Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции



Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции
Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции

 


Владельцы патента RU 2501859:

НЭШНЛ ИНСТИТЬЮТ ОФ ЭДВАНСТ ИНДАСТРИАЛ САЙЕНС ЭНД ТЕКНОЛОДЖИ (JP)
ОЦУКА ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД. (JP)

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана модифицированная липидами двухцепочечная РНК, включающая антисмысловую нить, нуклеотидная последовательность которой комплементарна целевой последовательности в целевом гене, и смысловую нить, нуклеотидная последовательность которой комплементарна антисмысловой нити. К первому нуклеотиду на 5′-конце смысловой нити напрямую или через линкер присоединен двухцепочечный липид. РНК обладает высокой устойчивостью к действию нуклеазы и эффективно поглощается клеткой, а также производит превосходный эффект РНК-интерференции. 4 н. и 11 з.п. ф-лы, 14 ил., 3 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к модифицированной липидами двухцепочечной РНК, которая может эффективно ингибировать экспрессию целевого гена. Более конкретно, настоящее изобретение относится к модифицированной липидами двухцепочечной РНК, которая обладает высокой устойчивостью к нуклеазе и с высокой эффективностью поглощается клеткой, и которая может производить превосходный эффект РНК-интерференции. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в которой применяется модифицированная липидом двухцепочечная РНК, а также к способу подавления экспрессии целевого гена с применением модифицированной липидами двухцепочечной РНК.

Уровень техники

Разработка лекарственных средств, с помощью которых можно эффективно лечить такие тяжелые заболевания, как рак и СПИД, является одной из наиболее важных целей в области биологии и медицины. Одним из способов, который обладает высоким потенциалом в качестве решения, является применение генных лекарственных средств, которые действуют только на определенные гены. В частности, недавно привлек внимание метод РНК-интерференции (РНКи), в котором используется короткая, длиной 21 нуклеотид, двухцепочечная РНК (малая интерферирующая РНК: миРНК). О методе РНКи в 1998 году впервые сообщил Fire с сотр. (см. Непатентный документ 1). Согласно методу, о котором сообщил Fire с сотр., двухцепочечную РНК длиной приблизительно 100 пар оснований, которая гомологична определенной области гена, функцию которого нужно ингибировать, вводят в клетку и расщепляют в цитоплазме на фрагменты двухцепочечной РНК размером приблизительно 20-25 пар оснований под действием дайсера. Затем фрагменты РНК взаимодействуют с множеством белков, формируя РНК-белковый комплекс (указанный комплекс называется "RISC": от англ. RNA-induced silencing complex - РНК-индуцированный комплекс сайленсинга). Данный комплекс связывается с гомологичной областью мРНК, синтезированной с целевого гена, эффективно подавляя, таким образом, экспрессию гена. Однако сообщается, что когда двухцепочечную РНК длиной приблизительно 30 пар оснований или больше вводят в клетки млекопитающих, развивается интерфероновый ответ, который представляет собой противовирусный ответ, вызывающий в результате явление апоптоза. Таким образом, считается, что метод РНКи сложно применять к системам клеток млекопитающих. С учетом указанной проблемы, Tuschl с сотр. химически синтезировали двухцепочечную РНК длиной 21 нуклеотид, которая на концах обеих нитей имеет 3'-выступающие концы, и сообщили, что прямое введение двухцепочечной РНК длиной 21 нуклеотид в клетки млекопитающих может сиквенс-специфично и эффективно подавлять экспрессию гена, избегая интерферонового ответа (см. Непатентный документ 2). Tuschl с сотр. также синтезировали короткие двухцепочечные РНК, в которых двухцепочечная область включает 19 пар нуклеотидов, имеющие на 3'-концах или 5'-концах выступающие концы различной длины, и исследовали их эффекты РНК-интерференции. Результаты показали, что миРНК длиной 21 нуклеотид, имеющие выступающие концы длиной 2 нуклеотида на обоих 3'-концах, производят очень мощный эффект РНК-интерференции, тогда как ни один другой тип коротких двухцепочечных РНК не производил заметного эффекта РНК-интерференции. Основываясь на данном сообщении, основной метод, применяемый сегодня, представляет собой метод РНК-интерференции, в котором используется двухцепочечная РНК длиной 21 нуклеотид, имеющая выступающие концы длиной 2 нуклеотида на обоих 3'-концах. Способ ингибирования экспрессии целевого гена с применением короткой двухцепочечной РНК длиной 21 нуклеотид, именуется в настоящей заявке как "миРНК способ", в целях его отличия от метода РНКи.

Поскольку в миРНК способе применяется синтетическая РНК, получение пробы является сравнительно легким, а обращение с ней также является простым. Кроме того, могут быть получены крайне мощные эффекты. Поэтому миРНК способ привлекает все большее внимание не только в области биологии и медицины, но также и в коммерческой биотехнологии.

Впрочем, с подобным превосходным миРНК способом также связаны некоторые сложности, которые необходимо решить. Как описано выше, миРНК состоит из молекул РНК, которые легко расщепляются под действием нуклеазы, содержащейся в клетках или в среде. Хотя двухцепочечная область РНК обладает относительно высокой устойчивостью к нуклеазе по сравнению с одноцепочечной РНК, двухцепочечная РНК длиной 19 пар нуклеотидов практически не проявляет эффекта РНК-интерференции на обычных уровнях. В этой связи сообщалось, что хотя синтетическая миРНК демонстрирует мощный супрессивный эффект в отношении экспрессии генов в течение приблизительно 2-4 дней после введения в клетки, содержащие последовательность целевого гена, в дальнейшем ее эффект РНК-интерференции резко снижался, и практически полностью утрачивался приблизительно через 7 дней.

Недавно были описаны различные химически модифицированные миРНК, направленные на достижение высокой эффективности поглощения клетками и длительного, крайне активного эффекта РНК-интерференции в синтетической РНК. Например, были синтезированы миРНК, модифицированные по концам аминогруппой, тиоловой группой или участком с удаленными основаниями, для повышения устойчивости к расщеплению экзонуклеазой. Однако сообщалось, что концевая модификация миРНК длиной 21 нуклеотид резко снижает эффект РНК-интерференции в большинстве случаев.

В недавнем сообщении J. Rossi с сотр. было описано, что двухцепочечная РНК длиной 27 пар нуклеотидов обладает эффектом РНК-интерференции, который приблизительно в 100 раз выше, чем у миРНК длиной 21 нуклеотид (см. Непатентный документ 3). Описанный мощный эффект, как полагают, достигается по следующей причине: после расщепления РНК длиной 27 пар нуклеотидов дайсером, который является ферментом, подобным РНКазе-III, с образованием миРНК длиной 21 нуклеотид, миРНК узнается белковым комплексом RISC как есть, и при этом эффекты миРНК могут производиться с высокой эффективностью.

Поскольку РНК длиной 27 оснований может производить превосходный эффект РНК-интерференции, как описанный выше, возрастают ожидания от его будущего применения в качестве генного лекарственного средства. Впрочем, то, какой технический способ может применяться для дальнейшего усиления эффекта РНК-интерференции молекул РНК длиной 27 оснований, совершенно неизвестно. Кроме того, также неизвестен технический способ усиления эффекта РНК-интерференции двухцепочечных РНК, имеющих другую длину, нежели 27 нуклеотидов.

Двухцепочечные РНК, которые производят эффект РНК-интерференции, обычно сконструированы так, что они на концах имеют один или более выступающих концов. Эффекты РНК-интерференции двухцепочечных РНК, не имеющих выступающих концов (то есть, с тупыми концами), также были исследованы. Однако результаты указывали на то, что двухцепочечные РНК, имеющие тупые концы на 5'-конце смысловой нити, обладают эффектом РНК-интерференции, который по существу аналогичен или даже ниже, чем у двухцепочечных РНК, имеющих выступающий конец на 5'-конце смысловой нити (см. Непатентный документ 4).

Липиды обладают высоким сродством к мембранам клеток и высокой проницаемостью через мембраны клетки, и, как известно, могут применяться для доставки лекарственных средств в клетки. Связывание подобного липида с двухцепочечной РНК, которая обладает эффектом РНК-интерференции, как можно было бы ожидать, повысит эффективность поглощения клеткой и увеличит эффект РНК-интерференции. Однако, простое связывание липида с двухцепочечной РНК, обладающей эффектом РНК-интерференции, как известно, резко уменьшало эффект РНК-интерференции. В предшествующем уровне техники, модифицированную липидами РНК, которая может производить как превосходный эффект РНК-интерференции, так и полезный эффект, основанный на свойствах липида, все еще требуется сконструировать.

Непатентный документ 1: Fire et al., Nature, 391, 806-811 (1998).

Непатентный документ 2: Tuschl et al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001).

Непатентный документ 3: J. Rossi et al., Nature Biotech., 23, 222-226 (2005).

Непатентный документ 4: J.Т. Marques et al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2006).

Описание изобретения

Задача, решаемая изобретением

Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении новой двухцепочечной РНК, которая обладает высокой устойчивостью к нуклеазе и высокой эффективностью поглощения клеткой, и которая может производить превосходный эффект РНК-интерференции. Другая цель настоящего изобретения состоит в предоставлении фармацевтической композиции, в которой применяется новая двухцепочечная РНК, а также способа подавления экспрессии целевого гена с применением новой двухцепочечной РНК.

Способы решения задачи

Авторы настоящего изобретения провели обширное исследование, чтобы достичь вышеуказанных целей, и обнаружили, что когда двухцепочечный липид связан напрямую или через линкер, по меньшей мере, с одним из первых шести нуклеотидов на 5′-конце смысловой нити двухцепочечной РНК, которая включает антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности в целевом гене, и смысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную антисмысловой нити, и которая может подавлять экспрессию целевого гена, то получаемая в результате двухцепочечная РНК обладает высокой устойчивостью к нуклеазе и высокой эффективностью поглощения клеткой, и может производить превосходный эффект РНК-интерференции. Настоящее изобретение было осуществлено в результате дальнейшего исследования, основанного на описанном открытии.

Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает следующие модифицированные липидами двухцепочечные РНК, фармацевтические композиции, в которых они применяются, а также способ подавления экспрессии целевого гена.

Пункт 1. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК, включающая антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную к целевой последовательности в целевом гене, и смысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную антисмысловой нити, способная подавлять экспрессию целевого гена, и двухцепочечный липид, связанный напрямую или через линкер, по меньшей мере, с одной из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой нити.

Пункт 2. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 1, которая имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, и тупой конец или выступающий конец на 3'-конце смысловой нити.

Пункт 3. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 1, которая имеет выступающие концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити.

Пункт 4. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-3, где смысловая нить состоит из 21-27 нуклеотидов.

Пункт 5. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 2, которая имеет тупые концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 27 нуклеотидов.

Пункт 6. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 2, которая имеет тупые концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 23 нуклеотидов.

Пункт 7. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 2, которая имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, причем смысловая нить состоит из 25 нуклеотидов, а антисмысловая нить состоит из 23 нуклеотидов.

