблюдении в основном двух условий. Во-первых, фермент должен находиться в абсолютно правильной конформации. Во-вторых, он должен иметь возможность изменять свою конформацию в процессе катализа.

В качестве матрицы необходимо выбрать такую, которая бы не препятствовала проникновению к нему субстрата и «не приковывала» фермент, лишая его подвижности, необходимой для выполнения присущей ему функции.

Принимая во внимание вышеперечисленные факторы и учитывая свойства липосом, следует отметить, что наиболее подходящей матрицей для фермента-пероксидазы хрена и поставленной задачи - получение иммобилизованного иммунопероксидазного конъюгата - являются липосомы.

Природа препарата иммобилизованного фермента зависит от характера содержащей фермент фазы. Есть способ прикрепления фермента с использованием электростатических или других нековалентных механизмов связывания. С другой стороны, фермент не обязательно должен быть прикреплен к носителю, а может удерживаться внутри него. При этом носитель образует вокруг фермента сетеподобную матрицу, ячейки которой настолько малы, что молекула фермента не может освободиться из сети, но в то же время достаточно велики для проникновения низкомолекулярных субстратов [3]. Один из вариантов этого метода лежит в основе использования двойного фосфолипидного слоя в качестве ферментной фазы. В этом случае фермент может находиться в водном растворе, окруженном фосфолипидным барьером, либо быть растворенным в гидрофобной части двойного слоя.

Технология получения липосомально-иммунопероксидазного конъюгата состояла из нескольких этапов: получение липосом; включение фермента; иммобилизация с иммуноглобулинами; очистка от несвязавшихся компонентов, лиофилизация и контроль. Липосомы получены с помощью хлороформо-этанольной смеси, при этом скорость диффузии катионов через мембраны увеличивается. В качестве сырья использовали гомогенезированный мозг свиньи. После экстракции проводили отделение липидов, добавляя 20% от объема экстракта 0,9% раствора натрия хлорида. После инкубации в течение 2-3 ч липиды отделяли. Значение количества липидов колебалось от 30 до 50 мг/мл. Состав липидов определяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинах «Силуфол» [4].

Липиды, полученные вышеописанным способом, состояли из фосфатидилхолина, фосфатидилсерина, фосфотидилинозита и холестерина. Далее проводили выпаривание экстракта липидов на роторном испарителе для образования пленки липидов на стенках колбы. Данный этап очень важен в связи с тем, что пленка липидов должна быть достаточно тонкая, иначе происходит нежелательное включение значительного количества сухого фосфолипида в систему концентрических бислоев, так как замкнутые мембраны будут эффективно предотвращать дальнейший доступ воды и соли. Далее смывали высушенные липиды хлороформом (из расчета на 50 мг липидов 3,5 мл хлороформа), перемешивали колбу до полного растворения осадка, вносили 1,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида и хлороформ удаляли в роторном испарителе. Определение размера липосом проводили на электронном микроскопе и рассчитывали по формуле. Размер полученных липосом составил 100-200 нм.

При получении липосомально-иммунопероксидазного конъюгата первоначально проведены исследования в плане включения фермента в липосомы. Наиболее приемлемым оказался метод включения предварительно активированной пероксидазы хрена: (5±0,1) мг пероксидазы хрена растворили в 1 мл 0,3 М раствора натрия углекислого кислого, добавили 0,025 мл 0,32% раствора формалина. Смесь перемешали на мешалке в течение (30±5) мин при температуре (22±4)°С и добавили 1 мл 0,04 М раствора перйодата натрия, продолжая перемешивать в течение (30±5) мин при температуре (22±4)°С. Далее вносили 1,0 мл 0,16 М раствора этиленгликоля (для снижения поверхностного натяжения), осторожно перемешивая в течение (60±5) мин при температуре (22±4)°С. В конце процедуры препарат активированной пероксидазы должен быть прозрачным, без запаха, зеленовато-коричневой окраски. Активированную пероксидазу переносили в диализный мешок и диализовали против 1 л 0,01 М карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ), pH 9,5, в течение (19±1) ч на мешалке при температуре 2-8°С в холодильной камере. Таким образом, в результате активирования фермента перйодатным окислением, образовывались альдегидные группы.

