Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением



Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением
Слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, поддерживаемый за счет замедленного высвобождения in vivo, и способ увеличения времени полужизни in vivo с его применением

 


Владельцы патента RU 2503688:

АЛТЕОГЕН, ИНК (KR)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к созданию лекарственных препаратов с замедленным высвобождением белковых или пептидных лекарственных средств, и может быть использовано в медицине. Физиологически активный белок или полипептид сливают с вариантом альфа-1-антитрипсина, имеющим по меньшей мере один мутированный аминокислотный остаток. Мутации производят в следующих положениях: остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357; или остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357 и остаток треонина вместо серина в положении 359; или остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357 и остаток серина вместо цистеина в положении 232; или остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357, остаток треонина вместо серина в положении 359 и остаток серина вместо цистеина в положении 232. Изобретение позволяет увеличить время полужизни физиологически активного белка или полипептида in vivo путем поддержания его устойчивой циркуляции в крови. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 13 ил., 7 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к слитому белку или пептиду, который имеет увеличенное время полужизни in vivo, и к способу увеличения времени полужизни in vivo белка или пептида с его применением.

Уровень техники

Белковые и пептидные лекарственные средства обладают отличными терапевтическими эффектами в случае, когда нет возможности проводить лечение с помощью обычных синтетических химических лекарственных средств, и, следовательно, занимают важное положение в медицине и фармакологии. Например, рекомбинантный гормон роста человека (hGH) представляет собой единственное эффективное терапевтическое средство для лечения дефицита гормона роста, а рекомбинантный эритропоэтин человека (ЕРО) применяют при лечении анемии, возникающей в результате хронической болезни почек, благодаря его способности увеличивать уровень эритроцитов, и рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий гормон (G-CSF) применяют в качестве единственного лекарственного средства для увеличения уровня лейкоцитов в крови у пациентов с раком после химиотерапии. Кроме того, обнаруженные в организме различные типы цитокинов, гормонов и пептидов применяют в качестве единственной терапии для широкого спектра заболеваний, для которых не существует других доступных в настоящее время альтернатив.

Хотя белковые или пептидные лекарственные средства демонстрируют отличные терапевтические эффекты in vivo, они быстро теряют свою терапевтическую активность и, таким образом, они имеют короткие периоды полужизни in vivo, поскольку сразу же после инъекции происходит их деградация под действием протеиназ крови или они легко удаляются из крови почками или печенью. Следовательно, их недостаток в том, что они требуют частых инъекций с целью поддержания их постоянного уровня в крови или их постоянного титра. Пациенты менее охотно соглашаются на прием лекарственного средства, вводимого с помощью частых инъекций, из-за боязни инъекций и их болезненности или беспокойства, причиняемого повторными введениями, если их применяют в течение длительного периода.

Постоянно проводят множество исследований с целью увеличить стабильность белковых и пептидных лекарственных средств в крови и сохранить уровень лекарственных средств в крови в течение длительного промежутка времени.

Например, были разработаны лекарственные формы с замедленным высвобождением лекарственных средств путем создания композиций терапевтически активного белка или пептида с биологически разлагаемым полимером, который позволяет белкам или пептидам медленно высвобождаться из места инъекции. Если лекарственное средство с замедленным высвобождением вводят с помощью подкожной или внутримышечной инъекции, то лекарственное средство медленно высвобождается для поддержания постоянного уровня лекарственного средства в течение определенного периода времени (М. Chasin & R. Langer, et al., Biodegradable polymer as drug delivery system. Marcel Dekker (1990); J.Heller, et al., Adv. Drug Del Rev., 10, 163 (1993)). Среди биологически разлагаемых полимеров, широко применяют PLGA (сополимер молочной и гликолевой кислот). Например, была создана лекарственная форма с замедленным высвобождением пептидного агониста LHRH (лютеинизирующего гормона высвобождающий фактор), и было обнаружено, что это изделие высвобождает пептид in vivo в течение одного или трех месяцев. Применяют биологически разлагаемые полимеры и вместе с высокомолекулярными белками. Например, патент США №.6,500,448 раскрывает фармацевтическую композицию для замедленного высвобождения гормона роста человека, которая включает биологически совместимый полимер и частицы гормона роста человека в комплексе с катионами металла. В другом исследовании, в патенте Кореи №№.10-0236771 и 10-0329336, описано применение гиалуроновой кислоты для создания микрочастиц с замедленным высвобождением белковых лекарственных средств, в том числе рекомбинантного гормона роста человека.

Несмотря на то, что для замедленного высвобождения лекарственных средств, успешно применяют биологически разлагаемые полимеры для низкомолекулярных пептидов, существуют ограничения в отношении их применения для высокомолекулярных белков. Причина этого заключается в том, что белки легко денатурируют в ходе изготовления микрочастиц для замедленного высвобождения и денатурированные аминокислоты снижают активность белка, что может вызвать некоторые нежелательные иммунные ответы в организме человека. Кроме того, размер микрочастиц для замедленного высвобождения белков или пептидов бывает обычно большим, что требует применения толстых игл для шприца при введении с помощью инъекции в организм человека и вызывает болезненные ощущения в месте инъекции. Также, микрочастицы невыгодны с точки зрения экономики из-за низких выходов при производстве изделий для коммерческих целей.

С целью преодоления вышеуказанных проблем, были проведены исследования, направленные на замедление почечного клиренса белков или пептидов. В общем, белки с молекулярной массой, равной 60000 дальтон или менее, проходят через почки без задержки. Следовательно, были предприняты попытки увеличения низкой молекулярной массы пептидных или белковых терапевтических средств для того, чтобы продлить время циркуляции в крови т vivo, снижая, таким образом, частоту инъекций. В соответствии с этими методиками, физиологически активные белки и пептиды обеспечивают не в форме с замедленным высвобождением, а скорее в форме с длительным действием.

Одна из наиболее популярных стратегий, применяемых для снижения частоты инъекций, заключается в присоединении хорошо растворимого полимера, такого как полиэтиленгликоль (в дальнейшем в этой заявке обозначен как «ПЭГ») к поверхности фармацевтически активных белков или пептидов. ПЭГ может быть неспецифически присоединен к аминогруппе аминокислот белков или пептидов. ПЭГилирование может обеспечить растворимость в воде для гидрофобных лекарственных средств и белков и увеличивает гидродинамический размер средства для продления времени циркуляции в крови после введения с помощью инъекции в организм (Sada et al., J. Ferment Bioeng 71, 137-139, 1991).

Недавно, был налажен серийный выпуск ПЭГилированного интерферона-альфа с целью уменьшить частоту инъекций. Кроме того, Kinstler et al. показали, что одна инъекция ПЭГилированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) в неделю (один цикл химиотерапии) имеет такое лечебное действие, какое производят инъекции G-CSF, проводимые три раза в неделю (Kinstler et al., Pharm Res 12, 1883-1888, 1995). ПЭГ-GCSF доступен для приобретения под торговым наименованием «Neulast».

Поскольку ПЭГилирование белка происходит в результате неспецифического ковалентного присоединения ПЭГ к поверхности белка, в ПЭГилированном участке может быть затруднено взаимодействие белка с его рецептором, что существенно снижает активность белка in vivo. Кроме того, ПЭГилирование представляет собой несколько трудоемкую процедуру, поскольку белки, ПЭГилированные по физиологически активному участку, должные быть удалены в процессе очистки, чтобы оставались только такие конъюгаты ПЭГ-белок, у которых активность была бы снижена минимально. Следовательно, в этом процессе выход желаемых конъюгатов ПЭГ-белок существенно снижен, что приводит к неблагоприятной с точки зрения экономики ситуации. Кроме того, что касается некоторых белков, которые нестабильны в водных растворах, то попытки конъюгировать их с ПЭГ потерпели неудачу.

Кроме того, частоту инъекций снижают с помощью гликоинженерной методики, применяемой в настоящее время в коммерческом производстве. Elliot et al. сообщили о дополнительном гликозилировании эритропоэтина (ЕРО) путем замещения аминокислот в определенных положениях {Nat Biotechnol 21, 414-421, 2003; патент США №.7,217,689). Эритропоэтин, модифицированный гликоинженерными способами, в настоящее время доступен для приобретения под торговым наименованием «Aranesp», и известно, что благодаря добавлению цепей Сахаров с сиаловой кислотой на конце и увеличению молекулярной массы замедляется циркуляция в кровотоке, метаболизм и экскреция модифицированного эритропоэтина. Однако гликоинженерию не используют широко для введения дополнительных участков гликозилирования белков, поскольку присоединение или добавление цепей Сахаров может привести к инактивации физиологически активного белка, и ее способность поддерживать стабильность т vivo не была подтверждена для многих белков. И набор участков физиологически активного белка, к которым могут быть дополнительно присоединены цепи Сахаров, очень невелик. Кроме того, гликоинженерию трудно применять в случае пептидов с низкой молекулярной массой.

Развитие генной инженерии позволило увеличить размер физиологически активного белка путем слияние его с высокомолекулярным белком (Curr Opin Drug Discov Devel 12, 284-295, 2009). Например, ген физиологически активного белка сливают с геном альбумина человека и затем экспрессируют в дрожжевых клетках для получения слитого белка (международные публикации патента №№WO 93/15199 и WO 93/15200). Примеры физиологически активных белков, слитых с альбумином, включают гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Halpem et al., Pharm Res 19, 1720-1729, 2002), гормон роста человека (Osborn et al., Eur J Pharmacol 456, 149-158, 2002), глюкагон-подобный пептид-1 (Baggio et al., Diabetes 53, 2492-2500, 2004), и интерферон-альфа (Osbom et al., J Pharmacol Exp Ther 303, 540-548, 2002).

Известны также слитые белки с трансферрином, полученные с помощью методики рекомбинантного слияния. Например, патент США №7,176,278 раскрывает слитую молекулу, в которой глюкагон-подобный пептид-1 слит с природным трансферрином или дегликозилированным трансферрином, и время его полужизни in vivo увеличивается.

