Способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях



Способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях
Способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях
Способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях
Способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях
Способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях

 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2501016:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени В.Д. Чаклина" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к определению ферментов в костной и хрящевой тканях при изучении регенераторных процессов, и описывает способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях, включающий подготовку образцов исследуемых тканей и гистохимическое исследование срезов полученного материала, где образцы исследуемых костной и хрящевой тканей выдерживают в забуференном растворе нейтрального 10% формалина в течение 1 суток при температуре +4°C, затем обрабатывают в 0,1 М растворе фосфатного буфера сначала в 4 смены по 2 часа каждая, а после в 9 смен по часу с добавлением сахарозы постепенно возрастающей концентрации, после чего исследуемый материал погружают в реагент Tissue-Tek O.C.T. Compound, замораживают при -35°C, готовят срезы и визуально определяют наличие щелочной фосфатазы. Способ прост в исполнении, его возможно использовать для определении щелочной фосфатазы в образцах ткани в каждом учреждении медицинского профиля и научной лаборатории без использования специального оборудования. 5 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к определению ферментов в костной и хрящевой тканях при изучении регенераторных процессов.

Известны способы определения ферментов в костной ткани, показывающие результат в виде биохимических данных [1]. Однако способы трудоемки, требуют многоэтапной подготовки исследуемого материала. Полученные результаты являются только количественными и невозможна визуализация ферментов в образцах костной и хрящевой тканях, чего требует практика: присутствие или отсутствие фермента, место его локализации.

В применяемых гистохимических методиках по определению ферментов [1-4] для подготовки образцов тканей для исследования требуется специальная аппаратура и реактивы. Кроме того, для того чтобы костную ткань сделать годной для резки, необходимо удалить отложенные в ее основном веществе соли извести. Эта процедура называется - декальцинацией [2]. Однако методы кислотной декальцинации совершенно не подходят для ГХ исследования. Ферменты сохранившиеся при фиксации, в значительной степени, если не полностью, разрушаются даже при кратковременной декальцинации.

Как известно сохранность структур исследуемой костной ткани, а так же сохранность выявляемых ферментов достигается путем замораживания -высушивания или замещения в замороженном состоянии криостатных срезов [4]. Однако способ технически сложен, необходима заморозка при температуре минус 50°С и минус 70°С, требует специального оборудования и реактивов.

Известен способ гистохимического исследования ферментов в мягких тканях [3], образцы которых сначала фиксируют в 10% нейтральном формалине в течение 10 часов при температуре +4°С или в этанол-ацетоне по Гесснеру, затем обезвоживают и заливают в парафин согласно схеме: 3 смены ацетона - (каждая по 3 часа); эфир-этанол (1:1) - 3 часа при +4°С; 2% целлоидин в эфире - 12 часов; 2 смены бензола - (каждая по 30 минут при комнатной температуре); пропитка парафином в вакууме при температуре 56°С 30 мин и заливка. После чего готовят парафиновые срезы для исследования.

Недостатком способа является невозможность определения щелочной фосфатазы в срезах костной и хрящевой тканей.

Техническая задача - упрощение способа и возможность визуализации определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях за счет повышения качества срезов исследуемого материала, решается следующим образом.

В способе определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях включающий подготовку образцов исследуемых тканей и гистохимическое исследование полученного материала, согласно изобретения образцы исследуемых костной и хрящевой тканей обрабатывают в забуференном растворе нейтрального 10% формалина, в течение 1 суток, при температуре +4°С, затем обрабатывают в 0,1 М растворе фосфатного буфера сначала в 4 смены по 2 часа каждая, затем в 9 смен по часу каждая с добавлением сахарозы постепенно возрастающей концентрации, после чего исследуемый материал погружают в реагент О.С.Т., замораживают при -35°С, готовят срезы и визуально определяют наличие щелочной фосфатазы.

Подготовка недекальцинированных образцов костной и хрящевой ткани в 0,1 М фосфатном буфере с добавлением сахарозы, позволяет получать срезы большего размера, в сравнении со срезами только после заморозки в -35°С и -196°С без предварительной подготовки. Кроме того срезы практически не подвергаются деформации, что улучшает качество морфологического исследования.