Дальнейший этап получения комплекса липосомально-иммунопероксидазного конъюгата заключался в следующем. К 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М КББ pH 9,5. Суспензию подвергали ультразвуковой обработке (44 кГц) в течение 1 мин, далее инкубировали 1 ч. К липосомам, иммобилизованным пероксидазой хрена, добавляли туляремийные иммуноглобулины (Ig G) в количестве от 2,5 до 10 мг на 3 мл 0,01 М КББ pH 9,5. Иммобилизацию иммуноглобулинов с активированной пероксидазой хрена проводили при температуре (22±4)°С, помешивая на шуттеле в течение 2 ч, стабилизировали 5 мг боргидрида в холодильнике при температуре (4-6)°С. Вероятно, при этом пероксидаза включалась в мембрану липосом, а альдегидные группы углеводной части фермента взаимодействовали с аминогруппами иммуноглобулинов.

Для очистки конъюгата от несвязавшегося фермента использовали гель-хроматографию. Конъюгат наносили на колонку 100×12 мм с сефадексом G-100, уравновешенную 0,1 М раствором ФСБ pH 7,2. В результате происходило фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. Поэтому в первом пике выходил липосомально-иммунопероксидазный конъюгат, далее несвязавшиеся иммуноглобулины и фермент. Элюцию проводили тем же буферным раствором, фракции собирали по 2,0 мл и исследовали в иммуноферментном анализе (ИФА).

В результате установлено, что обязательным условием получения качественного препарата является активирование фермента при оптимальном времени иммобилизации 2 ч и концентрации белка иммуноглобулинов 5 мг/мл.

Для увеличения срока годности препарат разливали в ампулы, предварительно добавив к нему 1% БСА, замораживали и лиофилизировали в течение (18±2) ч до конечной температуры 25°С. В готовом препарате контролировали физико-химические (растворимость, цветность, прозрачность, потерю в массе при высушивании) и иммунологические (активность, специфичность, чувствительность) свойства после лиофилизации и в процессе хранения в течение 6 лет (срок наблюдения). Чувствительность и специфичность конъюгата определяли в ИФА с гомологичными и гетерологичными штаммами по методике Dark M.F., Adams A.N. [5].

В таблице представлены результаты анализов физико-химических свойств и чувствительности препаратов. Разработанные препараты удовлетворяют требованиям нормативных документов, предъявляемым к диагностическим препаратам, а их стабильность превосходит традиционные иммуноферментные конъюгаты в 6 раз (срок наблюдения).

Таким образом, в результате проведенных исследований разработана технология изготовления иммобилизованного ферментного препарата, значительно увеличивающая его стабильность. Это связано с тем, что иммобилизация эффективно препятствует вредному воздействию внешней среды на ферментный препарат, он становится заключенным в матрицу (липосомы), т.е. защищенным, при отсутствии физических и каталитических ограничений, при этом матрица не препятствует проникновению к нему субстрата за счет эффективного метода получения липосом, включения фермента и иммобилизации антител, подбора температурных, временных параметров, проведения щадящей очистки от несвязавшихся компонентов.

Возможность практического применения заявляемого способа иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получение чумного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата и его контроль в ИФА

Предварительно проводили активирование пероксидазы хрена: (5±0,1) мг пероксидазы хрена растворяли в 1 мл 0,3 М раствора натрия углекислого кислого, добавляли 0,025 мл 0,32% раствора формалина. Смесь перемешивали на мешалке в течение (30±5) мин при температуре (22±4)°С и добавляли 1 мл 0,04 М раствора перйодата натрия, продолжая перемешивать в течение (30±5) мин при температуре (22±4)°С. Далее вносили 1,0 мл 0,16 М раствора этиленгликоля, осторожно перемешивая в течение (60±5) мин при температуре (22±4)°С. Активированную пероксидазу переносили в диализный мешок и диализовали против 1 л 0,01 М раствора КББ pH 9,5 в течение (19±1) ч на мешалке при температуре 2-8°С в холодильной камере.