При этом время полужизни белка in vivo может быть продлено путем слияния с Fc-фрагментом иммуноглобулина (Ig) (патенты США №5,116,964 и №5,605,690). Слитый ген фрагмента рецептора TNF-α и фрагмента IgG1 Fc экспрессируют в животных клетках (клетках яичника китайского хомячка, СНО), трансформированных геном, кодирующим слитый белок, и слитый белок в настоящее время доступен для приобретения (торговое наименование: Enbrel) после одобрения USFDA в качестве терапевтического средства для лечения ревматоидного артрита. Кроме того, Wang удалось (Qinghua Wang; WO 2007/012188) удлинить время полужизни in vivo GLP-1 (t1/2<2 мин) или эксендина-4 с коротким временем полужизни путем слияния с Fc-фрагментом Ig.

Несмотря на то, что Ig Fc широко применяют в качестве носителя для слитых белков с целью увеличения времени полужизни in vivo, IgG1 Fc сохраняет свою собственную антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплементзависимую цитотоксичность (CDC). Таким образом, при введении в организм с помощью инъекции, слитый белок физиологически активного белка с IgG1 Fc может вызвать комплексные иммунные ответы. Кроме того, повторное введение Fc-слитых белков в течение длительного периода времени может привести к продукции нежелательных антител. Следовательно, применение белков, слитых с IgG1 Fc, имеет ограничение при применении в медицинской практике.

Патент Кореи №10-0725315 раскрывает белковый комплекс с применением фрагмента иммуноглобулина и способ его получения, в котором физиологически активный белок сливают с IgG Fc через ПЭГ. «Белковый комплекс», имеющий структуру физиологически активный белок-ПЭГ-Fc, обладает более продолжительным временем полужизни in vivo, по сравнению с физиологически активным белком, согласно данным фармакокинетических анализов. Однако похожие недостатки или проблемы, показанные для способа слияния с Fc, также можно наблюдать и для «белкового комплекса», поскольку физиологически активный белок и Fc-фрагмент химически связаны молекулой ПЭГ.

Другой пример применения иммуноглобулина для увеличения стабильности пептидного лекарственного средства in vivo представляет собой слияние целой молекулы антитела IgG и низкомолекулярного пептида (Rader et al, Proc. Natl. Acad. Sci. США 100, 5396-5400, 2003, Doppalapudi et al., Bioorg & Med Chew 17, 501-506, 2007). Однако эта методика, называемая «CovX-Body», не может быть применена к высокомолекулярным белкам, и ее применение ограничено из-за проблем, возникающих при получении Fc-слитых белков или ПЭГ-слитых белков.

Как описано выше, множество попыток было предпринято для слияния биополимера с физиологически активным белком или терапевтическим пептидом, но они могут быть применены только к ограниченному кругу белков или пептидов по следующим причинам: время существования in vivo не достаточно продолжительно для разработки слитого белка для медицинских целей; очень низкий выход при получении, делающий производство экономически невыгодным; нежелательные иммунные ответы, когда их используют в течение длительного времени; и нежелательное остаточное присутствие токсических химических производных, когда их используют для конъюгации с белками или пептидами. Следовательно, существует необходимость в новых слитых белках или пептидах, которые могут продлевать время полужизни in vivo физиологически активных белков или пептидов, с минимальной потерей активность in vivo.

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Приведшее к настоящему изобретению интенсивное и тщательное исследование слитых белков или пептидов, которые имеют увеличенное время полужизни т vivo и минимальную потерю активности in vivo, проведенное авторами настоящего изобретения, привело к обнаружению того, что альфа-1-антитрипсин или его вариант позволяют слитому с ним физиологически активному белку или пептиду поддерживать устойчивую циркуляцию in vivo и, таким образом, увеличивают стабильность in vivo и время полужизни in vivo (Т1/2), по сравнению с собственными свойствами белка или пептида.

Техническое решение

Настоящее изобретение обеспечивает слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo с поддержанием его устойчивой циркуляции, и способ увеличения времени полужизни in vivo белка или пептида с применением того же.

Описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое поведение слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и гормона роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH].

Фиг.2 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое поведение слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α].

Фиг.3 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое поведение слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF].

Фиг.4 представляет собой график, демонстрирующий фармакокинетическое поведение слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: Эксендин-4/α1AT(P357N)].

Фиг.5 представляет собой график, демонстрирующий in vivo активность (изменение массы тела у крыс с удаленным гипофизом) слитого белка моновариант гормона роста человека/альфа-1-антитрипсин [Т109: α1AT(P357N)/hGH].

Фиг.6 представляет собой график, демонстрирующий in vivo активности (увеличение количества лейкоцитов) слитого белка гранулоцинарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/ тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF].

Фиг.7 представляет собой график, демонстрирующий результаты внутрибрюшинного теста на толерантность к глюкозе, проведенного с слитым белком эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: Эксендин-4/α1AT(P357N)].

Фиг.8 представляет собой график, демонстрирующий влияние слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: Эксендин-4/α1AT(Р357Н)] на уровень сахара в крови в моделях диабета на мышах.

Фиг.9 представляет собой график, демонстрирующий внутриклеточную активность слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитого белка гормона роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитого белка гормона роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH].

Фиг.10 представляет собой график, демонстрирующий внутриклеточную активность слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF].

Фиг.11 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующую активность слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и слитого белка гормона роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] в отношении трипсина.

Фиг.12 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующую активность слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и слитого белка гормона роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] в отношении эластазы нейтрофилов человека.

Фиг.13 представляет собой фотографии, демонстрирующие полосы слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсина [T109wt: α1AT/hGH] и слитого белка гормона роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т 109: α1AT(P357N)/hGH] и слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] после электрофореза в SDS-полиакриламидном геле.

Лучший способ осуществления изобретения

В соответствии с аспектом настоящего изобретения обеспечивают слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, в котором физиологически активный белок или пептид слит с альфа-1-антитрипсином, в результате чего физиологически активный белок или пептид может долговременно циркулировать in vivo.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечивают слитый белок или пептид с увеличенным временем полужизни in vivo, в котором физиологически активный белок или пептид слит с вариантом альфа-1-антитрипсина, мутированным по одному или нескольким аминокислотным остаткам, в результате чего физиологически активный белок или пептид может долговременно циркулировать in vivo.

В соответствии с дальнейшим аспектом настоящего изобретения обеспечивают способ увеличения времени полужизни in vivo у физиологически активного белка или пептида, включающий слияние физиологически активного белка или пептида с альфа-1-антитрипсином или с вариантом альфа-1-антитрипсина, имеющим одну или несколько мутированных аминокислот, в результате чего физиологически активный белок или пептид может долговременно циркулировать in vivo.

Ниже приведено осуществление настоящего изобретения.

Слитый белок или пептид в соответствии с настоящим изобретением представляет собой пример применения альфа-1-антитрипсина или варианта альфа-1-антитрипсина для поддержания устойчивой циркуляции физиологически активного белка или пептида для увеличения времени полужизни in vivo путем слияния с ним физиологически активного белка или пептида.

Как применен в настоящей заявке, термин «слитый белок/слитый полипептид» означает новую белковую молекулу, в которой физиологически активный белок с большой молекулярной массой слит с N- или С-концом альфа-1-антитрипсина или варианта альфа-1-антитрипсина. Подобным образом, термин «слитый пептид», как применен в настоящей заявке, означает новую пептидную молекулу, в которой физиологически активный пептид с низкой молекулярной массой слит с N- или С-концом альфа-1-антитрипсина или варианта альфа-1-антитрипсина.

Физиологически активный белок или пептид могут быть слиты непосредственно или через линкер, состоящий из аминокислот, с альфа-1-антитрипсином или вариантом альфа-1-антитрипсина, мутированного по одной или нескольким аминокислотам.

Предпочтительно, для слияния физиологически активного белка или пептида с альфа-1-антитрипсином или вариантом альфа-1-антитрипсина, мутированного по одной или нескольким аминокислотам, применяют методику генетической рекомбинации. Альтернативно, для слияния физиологически активного белка или пептида с N- или С-концом или свободной группой альфа-1-антитрипсина или варианта альфа-1-антитрипсина, мутированного по одной или нескольким аминокислотам, может быть применен линкер, хорошо известный в этой области техники.

Среди физиологически активных белков есть гормоны и их рецепторы, модификаторы биологического ответа и их рецепторы, цитокины и их рецепторы, ферменты, антитела и фрагменты антител. Конкретные примеры физиологически активных белков включают гормон роста человека (hGH), инсулин, фолликулостимулирующий гормон (FSH), хорионический гонадотропин человека, паратиреоидный гормон (РТН), эритропоэтин (ЕРО), тромбопоэтин (ТРО), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор(О-CSF), гранулоцитарно-макрофаговый колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, интерлейкины, макрофаг активирующий фактор, фактор некроза опухолей, тканевой активатор плазминогена, фактор коагуляции VII, VIIa, VIII и IX, костный морфогенетический белок человека 2 (hBMP2), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), глюкоцереброзидазу, α-галактозидазу А, α-L-идуронидазу, идуронат-2-сульфатазу, лактазу, аденозиндеаминазу, бутирилхолинэстеразу, хитиназу, глутаматдекарбоксилазу, имиглюцеразу, липазу, уриказу, ацетилгидролазу фактора активации тромбоцитов, нейтральную эндопептидазу, урокиназу, стрептокиназу, миелопероксидазау, супероксиддисмутазу, ботулотоксин, коллагеназу, гиалуронидазу, L-аспарагиназу, моноклональные антитела, поликлональные антитела, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 и Fd, но не ограничиваясь этим.