Пункт 8. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 3, где и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 21 нуклеотида.

Пункт 9. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-8, где две гидрофобных группы двухцепочечного липида являются одинаковыми или различными, при этом каждый представляет собой остаток насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты, содержащий 6-50 атомов углерода.

Пункт 10. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-9, где двухцепочечный липид является глицерофосфолипидом, глицерогликолипидом, диацилглицерином или церамидом.

Пункт 11. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-9, где двухцепочечный липид является глицерофосфолипидом.

Пункт 12. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 11, где двухцепочечный липид является фосфатидилэтаноламином.

Пункт 13. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно пункту 12, где двухцепочечный липид является, по меньшей мере, одним представителем, выбранным из группы, состоящей из димиристоилфосфатидилэтаноламина, дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилэтаноламина и диолеоилфосфатидилэтаноламина.

Пункт 14. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-13, где липид связан, по меньшей мере, с одним из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой нити через линкер, представленный формулой (L-27)

в которой n3 и n4 являются одинаковыми или различными, и обозначают целое число 1-20.

Пункт 15. Фармацевтическая композиция, включающая модифицированную липидом двухцепочечную РНК согласно любому из Пунктов 1-14, и фармацевтически приемлемый носитель.

Пункт 16. Применение модифицированной липидом двухцепочечной РНК согласно любому из Пунктов 1-14 для приготовления фармацевтической композиции, направленной на подавление экспрессии целевого гена.

Пункт 17. Способ подавления экспрессии целевого гена, включающий стадию введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК согласно любому из Пунктов 1-14 в клетку.

Технический результат изобретения

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК настоящего изобретения модифицирована двухцепочечным липидом на 5'-конце смысловой нити. На основании данной структурной особенности, модифицированная липидом двухцепочечная РНК обладает значительно усиленным эффектом РНК-интерференции. В частности, поскольку в модифицированной липидом двухцепочечной РНК настоящего изобретения двухцепочечный липид связан с ее определенным участком, обеспечиваются существенно повышенная устойчивость к нуклеазе и эффект РНК-интерференции, без нарушения процессинга Дайсера или способности РНК формировать комплекс с RISC, что вносит, таким образом, существенный вклад в ее применение в медицине.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения обладает поразительно высокой способностью к внутриклеточной доставке, даже когда она применяется в отдельности. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может быть введена в клетку без использования каких-либо известных реактивов для генной трансфекции, или при использовании известного реактива для генной трансфекции в уменьшенном количестве. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может подавлять развитие цитотоксичности, являющейся проблемой при использовании обычных реактивов для генной трансфекции, гарантируя, таким образом, высокую безопасность при клиническом применении.

Таким образом, в случае применения фармацевтической композиции или способа подавления экспрессии целевого гена, в которых применяется модифицированная липидами двухцепочечная РНК изобретения, клинически возможно более эффективно подавлять или ингибировать экспрессию целевого гена.

Краткое описание Фигур

На Фиг. 1 показаны результаты ВЭЖХ анализа, выполненного на модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитях в Примере 1.

На Фиг. 2 показаны результаты подтверждения образования двухцепочечных РНК модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 1;

На Фиг. 2A дорожка (1) соответствует 21nt миРНК, дорожка (2) соответствует РНК DPPE L21A/L21B, дорожка (3) соответствует РНК POPE L21A/L21B, дорожка (4) соответствует РНК DOPE L21A/L21B и дорожка (5) соответствует РНК DMPE L21A/L21B; и

На Фиг. 2B дорожка (1) соответствует 27nt днРНК, дорожка (2) соответствует РНК DPPE L27A/L27B, дорожка (3) соответствует РНК POPE L27A/L27B, дорожка (4) соответствует РНК DOPE L27A/L27B и дорожка (5) соответствует РНК DMPE L27A/L27B.

На Фиг. 3 показаны результаты исследования устойчивости к нуклеазе модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 1.

На Фиг. 4 показаны результаты исследования процессирования Дайсером модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 1.

На Фиг. 5 показаны результаты исследования эффектов РНК-интерференции модифицированных липидом двухцепочечных 27nt днРНК при концентрации 2 нМ в Примере 1.

На Фиг. 6 показаны результаты ВЭЖХ анализа, выполненного на модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитях в Примере 2.

На Фиг. 7 показаны результаты подтверждения образования двойных нитей модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 2;

На Фиг. 7A дорожки (1) и (2) A-1 соответствуют 21nt миРНК и РНК DPPE v21A/v21B, соответственно; и дорожки (1), (2), (3) и (4) A-2 соответствуют 21nt миРНК, РНК POPE v27A/v27B, РНК DOPE v27A/v27B и РНК DMPE v27A/v27B, соответственно; и

На Фиг. 7B, дорожки (1), (2), (3), (4) и (5) соответствуют 27nt днРНК, РНК DPPE v27A/v27B, РНК POPE v27A/v27B, РНК DOPE v27A/v27B и РНК DMPE v27A/v27B, соответственно.

На Фиг. 8 показаны результаты исследования устойчивости к нуклеазе двухцепочечных модифицированных липидом РНК в Примере 2.

На Фиг. 9 показаны результаты исследования процессирования Дайсером двухцепочечных модифицированных липидом РНК в Примере 2.

На Фиг. 10 показаны результаты исследования эффектов РНК-интерференции двухцепочечных модифицированных липидом РНК в отношении гена VEGF в клетках HeLa и клетках A549 в Примере 2.

На Фиг. 11-1 показаны результаты исследования эффективности поглощения клеткой двухцепочечных модифицированных липидами РНК, направленных на ген VEGF, в клетках HeLa;

где "FL" обозначает изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа; "Trans" обозначает изображения, полученные с помощью фазовоконтрастного микроскопа в том же поле зрения, как в изображениях FL; и "Merge" обозначает изображения, полученные в результате наложения изображений Trans и FL.

На Фиг. 11-2 показаны результаты исследования эффективности поглощения клеткой двухцепочечных модифицированных липидами РНК, направленных на ген VEGF, в клетках A549;

где "FL" обозначает изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа; "Trans" обозначает изображения, полученные с помощью фазовоконтрастного микроскопа в том же поле зрения, как в изображениях FL; и "Merge" обозначает изображения, полученные в результате наложения изображений Trans и FL.

На Фиг. 12 показаны результаты ВЭЖХ анализа, выполненного на двухцепочечной модифицированной липидами РНК в Примере 3.

На Фиг. 13 показаны результаты подтверждения синтеза модифицированной липидами двухцепочечной РНК в Примере 3.

Наилучший вариант осуществления изобретения

В настоящем описании "тупой конец" или "с тупым концом" относится к концевой структуре двухцепочечной РНК, в которой основания в концевой области смысловой нити и основания в концевой области антисмысловой нити, комплементарной смысловой нити, гибридизуются без образования одноцепочечной части (то есть, без образования выступа). "Выступающий конец" также называют "оверхэнгом" или "липким концом". Данный термин относится к концевой структуре нуклеотидной последовательности (выступу), в которой присутствует одиночная нить, без образования двойной нити, потому что комплементарные основания не присутствуют в концевой области смысловой нити двухцепочечной РНК, или в концевой области антисмысловой нити, комплементарной смысловой нити. В настоящем описании "модифицированная липидом двухцепочечная РНК" относится к двухцепочечным молекулам РНК, с которыми связан двухцепочечный липид.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения включает антисмысловую нить, которая имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности в целевом гене.

Целевой ген, используемый в настоящем описании, относится к гену, экспрессия которого подавляется эффектом РНК-интерференции. В модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, целевой ген конкретно не ограничивается, и может быть соответственно выбран в зависимости от предполагаемого применения модифицированной липидами двухцепочечной РНК.

Целевая последовательность целевого гена конкретно не ограничивается, при условии, что экспрессия гена может быть подавлена эффектом РНК-интерференции. Целевая последовательность может быть соответственно определена согласно известному способу, например, при использовании поиска NCBI BLAST, и т.д. Например, целевая последовательность может являться областью, которая состоит из 19-30 оснований после оснований "АА" в области экзона, которая расположена через 50-100 оснований после старткодона кодирующей области (ORF) целевого гена, и имеет содержание GC приблизительно 50%. В данной области техники опытным путем известно, что превосходный эффект РНК-интерференции может быть получен при использовании цепи, комплементарной подобной целевой последовательности. Целевая последовательность может быть также определена, например, в соответствии с инструкциями IDT (Integrated DNA Technologies, Inc; Dicer Substrate RNAi Design). Кроме того, в недавнем сообщении было показано, что двухцепочечная РНК, обладающая мощным эффектом РНК-интерференции, может быть получена при конструировании двухцепочечной РНК, которая удовлетворяет следующим структурным признакам: (i) имеет пару A/U на 5′-конце антисмысловой нити, (ii) имеет пару G/C на 5′-конце смысловой нити и (iii) имеет приблизительно пять пар A/U, которые присутствуют в 5′-концевой области антисмысловой нити; (iv) и двухцепочечная РНК не содержит девяти или более пар G/C (Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)).

В тех случаях, когда модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения не имеет выступающих концов на антисмысловой нити, антисмысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой последовательности. Если выступающий конец присутствует на 5′-конце и/или 3′-конце антисмысловой нити, антисмысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, имеющей нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности, а также нуклеотидной последовательности выступающего конца, которая присоединена к 5′-концу и/или 3′-концу комплементарной нуклеотидной последовательности.

При условии, что эффект РНК-интерференции может быть произведен, количество нуклеотидов, которые составляют антисмысловую нить модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, конкретно не ограничено, и может быть соответственно выбрано в зависимости от желаемой структуры модифицированной липидами двухцепочечной РНК, и т.д. Количество нуклеотидов обычно составляет 21-27, предпочтительно 21, 23, 25 или 27, и более предпочтительно 21 или 27. В тех случаях, когда на антисмысловой нити выступающие концы не присутствуют, количество нуклеотидов, которые составляют антисмысловую нить, в рамках настоящего описания, относится к общему количеству нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности. Если на антисмысловой нити присутствует выступающий конец, количество нуклеотидов, которые составляют антисмысловую нить, относится к сумме количества нуклеотидов, составляющих выступающий конец, и количества нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения включает смысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную антисмысловой нити.

В тех случаях, когда модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения не имеет выступающих концов на смысловой нити, смысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной части или всей "нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой последовательности" антисмысловой нити. Если выступающий конец присутствует на 5′-конце и/или в 3′-конце смысловой нити, смысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной части или всей "нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой последовательности" антисмысловой нити, а также нуклеотидной последовательности выступающего конца, которая присоединена к 5′-концу и/или 3′-концу комплементарной нуклеотидной последовательности антисмысловой нити.