Получение комплекса липосомалыю-иммунопероксидазного конъюгата проводили следующим образом: к 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы добавляли 1 мл суспензии липосом в 0,01 М растворе КББ pH 9,5. Суспензию подвергали ультразвуковой обработке в течение 1 мин, далее инкубировали 1 ч. К липосомам, иммобилизованным пероксидазой хрена, добавляли чумные иммуноглобулины (Ig G) в количестве 5 мг на 3 мл 0,01 М КББ pH 9,5. Иммобилизацию иммуноглобулинов с активированной пероксидазой хрена проводили при температуре (22±4)°С, помешивая на шуттеле в течение 2 ч, стабилизировали 5 мг боргидрида натрия в холодильнике при температуре (4-6)°С в течение 2 ч. Для очистки конъюгата от несвязавшегося фермента использовали гель-хроматографию. Конъюгат наносили на колонку с сефадексом G-100, уравновешенную 0,1 М раствором ФСБ pH 7,2. В результате происходило фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. В первом пике выходил конъюгат, далее несвязавшиеся иммуноглобулины и фермент. Элюцию проводили тем же буферным раствором. Активность проверяли в ИФА. Препарат разливали в ампулы, предварительно добавив к готовому препарату 1% БСА, замораживали и лиофилизировали в течение (18±2) ч до конечной температуры 25°С. В готовом препарате контролировали физико-химические и иммунологические свойства после лиофилизации и в процессе хранения. Чувствительность конъюгата в ИФА с гомологичными штаммами составила 1×104 м.к./мл, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Срок годности препарата - 6 лет (срок наблюдения).

Пример 2. Получение туляремийного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата и его контроль в ИФА

Получали аналогично примеру 1, только вместо чумных использовали туляремийные иммуноглобулины. Чувствительность конъюгата в ИФА с гомологичными штаммами составила 5×104 м.к./мл, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Срок годности препарата - 6 лет (срок наблюдения).

Пример 3. Получение бруцеллезного липосомально-иммунопероксидазного конъюгата и его контроль в ИФА

Получали аналогично примеру 1, только вместо чумных использовали бруцеллезные иммуноглобулины. Чувствительность конъюгата в ИФА с гомологичными штаммами составила 1×105 м.к./мл, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами. Срок годности препарата - 6 лет (срок наблюдения).

Источники информации

1. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody - a new method of conjugation / P.K.Nakane, A.Kawaoi // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol.22. - P.506-508.

2. Патент РФ №2276362, опубл. 10.05.2006, «Способ выявления вируса крымской геморрагической лихорадки (КГЛ) в биологическом и полевом материале», авторы Василенко Н.Ф., Ефременко В.И., Тюменцева И.С. и др. Бюл. №13.

3. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. - М.: Мир, 1983. - С.23.

4. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975. - С.68-82.

5. Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. - 1977. - V.36, №3. - P.475-480.

Способ получения липосомально-иммунопероксидазного конъюгата для индикации возбудителей инфекционных заболеваний в иммуноферментном анализе, характеризующийся тем, что в качестве матрицы для активированного фермента - пероксидазы хрена - используют липосомы, при этом к 5 мг окисленной перйодатным методом пероксидазы хрена добавляют 1 мл суспензии липосом в 0,01 М растворе карбонатно-бикарбонатного буфера при рН 9,5, подвергают ультразвуковой обработке в течение 1 мин, инкубируют 1 ч, иммобилизуют с иммуноглобулинами в концентрации 5 мг в течение 2 ч при температуре 22±4°С, стабилизируют 5 мг боргидрида натрия с последующей гель-хроматографической очисткой.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения антител к Mycobacterium leprae. Способ включает выявление в сыворотках крови антител к Mycobacterium leprae с помощью иммуноферментного метода.