Примеры физиологически активного пептида включают глюкагон-подобный пептид-1 (GLP-1) и его аналоги, эксендин и его аналоги, соматостатин и его аналоги, агонист и антагонист гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон (LHRH), адренокортикотропный гормон, гормон, высвобождающий гормон роста, окситоцин, тимозин альфа-1, кортикотропин-рилизинг фактор, кальцитонин, бивалирудин, аналоги вазопрессина и фрагменты физиологически активных белков, но, не ограничиваясь этим.

Альфа-1-антитрипсин представляет собой сывороточный белок млекопитающих, размером примерно 50000 дальтон, который присутствует в крови в высоких концентрациях, примерно 2 мг/мл (Robin W.C. et al., Nature 298, 329-334, 1982). Альфа-1-антитрипсин также называют ингибитором альфа-1-протеаз, поскольку он ингибирует широкий круг протеаз. Однако, в отношении известных заболеваний, его основная функция заключается в защите тканей легкого от эластазы нейтрофилов (Beatty et al., J Biol Chem 255, 3931-3934, 1980). В отсутствии альфа-1-антитрипсина, эластаза нейтрофилов свободно разрушает эластин, который вносит вклад в эластичность легких, что приводит к затруднению дыхания, такому как эмфизема. Расстройства, связанные с этим белком, включают такое наследственное заболевание как недостаточность альфа-1-антитрипсина. Альфа-1-антитрипсин, экстрагированный из сыворотки, доступен для приобретения в качестве терапевтического средства для лечения эмфиземы под торговым наименованием «Prolastin», поскольку он был одобрен FDA. Стабильность и безопасность Prolastin была подтверждена, и его вводят в виде внутривенной инъекции в дозе, равной 60 мг/кг в неделю. Кроме того, известно, что альфа-1-антитрипсин сам по себе имеет время полужизни in vivo, равное примерно 5-6 дням (Weweres, MD, et al., N. Engl J Med 316, 1055-1062, 1987). Это обеспечивает теоретическую основу, согласно которой альфа-1-антитрипсин, который безопасен для организма, даже если его вводят в большом количестве, может служить для увеличения времени полужизни in vivo физиологически активного белка или пептида путем слияния его и альфа-1-антитрипсина между собой. Структура альфа-1-антитрипсина и его роль в качестве ингибитора протеазы хорошо известны (Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998). PI аминокислотный остаток (положение 358 от N-конца) в альфа-1-антитрипсине представляет собой метионин, остаток, важный для связывания эластазы. Известно также, что белок ингибирует широкий круг протеаз, включая трипсин, химотрипсин, тромбин и эластазу. Ген альфа-1-антитрипсина высоко плеоморфный, со свыше, чем 100 идентифицированными к настоящему времени аллелями, их фенотипы установлены с помощью IEF (изоэлектрическое фокусирование) и им присвоен буквенный код (от А до Z) (Stoller et al., The Lancet, 365, 2225-2236, 2005). Семейство М-аллелей, наиболее распространенное среди аллелей, обозначаемое как М, дополнительно подразделяется на подтипы, такие как M1 (Val213), M1 (Ala213), M2 и М3, в соответствии с мутациями аминокислот в последовательности. Следовательно, альфа-1-антитрипсин, применяемый в настоящем изобретении, представляет собой специфический подтип, принадлежащий к семейству М-аллелей, применяют также и другие подтипы с тем же эффектом.

Вариант альфа-1-антитрипсина может быть получен с помощью сайт-направленного мутагенеза одной или нескольких аминокислот. Например, вариант альфа-1-антитрипсина может иметь аспарагин в положении 357 в Р2 вместо пролина. В дополнении к замещению в Р2 пролина на аспарагин в положении 357, вариант альфа-1-антитрипсина может иметь одну или несколько иных мутантных аминокислот в других положениях. Подробно, вариант альфа-1-антитрипсина может иметь аспарагин вместо пролина в положении 357 и, необязательно, треонин вместо серина в положении 359 и/или серин вместо цистеина в положении 232. Вариант альфа-1-антитрипсина, применяемый в настоящем изобретении, может быть выбран из моноварианта альфа-1-антитрипсина [α1AT(P357N)], диварианта альфа-1-антитрипсина [α1AT(P357N, S359T)], диварианта альфа-1-антитрипсина 2 [α1AT(P357N, C232S)] и триварианта альфа-1-антитрипсина [α1AT(P357N, C232S, S359T)].

Моновариант альфа-1-антитрипсина [α1AT(P357N)] получают при замещении пролина (Pro) аспарагином (Asn) в положении 357 в Р2 с N-конца. Этот вариант альфа-1-антитрипсина характеризуется образованием нового участка N-гликозилирования Asn-X-Ser, который вносит вклад в нейтрализацию ингибирующей активности альфа-1-антитрипсина как ингибитора протеаз, а также минимизирует иммуногенность, возникающую после инъекции из-за замены аминокислоты.

Дивариант альфа-1-антитрипсина [α1AT(P357N, S359T)] возникает в результате замещения пролина аспарагином в положении 357 в Р2 и серина треонином в положении 359. Этот вариант альфа-1-антитрипсина характеризуется образованием нового участка N-гликозилирования Asn-X-Thr, который вносит вклад в нейтрализацию ингибирующей активности альфа-1-антитрипсина как ингибитора протеаз и минимизирует иммуногенность, возникающую после инъекции из-за замены аминокислоты

Дивариант альфа-1-антитрипсина 2 [α1AT(P357N, C232S)] возникает в результате замещения пролина аспарагином в положении 357 в Р2 и цистеина серином в положении 232. Этот дивариант альфа-1-антитрипсина 2 характеризуется образованием нового участка N-гликозилирования Asn-X-Ser, который вносит вклад в нейтрализацию ингибирующей активности альфа-1-антитрипсина как ингибитора протеаз, минимизирует иммуногенность, возникающую после инъекции из-за замены аминокислоты, и дополнительно предупреждает образование димера, опосредуемое свободным цистеином.

Образующийся в результате замещения пролина аспарагином в положении 357 в Р2, цистеина серином в положении 232 и серина треонином в положении 359, тривариант альфа-1-антитрипсина [α1AT(P357N, C232S, S359T)] характеризуется образованием нового участка N-гликозилирования Asn-X-Thr, вносит вклад в нейтрализацию ингибирующей активности альфа-1-антитрипсина как ингибитора протеаз, минимизирует иммуногенность, возникающую после инъекции из-за замены аминокислоты, и дополнительно предупреждает образование димера, опосредуемое свободным цистеином.

Среди слитых белков или пептидов настоящего изобретения можно назвать гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] (SEQ ID NO:1), гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] (SEQ ID NO:2), гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] (SEQ ID NO:3), интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α] (SEQ ID NO:4), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] (SEQ ID NO:5), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] (SEQ ID NO:6) и эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)] (SEQ ID NO:7).

У всех слитых белков или пептидов, описанных в этой заявке, гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH], гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH], интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α], гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] и эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: у эксендин-4/α1AT(P357N], значительно вырастает время полужизни в сыворотке крови (t1/2), и он демонстрирует отличную стабильность in vivo, по сравнению с физиологически активным белком или пептидом самим по себе.

При введении с помощью инъекции крысам с удаленным гипофизом, было обнаружено, что слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] индуцирует прирост веса у животных. После инъекции слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] или слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] у крыс возрастает уровень лейкоцитов. Группа, которой вводят слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)], продемонстрировала большее снижение уровня сахара в крови, по сравнению с группами, которым вводят экссндин-4, и этот низкий уровень сахара в крови сохранялся, по меньшей мере, в течение 24-х часов после введения. Следовательно, слитые белки или пептиды в соответствии с настоящим изобретением сохраняют активность in vivo в течение длительного периода времени.

Кроме того, слитые белки или пептиды, гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т 109: α1AT(P357N)/hGH], гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH], гранулоцинарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и гранулоцинарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF], обладают сходной внутриклеточной активностью (ЕС50) и, следовательно, их активности незначительно различаются в зависимости от типа носителя, т.е., альфа-1-антитрипсина и вариантов альфа-1 -антитрипсина.

Кроме того, слитый белок настоящего изобретения гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], демонстрирует отличную ингибирующую активность в отношении трипсина и эластазы нейтрофилов человека, тогда как слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т 109: α1AT(P357N)/hGH], обладает очень низкой ингибирующей активностью в отношении трипсина и эластазы нейтрофилов человека. Следовательно, тот факт, что слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] увеличивают время полужизни in vivo путем устойчивой циркуляции, не зависит от собственных свойств альфа-1-антитрипсина.

Как описано выше, слитые белки или пептиды в соответствии с настоящим изобретением увеличивают время полужизни в сыворотке крови (T1/2) посредством устойчивой циркуляции, и, таким образом, обладают повышенной стабильностью in vivo, по сравнению с собственно физиологически активными белками или пептидами. Следовательно, слитые белки или пептиды настоящего изобретения могут быть применены для разработки лекарственных форм белковых или пептидных лекарственных средств с устойчивой циркуляцией.

Осуществление изобретения

Лучшее понимание настоящего изобретения может быть достигнуто с помощью следующих примеров, которые приведены для иллюстрации, но не должны рассматриваться, как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1. Получение слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH]

1. Конструирование вектора экспрессии, pSNAT

Для экспрессии гормона роста человека, слитого с С-концом альфа-1-антитрипсина, конструируют вектор экспрессии pSNAT, несущий альфа-1-антитрипсин. Подробно, ген альфа-1-антитрипсина получают из вектора hMU001448 (KRIBB) с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT21 (SEQ ID NO:8) и ALT30 (SEQ ID NO:9), которые были разработаны для слияния гормона роста человека с С-концом альфа-1-антитрипсина. При разработке в праймер ALT30 также был включен линкер, который может создавать подвижность, необходимую для стабилизации слитых белков. Амплифицированные нуклеотиды расщепляют в присутствии двух рестриктаз XhoI и BamHI и клонируют в pSGHVO (код доступа в Банке генов AF285183), получая в результате рекомбинантный вектор, названный pSNAT.