При условии, что эффект РНК-интерференции может быть произведен, количество нуклеотидов, которые составляют смысловую нить в модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, конкретно не ограничено, и может быть соответственно выбрано в зависимости от желаемой структуры двухцепочечной РНК, и т.д. Количество нуклеотидов обычно составляет 21-27, предпочтительно 21, 23, 25 или 27, и более предпочтительно 21, 23 или 27. В тех случаях, когда на смысловой нити выступающие концы не присутствуют, количество нуклеотидов, которые составляют смысловую нить, в рамках настоящего описания, относится к общему количеству нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой последовательности. Если выступающий конец присутствует на смысловой нити, количество нуклеотидов, которые составляют смысловую нить, относится к сумме количества нуклеотидов, составляющих выступающий конец, и количества нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой последовательности.

Нуклеотиды, которые составляют смысловую нить и антисмысловую нить модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, главным образом являются рибонуклеотидами. В целях повышения устойчивости к ферментативному расщеплению, последовательность РНК может дополнительно включить различные химически модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды, 2'-F-модифицированные нуклеотиды, LNA (Закрытая нуклеиновая кислота) нуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В частности, когда модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения имеет выступающий конец, выступающий конец смысловой нити и/или антисмысловой нити может состоять из дезоксирибонуклеотидов. Примеры таких химически модифицированных нуклеотидов включают нуклеотиды, модифицированные по фосфатному скелету, такие как фосфоротиоат-модифицированная ДНК/РНК и боранофосфат-модифицированная ДНК/РНК; 2'-модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-OMe-модифицированная РНК и 2'-F-модифицированная РНК; модифицированные нуклеотиды, полученные путем сшивания молекулы сахара нуклеотида, такие как LNA (Закрытая нуклеиновая кислота) и ENA (2'-O,4'-C-этилен-мостиковые нуклеиновые кислоты); модифицированные нуклеотиды, имеющие различные скелеты, такие как ПНК (Пептид-нуклеиновая кислота) и морфолин-нуклеотид; нуклеотиды с модифицированным основанием, такие как 5-фторуридин и 5-пропилуридин; и т.п.

Структура двухцепочечной модифицированной липидами РНК изобретения конкретно не ограничивается, при условии что смысловая и антисмысловая нити гибридизуются с формированием двойной нити. В качестве примеров предпочтительными являются следующие структуры: структура (A), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, а также имеет тупой конец или выступающий конец (одноцепочечную область или выступ) на 3'-конце смысловой нити; и структура (B), в которой двухцепочечная РНК имеет выступающие концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити. На основе вышеуказанной структуры (A) или (B), модифицированная липидом двухцепочечная РНК может сохранять свой эффект РНК-интерференции, несмотря на то, что она модифицирована двухцепочечным липидом, и при этом также имеет существенно повышенную эффективность поглощения клеткой. Структура, которая включает "выступающий конец на 3'-конце смысловой нити", используемая в настоящем описании, включает два следующих случая: случай, в котором 3'-концевая область смысловой нити формирует выступающий конец; и случай, в котором 5'-концевая область антисмысловой нити формирует выступающий конец. Структура, которая включает "выступающий конец на 5'-конце смысловой нити", используемая в настоящем описании, включает два следующих случая: случай, в котором 5'-концевая область смысловой нити формирует выступающий конец; и случай, в котором 3'-концевая область антисмысловой нити формирует выступающий конец.

В целях обеспечения превосходного эффекта РНК-интерференции, например, из вышеуказанных структур (A) и (B) наиболее предпочтительными являются следующие структуры двухцепочечной РНК модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения: структура (A-1), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 27 нуклеотидов; структура (A-2), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 23 нуклеотидов; структура (A-3), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, причем смысловая нить состоит из 25 нуклеотидов, а антисмысловая нить состоит из 23 нуклеотидов; и структура (B-1), в которой двухцепочечная РНК имеет выступающие концы, которые состоят из двух нуклеотидов, на 3'-конце и смысловой, и антисмысловой нитей, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 21 нуклеотида.

Более конкретно, в структурах (A-1) и (A-2), смысловая и антисмысловая нити гибридизованы без формирования на концах каких-либо выступающих концов. В структуре (A-3) смысловая и антисмысловая нити гибридизуются таким образом, что двухцепочечная РНК имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, при этом выступающий конец формируют первый и второй нуклеотиды с 3'-конца смысловой нити. В структуре (B-1) с первого по 19-ый нуклеотиды с 5'-конца смысловой нити и с третьего по 21-ый нуклеотиды с 3'-конца антисмысловой нити гибридизуются таким образом, что первый и второй нуклеотиды с 3'-конца смысловой нити формируют выступающий конец, и первый и второй нуклеотиды с 3'-конца антисмысловой нити формируют выступающий конец.

Согласно модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения, липид связан, по меньшей мере, с одним из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой нити. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения не имеет заместителей в каком-либо положении за исключением 5'-концевой области смысловой нити. Более конкретно, ни одна часть смысловой нити, за исключением 5'-концевой области, и антисмысловой нити не имеет заместителей, причем указанные части состоят только из нуклеотидов. Связывание липида только с 5'-концевой областью смысловой нити повышает эффективность поглощения клеткой, а также может существенно усилить эффект РНК-интерференции. Более конкретно, в модифицированной липидом двухцепочечной РНК настоящего изобретения, двухцепочечной РНК-структуре, применение двухцепочечного липида для модификации двухцепочечной РНК и участок связывания двухцепочечного липида являются неразрывно связанными структурными признаками. Благодаря указанным структурным признакам модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения обладает превосходной эффективностью поглощения клеткой и устойчивостью к нуклеазе, а также может производить существенно усиленный эффект РНК-интерференции.

В модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения, двухцепочечный липид, связанный со смысловой нитью, конкретно не ограничен, при условии, что липид имеет две гидрофобных группы. Примеры двухцепочечного липида включают липиды, имеющие, по меньшей мере, две гидрофобных группы, которые выбраны из группы, состоящей из остатков C6-50 насыщенных жирных кислот и остатков C6-50 ненасыщенных жирных кислот. Каждый остаток насыщенной жирной кислоты и остаток ненасыщенной жирной кислоты предпочтительно содержит 8-30 атомов углерода, и более предпочтительно 10-24 атома углерода. Более конкретно, примеры гидрофобных групп липида включают остатки жирных кислот, таких как каприновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота, бегеновая кислота, лигноцериновая кислота, миристоленовая кислота, пальмитолеиновая кислота, олеиновая кислота, элаидиновая кислота, вакценовая кислота, эруковая кислота, гадолиновая кислота, линоленовая кислота, линолевая кислота, и арахидоновая кислота. В целях более эффективного осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один остаток жирной кислоты, выбранный из миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и олеиновой кислоты, предпочтительно используются в качестве двух гидрофобных групп двухцепочечного липида в настоящем изобретении.

Примеры двухцепочечных липидов, которые могут применяться в настоящем изобретении, включают глицерофосфолипид, глицерогликолипид, диацилглицерин, церамид и т.п. Чтобы дополнительно повысить устойчивость к нуклеазе, эффективность поглощения клеткой и эффект РНК-интерференции, предпочтительно может применяться глицерофосфолипид.

Глицерофосфолипид, который может применяться в настоящем изобретении, конкретно не ограничивается. Примеры глицерофосфолипида, который может применяться, включают фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту, а также фосфатидилинозит, и т.д.

Примеры фосфолипидов, которые могут применяться в настоящем изобретении, включают фосфатидилэтаноламины, такие как дилауроилфосфатидилэтаноламин, димиристоилфосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, дистеароилфосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилэтаноламин, 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидилэтаноламин, 1-олеил-2-пальмитоилфосфатидилэтаноламин и диэрукоилфосфатидилэтаноламин; фосфатидилглицерины, такие как дилауроилфосфатидилглицерин, димиристоилфосфатидилглицерин, дипальмитоилфосфатидилглицерин, дистеароилфосфатидилглицерин, диолеоилфосфатидилглицерин, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилглицерин, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилглицерин и диэрукоилфосфатидилглицерин; фосфатидилсерины, такие как дилауроилфосфатидилсерин, димиристоилфосфатидилсерин, дипальмитоилфосфатидилсерин, дистеароилфосфатидилсерин, диолеоилфосфатидилсерин, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилсерин, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилсерин и диэрукоилфосфатидилсерин; фосфатидные кислоты, такие как дилауроилфосфатидная кислота, димиристоилфосфатидная кислота, дипальмитоилфосфатидная кислота, дистеароилфосфатидная кислота, диолеоилфосфатидная кислота, 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидная кислота, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидная кислота, и диэрукоилфосфатидная кислота; и фосфатидилинозиты, такие как дилауроилфосфатидилинозит, димиристоилфосфатидилинозит, дипальмитоилфосфатидилинозит, дистеароилфосфатидилинозит, диолеоилфосфатидилинозит, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилинозит, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилинозит, и диэрукоилфосфатидилинозит. Для обеспечения более существенной устойчивости нуклеазы, эффективности поглощения клеткой и более существенного эффекта РНК-интерференции, предпочтительно могут применяться фосфатидилэтаноламины. Более предпочтительно, могут применяться димиристоилфосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилэтаноламин и диолеоилфосфатидилэтаноламин.

Способ связывания двухцепочечного липида со смысловой нитью в модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения конкретно не ограничивается. Липид и смысловая нить могут быть связаны напрямую или через линкер (связывающую область). Линкер, используемый для связывания липида со смысловой нитью, не включает нуклеиновую кислоту.

Линкер, который может применяться, конкретно не ограничивается, при условии, что с его помощью связываются липид и смысловая нить. Примеры линкеров, которые могут применяться, включают линкеры следующих структур:

-O-CO-O- (L-1)
-NH-CO-O- (L-2)
-NH-CO-NH- (L-3)
-NH-(CH2)n1- (L-4)
-S-(CH2)n1- (L-5)
-CO-(CH2)n1-CO- (L-6)
-CO-(CH2)n1-NH- (L-7)
-NH-(CH2)n1-NH- (L-8)
-CO-NH-(CH2)n1-NH-CO- (L-9)
-C(=S)-NH-(CH2)n1-NH-CO- (L-10)
-C(=S)-NH-(CH2)n1-NH-C-(=S)- (L-11)
-CO-O-(CH2)n1-O-CO- (L-12)
-C(=S)-O-(CH2)n1-O-CO- (L-13)
-C(=S)-O-(CH2)n1-O-C-(=S)- (L-14)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO- (L-15)
-C(=S)-NH-(CH2)n1-O-CO- (L-16)
-C(=S)-NH-(CH2)n1-O-C-(=S)- (L-17)
-CO-NH-(CH2)n1-O-CO- (L-18)
-C(=S)-NH-(CH2)n1-CO- (L-19)
-C(=S)-O-(CH2)n1-NH-CO- (L-20)
-C(=S)-NH-(CH2)n1-O-C-(=S)- (L-21)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH(CH2OH)- (L-22)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH2- (L-23)
-NH-(CH2CH2O)n2-CH2-CO- (L-24)
-O-(CH2)n3-S-S-(CH2)n4-O-P(=O)2- (L-25)
-CO-(CH2)n3-O-CO-NH-(CH2)n4- (L-26)
-CO-(CH2)n3-CO-NH-(CH2)n4- (L-27)

В формулах (L-4)-(L-21) n1 является целым числом 1-40, предпочтительно 2-20, и более предпочтительно 2-12.