Использование реагента О.С.Т. - «Tissue-Тек О.С.Т. Compound)), являющегося стабилизатором температуры, позволяет защитить образцы тканей в процессе заморозки от кристаллизации и растрескивания, т.е. исключить образование в тканях кристаллов льда, разрывающих клетки и их ядра.

Авторами проведена работа по исследованию фрагментов костной ткани бедра, полученных от 30 взрослых кроликов. Приготовление срезов производилось на микротоме снабженном термоохлаждающим столиком. Температурный режим устройства позволяет замораживать ткань до -18°С. Для работы производили охлаждение ножа до температуры -30°С. Были использованы наборы реактивов для гистоэнзиматических реакций в тканях человека, фирмы BioOptica, Италия. Полученные срезы фиксировали на стекле, наносили реактив и инкубировали в термостате при +37°С - 1 час. Фото-протоколирование полученных препаратов проводили с помощью видео-насадки VidiCam и микроскопа Olympus.

Фрагменты костной ткани для исследования были разделены на 2 группы. Первая группа - при подготовке образцов ткани для исследования применяли глубокое замораживание тканей при -196°С.

Вторая группа - подготовку образцов ткани осуществляли по предлагаемому методу: после обработки образцов ткани в забуференном растворе нейтрального 10% формалина, в течение 1 суток, при температуре +4°С, обрабатывали исследуемый материал в фосфатном буфере с добавлением сахарозы возрастающей концентрации, затем погружали в реагент, стабилизирующий температуру «Tissue-Тек О.С.Т. Compound)) (О.С.Т.) и замораживали при -35°С.

При микроскопичеком исследовании срезов подготовленных образцов, авторами выявлено, что ткани второй группы, имеют более четкие структуры, остеоциты располагающиеся в толще костных балок и остеонов определяются отчетливо. На срезах отмечались незначительные микротрещины. Срезы фрагментов суставных поверхностей и кортикальной пластинки в группе с проводкой с добавлением сахарозы(Фиг.1), получались более тонкими, имели больший размер и менее других подвергались деформации. На Фиг.1 представлено сравнение срезов бедренной кости. Щелочная фосфатаза: А - без добавления сахарозы. Б - с добавлением сахарозы. (Ув. 100).

Проведенная гистоэнзиматическая реакция на выявление щелочной фосфатазы показала активность фермента в остеоцитах, с локализацией на поверхности гаверсовых каналов и по краю костных балок (Фиг.2. Бедренная кость. Щелочная фосфатаза в остеоцитах. ГК - гаверсов канал. Ув. 400). Остеоциты имеют вид веретенообразных клеток с длинными канальцами отходящими к предыдущему и последующему рядам клеток. Щелочная фосфатаза локализуется в районе ядра, а также по всей длине канальцев (Фиг.3. Бедренная кость. Локализация щелочной фосфатазы в ядре и канальцах остеоцитов. Ув. 400.). Щелочная фосфатаза была обнаружена и в суставном хряще (Фиг.4. Щелочная фосфатаза в суставном хряще. X-суставной хрящ. К - кость. Ув. 400). На границе хряща и субхондральной зоны обнаружены изогенные группы гипертрофированных хондроцитов активно синтезирующие щелочную фосфатазу. Фермент в виде глыбок локализуется в ядрах хондроцитов. Эти группы находятся ниже базальной линии, относясь к слою оссифицирующегося хряща (Фиг.5. Щелочная фосфатаза в изогенных группах (ИГ) хрящевых клеток. Ув. 200).

Таким образом, предлагаемый способ прост в исполнении, позволяет получать срезы недекальцинированной костной ткани высокого качества, визуально определять наличие и локализацию щелочной фосфатазы в экспериментальном и диагностическом операционном материале (костная и хрящевая ткань) без применения специальной техники (криостата), что расширяет возможности гистологического исследования костной ткани.