2. Конструирование вектора гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt, α1AT/hGH]

Ген гормона роста человека (hGH) амплифицируют из вектора IOH45734 («Invitrogen») с помощью PCR, применяя пару праймеров DH22 (SEQ ID NO:10) и ALT12 (SEQ ID NO:11). PCR-продукт, полученный таким образом, расщепляют в присутствии двух рестриктаз BamHI и NotI, и клонируют в pSNAT по тому же сайту рестрикции BamHI/NotI для создания рекомбинантного вектора экспрессии, названного T109wt (SEQ ID NO:1).

3. Экспрессия слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин (T109wt) Слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин (T109wt), полученный как описано выше в пунктах 1-2, экспрессируют в клетках яичника китайского хомячка (СНО-K1). СНО-K1 поддерживают в DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), дополненной 10% FBS (эмбриональная бычья сыворотка) и антибиотиками при 37°С под 5%-ным CO2. За один день до введения в них гена гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин (T109wt), клетки инокулируют в количестве 1×106 клеток на 100 мм чашку для культивирования. К 800 мкл среды DMEM, свободной от FBS и антибиотиков, добавляют 5 мкг слитого белка гормона роста человека/альфа-1-антитрипсин (T109wt), и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 1 мин, смешивают с 20 мкг PEI (полиэтиленимин, линейный, «Polysciences Inc» (№ по каталогу: 23966, MW ~25000)) и оставляют при комнатной температуре в течение 10~15 мин. В это время клетки, инкубировавшиеся в течение одного дня, промывают PBS и к ним добавляют 6 мл свежей DMEM. Слитый белок гормона роста человека/альфа-1-антитрипсин (T109wt), оставленный на 10~15 мин при комнатной температуре, добавляют в чашку для культивирования. На следующий день, клетки промывают PBS и к ним добавляют свободную от FBS среду IMDM (№ по каталогу 12200-028, «Gibco». среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков) для идентификации экспрессии белка.

4. Очистка слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин (T109wt)

После того как в клетках яичника китайского хомячка (СНООК1) была проведена экспрессия, как описано выше в пунктах 1-3, белок T109wt очищают следующим образом. Подробно, поскольку слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин (T109wt), секретируется в среду, культуру клеток центрифугируют, так чтобы можно было собрать супернатант. Этот супернатант уравновешивают буферным раствором (20 мМ фосфат натрия, рН 8,0), наносят на колонку с Q-сефарозой («GE Healthcare», США), предварительно уравновешенную раствором буфера уравновешивания, и основательно промывают раствором буфера уравновешивания, затем элюируют в возрастающем градиенте концентрации NaCl (0~400 мМ NaCl, 20 мМ фосфат натрия, рН 8,0). Белковый элюат смешивают с солью, наносят на уравновешенную колонку с фенил-сефарозой («GE Healthcare», U.S.A), и промывают достаточным количеством раствора буфера уравновешивания, затем элюируют в понижающем градиенте концентрации NaCl (2~0 М NaCl, 20 мМ фосфат натрия, рН 6,8). Белковую фракцию концентрируют с помощью устройства «Vivaspin20» («GE Healthcare», США) и получают высокоочищенный T109wt.

Пример 2. Получение слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH]

1. Получение моноварианта альфа-1-антитрипсина (вектор для клонирования pDHT3N)

Поскольку сам альфа-1-антитрипсин, применяемый в качестве носителя при слиянии, в слитой молекуле обладает ингибирующей активностью, ингибирующую активность альфа-1-антитрипсина существенно снижают, создавая вариант альфа-1-антитрипсина. В связи с этим, ген альфа-1-антитрипсина амплифицируют из вектора hMU001448 (KRIBB) с помощью PCR, и клонируют в вектор уТ&А для получения рекомбинантного вектора pDHT3. После этого, проводят замену остатка пролина в положении 357 в Р2 на аспарагин для N-гликозилирования, применяя пару праймеров ALT1 (SEQ ID NO:12) и ALT2 (SEQ ID NO:13) с помощью набора для проведения мутагенеза («Stratagene», QuikChange II, № по каталогу 200523-5) и получают вектор для клонирования pDHT3N.

2. Конструирование вектора экспрессии pSNATN

Для экспрессии гормона роста человека, слитого с С-концом инактивированного альфа-1-антитрипсина, конструируют вектор экспрессии pSNATN, несущий моновариант альфа-1-антитрипсина. Подробно, ген моноварианта альфа-1-антитрипсина получают из вектора pDHT3N с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT 14 (SEQ ID NO:14) и ALT30 (SEQ ID NO:9), клонируют в pSNAT, расщепленный в присутствии двух рестриктаз EcoRV и BamHI, и получают рекомбинантный вектор, названный pSNATN.

3. Конструирование вектора гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109, α1AT(P357N)/hGH]

Ген гормона роста человека, амплифицированный по примеру 1-2, встраивают в pSNATN по сайту рестрикции BamHI/NotI и получают рекомбинантный вектор экспрессии, названный Т 10 (SEQ ID NO:2).

4. Экспрессия слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т109)

Экспрессию слитого белка гормона роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т109) в клетках яичника китайского хомячка (СНО-K1) идентифицируют с помощью той же процедуры, как в примере 1-3.

5. Очистка слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т109)

Слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т109) очищают таким же способом, как в примере 1-4.

Пример 3. Получение слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH]

1. Получение диварианта альфа-1-антитрипсина (вектор для клонирования pDHT3NT)

Для получения инактивированного альфа-1-антитрипсина путем введения участка гликозилирования в активный центр молекулы, альфа-1-антитрипсин мутируют дважды для снижения его активности и достижения однородности гликозилирования. В связи с этим, проводят замещение остатка серина в положении 359 на треонин для однородности гликозилирования на индуцирующем N-гликозилирование pDHT3N векторе для клонирования, несущем моновариант альфа-1-антитрипсина, активность которого снижена путем мутирования пролина в положении 357 в Р2 на аспарагин, применяя пару праймеров ALT82 (SEQ ID NO:15) и ALT83 (SEQ ID NO:16) с помощью набора для проведения мутагенеза (««Enzynomics»», EZchange № по каталогу ЕМ020) и получают вектор для клонирования, названный pDHT3NT.

2. Конструирование вектора экспрессии pSNATNT

Для экспрессии гормона роста человека, слитого с С-концом диварианта альфа-1-антитрипсина, обладающего однородностью гликозилирования и сниженной активностью, конструируют вектор экспрессии pSNATNT. В связи с этим, ген диварианта альфа-1-антитрипсина амплифицируют из pDHT3NT с помощью PCR. применяя пару праймеров ALT14 (SEQ ID NO:14) и ALT30 (SEQ ID NO:9), разработанных для слияния гормона роста человека с С-концом диварианта альфа-1-антитрипсина, и клонируют в pSNAT, предварительно обработанном в присутствии двух рестриктаз EcoRV и BamHI, и получают рекомбинантный вектор экспрессии, названный pSNATNT.

3. Конструирование вектора, несущего ген гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т, α1AT(P357N, S359T)/hGH]

Нуклеотид гормона роста человека, амплифицированный по примеру 1-2, клонируют в pSNATNT по сайту рестрикции BamHI/NotI и получают вектор экспрессии, названный Т109Т (SEQ ID NO:3).

4. Экспрессия слитого белка гормона роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина (Т109Т)

Экспрессию слитого белка гормона роста человека/диварианта альфа-1-антитрипсина (Т109Т), в клетках яичника китайского хомячка (СНО-K1) идентифицируют таким же способом, как в примере 1-3.

5. Очистка слитого белка гормона роста человека/диварианта альфа-1-антитрипсина (Т109Т)

Слитый белок гормона роста человека/диварианта альфа-1-антитрипсина (Т109Т), очищают таким же способом, как в примере 1-4.

Пример 4. Получение слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α]

1. Конструирование вектора для интерферона-альфа человека/моноварианта альфа-1-антитрипсина [Т502, α1AT(P357N)/IFN-α]

Ген интерферона-альфа человека (IFN-α) амплифицируют из вектора MHS1010-98051913 (««Open biosystems»») с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT45 (SEQ ID NO:17) и ALT49 (SEQ ID NO:18). PCR-продукт, полученный таким образом, расщепляют в двух местах в присутствии BamHI и NotI и затем клонируют в pSNATN по сайту рестрикции BamHI/NotI и получают рекомбинантный вектор экспрессии, названного Т502 (SEQ ID NO:4).

2. Экспрессия слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т502)

Экспрессию слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т502) в клетках яичника китайского хомячка (СНО-K1), идентифицируют таким же способом, как в примере 1-3.

3. Очистка слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т502)

Слитый белок интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т502), очищают таким же способом, как в примере 1-4.

Пример 5. Получение слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсин [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF]

1. Получение диварианта 2 альфа-1-антитрипсина (вектор для клонирования pDHT3NS)

Для применения при получении белковых или пептидных терапевтических средств, дивариант 2 альфа-1-антитрипсина получают с помощью мутации альфа-1-антитрипсина для снижения присущей ему активности альфа-1-антитрипсина и исключения возможности денатурации белка, в результате образования димеров опосредуемого цистеином. В этом контексте, мутацию, приводящую к замещению остатка цистеина в положении 232 на треонин, проводят на индуцирующем N-гликозилирование векторе для клонирования pDHT3N, который несет моновариант альфа-1-антитрипсина со сниженной с помощью мутации пролина в положении 357 в Р2 на аспарагин активностью, применяя пару праймеров ALT52 (SEQ ID NO:19) и ALT53 (SEQ ID NO:20) с помощью набора для проведения мутагенеза («Stratagene», QuikChange II № по каталогу 200523-5), и получают вектор для клонирования, названный pDHT3NS.