В формулах (L-22)-(L-24) n2 является целым числом 1-20, предпочтительно 1-10, и более предпочтительно 1-6.

В формулах (L-25)-(L-27) n3 и n4 могут быть одинаковыми или различными, и являются целым числом 1-20, предпочтительно 1-10, и более предпочтительно 1-6.

Одноцепочечная ДНК может быть связана либо с левой, либо с правой стороной линкеров формул (L-1)-(L-27). Предпочтительно, двухцепочечный липид связан с левой стороной линкера, а 5'-концевая область смысловой нити двухцепочечной РНК связана с его правой стороной.

Участок связывания двухцепочечного липида и линкера может быть соответственно выбран в зависимости от типов двухцепочечного липида и линкера. С линкером, посредством химической связи, может быть связано любое положение двухцепочечного липида за исключением гидрофобных групп. Например, при использовании фосфатидилэтаноламина, связывание может быть выполнено посредством образования амидной связи, и т.д. между аминогруппой фосфатидилэтаноламина и линкером. При использовании фосфатидилглицерина, связывание может быть выполнено посредством образования сложноэфирной связи, эфирной связи, и т.д. между гидроксильной группой глицеринового остатка и линкером. При использовании фосфатидилсерина, связывание может быть выполнено посредством образования амидной или сложноэфирной связи, и т.д. между аминогруппой или карбоксильной группой остатка серина и линкером. При использовании фосфатидной кислоты, связывание может быть выполнено посредством образования фосфоэфирной связи, и т.д. между остатком фосфата и линкером. При использовании фосфатидилинозита, связывание может быть выполнено посредством образования сложноэфирной связи, эфирной связи, и т.д. между гидроксильной группой остатка инозита и линкером.

Линкер может быть соответственно выбран в зависимости от типа липида, с которым он будет связан. Например, когда двухцепочечный липид представляет собой фосфолипид, содержащий аминогруппу (например, фосфатидилэтаноламин или фосфатидилсерин); или фосфолипид, содержащий гидроксильную группу (например, фосфатидилглицерин или фосфатидилинозит), то предпочтительно применяются линкеры формул (L-6), (L-7), (L-9), (L-10), (L-18), (L-26) и (L-27).

В дополнение к вышеприведенным примерам линкеров, также могут применяться другие линкеры, такие как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, N-4-малеимид-масляная кислота, S-(2-пиридилдитио)цистеамин, иодацетоксисукцинимид, N-(4-малеимидбутирилокси)сукцинимид, N-[5-(3'-малеимидпропиламид)-1-карбоксипентил]иминодиуксусная кислота, N-(5-аминопентил)иминодиуксусная кислота, а также подобные бифункциональные линкеры (линкеры, содержащие две функциональных группы).

Нуклеотид смысловой нити, с которым связывается либо двухцепочечный липид, либо линкер, используемый для связывания двухцепочечного липида, конкретно не ограничивается, при условии, что он является, по меньшей мере, одним из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой нити. Предпочтительным является, по меньшей мере, один из первых четырех нуклеотидов на 5'-конце. Более предпочтителен первый и/или второй нуклеотид с 5'-конца. Наиболее предпочтителен 5'-концевой нуклеотид (первый нуклеотид с 5'-конца).

Участок связывания смысловой нити, с которым связан двухцепочечный липид или линкер, используемый для связывания липида, конкретно не ограничивается. Двухцепочечный липид или линкер, используемый для связывания двухцепочечного липида, предпочтительно связывается со смысловой нитью путем замещения атома водорода в гидроксильной группе фосфатной части определенного нуклеотида на смысловой нити липидом или линкером.

Количество двухцепочечных липидов, связанных с модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения, конкретно не ограничивается. Например, могут быть связаны один - три двухцепочечных липида, предпочтительно один или два двухцепочечных липида, и более предпочтительно один двухцепочечный липид.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может быть получена путем синтеза каждой вышеуказанной смысловой нити, к которой присоединен, по меньшей мере, один двухцепочечный липид, и вышеуказанной антисмысловой нити, с последующей гибридизацией смысловой и антисмысловой нитей в соответствии с известным способом. Известный способ также может применяться для получения смысловой нити, к которой присоединен двухцепочечный липид.

В альтернативе, модифицированная липидом двухцепочечная РНК настоящего изобретения также может быть получена путем синтеза вышеуказанных смысловой и антисмысловой нитей согласно известным способам, последующей гибридизации смысловой и антисмысловой нитей с образованием двухцепочечной РНК, а затем связывания двухцепочечного липида с 5'-концом смысловой нити двухцепочечной РНК с помощью известной методики синтеза.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может подавлять или ингибировать экспрессию целевого гена при ее введении в клетки. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может применяться в качестве фармацевтического препарата для подавления экспрессии целевого гена или фармацевтического препарата для генотерапии, или в качестве экспериментального материала, применяемого для оценки супрессирующего эффекта в отношении экспрессии целевого гена.

Клетка, в которую введена модифицированная липидом двухцепочечная РНК, может быть любой клеткой, полученной от людей, млекопитающих за исключением человека, птиц, насекомых и т.д. Предпочтительными являются клетки, полученные от людей или других млекопитающих, исключая человека.

Способ введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК в клетку может быть аналогичен известным способам введения миРНК. Может применяться любой способ, который может обеспечить контакт эффективного количества модифицированной липидом двухцепочечной РНК с целевой клеткой. Введение модифицированной липидом двухцепочечной РНК в клетку может быть выполнено in vivo, in vitro или ex vivo.

Например, введение модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения в клетки in vivo может быть выполнено с применением способа, включающего культивирование клеток в присутствии соответствующего количества модифицированной липидом двухцепочечной РНК. Далее, in vitro или ex vivo введение модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения в культивируемые клетки, клетки, полученные из организма, или ткани, полученные из организма, может быть выполнено путем инкубирования культивируемых клеток, клеток, полученных из организма, или тканей, полученных из организма, в присутствии модифицированной липидом двухцепочечной РНК. Далее, in vivo введение модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения в клетки может быть выполнено посредством прямого введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК в ткани; с помощью внутривенной, подкожной, внутримышечной, внутрибрюшинной, внутриглазной инъекции, инъекции в ткани ЖКТ или дентальной инъекции; введения с помощью ингаляции в полость носа, ротовую полость, легкие и т.д.; перорального введения; трансдермального введения через кожу; и трансмукозального введения через слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку влагалища, слизистую оболочку глаза, слизистую оболочку прямой кишки или слизистую оболочку матки; и т.д.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может применяться в любом количестве, которое является эффективным для введения РНК в целевую клетку. Применяемое количество модифицированной липидом двухцепочечной РНК может составлять, например, 0,001-10 пмоль (пикомоль), предпочтительно 0,001-1 пмоль, и более предпочтительно 0,01-0,1 пмоль, в расчете на клетку.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения обладает высокой способностью к внутриклеточной доставке, даже когда она применяется отдельно. Поэтому модифицированная липидом двухцепочечная РНК может быть введена в клетки без применения каких-либо известных реактивов для генной трансфекции, используемых для введения миРНК в клетки, или с применением известного реактива для генной трансфекции в уменьшенном количестве.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может подавлять или ингибировать экспрессию целевого гена при введении в клетку. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК может применяться, например, в области медицины для профилактики, уменьшения интенсивности симптомов или лечения заболевания, вызванного экспрессией целевого гена. Когда модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения применяется в области медицины, модифицированная липидом двухцепочечная РНК предоставляется в виде фармацевтической композиции, полученной с применением РНК и фармакологически приемлемого носителя.

Фармацевтически приемлемый носитель, который применяется в фармацевтической композиции, конкретно не ограничивается, и может быть соответственно выбран в зависимости от лекарственной формы фармацевтической композиции. Примеры таких носителей включают водные носители, такие как очищенную воду, водные растворы сахаров, буферы, физиологический раствор, водные растворы полимеров, а также воду, несодержащую РНКазу, наполнители, и т.д.

Пропорция модифицированной липидом двухцепочечной РНК в фармацевтической композиции может быть соответственно выбрана из диапазона, который обеспечивает применение модифицированной липидом двухцепочечной РНК в вышеуказанном количестве. Пропорция модифицированной липидом двухцепочечной РНК составляет, например, 0,001-50% по весу, предпочтительно 0,01-10% по весу, и более предпочтительно 0,1-1% по весу, в расчете на общее количество фармацевтической композиции.

Лекарственная форма фармацевтической композиции конкретно не ограничивается, при условии, что модифицированная липидом двухцепочечная РНК может быть введена в клетки. Примеры лекарственной формы включают жидкости (такие как сиропы), капли, инъекции и прочие жидкие композиции; лиофилизированные композиции, сухие сиропы, таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы (такие как мягкие капсулы) и прочие твердые композиции; и т.д. Когда фармацевтическая композиция изобретения является твердым препаратом, композиция может применяться в форме раствора, после добавления дистиллированной воды для инъекции, стерильной воды и т.п. перед использованием.

Целевое заболевание или состояние, на которое направлено применение фармацевтической композиции изобретения, конкретно не ограничивается, при условии, что экспрессия целевого гена связана с заболеванием или состоянием. Взаимосвязь между целевым геном и заболеванием известна в данной области техники.

Фармацевтическая композиция изобретения может быть введена в клетки, полученные от человека, для лечения людей, или может применяться для лечения животных, за исключением людей (млекопитающих кроме человека).

ПРИМЕРЫ

Настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на следующие Примеры, впрочем, изобретение не ограничивается приведенными Примерами.

Пример 1 Ингибиторные эффекты 5' модифицированных липидом двухцепочечных РНК в отношении экспрессии гена люциферазы

1. Синтез модифицированных липидами двухцепочечных РНК, направленных на ген люциферазы

1-1. Последовательности смысловых нитей и антисмысловых нитей

Двухцепочечные РНК из смысловых нитей длиной 21 и 27 нуклеотидов и антисмысловых нитей длиной 21 и 27 нуклеотидов конструировали так, чтобы их последовательности были гомологичны гену люциферазы морского пера (Renilla) и могли подавлять экспрессию гена люциферазы Renilla. Полученные двухцепочечные РНК являлись следующими: При использовании антисмысловой нити и смысловой нити длиной 21 нуклеотид получали двухцепочечную РНК длиной 21 нуклеотид, имеющую выступающий конец длиной два основания на 3'-конце. При использовании антисмысловой нити и смысловой нити длиной 27 нуклеотидов получали двухцепочечную РНК длиной 27 нуклеотидов, в которой оба конца были тупыми. Последовательности используемых РНК приведены ниже.