Способ осуществляют следующим образом. Исследуемый экспериментальный или диагностический операционный материал (костные или хрящевые фрагменты) на начальном этапе обрабатывают в забуференном растворе нейтрального 10% формалина и выдерживают в течение 1 суток при температуре +4°С, затем обрабатывают материал в 0,1 М растворе фосфатного буфера с рН 7,4: первые сутки в 4 смены по 2 часа, меняя раствор, оставляя в последнем материал на ночь; на следующие сутки исследуемый материал обрабатывают в ОДМ растворе фосфатного буфера (рН 7,4) с добавлением сахарозы постепенно возрастающей концентрации (5, 5, 5, 10, 10, 10, 20, 20, 20%) в 9 смен по часу, оставляя материал на ночь в растворе с наибольшей концентрацией сахарозы. После чего погружают исследуемый материал в реагент О.С.Т. (производитель «Tissue-Тек О.С.Т. Compound))) и замораживают при минус 35°С. Из предварительно подготовленного материала готовят срезы, используя термоохлаждающий столик и исследуют на наличие и локализацию щелочной фосфатазы визуально, а так же используя гистохимические методы.

Предлагаемый способ прост в исполнении, его возможно использовать для определении щелочной фосфатазы в образцах ткани в каждом учреждении медицинского профиля и научной лаборатории без использования специального оборудования (криостата, микротома для приготовления недекальцинированных срезов).

Используемая литература

1. Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника / под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина. 1996. - 544 с.

2. Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. - М.: Издательство иностранной литературы, 1953. - 718 с.

3. Луппа X. Основы гистохимии. Изд. «Мир». - 1980. - 344 с.

4. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Изд.» Мир» М.: - 1982. - 272 с.

5. An Y.Н. Handbook of histology methods for bone and cartilage / Y.H. An, K.L. Martin. - NY: Humana Press, 2003. - 587p.

Способ определения щелочной фосфатазы в костной и хрящевой тканях, включающий подготовку образцов исследуемых тканей и гистохимическое исследование срезов полученного материала, отличающееся тем, что образцы исследуемых костной и хрящевой тканей выдерживают в забуференном растворе нейтрального 10% формалина в течение 1 суток при температуре +4°C, затем обрабатывают в 0,1 М растворе фосфатного буфера сначала в 4 смены по 2 ч каждая, а после в 9 смен по часу с добавлением сахарозы постепенно возрастающей концентрации, после чего исследуемый материал погружают в реагент Tissue-Tek O.C.T. Compound, замораживают при -35°C, готовят срезы и визуально определяют наличие щелочной фосфатазы.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ оценки индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию повышенных доз излучений радона и продуктов его распада.
Изобретение относится к области биохимии и микробиологии и может быть использовано для определения липолитической активности в субклеточных фракциях бактерий. Сущность способа состоит в том, что среда, содержит агарозу или агар (500 мг), неионный детергент (50 мкл), хлористый кальций (12,5 мг), 0,05 М Трис-HCl буфер pH 8,3 (до 100 мл), причем после застывания среды в ней делают лунки, в которые вносят исследуемый образец в объеме 10-50 мкл на одну лунку, затем среду с исследуемым образцом инкубируют при 37°C в течение 12 часов и визуально определяют наличие или отсутствие липолитической активности в исследуемом образце.

Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, а именно к способу дифференциальной диагностики гнойных и серозных менингитов у детей. Способ состоит в определении показателей микробицидной активности нейтрофильных лейкоцитов: ферментов миелопероксидазы, цитохромоксидазы, кислой фосфатазы в ликворе больных гнойным и серозным менингитами с помощью спектрофотометрического анализа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к молекулярной диагностике. Предложен способ определения чувствительности опухоли легкого к терапии ингибиторами тирозинкиназ у пациентов с раком легкого в цитологическом опухолевом материале методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени при помощи праймеров для выявления 8 делеций в 19 экзоне гена EGFR и замены L858R гена EGFR в 21 экзоне.

Изобретение относится к медицине и касается способа персонифицированного подбора антиагрегантых препаратов больным, нуждающимся в подобном лечении, включающего забор крови больного, получение богатой тромбоцитами плазмы с помощью центрифугирования крови, разделение ее на пробы и введение в них антиагрегантных препаратов, имеющих различные механизмы антиагрегационного действия на тромбоциты с последующей инкубацией проб плазмы с препаратами при температуре 36,5-37,5°C и с индуктором агрегации тромбоцитов.