2. Конструирование вектора экспрессии pSNATNS

Для экспрессии гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, слитого с С-концом диварианта 2 альфа-1-антитрипсина, который имеет сниженную ингибиторную активность, конструируют вектор экспрессии pSNATNS. В связи с этим, ген диварианта 2 альфа-1-антитрипсина амплифицируют из pDHT3NS с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT14 (SEQ ID NO:14) и ALT30 (SEQ ID NO:9), сконструированных для слияния гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с С-концом диварианта 2 альфа-1-антитрипсина, и клонируют в вектор pSNAT, предварительно обработанный в присутствии двух рестриктаз BstEII и BamHI, и получают рекомбинантный вектор экспрессии, названный pSNATNS.

3. Конструирование вектора гранулоцитарного колониестимулирующего фактора/диварианта 2 альфа-1-антитрипсина [T602S, α1AT(P357N, C232S)/G-CSF]

Ген гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) амплифицируют из IHS 1380-97652343 («Open biosystems») с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT56 (SEQ ID NO:21) и ALT57 (SEQ ID NO:22). PCR-продукт, полученный таким образом, расщепляют в двух местах с помощью BamHI и NotI, клонируют в pSNATNS по сайту рестрикции BamHI/NotI и получают рекомбинантный вектор экспрессии, названный T602S (SEQ ID NO:5).

4. Экспрессия слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина (T602S)

Экспрессию слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина (T602S) в клетках яичника китайского хомячка (СНО-K1) идентифицируют таким же способом, как в примере 1-3.

5. Очистка слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина (T602S)

Слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина (T602S) очищают таким же способом, как в примере 1-4.

Пример 6. Получение слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]

1. Получение триварианта альфа-1-антитрипсина (вектор для клонирования PDHT3NST)

Для применения при получении белковых или пептидных терапевтических средств, тривариант альфа-1-антитрипсина получают с помощью мутации диварианта альфа-1-антитрипсина для достижения однородности гликозилирования. В связи с этим, используя набор для проведения мутагенеза («Enzynomics», EZchange № по каталогу ЕМ020) в присутствии пары праймеров ALT82 (SEQ ID NO:15) и ALT83 (SEQ ID NO:16), проводят замещение остатка серина в положении 359 на треонин для однородности гликозилирования на индуцирующем N-гликозилирование pDHT3NS векторе для клонирования, несущем дивариант 2 альфа-1-антитрипсина, в котором присущая ему активность снижена в результате замещения пролина в положении 357 в Р2 на аспарагин, и вероятность денатурации белка, связанная с опосредуемым цистеином образованием димеров, исключена в результате замещения цистеина в положении 232 на серин.

2. Конструирование вектора экспрессии pSNATNST

Для экспрессии гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, слитого с С-концом триварианта альфа-1-антитрипсина, который имеет сниженную активность, конструируют вектор экспрессии pSNATNST. В связи с этим, ген триварианта альфа-1-антитрипсина амплифицируют из pDHT3NST с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT14 (SEQ ID NO:14) и ALT30 (SEQ ID NO:9), сконструированных для слияния гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с С-концом триварианта альфа-1-антитрипсина, и клонируют в вектор pSNAT, предварительно обработанный в присутствии двух рестриктаз BstEII и BamHI, и получают рекомбинантный вектор экспрессии, названный pSNATNST.

3. Конструирование вектора гранулоцитарного колониестимулирующего фактора/триварианта альфа-1-антитрипсина [T602ST, α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]

Ген гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF) амплифицируют из вектора IHS1380-97652343 («Open biosystems») с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT56 (SEQ ID NO:21) и ALT57 (SEQ ID NO:22). Амплифицированные нуклеотиды расщепляют в двух местах с помощью BamHI и NotI, клонируют в pSNATNST по сайту рестрикции BamHI/NotI и получают рекомбинантный вектор экспрессии, названный T602ST (SEQ ID NO:6).

4. Экспрессия слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина (T602ST)

Экспрессию слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина (T602ST) в клетках яичника китайского хомячка (СНО-K1) идентифицируют таким же способом, как в примере 1-3.

5. Очистка слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина (T602ST)

Слитый белок гранулоцитарного колониестимулирующего фактора/триварианта альфа-1-антитрипсина (T602ST) очищают таким же способом, как в примере 1-4.

Пример 7. Получение слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: Эксендин-4/α1AT(P357N)]

1. Конструирование вектора экспрессии pSCAT

Для экспрессии эксендина-4, слитого с N-концом альфа-1-антитрипсина, конструируют вектор pSCAT. Подробно, альфа-1-антитрипсин с N-концом которого должен быть слит эксендин-4, амплифицируют из вектора hMU001448 (KRIBB) с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT21 (SEQ ID NO:8) и ALT5 (SEQ ID NO:23). Амплифицированные нуклеотиды расщепляют в присутствии двух рестриктаз XhoI и NotI, клонируют в pSGHVO (код доступа в Банке генов AF285183) и получают рекомбинантный вектор, названный pSCAT.

2. Конструирование вектора экспрессии pSCATN

Для экспрессии эксендина-4, слитого с N-концом инактивированного моноварианта альфа-1-антитрипсина, конструируют pSCATN. В этом контексте, ген, кодирующий моновариант альфа-1-антитрипсина, с N-концом которого эксендин-4 должен быть слит, получают из вектора pDHT3N, клонируют в pSCAT, применяя две рестриктазы EcoRV и NotI, и получают рекомбинантный вектор, названный pSCATN.

3. Получение эксендина-4

Эксендин-4 ген амплифицируют с помощью PCR, применяя DH15 (смысловой кодон, SEQ ID NO:24) и DH16 (антисмысловой кодон, SEQ ID NO:25).

4. Конструирование вектора эксендина-4/моноварианта альфа-1-антитрипсина [Т304, эксендин-4/α1AT(P357N)]

Ген эксендина-4 амплифицируют из гена, полученного по примеру 7-3, с помощью PCR, применяя пару праймеров ALT44 (SEQ ID NO:26) и ALT41 (SEQ ID NO:27). Этот амплифицированный нуклеотид расщепляют в двух местах с помощью Xhol и BamHI, клонируют в pSCATN по сайту рестрикции XhoI/BamHI и получают вектор с эксендином-4/моновариантом альфа-1-антитрипсина (Т304, SEQ ID NO:7).

5. Экспрессия слитого белка эксендина-4/моноварианта альфа-1-антитрипсина (Т304)

Экспрессию слитого белка эксендина-4/варианта альфа-1-антитрипсина (Т304), в клетках яичника китайского хомячка (СНО-K1) идентифицируют таким же способом, как в примере 1-3.

6. Очистка слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т304) Слитый белок эксендина-4/моноварианта альфа-1-антитрипсина (Т304), очищают таким же способом, как в примере 1-4.

Тест-пример 1.

Иммуноферментный анализ слитых белков или пептидов Иммуноферментный анализ слитых белков или пептидов настоящего изобретения проводят следующим образом.

1. Иммуноферментный анализ гормона роста человека (hGH), слитого белка гормона роста человека/альфа-1-антитрипсина [T109wt: α1AT/hGH], слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH]

Моноклональные антитела к гормону роста человека («Medix Biochemica», Финляндия) разводят до концентрации, равной 1~5 мкг/мл в натрий-фосфатном буфере (PBS), разведения разделяют на аликвоты по 100 мкл/лунку в 96-луночном планшете («Nunc», Дания) и инкубируют при комнатной температуре в течение 15~18 часов. После удаления оставшихся в суспензии антител, вносят PBS, содержащий 1%-ный бычий сывороточный альбумин, в количестве 250 мкл/лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-х часов. Планшеты промывают три раза буфером промывания (0,05% Tween 20, PBS) и раствор отбирают. Образцы разводят в PBS, содержащем 1%-ный бычий сывороточный альбумин, и вносят в 96-луночные планшеты перед инкубацией при комнатной температуре в течение 2-х часов. 96-луночные планшеты промывают пять раз буфером промывания и в каждую лунку 96-луночных планшетов добавляют по 100 мкл конъюгированных с биотином моноклональных антител к гормону роста человека, полученных с применением сульфо-NHS-биотина («Pierce biotechnology», США), а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 2-х часов. Планшеты промывают пять раз буфером промывания и инкубируют со стрептавидин-HRP при комнатной температуре в течение 30 мин. Снова, планшеты промывают пять раз буфером промывания и проводят реакцию со 100 мкл смеси ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) и перекиси водорода на лунку в течение 30 мин в темном месте. В каждую лунку добавляют 100 мкл 1 М серной кислоты для остановки реакции, затем измеряют поглощение при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов «VersaMax» («Molecular Device», США). Величины для каждого образца рассчитывают путем регрессионного анализа после построения стандартной кривой по контрольному материалу.

2. Иммуноферментный анализ интерферона-альфа человека (IFN-α), слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α]

Иммуноферментный анализ интерферона-альфа человека (IFN-α) и слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина проводят с совместимой с IFN-α человека парой антител для ELISA («Bender Medsystems», Австрия). Антитела к IFN-α (10 мкг/мл) помещают в 96-луночные планшеты для прикрепления, затем их блокируют, как описано в тест-примере 1-1. При комнатной температуре в течение 2-х часов при встряхивании проводят реакцию между образцом в различных разведениях с антителами. Конъюгаты анти-IFN-α-HRP помещают в количестве 50 мкл/лунку и проводят реакцию с антителами при комнатной температуре в течение 2-х часов при встряхивании. Последующие процедуры проводят таким же способом, как в тест-примере 1-1.

3. Иммуноферментный анализ гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], слитого белка гранулоцитарного колониестимулирующего фактора/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]

Повторяют ту же процедуру, как в тест-примере 1, за исключением того, что вместо антител к гормону роста человека используют моноклональные антитела к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору (G-CSF) («RND systems», США), которые разводят до концентрации, равной 1~5 мкг/мл и применяют конъюгат поликлональных антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору-биотин («RND systems», США), вместо конъюгата моноклональные антитела к гормону роста человека и биотин.