27nt днРНК

Смысловая нить L27A:

5'-CUGGCCUUUCACUACUCCUACGAGCAC-3' (SEQ ID NO: 1)

Антисмысловая нить L27B:

3'-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUGCUCGUG-5' (SEQ ID NO: 2)

21nt миРНК

Смысловая нить L21A:

5'-GGCCUUUCACUACUCCUACGA-3' (SEQ ID NO: 3)

Антисмысловая нить L21B:

3'-GACCGGAAAGUGAUGAGGAUG-5' (SEQ ID NO: 4)

Двухцепочечные РНК получали, используя указанные смысловые нити и антисмысловые нити. Каждую двухцепочечную РНК получали путем смешивания эквимолярного количества одноцепочечных смысловой нити и антисмысловой нити в универсальном буфере (Hayashi Kasei Co., Ltd.), нагревания смеси в течение 2 минут при 92°C, с последующим постепенным уменьшением температуры до 4°C. Синтезируемые двухцепочечные РНК подвергали электрофорезу в 20%-ом полиакриламидном геле в течение 60 минут при 250 В, а затем подтверждали окрашиванием при использовании набора для окрашивания с нитратом серебра (GE Health Care Bioscience).

Из полученных двухцепочечных РНК двухцепочечную РНК длиной 21 нуклеотид с выступающим 3'-концом из двух нуклеотидов обозначили как “si L21A/L21B”, а двухцепочечную РНК длиной 27 нуклеотидов, которая имела оба тупых конца, обозначили как “Ds L27A/L27B”.

1-2. Синтез модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген люциферазы

Модифицированные двухцепочечными липидами смысловые нити синтезировали путем присоединения двухцепочечных липидов к 5'-концам смысловых нитей двухцепочечных РНК, способных подавлять экспрессию гена люциферазы. В каждой из указанных модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитей двухцепочечный липид был ковалентно связан через аминоалкильную группу (Amino Modifier C6; Glen Research), присоединенную к 5'-концу смысловой нити. Каждую модифицированную двухцепочечным липидом смысловую нить синтезировали путем взаимодействия в жидкой фазе липидного соединения, содержащего активную сложноэфирную группу (в дальнейшем называемого "активным липидным соединением, содержащим сложноэфирную группу"), со смысловой нитью, 5'-конец которой модифицировали аминированием (Схема реакции 1 ниже).

Схема реакции 1

где R1 и R2 являются одинаковыми или различными, и при этом каждый обозначает жирнокислотный остаток.

Определенный способ синтеза описан ниже. Для того чтобы выполнить аминирование 5'-конца РНК, проводили обычный способ (фосфорамидитный способ) синтеза, используя 5'-Amino-Modifier C6 (Glen Research) в твердофазном синтезе РНК, синтезируя, таким образом, смысловую нить, модифицированную аминоалкильной группой на 5'-конце. Смысловую нить, модифицированную аминоалкильной группой на 5'-конце, которая уже была очищена с помощью ВЭЖХ и подвергнута MALDI-TOF МС-анализу, приобрели у Hayashi Kasei Co., Ltd. В полученной смысловой нити, модифицированной аминоалкильной группой на 5'-конце, -(CH2)6-NH2 была присоединена к 5'-концу (фосфатному остатку первого нуклеотида на 5'-конце). Концентрацию полученной одноцепочечной РНК определяли путем измерения поглощения при 260 нм с помощью УФ-спектрометра. Полученную таким образом одноцепочечную РНК, модифицированную аминоалкильной группой, смешивали в условиях конденсации с каждым из следующих активных липидных производные, содержащих сложноэфирную группу [DPPE-NHS дипальмитоил-(N-(сукцинимидил-глутарил)-L-α-фосфатидилэтаноламин); POPE-NHS 1-пальмитоил-2-олеоил-(N-(сукцинимидил-глутарил)-L-α-фосфатидилэтаноламин); DOPE-NHS диолеоил-(N-(Сукцинимидил-глутарил)-L-α-фосфатидилэтаноламин); и DMPE-NHS димиристоил-(N-(Сукцинимидил-глутарил)-L-α-фосфатидилэтаноламин); все от NOF Corporation], которые были растворены в хлороформе, синтезируя, таким образом, модифицированную двухцепочечным липидом смысловую нить. После реакции полученную реакционную смесь очищали с помощью ВЭЖХ, чтобы удалить нежелательные реагенты, присутствующие в смеси, содержащей модифицированную двухцепочечным липидом смысловую нить. ВЭЖХ-очистку выполняли с использованием Буфера A: 100% 20 мМ TEAA (pH 7,0) и Буфера B: 80% CH3CN/20 мМ TEAA (pH 7,0) в линейном градиенте Буфера B 10-100% в течение 50 минут. В качестве колонки для очистки использовали CAP CELL (4,6×150 мм, 5 мкМ; Shiseido). На Фиг. 1 показаны примерные аналитические результаты ВЭЖХ. Модифицированную двухцепочечным липидом смысловую нить, очищенную с помощью ВЭЖХ, лиофилизировали и растворяли в очищенной воде, после чего ее концентрацию и выход синтеза определяли с помощью УФ-спектрометрии.

Структуры и выходы синтезированных модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитей приведены ниже.

Каждую из синтезированных модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитей соединяли с антисмысловой нитью, получая модифицированную липидами двухцепочечную РНК. Указанные двухцепочечные РНК получали согласно такой же методике, как описано выше, и подтверждали с помощью электрофореза в 20%-ом полиакриламидном геле (см. Фиг. 2).

2. Устойчивость модифицированных липидами двухцепочечных РНК к ферментативному расщеплению

Исследовали устойчивость к нуклеазе модифицированных липидами двухцепочечных si L21A/L21B и Ds L27A/L27B. Эксперименты проводили следующим образом: Концентрации каждой из модифицированных липидом двухцепочечных РНК, модифицированных по 5'-концу смысловой нити (si L21A/L21B и Ds L27A/L27B), доводили до конечной концентрации 2 мкМ, инкубировали при 37°C в среде RPMI-1640 (Invitrogen), содержащей 10% FBS (Sanko Junyaku, Co., Ltd.) (конечный объем: 110 мкл). Через 0 ч, 0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч инкубирования 10 мкл аликвоту каждой РНК отбирали и помещали в пробирку, содержащую 2 мкл красителя для нанесения. Для остановки расщепления отобранную пробу быстро лиофилизировали в жидком азоте и хранили при -20°C. Полученный продукт подвергали электрофорезу в 20%-ом полиакриламидном геле при 250 В в течение 70 минут. Затем продукт окрашивали с использованием набора для окрашивания с нитратом серебра (GE Health Care Bioscience) (относительно информации по условиям окрашивания см. руководство по применению набора), после чего гель подвергали анализу на ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). В качестве сравнения аналогичным образом оценивали устойчивость к нуклеазе немодифицированных si L21A/L21B и Ds L27A/L27B. На Фиг. 3 показаны результаты гель-электрофореза.

В результате немодифицированная si L21A/L21B быстро расщеплялась в среде, содержащей сыворотку, при этом полное исчезновение РНК в пробе подтверждали приблизительно через 1-2 часа. Напротив, модифицированная липидом двухцепочечная si L21A/L21B (si DPPE-L21A/L21B) демонстрировала очень высокую устойчивость к нуклеазе по сравнению с si L21A/L21B, причем РНК сохранялась даже по истечении 48 часов. Немодифицированная Ds L27A/L27B также демонстрировала высокую устойчивость к нуклеазе, однако модифицированная липидом двухцепочечная Ds L27A/L27B (Ds DPPE-L27A/L27B) показала еще более высокую устойчивость к нуклеазе. Кроме того, обнаружили, что устойчивость модифицированных липидом двухцепочечных РНК к расщеплению ферментами была увеличена, поскольку они были связаны с белками сыворотки.

Указанные результаты привели к новому открытию, которое состоит в том, что модифицированные липидами двухцепочечные РНК обладали заметно более высокой стабильностью in vivo по сравнению с 21-миРНК, которые широко применяются.

3. Дайсер-процессинг модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген люциферазы

Исследовано процессирование синтезированных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК рекомбинантным Дайсером. Эксперименты по расщеплению под действием Дайсера проводили следующим образом: в пробирках приготовили смеси 10 мкл 0,5 Ед рекомбинантного Дайсера (Gene Therapy Systems) и каждую немодифицированную РНК или модифицированную липидом двухцепочечную РНК доводили до конечной концентрации 2 мкМ в растворе 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 15 мМ NaCl и 2,5 мМ MgCl2. Пробы инкубировали в термостате при 37°C в течение 12 часов. Для последующей остановки реакции расщепления Дайсером в реакционные смеси добавляли по 2 мкл стоп-раствора (Dicer Stop Solution, Gene Therapy Systems), с последующим добавлением 2 мкл красителя для нанесения. Полученные пробы подвергали электрофорезу на 20%-ом полиакриламидном геле при 250 В в течение 70 минут. Затем продукты окрашивали с использованием набора для окрашивания с нитратом серебра (GE Health Care Bioscience) (относительно информации по условиям окрашивания см. руководство по применению набора), после чего гель подвергали анализу на ChemiImager 4000 (Alpha Innotech Corporation). В качестве контроля с помощью гель-электрофореза также анализировали немодифицированную 21-миРНК. Результаты представлены на Фиг. 4.

Полученные результаты показали, что немодифицированная Ds L27A/L27B под действием Дайсера процессировалась с образованием РНК длиной 21 нуклеотид; также под действием Дайсера процессировались модифицированные липидами двухцепочечные РНК длиной 27 нуклеотидов (Ds Липид-L27A/L27B) с образованием РНК длиной 21 нуклеотид и других РНК. Данные результаты показали, что РНК длиной 27 нуклеотидов, к которым присоединены липиды, узнаются Дайсером и подвергаются процессированию.

Напротив, обнаружили, что немодифицированная si L21A/L21B не подвергалась процессированию Дайсером, и что процессированию Дайсером также не подвергались двухцепочечные РНК длиной 21 нуклеотид, которые были модифицированы двухцепочечными липидами (si Липид-L21A/L21B). Кроме того, модифицированная липидом двухцепочечная si L21A/L21B, при смешивании с белком Дайсером, демонстрировала увеличение молекулярной массы, что подтверждает образование комплекса между модифицированной липидом двухцепочечной si L21A/L21B и белком Дайсером.