Изобретение применяют для оценки влияния цитомегаловирусной инфекции на содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови беременной на третьем триместре гестации.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для выявления высокого риска развития нарушения толерантности к глюкозе на фоне приема метопролола у больных стабильной стенокардией напряжения.

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования возникновения рецидивов при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ).
Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ определения содержания в тканях сердечно-сосудистой системы Ti, Al, включающий помещение образца ткани в емкость с добавлением азотной кислоты и выдержкой в течение 3 час при 75°С, последующее приливание перекиси водорода с выдержкой в течение 2 часов при той же температуре, добавление новой порции азотной кислоты с выдержкой 2 часа при температуре 110°С, добавление плавиковой кислоты и выдерживание в течение 18 часов при 20°С с последующим нагревом в течение 6 часов при 75°С и помещением в микроволновую печь, выпариванием и выполнением измерений методикой масс-спектроскопии с индуктивно связанной плазмой, при следующем соотношении компонентов, мас.%: НNО3 35, Н2О2 5, HF 13,3, деионизированная вода - остальное.
Изобретение относится к медицине и касается способа лабораторной диагностики развития инфекции у больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в состоянии индуцированной нейтропении.
Изобретение относится к педиатрии и онкогематологии и может быть использовано для прогнозирования развития нарушений функции миокарда у детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) на разных этапах полихимиотерапии (ПХТ). Для чего проводят исследование в крови N-концевого фрагмента предшественника мозгового натрийуретического пептида (NT-pro-BNP), прогормона предсердного натрийуретического пептида (pro-ANP), белка, связывающего жирные кислоты (БСЖК), ферритина, гепсидина, гомоцистеин, неоптерина до начала ПХТ и уровня ферритина 2 после проведения индукции ремиссии. Выявленные значения показателей вышеперечисленных параметров подставляют в уравнения для расчета изменения показателей ЭКГ, ИЖМ, В(Е-Еа), NT-pro-BNP, ФВ после окончания интенсивной ПХТ. Рассчитывают общий коэффициент К по следующей формуле: К=ЭКГ3×ИЖМ3×В(Е-Еа)3×NT-pro-BNP3×ФВ3. При значениях коэффициента К>0,17 прогнозируют развитие кардиальных осложнений. Изобретение позволяет выбрать тактику сопроводительной терапии для коррекции и предупреждения нарушений функции миокарда у детей острым лимфобластным лейкозом. 6 табл.
Предлагаются модели на насекомых, предназначенные отображать проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) у млекопитающего, в частности, человека. Изобретение касается способа оценки транспорта химического соединения через ГЭБ, а также применения насекомых в скрининге веществ, обладающих биологическим действием на мозг или центральную нервную систему и/или действующих на заболевание или нарушение, затрагивающее мозг или центральную нервную систему. Способ включает: введение химического соединения насекомому, имеющему ГЭБ; выдерживание насекомых; препарирование мозга насекомых и измерение концентрации химического соединения в мозге. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 2 табл., 12 пр.