4. Иммуноферментный анализ эксендина-4, слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304:эксендин-4/α1AT(P357N)]

Повторяют ту же процедуру как в тест-примере 1-1, за исключением того, что используют поликлональные антитела к эксендину-4 («Peptron», Корея), вместо антител к гормону роста человека, которые разводят до концентрации, равной 5~10 мкг/мл в PBS и применяют конъюгат моноклональные антитела к эксендину-4 и биотин, вместо конъюгата моноклональные антитела к гормону роста человека и биотин.

Что касается слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т304), полученного по примеру 7, то его для получения антисыворотки перед инъекцией крысам смешивают с адъювантом Фрейнда («Sigma», США). Антитела очищают, применяя протеин-О-сефарозу («GE Healthcare», США). Очищенные антитела разводят до концентрации, равной 10~20 мкл/мл в PBS, 96-луночные планшеты покрывают антителами, и проводят реакцию с конъюгатом поликлональных антител к слитому белку эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина (Т304) и биотина, который был получен с применением сульфо-NHS-биотин конъюгата («Pierce biotechnology», США), таким же образом, как описано в тест-примере 1-1. Реакции с образом и конъюгатом проводят при встряхивании.

Тест-пример 2. Фармакокинетический анализ слитых белков или пептидов

Для исследования фармакокинетики слитых белков или пептидов, проводят следующие эксперименты.

1. Фармакокинетика гормона роста человека (hGH), слитого белка гормона роста человека/альфа-1-антитрипсина [T109wt: α1AT/hGH], слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH], слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH]

В качестве экспериментальных животных используют крыс Sprague-Dawley, трем из них вводят гормон роста человека, тогда как остальных крыс распределяют по группам, которым вводят слитые белки, по пять крыс в группе. Слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитый белок гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH], все полученные по примеру 1~3, вводят подкожно в дозе 720 мкг/кг соответствующей группе крыс Sprague-Dawley. Образцы разводят в PBS перед инъекцией. Образцы крови отбирают через 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30 и 48 часов после инъекции, и центрифугируют для получения сыворотки. Для контроля, Scitropin («SciGen», Сингапур), разновидность гормона роста человека, вводят подкожно с помощью инъекции в дозе 200 мкг/кг. В качестве растворителя применяют PBS. Образцы крови отбирают через 0, 0,33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24, 30 и 48 часов после инъекции, и центрифугируют для получения сыворотки. Каждый образец анализируют с помощью иммуноферментного анализа, следуя процедуре, описанной в тест-примере 1.

Фармакокинетика слитого белка гормона роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитого белка гормона роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] изображена на графике, представленном на фиг.1.

Как показано на фиг.1, слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 5,3 часа и время, при котором его концентрация в сыворотке достигает максимального значения (Tmax), равное 8 часам, слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 5,4 часов, и Tmax, равное 12 часов, и слитый белок гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 4,9 часа и Tmax, равное 12,8 часа. С другой стороны, гормон роста человека (hGH) имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 0,8 часа и Tmax, равное 1 часу. Следовательно, было обнаружено все слитые белки, слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитый белок гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] обладают значительно увеличенной in vivo стабильностью по сравнению с гормоном роста человека.

2. Фармакокинетика интерферона-альфа человека (IFN-α), слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α]

В качестве экспериментальных животных используют крыс Sprague-Dawley, их распределяют по пять крыс в каждую тестируемую группу. Слитый белок интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α], полученный по примеру 4, вводят подкожно с помощью инъекции в дозе 200 мкг/кг крысам Sprague-Dawley одной из тестируемых групп, после этого через 0, 0,33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, 24, 30, 48, 72 и 96 часов отбирают образцы крови и центрифугируют их для получения сыворотки. В качестве контроля, интерферон-альфа человека (IFN-α, «Intermax alpha», «LG Life Sciences», Корея) вводят крысам подкожно с помощью инъекции в дозе 60 мкг/кг, после этого через 0, 0,33, 1, 2, 5, 8, 12, 18, и 24 часов отбирают образцы крови и центрифугируют их для получения сыворотки. Каждый образец анализируют с помощью иммуноферментного анализа, следуя процедуре, описанной в тест-примере 1.

Фармакокинетика слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α] показана на фиг.2.

Как показано на фиг.2, слитый белок интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α] имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 18,5 часа и Tmax, равное 12 часов, тогда как интерферон-альфа человека имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 3,4 часа, и Tmax, равное 1,4 часа. Следовательно, in vivo стабильность слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α] настоящего изобретения значительно увеличена по сравнению с интерфероном-альфа человека.

3. Фармакокинетика гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]

В качестве экспериментальных животных используют крыс Sprague-Dawley, и трем из них вводят гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, тогда как остальных крыс распределяют по группам, которьм вводят слитые белки, по пять крыс в группе. Слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF], все получены по примеру 5~6, вводят подкожно в дозе 340 мкг/кг соответствующей группе крыс Sprague-Dawley. Образцы крови отбирают через 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, и 48 часов после инъекции, и центрифугируют для получения сыворотки. Для контроля, Filgrastim («Gracin», «Jeil Pharmaceutical Co. Ltd.», Корея), доступный для приобретения гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, вводят подкожно с помощью инъекции в дозе 100 мкг/кг. Образцы крови отбирают через 0, 1, 2, 4, 8, 12, 18, 24, 30 и 48 часов после инъекции, и центрифугируют для получения сыворотки. Каждый образец анализируют с помощью иммуноферментного анализа, следуя процедуре, описанной в тест-примере 1.

Фармакокинетика слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] изображена на фиг.3.

Как показано на фиг.3, слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 5,1 часа, и Tmax, равное 13,6 часа и слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 4,5 часа, и Tmax, равное 16 часов. С другой стороны, время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 1,8 часа, и Tmax, равное 1,8 часа, было определено в группе, которой вводили гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Следовательно, обнаружено, что слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] обладает значительно увеличенной т vivo стабильностью по сравнению с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором.

4. Фармакокинетика эксендина-4, слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)]

В качестве экспериментальных животных используют крыс Sprague-Dawley, и их распределяют по пять крыс в каждую тестируемую группу. Слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)], полученный по примеру 7, вводят подкожно с помощью инъекции в дозе 520 мкг/кг крысам Sprague-Dawley в каждой из тестируемых групп.Образцы крови отбирают через 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 24, 30, 48 и 72 часов после инъекции, и центрифугируют для получения сыворотки. В качестве контроля, эксендин-4 вводят подкожно с помощью инъекции крысам в дозе 40 мкг/кг. Образцы крови отбирают в гепаринизированные пробирки через 0, 10, 20, 30, 40, 60, 120, 180, 240, 300 и 360 мин после инъекции, и центрифугируют для получения сыворотки. Каждый образец анализируют с помощью иммуноферментного анализа, следуя процедуре, описанной в тест-примере 1.

Фармакокинетика слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N] изображена на фиг.4.

Как показано на фиг.4, слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(Р357К)] имеет время полужизни в сыворотке крови (t 1/2), равное 19,1 часа, и Tmax, равное 10,4 часа, тогда как эксендин-4 имеет время полужизни в сыворотке крови (t1/2), равное 0,8 часа, и Tmax, равное 0,4 часа. Следовательно, слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(Р357К)] настоящего изобретения обладает значительно увеличенной in vivo стабильностью, по сравнению с эксендином-4.

Тест-пример 3. Анализ активности слитых белков или пептидов in vivo

Следующие эксперименты проводят для исследования активности in vivo слитых белков или пептидов в соответствии с настоящим изобретением.

1. In vivo активность гормона роста человека (hGH), слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH]

В качестве экспериментальных животных применяют крыс Sprague-Dawley с удаленным гипофизом, их разбивают на три группы по семь крыс в каждой. Крысам Sprague-Dawley с удаленным гипофизом ежедневно вводят подкожно слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109; α1AT(P357N)/hGH], полученный по примеру 2, и гормон роста человека (эутропин, «LG Life Sciences» Ltd, Корея) в дозах 18 мкг и 5 мкг на крысу, соответственно. Для контроля применяют PBS. После введения инъекции крыс ежедневно взвешивают.

Результаты анализа in vivo активности (изменение массы тела у крыс с удаленным гипофизом) слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] приведены на фиг.5.

Как показано на фиг.5, крысы с удаленным гипофизом практически не прибавляют в весе, при введении PBS, тогда как прибавление в весе наблюдали примерно на 10,2% и 9,4% на 7-й день у крыс с удаленным гипофизом, которым вводят гормон роста человека и слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH], соответственно. Таким образом, было обнаружено, что слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] настоящего изобретения, сохраняет эффективную in vivo активность у крыс с удаленным гипофизом, подобно гормону роста человека.

2. In vivo активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]

В качестве экспериментальных животных используют крыс Sprague-Dawley, их распределяют по пяти группам по пять крыс в каждой. Слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF], полученный по примеру 5, вводят подкожно с помощью инъекции в дозах 340 мкг/кг и 1700 мкг/кг. Другим группам крыс, вводят подкожно слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF], полученный по примеру 6, и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор Filgrastim («Gracin», «Jell Pharmaceutical Co. Ltd.», Корея) в дозах 1700 мкг/кг и 100 мкг/кг, соответственно. Образцы крови отбирают из хвоста за 3 дня перед экспериментом и на 1, 2, 3, 4 и 5 день после инъекции и определяют количество лейкоцитов с помощью гематологического анализатора (Pentra 120).

Результаты анализа in vivo активности (изменение количества лейкоцитов) слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] приведены на фиг.6.