4. Подавление экспрессии гена люциферазы под действием модифицированных липидами двухцепочечных РНК

Эффекты РНК-интерференции синтезированных немодифицированных РНК и модифицированных липидом двухцепочечных РНК оценивали, используя в качестве гена-мишени люциферазу Renilla. Клетки HeLa (клетки рака шейки матки человека; Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University), доведенные до титра 1×105 клеток/мл перед экспериментами, вносили в 96-луночный планшет по 100 мкл в лунку и инкубировали при 37°C в течение ночи. На следующий день старую среду из лунок удаляли и добавляли в лунку 80 мкл свежей среды без антибиотика; затем в каждую лунку, содержащую клетки HeLa, добавляли по 10 мкл раствора комплекса, содержащего вектор, экспрессирующий люциферазы жука-светляка и морского пера Renilla (вектор psiCHECKTM-2; Promega), и LipofectamineTM 2000 (Invitrogen). Экспрессионный вектор доводили до 0,02 мкг в лунке, LipofectamineTM 2000 доводили до 0,2 мкл в лунке, а для доведения объема до необходимого уровня использовали OptiMem (Invitrogen). Для образования комплекса, экспрессионный вектор и LipofectamineTM 2000 смешивали, используя OptiMem, а затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После добавления раствора комплекса клетки инкубировали в течение 4 часов при 37°C в присутствии 5% CO2. После инкубирования немодифицированные двухцепочечные РНК и модифицированные липидами двухцепочечные РНК, полученные в результате присоединения двухцепочечных липидов к 5'-концам смысловых нитей, содержащие антисмысловую последовательность, гомологичную последовательности гена люциферазы Renilla, соединяли с LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) в конечных концентрациях 0 нМ, 0,2 нМ, 0,5 нМ, 1 нМ, 2 нМ, 5 нМ и 10 нМ, получая комплекс, затем по 10 мкл каждого из полученных растворов комплекса добавляли к клеткам HeLa, в которые был введен экспрессионный вектор. Конечный объем в лунках составил 100 мкл. Раствор комплекса каждой РНК и LipofectamineTM 2000 получали, смешивая водный раствор РНК в количестве 5 мкл в лунке и раствор LipofectamineTM 2000 в OptiMem (0,2 мкл) в количестве 5 мкл в лунке, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После введения РНК клетки инкубировали в течение 48 часов, а затем оценивали уровни экспрессии люциферазы светляка и Renilla, используя набор Dual-GloTM Luciferase Assay System (Promega) и люминометр (MicroLumat LB96p; Berthold), и эффекты подавления экспрессии люциферазы Renilla определяли на основе уровня экспрессии люциферазы светляка, используемой в качестве контроля.

Результаты представлены на Фиг. 5. На Фиг. 5 на графике А показаны результаты подавления экспрессии гена люциферазы с использованием модифицированных липидами двухцепочечных 21nt миРНК; а на графике B показаны результаты подавления экспрессии гена люциферазы с использованием модифицированных липидами двухцепочечных 27nt днРНК. Также оценивали немодифицированные 21nt миРНК и 27nt днРНК. Результаты подтверждали, что 21nt миРНК и 27nt днРНК, к которым были присоединены двухцепочечные липиды, демонстрировали заметно более мощные эффекты РНК-интерференции по сравнению с немодифицированными 21nt миРНК и 27nt днРНК.

Пример 2 Ингибиторные эффекты 5'-модифицированных липидом двухцепочечных РНК в отношении экспрессии гена VEGF

1. Синтез модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген VEGF

1-1. Последовательности смысловых нитей и антисмысловых нитей

Двухцепочечные РНК смысловых нитей длиной 27 и 21 нуклеотидов и антисмысловых нитей длиной 27 и 21 нуклеотидов были сконструированы так, что они содержали последовательности, гомологичные VEGF (фактору роста эндотелия сосудов), и обладали способностью подавлять экспрессию гена VEGF. Следующие эксперименты проводили, используя указанные двухцепочечные РНК. Нужно отметить, что 21миРНК представляет собой двухцепочечную РНК, имеющую выступающие концы из двух оснований на 3'-концах смысловой нити и антисмысловой нити, а 27nt днРНК представляет собой полностью двухцепочечную РНК, не имеющую выступающих концов (одноцепочечных областей), то есть, двухцепочечную РНК, в которой тупыми являются и 5'-, и 3'-концы смысловой нити. Последовательности используемых 27nt днРНК и 21миРНК являлись следующими.

27nt днРНК

Смысловая нить v27A:

5'-CUUCCUACAGCACAACAAAUGUGAAUG-3' (SEQ ID NO: 5)

Антисмысловая нить v27B:

3'-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUACACUUAC-5' (SEQ ID NO: 6)

21nt миРНК

Смысловая нить v21A:

5'-UCCUACAGCACAACAAAUGUG-3' (SEQ ID NO: 7)

Антисмысловая нить v21B:

3'-GAAGGAUGUCGUGUUGUUUAC-5' (SEQ ID NO: 8)

Указанные смысловые нити и антисмысловые нити гибридизовали таким же образом, как в Примере 1, с образованием двойных нитей, получая, таким образом, немодифицированные липидами двухцепочечные РНК. Образование двойных нитей подтверждали с помощью электрофореза в 20%-ом акриламидном геле согласно такой же методике, как в Примере 1.

1-2. Синтез модифицированных липидом двухцепочечных РНК, направленных на ген VEGF

Двухцепочечные модифицированные липидами РНК синтезировали путем присоединения липидов к 5'-концам смысловых нитей вышеуказанных двухцепочечных РНК, способных подавлять экспрессию гена VEGF. В каждой из модифицированных липидом двухцепочечных РНК, двухцепочечный липид был ковалентно связан через аминоалкильную группу (Amino Modifier C6; Glen Research), присоединенную к 5'-концу смысловой нити. Модифицированные двухцепочечными липидами одноцепочечные РНК (смысловые нити) синтезировали согласно той же методике, как в Примере 1. На Фиг. 6 показаны результаты ВЭЖХ-анализа синтезированных модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитей. Время элюирования модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитей, направленных на ген VEGF, также было по существу таким же, как в Примере 1.

Структурные модели и выходы модифицированных липидами двухцепочечных РНК, направленных на ген VEGF, представлены ниже.

Синтезированные модифицированные двухцепочечными липидами смысловые нити гибридизовали с антисмысловыми нитями, получая модифицированные липидами двухцепочечные РНК. Образование двухцепочечных РНК подтверждали с помощью электрофореза в 20%-ом полиакриламидном геле согласно такой же методике, как в Примере 1 (см. Фиг. 7).

2. Устойчивость модифицированных липидом двухцепочечных РНК к ферментативному расщеплению

Исследовали устойчивость к нуклеазе модифицированных липидами двухцепочечных si v21A/v21B и Ds v27A/v27B. В качестве сравнения также оценивали устойчивость к нуклеазе немодифицированных si L21A/L21B и Ds L27A/L27B. Эксперименты проводили согласно такому же методу, как в Примере 1. На Фиг. 8 представлены результаты гель-электрофореза.

Согласно результатам, немодифицированная si v21A/v21B быстро расщеплялась в содержащей сыворотку среде, при этом исчезновение РНК в пробе подтверждали приблизительно через 1-2 часа. Напротив, модифицированная липидом двухцепочечная si v21A/v21B (si DPPE-v21A/v21B) показала очень высокую устойчивость к нуклеазе по сравнению с si v21A/v21B, причем РНК сохранялась даже по истечению 48 часов. Немодифицированная Ds v27A/v27B также продемонстрировала высокую устойчивость к нуклеазе, однако модифицированная липидом двухцепочечная Ds v27A/v27B (Ds DPPE-v27A/v27B) показала еще более высокую устойчивость к нуклеазе. Кроме того, обнаружили, что устойчивость к ферментативному расщеплению модифицированных липидом двухцепочечных РНК была повышена, поскольку они были связаны с белками сыворотки.

Данные результаты также показали, что модифицированные липидами двухцепочечные РНК обладали заметно более высокой стабильностью in vivo по сравнению с 21миРНК, которые широко применяются.

3. Процессирование Дайсером модифицированных липидами двухцепочечных РНК, направленных на ген VEGF

Исследовали процессирование синтезированных двухцепочечных немодифицированных липидами РНК и двухцепочечных модифицированных липидами РНК рекомбинантным Дайсером. Эксперименты по расщеплению Дайсером проводили согласно такой же методике, как в Примере 1. Результаты представлены на Фиг. 9.

Полученные результаты показали, что немодифицированная Ds v27A/v27B под действием Дайсера процессировалась с образованием двухцепочечных РНК длиной 21 нуклеотид, и что двухцепочечные модифицированные липидами РНК (Липид-Ds v27A/v27B) длиной 27 нуклеотидов под действием Дайсера также процессировались с образованием РНК длиной 21 нуклеотид и других РНК. Полученные результаты показали, что РНК длиной 27 нуклеотидов, к которой присоединены липиды, узнаются Дайсером, и подвергаются процессированию.

Напротив, обнаружили, что немодифицированная si v21A/v21B не подвергалась процессированию Дайсером, и что РНК длиной 21 нуклеотид, которая была модифицирована двухцепочечными липидами, также не подвергалась процессированию Дайсером. Кроме того, модифицированная липидом двухцепочечная si v21A/v21B, при смешивании с белком Дайсером, показала увеличение молекулярной массы, что подтверждает образование комплекса между модифицированной липидом двухцепочечной si L21A/L21B и белком Дайсером.

4. Подавление экспрессии гена VEGF под действием модифицированных липидами двухцепочечных РНК

Оценку ингибиторных эффектов в отношении экспрессии гена VEGF с использованием клеток HeLa (клеток рака шейки матки человека; Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University), и клеток A549 (клеток рака легких человека; Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University), выполняли для si v21A/v21B с немодифицированными концами, Ds v27A/v27B с немодифицированными концами, si v21A/v21B (si Липид-v21A/v21B), модифицированной двухцепочечными липидами по 5'-концам смысловых нитей, и Ds v27A/v27B (Ds Липид-v27A/v27B), модифицированной двухцепочечными липидами по 5'-концам смысловых нитей. Аналогичную оценку также проводили для РНК (27nt днРНК (случайная), 21nt миРНК (случайная)), имеющих негомологичную гену VEGF последовательность.