Изобретение относится к медицине, в частности к способу оценки функционального состояния эндотелия (ФСЭ) экспериментальных животных после реконструктивных операций на брюшной аорте. Сущность способа состоит в том, что для оценки ФСЭ осуществляют исходный анализ биохимических показателей крови, таких как оксид азота (II), супероксиддисмутаза (СОД), малоновый диальдегид (МДА), проводят аллопластику брюшной аорты, затем осуществляют биохимический контроль через 6 месяцев, выводят животных из эксперимента, далее проводят гистологическое исследование зоны аллопластики аорты с помощью компьютерной морфометрии и осуществляют расчет корреляции. При увеличении уровня метаболитов NO считают развитие утолщения интимы менее выражено, что не превышает физиологических значений восстановления стенки артерии после операционного воздействия, при уменьшении уровня метаболитов N0 развивается гиперплазия интимы, а при увеличении активности СОД и уровня МДА определяют активное развитие утолщение интимы артерии. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность оценки ФСЭ у животных после реконструктивных операций на брюшной аорте. 3 табл., 5 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ диагностики предрасположенности пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта. Фибробласты кожи, взятые у пациента, культивируют и обрабатывают вирусными конструкциями, несущими гены Oct4, Sox2 и Klf4 под контролем CMV промотера. Осуществляют направленную дифференцировку фибробластов в клетки ретины. Из клеток ретины выделяют кодирующую РНК гена АВСА4. По наличию делеции в экзоне 39-41 гена АВСА4 диагностируют предрасположенность пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта. Изобретение позволяет эффективно диагностировать предрасположенность пациента к наследственной макулодистрофии Штаргардта по наличию делеции в экзоне 39-41 гена АВСА4. 3 ил., 1 табл., 1 пр.
Изобретение относится к области медицины, в частности к прогнозированию риска раннего развития атеросклероза у больных хроническим простатитом. Сущность способа состоит в том, что в сыворотке крови больных хроническим простатитом молодой возрастной группы определяют уровень общего тестостерона, секссвязывающего глобулина с последующим расчетом индекса свободного тестостерона, а также определяют содержание липопротеидов высокой плотности, триацилглицеридов и рассчитывают коэффициент атерогенного риска по формуле. При значении коэффициента атерогенного риска <3,7 прогнозируют высокий риск раннего развития атеросклероза. Использование заявленного способа позволяет повысить точность прогнозирования риска раннего развития атеросклероза у больных хроническим простатитом. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ выявления мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5, сопровождающийся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты. Способ включает выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Проводят полимеразную цепную реакцию с возможностью проведения анализа флуоресценции по конечной точке. Амплифицируют одновременно два участка гена SLC26A5 в смеси двух пар последовательностей олигонуклеотидов с флуоресцентной меткой: CACCACAAAGAAGAGATG, TCAGCATGATCCATAGTAC, FAM-agtgtCacTagGggaaaa-BHQ-1, VIC-agtgtCacCagGggaaaa-BHQ-2, фланкирующих область с возможным содержанием мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5. Предложенное изобретение позволяет получить точный, объективный клинический диагноз наследственной аутосомно-рецессивной потери слуха. 1 ил., 2 табл., 2 пр.
Изобретение относится к области косметики и представляет собой способ определения водостойкости антиперспиранта, включающий: a) отбор участников исследования; b) выполнение требований участниками исследования о не использовании каких-либо продуктов или использовании продуктов, не содержащих антиперспирант, в подмышечных областях в течение требуемого периода; c) очистку подмышечных областей каждого участника исследования; d) нанесение необходимого количества антиперспирантного продукта на одну подмышечную область и плацебо на другую подмышечную область каждого участника исследования; e) выполнение стадии d) до достижения необходимого числа нанесений, если выбирается более одного нанесения; f) после выполнения последнего нанесения проводят водное испытание, включающее круговое движение участников исследования в бассейне и/или плавание в течение периода времени активности в бассейне с глубиной воды, достаточной для смачивания подмышечных областей; g) проведение оценки потоотделения; и h) определение того, проявляет ли антиперспирантный продукт по меньшей мере стандартную антиперспирантную эффективность. 8 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования сроков наступления реактивной фазы острого панкреатита. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизма гена фактора некроза опухоли α и при выявлении генотипов -308 АА или -308 GA TNFα прогнозируют риск позднего наступления реактивной фазы острого панкреатита. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки сроков наступления реактивной фазы острого панкреатита. 2 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизма -308G/A гена фактора некроза опухоли α и при выявлении аллеля -308A TNFα прогнозируют повышенный риск развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития диабетической ангиопатии у больных сахарным диабетом 2-го типа. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых. Осуществляют два раунда полимеразной цепной реакции с праймерами B37-B853r и B123-B320r для выявления фрагмента сегмента В, кодирующего РНК-зависимую РНК-полимеразу вируса инфекционного некроза поджелудочной железы с последующим электрофоретическим определением размера амплифицируемого фрагмента нуклеотидной последовательности. По наличию на электрофореграмме фрагментов длиной 860 и/или 240 пн в исследуемом образце диагностируют вирус инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых. Предлагаемое изобретение применимо в диагностических исследованиях в научно-исследовательских институтах, ветеринарных лабораториях, рыбоводческих хозяйствах. 2 ил., 3 табл., 3 пр.
Наверх