Как показано на фиг.6, количество лейкоцитов достигало максимального уровня на день 1 и затем снижалось до базового уровня со дня 2 в группе, которой вводили гранулоцитарный колониестимулирующий фактор Filgrastim, и максимального уровня на день 2 и затем снижалось со дня 3 в группе, которой вводили слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] в дозе 340 мкг/кг. В группах, которым соответственно вводили слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] в дозе 1700 мкг/кг, количество лейкоцитов оставалось высоким вплоть до дня 3, и их снижение начиналось на день 4. Следовательно, было показано, что слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] продлевают in vivo активность по сравнению с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором.

3. In vivo активность эксендина-4 и слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)]

Для исследования in vivo активности слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)] настоящего изобретения, проводят внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе и тест на снижение сахара в крови в модели на мышах с диабетом, как описано ниже.

3-1. Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе

Восьминедельных мышей C57BL/6 кормят в течение четырех недель кормом с высоким содержанием жира для индукции у них ожирения. Мыши голодают 15 часов перед проведением внутрибрюшинного теста на толерантность к глюкозе. В этом контексте, слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: Эксендин-4/α1AT(P357N)], полученный по примеру 7, и эксендин-4 вводят с помощью внутрибрюшинной инъекции однократно в дозе 10 нмоль/кг соответствующей группе мышей, после этого через 30 мин, 12 часов и 24 часа с помощью внутрибрюшинной инъекции в мышь вводят глюкозу в дозе 1,5 г/5 мл/кг. Уровень сахара в крови определяют с помощью глюкометра («Allmedicus», Корея) через 0, 10, 20, 30, 60, 90 и 120 мин после инъекции глюкозы.

Результаты внутрибрюшинного теста на толерантность к глюкозе со слитым белком эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(Р357Н)] показаны на фиг.7.

Как показано на фиг.7, в группе, которой вводили слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(Р357Н)] поддерживался низкий уровень глюкозы в течение более длительного периода времени, по сравнению с группой, которой вводили эксендин-4.

3-2. Снижение глюкозы в крови в модели на мышах с диабетом

В качестве экспериментальных животных используют мышей db/db в возрасте 9-ти недель, их подразделяют на три группы по шесть животных. Мышам db/db, содержавшимся в условиях свободного доступа к корму, вводят подкожно слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)] полученный по примеру 7, или эксендин-4 в дозе 100 нмоль/кг, и через 0, 1, 3, 6, 24, 43, 48 и 52 часов после этого определяют концентрацию сахара в крови с помощью глюкометра («Allmedicus», Корея).

Эффект слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(P357N)] в модели диабета на мышах показан на фиг.8.

Как показано на фиг.8, с момента 24 часа после инъекции, группа, которой был введен эксендин-4, имела уровень сахара в крови сходный с таковым в контрольной группе, тогда как в группе, которой вводили слитый белок эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1AT(Р357Н)], сохранялся пониженный уровень сахара в крови, демонстрируя пролонгированную активность слитого белка.

Тест-пример 4. In vitro активность слитых белков или пептидов

Для исследования in vitro активности слитых белков или пептидов настоящего изобретения проводят следующие эксперименты.

1. In vitro активность гормона роста человека (hGH), слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH]. слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH]

Линию клеток лимфомы крыс (NB2-клетки) поддерживают в среде RPMI1640, с добавкой 10%-ной HS (сыворотка лошади), 10%-ной FBS, 2-меркаптоэтанолом и антибиотиками при 37°С и 5%-ном СО2. В течение 24-х часов перед экспериментом, NB2-клетки инкубируют в среде RPMI 1640, с добавкой 10%-ной HS. После этого, NB2-клетки промывают однократно 1×DPBS (среда Дульбекко: солевой раствор с фосфатным буфером), и помешают в 96-луночные планшеты (Coming, США) в концентрации 2×104 клетки/100 мкл/лунку в среде RPMI 1640 с добавкой 5%-ной HS в конечном объеме 100 мкл. Серии разведении образцов добавляют в количестве 20 мкл в каждую лунку 96-луночных планшетов, затем инкубируют при 37°С в течение 48 часов при 5%-ном СО2. Затем, по 20 мкл раствора MTS («Promega», США) добавляют в каждую лунку 96-луночных планшетов и реакцию проводят при 37°С в течение 3-х часов при 5%-ным СО2. Реакцию останавливают добавлением 20 мкл 10%-ного SDS (додецилсульфат натрия) в каждую лунку. Измеряют поглощение при 490 нм с помощью считывающего устройства «VersaMax» для микропланшетов («Molecular Device», США). Величины ЕС50 (50%-ная эффективная концентрация) лекарственных средств, т.е. концентрации, при которых выживают 50% клеток, определяют на основании результатов измерения поглощения MTS способом.

Результаты анализа in vitro активности слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] суммированы в таблице 1 и представлены на фиг.9.

Таблица 1
Образец ЕС50 (пМ)
T109wt 211,8
Т109 181,1
Т109Т 217,1

Как видно из данных, приведенных в таблице 1 и на фиг.9, слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитый белок гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] незначительно отличаются по величине EC50. Следовательно, слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсина [T109wt: α1AT/hGH], слитый белок гормон роста человека/моноварианта альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитый белок гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] демонстрируют относительно постоянную т vivo активность (EC50) независимо от аминокислотной мутации в альфа-1-антитрипсине.

2. In vitro активность гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF]

Клетки миелобластомы мышей NFS-60 инкубируют в среде RPMI 1640, с добавкой 10%-ной FBS, мышиного IL-3 и антибиотиками при 37°С при 5%-ном CO2. Поглощение клеток измеряют при 490 нм таким же способом, как в тест-примере 4-1. Величины ЕС50 (50%-ная эффективная концентрация) лекарственных средств, т.е. концентрации, при которых выживают 50% клеток, определяют на основании результатов измерения поглощения MTS способом.

Анализ результатов in vitro активности слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] приведен в таблице 2 и на рис.10.

Таблица 2
Образец ЕС50 (пМ)
T602S 78,1
T602ST 97,6

Как видно из данных, приведенных в таблице 2 и на рис.10, слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина слияние [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] незначительно отличаются по величине EC50. Следовательно, слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] и слитый белок гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] демонстрируют относительно постоянную in vivo активность (ЕС50) независимо от аминокислотной мутации в альфа-1-антитрипсине.

Тест-пример 5. Анализ ингибирующей активности слитых белков или пептидов в отношении трипсина

Для исследования ингибирующей активности слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] в отношении трипсина, проводят следующие эксперименты.

Слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], полученный по примеру 1, и слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH], полученный по примеру 1, по отдельности смешивают с трипсином. Трипсин и слитые белки применяют в концентрации 10 нМ, соответственно. После инкубации при комнатной температуре в течение 1-го часа, проводят реакцию смеси с 0,2 мМ субстратом N-бензоил-Val-Gly-Arg-n-нитроанилид гидрохлоридом («Sigma», США), и затем измеряют поглощение при 405 нм. За единицу трипсина принимают концентрацию субстрата, приводящую к изменению поглощения, равному 0,001, и активность фермента выражают как единица/мг трипсина. Для сравнения, в качестве контроля применяют трипсин.

Результаты приведены на фиг.11.

Как показано на фиг.11, по расчетам Ка (равновесная константа ассоциации) между трипсином и альфа-1-антитрипсином равна примерно 7,5×108 М-1 для слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и примерно 8,0×106 М-1 для слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH]. Слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] продемонстрировал отличную ингибирующую активность в отношении трипсина, тогда как слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] не представляет собой хороший ингибитор трипсина. Следовательно, тот факт, что слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] увеличивают время полужизни in vivo путем устойчивой циркуляции, не зависит от собственных свойств альфа-1-антитрипсина.

Тест-пример 6. Анализ ингибирующей активности слитых белков или пептидов в отношении эластазы нейтрофилов человека

Для исследования ингибирующей активности слитого белка гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т 109: α1AT(P357N)/hGH] в отношении эластазы нейтрофилов человека проводят следующие эксперименты.

Слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], полученный по примеру 1, и слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH], полученный по примеру 1, смешивают по отдельности с эластазой нейтрофилов человека. Эластазу и слитые белки применяют в концентрации 40 нМ, соответственно. После инкубации при комнатной температуре в течение 1-го часа, проводят реакцию смеси с субстратом 1 мМ MeOSuc-AAPV-pNA («Santa Cruz Biotechnology, Inc.», США), затем измеряют поглощение при 405 нм. За единицу эластазы нейтрофилов человека принимают концентрацию субстрата, вызывающую изменение поглощения, равное 0,001 и активность фермента выражают как единицы/мг эластазы.

Результаты изображены на фиг.12.

Как показано на фиг.12, было обнаружено, что слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] ингибирует практически 100% эластазы нейтрофилов человека, тогда как гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] имеет Ка, равную примерно 1,4×107 М-1. Следовательно, слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] служит в качестве отличного ингибитора эластазы нейтрофилов человека, тогда как гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] обладает низкой ингибирующей активностью в отношении эластазы нейтрофилов человека. Следовательно, тот факт, что слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH] и слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] увеличивают время полужизни in vivo путем устойчивой циркуляции, не зависит от присущих собственно альфа-1-антитрипсину свойств.

Тест-пример 7. Анализ слитых белков или пептидов с помощью электрофореза

Для исследования изменения молекулярной массы, связанного с введением дополнительного участка гликозилирования, слитый белок гормон роста человека/альфа-1-антитрипсин [T109wt: α1AT/hGH], слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитый белок гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] подвергают SDS-электрофорезу в полиакриламидном геле.

Результаты показаны на фиг.13.

Как показано на фиг.13, слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH], в котором присутствовал дополнительный участок гликозилирования (Asn-X-Ser), мигрирует в виде белковой полосы с более высокой молекулярной массой, по сравнению с нативным слитым белком гормон роста человека/альфа-1-антитрипсина [T109wt: α1AT/hGH], в котором не создавали дополнительного участка гликозилирования. Что касается слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH], то он имеет более обширное дополнительное гликозилирование в положении 357 (Asn-X-Thr), и увеличение его молекулярной массы еще более очевидно. Следовательно, слитый белок гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH] и слитый белок гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH] имеют увеличенную молекулярную массу благодаря введению в них участка гликозилирования.