Эксперименты проводили согласно следующим методикам. Клетки HeLa и клетки A549, доведенные до титра 1×105 клеток/мл перед экспериментами, вносили в 24-луночный планшет в количестве 500 мкл на лунку, и инкубировали при 37°C в течение ночи. На следующий день из лунки удаляли старую среду и добавляли свежую среду без антибиотика в количестве 450 мкл на лунку. Для клеток HeLa использовали среду MEM, а для других клеток использовали среду PRMI-1640. Комплекс раствора LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) (25 мкл) получали с каждой из немодифицированных РНК или модифицированных липидами двухцепочечных РНК (25 мкл), содержащих гомологичную последовательности гена VEGF антисмысловую последовательность, а затем 50 мкл полученного раствора РНК добавляли к 450 мкл вышеуказанных клеток. Конечный объем в лунке составил 500 мкл. Раствор комплекса каждой РНК и LipofectamineTM 2000 получали путем смешивания водного раствора РНК в количестве 25 мкл на лунку и раствора LipofectamineTM 2000 (2 мкл) в OptiMem в количестве 25 мкл на лунку, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. После введения РНК клетки инкубировали в течение 48 часов при 37°C в присутствии 5% CO2. После инкубирования клетки три раза промывали PBS (-), а затем из клеток выделяли суммарную РНК, используя набор RNeasy Plus Mini (Qiagen). Затем проводили реакции RT-PCR с целью измерения количества мРНК VEGF. Для реакции RT-PCR использовали Набор Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen), а в качестве PCR-праймеров к VEGF использовали 5'-CCC TGA TGA GAT CGA GTA CAT CTT-3' (SEQ ID NO: 9) и 5'-ACC GCC TCG GCT TGT CAC-3' (SEQ ID NO: 10). В качестве контроля с использованием такой же методики измеряли ген GAPDH. В качестве праймеров к GAPDH использовали 5'-GGAAAGCTGTGGCGTGATG-3' (SEQ ID NO: 11) и 5'-CTGTTGCTGTAGCCGTATTC-3' (SEQ ID NO: 12). Реакции RT-PCR проводили следующим образом. Реакцию RT (обратной транскрипции) проводили при 50°C в течение 30 минут, а затем проводили реакцию PCR, включающую повтор 25-28 циклов (в зависимости от используемых клеток) реакции разделения двойной цепи при 92°C в течение 30 секунд, реакции отжига праймеров при 55°C в течение 30 секунд и реакции элонгации при 68°C в течение 45 секунд. Наконец, инкубирование выполняли при 68°C в течение 10 минут, понижали температуру до 4°C и завершали реакцию. Реактивы, суммарную РНК, праймеры и т.д., используемые в RT-PCR, получали согласно условиям реакции набора Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen). После завершения реакций RT-PCR к ПЦР-смесям добавляли по 2 мкл красителя для нанесения, и продукты RT-PCR, полученные из мРНК VEGF и GAPDH, подтверждали с использованием 2%-го агарозного геля. Эффекты подавления экспрессии генов оценивали, измеряя уровень экспрессии VEGF в клетках, в которые были введены РНК (как немодифицированные РНК, так и модифицированные липидами двухцепочечные РНК), принимая уровень экспрессии гена VEGF в контрольных клетках (клетках, в которые не вводили двухцепочечные РНК) за 100%. Ошибку в уровнях экспрессии в клетках корректировали на основе уровня экспрессии контрольного гена (GAPDH).

На Фиг. 10 представлены результаты эффектов РНК-интерференции немодифицированных РНК и модифицированных липидами двухцепочечных РНК, направленных против VEGF, при концентрации РНК 50 нМ. Фиг. 10A и 10B представляют собой графики, на которых показаны эффекты подавления экспрессии гена VEGF немодифицированных РНК и модифицированных липидами двухцепочечных РНК в клетках HeLa; а Фиг. 10C и 10D представляют собой графики, на которых показаны эффекты подавления экспрессии гена VEGF немодифицированных РНК и модифицированных липидами двухцепочечных РНК в клетках A549. В графиках A и C используются двухцепочечные РНК длиной 21 нуклеотид; и в графиках B и D используются двухцепочечные РНК длиной 27 нуклеотидов.

В результате наблюдение способностей модифицированной липидом двухцепочечной si v21A/v21B подавлять экспрессию гена в клетках HeLa (График A) показало, что все модифицированные липидами двухцепочечные РНК обладали более высокой способностью подавлять экспрессию гена по сравнению с немодифицированной РНК. В частности, si DPPE-v21A/v21B показала очень высокую способность подавлять экспрессию гена. Аналогично, наблюдение способностей модифицированной липидом двухцепочечной Ds v27A/v27 подавлять экспрессию гена в клетках HeLa (График B) показало, что все модифицированные липидами двухцепочечные РНК обладали более высокой способностью подавлять экспрессию гена по сравнению с немодифицированной РНК. В частности, Ds DPPE-v27A/v27B показала очень высокую способность подавлять экспрессию гена.

Наблюдение способностей модифицированной липидом si v21A/v21B подавлять экспрессию гена VEGF в клетках A549 (График C) показало, что все модифицированные липидами двухцепочечные РНК обладали более высокой способностью подавлять экспрессию гена по сравнению с немодифицированной РНК. В частности, si DPPE-v21A/v21B показала очень высокую способность подавлять экспрессию гена. Наблюдение способностей модифицированной липидом двухцепочечной Ds v27A/v27 подавлять экспрессию гена в клетках A549 (График D) показало, что РНК, к которым были присоединены DPPE или DMPE, показали более высокие способности подавлять экспрессию гена по сравнению с немодифицированной РНК.

Представленные результаты показали, что миРНК и днРНК длиной 21 нуклеотид и 27 нуклеотидов, в которых двухцепочечные липиды были ковалентно связаны с 5'-концами смысловых нитей двухцепочечных РНК, продемонстрировали более высокие способности подавлять экспрессию гена по сравнению с каждой из немодифицированных двухцепочечных РНК. В частности, двухцепочечные РНК, к которым был присоединен DPPE, показали очень высокую способность подавлять экспрессию гена. Кроме того, РНК, к которым были присоединены DMPE или DOPE, также показали высокие способности подавлять экспрессию гена по сравнению с немодифицированной РНК.

Было продемонстрировано, что направленные против VEGF двухцепочечные РНК, используемые в настоящей заявке, подавляют экспрессию гена-мишени сиквенс-специфичным образом. Более того, результаты тестов указывают на то, что побочные эффекты в отношении клеток были уменьшены благодаря присоединению к двухцепочечным РНК двухцепочечных липидов.

5. Исследование эффективности поглощения клеткой модифицированных липидами двухцепочечных РНК

Клетки HeLa (клетки рака шейки матки человека; Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University) и клетки A549 (клетки рака легких человека; Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University), доведенные до титра 1×105 клеток/мл перед экспериментами, вносили в 24-луночный планшет в количестве 1 мл на лунку, и инкубировали клетки в среде, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS; Sanko Junyaku, Inc) и антибиотики, при 37°C в присутствии 5% CO2. Что касается антибиотиков и сред, среду MEM (Invitrogen) использовали для клеток HeLa, а для других клеток использовали среду RPMI-1640 (Invitrogen). Перед введением меченых флуоресцентной меткой модифицированных липидом двухцепочечных РНК, указанные среды заменяли средой без антибиотика (450 мкл). Флуоресцентно меченые, модифицированные липидами двухцепочечные РНК получали при использовании антисмысловых нитей 21nt и 27nt, меченых 6-FAM на 5'-концах, с последующей гибридизацией меченых таким образом антисмысловых нитей 21nt и 27nt с немодифицированными смысловыми нитями 21nt и 27nt, соответственно, и со смысловыми нитями 21nt и 27nt, модифицированными двухцепочечными липидами по 5'-концам, соответственно, с образованием двойных нитей. Эксперименты на предмет поглощения клеткой проводили следующим образом. Для образования комплекса каждой флуоресцентно меченой модифицированной липидом двухцепочечной РНК и LipofectamineTM 2000 (Invitrogen), 25 мкл смешанного раствора 10 мкл каждого 10 мкМ водного раствора флуоресцентно меченого олигонуклеотида и 15 мкл раствора OptiMem смешивали с 25 мкл смешанного раствора из 2 мкл раствора LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) и 23 мкл раствора OptiMem с получением 50 мкл смешанного раствора, который затем инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученные в результате 50 мкл флуоресцентно меченого олигонуклеотидного комплекса добавляли к 450 мкл клеток, полученных выше (конечная концентрация двухцепочечных РНК: 200 нМ), и инкубировали в течение 4 часов при 37°C в присутствии 5% CO2. Затем клетки промывали PBS (-) или средой три раза, и оценивали поглощение двухцепочечных РНК клеткой, используя конфокальный флуоресцентный лазерный микроскоп и проточную цитометрию.

Систему Radiance 2000 (Bio Rad) использовали в качестве конфокального флуоресцентного лазерного микроскопа, при этом флуоресценцию наблюдали, используя аргоновый лазер. Проточную цитометрию выполняли с использованием цитометра Coulter EPICS XL cytometer (Beckman Coulter), измеряя эффективность поглощения клеткой на 10000 клеток. В проточном цитометрическом анализе использовали программу XL EXPO32TM (Beckman Coulter).

Результаты показаны на Фиг. 11. В Секциях A и B на Фиг. 11-1 показаны результаты, полученные в ходе измерения эффективности поглощения клеткой при введении в клетки HeLa флуоресцентно меченых РНК длиной 21 нуклеотид и 27 нуклеотидов (si v21A/v21B и si v27A/v27B) и флуоресцентно меченых РНК, модифицированных двухцепочечными липидами по 5'-концам смысловых нитей, используя в качестве реактива для трансфекции LipofectamineTM 2000. В Секциях C и D на Фиг. 11-2 показаны результаты, полученные в ходе измерения эффективности поглощения клеткой при введении в клетки A549 флуоресцентно меченых РНК длиной 21 нуклеотид и 27 нуклеотидов (si v21A/v21B и si v27A/v27B) и флуоресцентно меченых РНК, модифицированных двухцепочечными липидами по 5'-концам смысловых нитей, используя в качестве реактива для трансфекции LipofectamineTM 2000.

Результаты подтверждали введение в присутствии LipofectamineTM 2000 немодифицированных РНК и модифицированных липидами двухцепочечных РНК в оба типа клеток (клетки HeLa и клетки A549). В частности, наблюдения с помощью конфокальной флуоресцентной лазерной микроскопии и проточной цитометрии показали, что РНК длиной 27 нуклеотидов, модифицированные двухцепочечными липидами по 5'-концам смысловых нитей, показали очень высокую эффективность поглощения клеткой по сравнению с немодифицированными РНК. Кроме того, наблюдение с помощью конфокальной флуоресцентной лазерной микроскопии показало, что модифицированные липидами двухцепочечные РНК активно локализовались в цитоплазме. В частности, двухцепочечные РНК длиной 27 нуклеотидов, к которым в качестве двухцепочечного липида были присоединены DPPE или DMPE, показали превосходную эффективность поглощения клеткой.

Результаты также подтверждали, что модифицированные липидами двухцепочечные РНК, в которых двухцепочечные липиды были присоединены к РНК длиной 21 нуклеотид, показали высокую эффективность поглощения клеткой в присутствии LipofectamineTM 2000. В частности, было подтверждено, что РНК длиной 21 нуклеотид, к которой в качестве двухцепочечного липида был присоединен DMPE, обладала превосходной эффективностью поглощения клеткой.

Полученные результаты привели к новому открытию, которое состояло в том, что если липид ковалентно связан с 5'-концом смысловой нити двухцепочечной РНК, двухцепочечная РНК может демонстрировать существенно повышенную эффективность поглощения клеткой, а также может быть локализована в цитоплазме клеток.

Пример 3 Синтез модифицированных липидами двухцепочечных РНК, направленных против гена WT1

Используя методику, отличающуюся от методик, используемых в Примерах 1 и 2, модифицированную двухцепочечным липидом смысловую нить синтезировали, связывая двухцепочечный липид с 5' концами смысловой нити двухцепочечной РНК, способной к подавлению экспрессии гена WT1.