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты антитела или его фрагмента, специфичных в отношении β-амилоидного белка.
Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано у больных гемобластозами для прогноза развития рецидива заболевания после проведения аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток (АТСКК).

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, может быть использовано для диагностики скрытой активности туберкулеза у детей и подростков. Для этого проводят оценку состояния специфического клеточного иммунитета с помощью модифицированной реакции бластной трансформации лимфоцитов (мРБТЛ) с туберкулином (ППД-Л) и определение уровня интерферона-гамма (ИФН-γ) с ППД-Л с использованием малого объема (200 мкл) цельной крови и 4-х разведении антигена ППД-Л.

Группа изобретений относится к лабораторной диагностике и может быть использована для проведения анализов, основанных на реакции агглютинации частиц. Аналитический наконечник (100), предназначенный для выполнения визуально детектируемой реакции агглютинации после всасывания в него реактивов и образца, включает: первое отверстие (110) для приложения отрицательного или положительного давления к внутреннему объему аналитического наконечника; камеру для образца (120); по меньшей мере, одну боковую камеру (130), которая расположена по периметру камеры для образца; камеру детектирования (150), находящуюся в жидкостной связи с камерой для образца; переходную зону (140) между камерой детектирования и камерой для образца для вращательного перемешивания образца; второе отверстие (160) для всасывания реактивов и образца во внутренний объем аналитического наконечника или для удаления их оттуда.

Заявленная группа изобретений относится к области медицины и предназначена для выявления пациентов с повреждением сердца и оценки эффективности проводимой терапии.

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ ранней диагностики развивающегося пролапса тазовых органов у женщин репродуктивного возраста при отсутствии клинических признаков, заключающийся в отборе материала ткани стенки влагалища, проведении гистохимического анализа, определении количества и состояния эластиновых фибрилл, содержания матриксных белков LOXL1 и FBLN5, в котором развивающийся пролапс тазовых органов диагностируют при снижении количества эластиновых фибрилл и их фрагментации и при одновременном уменьшении содержания матриксных белков LOXL1 и в эпителии, эндотелии сосудов, фибробластах, экстрацеллюлярном матриксе по отношению к одноименным показателям у здоровых женщин.
Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, иммунологии, и может быть применено для определения степени риска формирования клинических осложнений атеросклероза.
Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики синдрома Сезари от эритродермий. Для этого проводят гистологическое исследование биоптатов пораженной кожи путем световой микроскопии, иммунофенотипирование клеток инфильтрата.

Способ одновременного определения двух аналитов биолюминесцентным молекулярным микроанализом относится к биохимии, а именно к способам проведения иммуноферментного и ДНК гибридизационного анализа.

Изобретение относится к области медицины. Предложен набор реагентов для иммуноферментного определения антител к эндогенным биорегуляторам в сыворотке крови для выявления заболеваний зависимости методом двухстадийного иммуноферментного анализа в сыворотке крови человека in vitro.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биохимической диагностике и касается способа определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови. .
Изобретение относится к биохимическим методам анализа, в частности к иммуноферментному анализу, и может быть использовано в санитарно-эпидемиологических, медицинских и ветеринарных исследованиях.

Изобретение относится к области экологии и может быть использовано для определения интегральной загрязненности воды, а также водных экстрактов органическими и неорганическими соединениями.

Изобретение относится к области композиций красителей, подходящих для использования в тестах обнаружения аналита, например в тестах по определению глюкозы. .
Изобретение относится к ветеринарной медицине. .

Изобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам определения микроколичеств ртути и может быть использовано для экспресс-анализа объектов окружающей среды.
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для лабораторного и промышленного производства пероксидазы высокого качества из корней хрена для диагностических целей.
Наверх