Промышленная применимость

Находясь в формах, устойчивых при циркуляции в крови, слитые белки или пептиды настоящего изобретения значительно увеличивают время полужизни в сыворотке крови (T1/2) и демонстрируют отличную in vivo стабильность, по сравнению с собственно физиологически активными белками или пептидами. Следовательно, слитые белки или пептиды настоящего изобретения могут быть применены для создания устойчиво циркулирующих лекарственных форм белковых или пептидных лекарственных средств.

1. Слитый белок или полипептид с увеличенным временем полужизни для терапевтического применения, включающий физиологически активный белок или полипептид, слитый с вариантом альфа-1-антитрипсина, имеющим, по меньшей мере, один мутированный аминокислотный остаток, в результате чего физиологически активный белок или полипептид имеет увеличенное время полужизни in vivo путем поддержания устойчивой циркуляции в крови, где по меньшей мере один мутированный аминокислотный остаток представляет собой
остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357; или
остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357 и остаток треонина вместо серина в положении 359; или
остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357 и остаток серина вместо цистеина в положении 232; или
остаток аспарагина вместо остатка пролина в положении 357, остаток треонина вместо серина в положении 359 и остаток серина вместо цистеина в положении 232.

2. Слитый белок или полипептид по п.1, в котором физиологически активный белок или полипептид слит непосредственно или через линкер, состоящий из аминокислот, с вариантом альфа-1-антитрипсина, имеющим, по меньшей мере, один мутированный аминокислотный остаток.

3. Слитый белок или полипептид по п.1, в котором физиологически активные белок выбирают из группы, состоящий из гормонов и их рецепторов, модификаторов биологических ответов и их рецепторов, цитокинов и их рецепторы, ферментов, антител и фрагментов антител.

4. Слитый белок или полипептид по п.3, в котором физиологически активный белок выбирают из группы, состоящей из гормона роста человека (hGH), инсулина, фолликулостимулирующего гормона (FSH), хорионического гонадотропина человека, паратиреоидного гормона (РТН), эритропоэтина (ЕРО), тромбопоэтина (ТРО), гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), интерферона-альфа, интерферона-бета, интерферона-гамма, интерлейкинов, макрофаг активирующего фактора, фактора некроза опухолей, тканевого активатора плазминогена, фактора коагуляции VII, VIIa, VIII и IX, костного морфогенетического белка человека 2 (hBMP2), фактора роста кератиноцитов (KGF), фактора роста тромбоцитов (PDGF), глюкоцереброзидазы, α-галактозидазы А, α-L-идуронидазы, идуронат-2-сульфатазы, лактазы, аденозиндеаминазы, бутирилхолинэстеразы, хитиназы, глутаматдекарбоксилазы, имиглюцеразы, липазы, уриказы, ацетилгидролазы фактора активации тромбоцитов, нейтральной эндопептидазы, урокиназы, стрептокиназы, миелопероксидазы, супероксиддисмутазы, ботулотоксина, коллагеназы, гиалуронидазы, L-аспарагиназы, моноклональных антител, поликлональных антител, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 и Fd и их комбинаций.

5. Слитый белок или полипептид по п.1, в котором физиологически активный полипептид выбирают из группы, состоящей из глюкагон-подобного пептида-1 (GLP-1) и его аналогов, эксендина и его аналогов, соматостатина и его аналогов, агониста и антагониста рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона (LHRH), адренокортикотропного гормона, гормона, высвобождающего гормон роста, окситоцина, тимозина альфа-1, кортикотропин-рилизинг фактора, кальцитонина, бивалирудина, аналогов вазопрессина, фрагментов физиологически активных полипептидов и их комбинаций.

6. Слитый белок или полипептид по п.1, который выбирают из группы, состоящей из слитого белка гормон роста человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т109: α1AT(P357N)/hGH](SEQ ID NO:2), слитого белка гормон роста человека/дивариант альфа-1-антитрипсина [Т109Т: α1AT(P357N, S359T)/hGH](SEQ ID NO:3), слитого белка интерферон-альфа человека/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т502: α1AT(P357N)/IFN-α](SEQ ID NO:4), слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/дивариант альфа-1-антитрипсина [T602S: α1AT(P357N, C232S)/G-CSF] (SEQ ID NO:5), слитого белка гранулоцитарный колониестимулирующий фактор/тривариант альфа-1-антитрипсина [T602ST: α1AT(P357N, C232S, S359T)/G-CSF] (SEQ ID NO:6) и слитого белка эксендин-4/моновариант альфа-1-антитрипсина [Т304: эксендин-4/α1АТ(P357N](SEQ ID NO:7).

7. Способ увеличения времени полужизни in vivo белка или полипептида, включающий конъюгацию физиологически активного белка или полипептида с вариантом альфа-1-антитрипсина по п.1, в результате чего конъюгат характеризуется устойчивостью при циркуляции in vivo.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа синтеза целевого секретируемого белка человека в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Способ включает культивирование в подходящих условиях дрожжей Saccharomyces cerevisiae и секрецию целевого белка, причем секреция направлена лидерным полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO1 и представляющим собой вариант про-области лидерного полипептида белка PpPIR1 Pichia pastoris.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения тканевого активатора плазминогена человека. Рекомбинантной плазмидной ДНК рВК415, кодирующей полипептид с последовательностью тканевого активатора плазминогена человека, включающей также MAR - область прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, усилитель транскрипции вируса CMV, внутренний сайт инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита, ген DHFR мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40, ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, обеспечивающей устойчивость к генетицину (Neo) и кассету для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампицилину, трансформируют клетки линии Cricetulus griseus CHO DHFR(-) с получением линии клеток Cricetulus griseus CHO 1F8, продуцирующей рекомбинантный белок тканевого активатора плазминогена со стабильно высоким выходом на уровне до 190 мг/л.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного фактора свертываемости крови IX человека (hFIX). Рекомбинантная плазмидная ДНК рАК380, содержащая ген белка rhFIX, MAR - область прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц, усилитель транскрипции вируса CMV, внутренний сайт инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита, ген DHFR мыши, сигнал полиаденилирования вируса SV40, ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы для устойчивости к генетицину (Neo), кассету для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы для устойчивости к ампицилину, используется для получения рекомбинантного фактора hFIX в клетках линии Cricetulus griseus CHO 1E6.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу синтеза целевого белка с пониженным ксилозилированием, пониженным фукозилированием или их комбинацией.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к бис-Met-гистонам, и может быть использовано в медицине. Молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, состоящий из двух остатков метионина в качестве первого и второго N-концевых аминокислотных остатков, соединенных через пептидную связь со зрелым эукариотическим гистоном.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложены соединения лабиринтопептинов А1, А2, или А3 формулы (I), где {A}, {B}, {C}, R1-R6, m и n имеют значения, указанные в формуле изобретения.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Представлена протеаза, обладающая усовершенствованной молокосвертывающей активностью, содержащая аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичую SEQ ID NO: 3, где указанная протеаза имеет, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из: (а) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 265 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту; и (b) замены глутамина, соответствующего глутамину в положении 266 в SEQ ID NO:3, на кислую аминокислоту.

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно, и может быть использовано для получения рекомбинантного инсулина гларгина. Способ включает стадию культивирования дрожжей, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой Х-В-Y-А, кодирующей предшественника инсулина гларгина, в которой Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту, В представляет собой В1-В30 последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина гларгина, Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты, А представляет собой А1-А21 последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина гларгина, стадию выделения экспрессирующегося предшественника инсулина гларгина, стадию кристаллизации выделенного предшественника инсулина гларгина, стадию проведения ферментативной конверсии кристаллов предшественника инсулина гларгина при рН от 8 до 10 в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента и водорастворимых органических растворителей в соотношении от 40% до 60% реакционной смеси с образованием инсулина гларгина, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь.

Изобретение относится к области генной инженерии, молекулярной и клеточной биологии. Предложена плазмидная генетическая конструкция pOL-DsRed2, построенная на основе плазмидного вектора pIRES (Clontech), в который помещены фрагменты кДНК генов ОСТ4 и LIN28 человека, соединенные нуклеотидной последовательностью, кодирующей F2А-пептид, и кДНК гена, кодирующая флуоресцентный белок DsRed2.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к рекомбинантному гибридному ингибитору ангиогенеза и к способу его получения. Рекомбинантный гибридный ингибитор ангиогенеза представляет собой белок, указанный на фиг.1.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу синтеза целевого белка с пониженным ксилозилированием, пониженным фукозилированием или их комбинацией.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который обеспечивает повышение качества (гомогенности) и выхода целевого продукта в условиях, когда гибридный белок обнаруживает дополнительные (скрытые) сайты расщепления энтеропептидазой.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается химерного белка, нуклеиновой кислоты, кодирующей такой белок, кассеты экспрессии и эукариотической клетки-хозяина.

Группа изобретений относится к области белковой инженерии, молекулярной биологии растений и борьбы с вредителями и касается гибридного инсектицидного белка и его применений.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения рекомбинантного антигена G2 хантавируса Добрава в клетках Е.coli. Способ характеризуется тем, что ДНК конструкции рНК6, указанной на фиг.1, кодирующая слитой белок из трех частей, где N-концевое положение занимает зеленый флуоресцентный белок GFP, центральное - пептид длиной 73 а.о.

Изобретение относится к вакцине, защищающей от инфекций, вызываемых стрептококком группы В (GBS), который является самой важной причиной угрожающих жизни бактериальных инфекций у новорожденных.
Изобретение относится к области биохимии. .
Наверх