Сначала, согласно известной методике, получали смысловую нить и антисмысловую нить. Затем, согласно стандартной методике, с использованием 5'-Amino-Modifier C6 (Glen Research) проводили аминоалкилирование 5'-концов смысловой нити (фосфорамидитный способ синтеза), синтезируя, таким образом, смысловую нить, модифицированную аминоалкильной группой по 5'-концу. В синтезируемой смысловой нити, модифицированной аминоалкильной группой по 5'-концу, -(CH2)6-NH2 была связана через атом кислорода с фосфатным остатком первого нуклеотида с 5'-конца. Синтезированную смысловую нить, модифицированную аминоалкильной группой по 5'-концу, гибридизовали с антисмысловой нитью, получив двухцепочечную РНК (в дальнейшем называемую "аминоалкил- модифицированной двухцепочечной РНК"). Двухцепочечную РНК получали согласно такой же методике, как описано выше. Полученную таким образом аминоалкил-модифицированную двухцепочечную РНК смешивали с активным, содержащим сложноэфирную группу, двухцепочечным липидным производным (DPPE-NHS дипальмитоил-(N-(сукцинимидил-глутарил)-L-α-фосфатидилэтаноламином); NOF Corporation), растворенным в хлороформе в условиях конденсации, синтезировав модифицированную липидом двухцепочечную РНК (DPPE-модифицированную двухцепочечную РНК). После завершения реакции реакционную смесь очищали с помощью ВЭЖХ для удаления нежелательных реагентов, присутствующих в реакционной смеси, содержащей модифицированную липидами двухцепочечную РНК. Очистку ВЭЖХ выполняли с использованием Буфера A: 100% 20 мМ TEAA (pH 7,0) и Буфера B: 80% CH3CN/20 мМ TEAA (pH 7,0) в линейном градиенте 10-100% Буфера B в течение 50 минут. В качестве колонки для очистки использовали CAP CELL (4,6×150 мм, 5 мкм; Shiseido). На Фиг. 12 показаны примерные результаты анализа ВЭЖХ. Очищенную с помощью ВЭЖХ модифицированную липидом двухцепочечную РНК лиофилизировали и растворяли в очищенной воде, после чего с помощью УФ-спектрометрии определяли ее концентрацию и выход синтеза. Модифицированную липидом двухцепочечную РНК подтверждали с помощью электрофореза в 20%-ом полиакриламидном геле (Фиг. 13).

Структура и выход синтезированной двухцепочечной РНК приведены ниже.

1. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК, включающая антисмысловую нить, нуклеотидная последовательность которой комплементарна целевой последовательности в целевом гене, и смысловую нить, нуклеотидная последовательность которой комплементарна антисмысловой нити, при этом двухцепочечная РНК способна подавлять экспрессию целевого гена, и к первому нуклеотиду на 5′-конце смысловой нити напрямую или через линкер присоединен двухцепочечный липид,
где двухцепочечный липид является глицерофосфолипидом,
где линкером является, по меньшей мере, один линкер, выбранный из группы, состоящей из линкеров, представленных формулами (L-1)-(L-27),



где n1 является целым числом от 1 до 40,
n2 является целым числом от 1 до 20 и
n3 и n4 могут быть одинаковыми или различными, и являются целым числом от 1 до 20.

2. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.1, которая имеет тупой конец на 5′-конце смысловой нити и тупой конец или выступающий конец на 3′-конце смысловой нити.

3. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.1, которая имеет выступающие концы и на 5′-, и на 3′-концах смысловой нити.

4. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по любому из пп.1-3, где смысловая нить состоит из 21-27 нуклеотидов.

5. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.2, которая имеет тупой конец и на 5′-, и на 3′-концах смысловой нити, при этом и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 27 нуклеотидов.

6. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.2, которая имеет тупой конец и на 5′-, и на 3′-концах смысловой нити, при этом и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 23 нуклеотидов.

7. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.2, которая имеет тупой конец на 5′-конце смысловой нити, причем смысловая нить состоит из 25 нуклеотидов, а антисмысловая нить состоит из 23 нуклеотидов.

8. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.3, где смысловая и антисмысловая нити состоят из 21 нуклеотида.

9. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.1, где две гидрофобные группы двухцепочечного липида являются одинаковыми или различными и каждая является насыщенным или ненасыщенным жирнокислотным остатком, содержащим 6-50 атомов углерода.

10. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.1, где двухцепочечный липид является фосфатидилэтаноламином.

11. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.10, где двухцепочечный липид является, по меньшей мере, одним представителем, выбранным из группы, состоящей из димиристоилфосфатидилэтаноламина, дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилэтаноламина и диолеоилфосфатидилэтаноламина.

12. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК по п.1, где липид связан с первым нуклеотидом на 5′-конце смысловой нити через линкер, представленный формулой (L-27)

где n3 и n4 являются одинаковыми или различными и каждый обозначает целое число от 1 до 20.

13. Фармацевтическая композиция для подавления экспрессии целевого гена, содержащая эффективное количество модифицированной липидами двухцепочечной РНК по любому из пп.1-12, а также фармацевтически приемлемый носитель.

14. Применение модифицированной липидом двухцепочечной РНК по любому из пп.1-12 для получения фармацевтической композиции, предназначенной для подавления экспрессии целевого гена.

15. Способ подавления экспрессии целевого гена, включающий стадию введения эффективного количества модифицированной липидом двухцепочечной РНК по любому из пп.1-12 в клетку.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к новым глицерол-3-фосфатацилтрансферазам и полинуклеотидам, их кодирующим. Настоящее изобретение относится также к вектору экспрессии и трансформанту, содержащему полинуклеотид, а также способу получения липидной композиции или композиции на основе жирных кислот с использованием трансформанта.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантному гибридному ингибитору ангиогенеза и к способу его получения. Рекомбинантный гибридный ингибитор ангиогенеза представляет собой белок, указанный на фиг.1.

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии. Получена генетическая конструкция pAd-SM, построенная путем гомологичной рекомбинации вектора pAdEasy-1, содержащего основную часть генома аденовируса и плазмиды pAdTrack-CMV, в которую помещены фрагменты кДНК генов SOX2 и C-MYC человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей Р2А-пептид.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Предложен способ получения полипептида, включающий культивирование клетки, которая усиленно экспрессирует переносчик бикарбоната и имеет перенесенную ДНК, кодирующую желаемый полипептид, что позволяет клетке продуцировать указанный полипептид, а также соответствующая клетка.

Изобретение относится к соединениям общей Формулы III и их фармацевтически приемлемым солям, где А представляет собой (C1-С6)алкил-O-, фенил-(С1 -С6)алкил-O-; арил, выбранный из фенила, нафтила, и , который возможно замещен 1-3 заместителями, указанными в формуле изобретения; или гетероарил, имеющий четыре или пять атомов углерода и один гетероатом, выбранный из кислорода, азота и серы, который возможно замещен 1-3 заместителями, указанными в формуле изобретения; В представляет собой фенил, возможно замещенный 1-3 заместителями, где заместители выбраны из (С1-С 6)алкила, (С3-С7)циклоалкила, (С 1-С6)алкил-О-, гидрокси, амино и галогено; и R1 и R2 независимо представляют собой (С 1-С6)алкил, фенил-(С1-С6 )алкил-, гидрокси-(С1-С6)алкил, (С 3-С7)циклоалкил, (С2-С6 )алкенил или (С2-С6)алкинил; при условии, что R1 отличается от R2; где абсолютной конфигурацией асимметрического атома углерода, несущего R 1 и R2, преимущественно является R-конфигурация.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению антител против NR10, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения клетки СНО, способной продуцировать желаемый полипептид с высоким выходом, клетке, полученной данным способом, способу получения желаемого полипептида, способу количественного увеличения продукции полипептида клеткой СНО с сильной экспрессией переносчика таурина.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к апоптотическим факторам, и может быть использовано в медицине. Получают композицию, включающую ингибитор TNF-подавляющей активности Core 1 митохондриального дыхательного комплекса III в опухолевой клетке на основе нуклеиновой кислоты; член суперсемейства фактора некроза опухоли (TNF) и носитель.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения вирусных инфекций. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, включающее активированные-потенцированные антитела к гамма- интерферону человека, к CD4 рецептору и к гистамину.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложен способ получения вакцины с применением обратимого латекса.

Группа изобретений относится к композициям, наборам, способам профилактики и терапии рака с использованием рекомбинантных вирусов MVA (модифицированный вирус коровьей оспы Анкара), кодирующих антигены, ассоциированные с опухолью: PSA (простато-специфический антиген) и РАР (простатическая кислая фосфатаза).
Изобретение относится к медицинской иммунологии, иммунохимии, а именно к способу получения поликлональной моноспецифической сыворотки против секреторного иммуноглобулина A (SIgA) человека, не содержащей в исходном состоянии примесных антител к лактоферрину.

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для индукции иммунной системы, содержащей синтетические наноносители, обладающие по меньшей мере одной поверхностью с иммунными свойствами, образованной множеством молекул, которые обеспечивают высокую авидность и низкую аффиность связывания с антигенпрезентирующими клетками (АРС), и фармацевтически приемлемый наполнитель; способа индукции иммунной системы, включающего введение указанной композиции индивидууму.

Группа изобретений относится к области медицины и фармацевтики и касается стабильной изотонической действующей композиции, содержащей протеин в количестве по крайней мере 50 мг/мл и растворитель, который разбавляет композицию, полученную из лиофилизированной смеси протеина и лиопротектора, где мольное соотношение лиопротектора и протеина в смеси составляет 100-600 моль лиопротектора на 1 моль протеина, причем концентрация протеина в разбавленной действующей композиции в 2-40 раз выше, чем концентрация протеина в смеси до лиофилизации.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к композициям и способам для доставки наноносителей к клеткам иммунной системы, способным стимулировать иммунный ответ в Т-клетках и/или в В-клетках.

Данное изобретение относится к медицине, биофармацевтики и может быть использовано для приготовления вакцин. Для этого иммуногенная композиция содержит: 1) антиген нейссериальный аутотранспортерный белок, представляющий собой NadA или Hsf; 2) антиген нейссериальный белок, участвующий в усвоении железа, представляющий собой Lipo28 или низкомолекулярный и высокомолекулярный TbpA и 3) препарат везикул наружной мембраны, включающий нейссериальный липополисахарид (LPS) иммунотипа L3; и где указанные антигены, в тех случаях, когда они присутствуют в везикуле наружной мембраны, позитивно отрегулированы рекомбинантным образом в указанной везикуле наружной мембраны.

Группа изобретений относится к композициям, включающим Tr1-клетки и мезенхимальные стволовые клетки, представляющие собой специфические клетки для антигена, в норме толерантного у здорового субъекта, где указанный антиген представляет собой аллерген, собственный антиген, пищевой антиген или антиген микроорганизмов, и способам лечения аутоиммунного заболевания, аллергического заболевания или воспалительного заболевания.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложен способ получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу. Указанная адаптированная рекомбиназа рекомбинирует асимметричные участки-мишени в LTR провирусной ДНК ретровируса, встроенного в геном клетки-хозяина, и пригодна в качестве средства для вырезания провируса из генома клетки-хозяина. Настоящее изобретение дополнительно относится к способу оптимизации лечения ретровирусной инфекции у индивида in vitro и к использованию адаптированных рекомбиназ для получения фармацевтических композиций для снижения вирусной нагрузки у индивида, инфицированного ретровирусом. 11 н. и 10 з.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл., 4 пр.
Наверх