Способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого импланта малого диаметра

Изобретение относится к области медицины и тканевой инженерии и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии при выполнении шунтирующих операций на сосудах малого диаметра. Изготовление сосудистого графта осуществляют методом двухфазного электроспиннинга с поэтапным введением компонентов в состав полимерной композиции. Техническим результатом изобретения является создание биорезорбируемого сосудистого импланта малого диаметра, обладающего повышенными биосовместимыми свойствами, за счет использования полимерной композиции на основе полигидроксибутирата с оксивалериатом (ПГБВ) и эпсилон-поликапролактона с дополнительным введением в ее состав коллагена IV типа, человеческого фибронектина и человеческого фактора роста фибробластов (bFGF). 1 з.п. ф-лы, 1 пр., 3 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и тканевой инженерии, и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии при выполнении шунтирующих операций на сосудах малого диаметра.

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности и инвалидизации населения, при этом ишемические поражения сосудистого русла являются лидирующими в этой области (ишемическая болезнь сердца, синдром Лериша и т.д.). Одним из эффективных способов лечения данной патологии является проведение шунтирующих операций с использованием сосудов самого пациента (аутотрансплантаты) или с использованием графтов на основе синтетических полимеров. В то же время применение аутотрансплантатов ограничено вследствие их недолговечности и сложности подбора интактных сосудов нужного диаметра, пригодных для шунтирования. А использование графтов на основе синтетических полимеров приводит к индуцированным иммунологическим реакциям, способствующим развитию хронического воспаления и тромбообразованию. Указанные недостатки привели к необходимости поиска новых материалов для создания сосудов на основе тканевой инженерии. При этом на сегодняшний день отсутствуют функционально надежные сосудистые протезы малого диаметра (не более 5 мм), которые могли бы применяться при аортокоронарном шунтировании и реконструкции артерий малого диаметра различных сосудистых бассейнов.

Известна полимерная композиция для изготовления биодеградируемых медицинских изделий и покрытий медицинского назначения, в частности сосудистых стентов, где в качестве структурообразующего вещества принят биоразлагаемый полимер, полученный из N-substituted-4-aza-caprolactone (4-aza-caprolactone-based polymeric compositions useful for the manufacture of biodegradable medical devices and as medical device coatings: pat. 8,137,687 USA. №12/064,108; Fil. 09.08.06; Pub. Date 01.03.07.). При этом функциональная подвесная группа, приложенная к кольцевому азоту, обеспечивает его амфифильные свойства, а в состав полимера может быть включено любое лекарственное или биологически активное вещество.

Недостатком известного полимера является использование гидрофобного полимера, что значительно снижает его биологическую совместимость. Адгезия клеток на поверхности материала представляет значительные трудности.

Известен способ создания биодеградируемого сосудистого импланта с буферизованием биорезорбируемого полимера (Biodegradable vascular device with buffering agent: pat. 7,803,182 USA. №10/856,459; Fil. 28.05.2004; Pub. Dat 28.09.2010), заключающийся во включении одного или нескольких структурных компонентов, сделанных из разлагаемых биополимеров. При этом буферизующий агент выделяется в процессе резорбции полимера и позволяет сохранять pH окружающих имплант тканей, что в свою очередь может обеспечить отсутствие реакции неспецифического воспаления, способного повлиять на проходимость конструкции.

Недостатком метода является выделение в окружающие ткани кислых продуктов резорбции полимеров (молочная и гликолевая кислоты), что вызывает закисление окружающих тканей, провоцируя развитие хронического воспаления и тромбообразования сосудистого импланта. Данное обстоятельство требует дополнительного введения в состав конструкции буферизующего агента, что усложняет технологию производства и повышает ее стоимость. Важным недостатком метода является отказ от использования аутологичных клеток для формирования внутренней поверхности сосудистого импланта, что позволило бы избежать реакции неспецифического воспаления и тромбообразования.

Наиболее близким к заявляемому является способ формирования трехмерных тканеинженерных конструкций на основе биосовместимых и биодеградируемых полимеров с введением в сополимерный каркас биологически активных веществ (факторов роста и хемоаттрактантов) (Engineering of strong, pliable tissues: pat. RE 42,575 USA. №11/529,691; Fil. 28.08.2006; Pub. Date 26.07.11.). Изготовленный полимерный каркас предварительно имплантируют в подкожную клетчатку для формирования клеточных слоев будущего импланта, после чего графт имплантируют в сердечно-сосудистую сеть. Синтетическая пористая матрица, содержащая факторы роста и хемоаттрактанты, в процессе распада способствует привлечению и организации аутоклеток различного происхождения. Именно данный способ мы принимаем в качестве прототипа.

Недостатком способа является необходимость проведения двухстадийной имплантации, включающей в себя на первом этапе подкожную имплантацию биодеградируемой конструкции, а на втором этапе - установку заселенного аутоклетками импланта в окончательную локацию. В результате требуется проведение пациенту дополнительных хирургических вмешательств, повышающих риски осложнений и развития неблагоприятных исходов. Недостатком предлагаемого способа является необходимость длительной (от 3 до 6 месяцев) подкожной имплантации для полноценного заселения полимерной матрицы аутоклетками.

Техническим результатом изобретения является создание биорезорбируемого сосудистого импланта малого диаметра, обладающего повышенными биосовместимыми свойствами, за счет использования полимерной композиции на основе полигидроксибутирата с оксивалериатом (ПГБВ) и эпсилон-поликапролактона с дополнительным введением в ее состав коллагена IV типа, человеческого фибронектина и человеческого фактора роста фибробластов (bFGF).

Струтурообразующим полимером при изготовлении предложенного импланта выступает эпсилон-поликапролактон (PCL), который является продуктом нефтяной промышленности и представляет собой циклический мономер, обладающий высокой прочностью и эластичностью. Кроме того, PCL способен биорезорбироваться в организме животного или человека со средним сроком биодеградации до 3 лет.

Полигидроксибутират с оксивалериатом (ПГБВ), вводимый в состав полимерной композиции, относится к бактериальным полимерам класса полигидроксиалканоатов (ПГА) и обладает высокой биосовместимостью к тканям организма, способен к биодеградации с образованием нетоксичных продуктов распада. Известно, что включение в состав полимерной композиции сополимера микробного происхождения ПГБВ с уровнем оксивалериата от 8,5% до 37% позволяет решить проблему цитотоксичности при создании гибридного сосудистого импланта на основе чистого поликапролактона. Полимерная композиция на основе ПГБВ и PCL резорбируется в организме с образованием безопасных компонентов - гидроксимасляной кислоты, воды и углекислого газа, что позволяет использовать их в различных соотношениях при создании биорезорбируемых конструкций медицинского назначения.

Кроме того, введение в состав композиции ПГБВ позволяет улучшить адгезивные свойства импланта, что является критичным фактором при изготовлении сосудистых графтов с использованием клеточных технологий.

Основная задача при выборе соотношения данных полимеров в композиции - сохранение скорости биорезорбции в организме, достаточной для завершения воссоздания собственного нового сосуда на месте резорбируемого импланта, и учет особенностей метода изготовления трубчатой структуры будущего сосудистого импланта малого диаметра.

Исследования физико-механических характеристик, цитотоксичности in vitro и биодеградации биорезорбируемых полимерных конструкций in vivo проведены на базе Отдела экспериментальной и клинической кардиологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» СО РАМН.

Выявлено, что оптимальными являются следующие соотношения полимеров в растворителе: 3%-8% ПГБВ и 10%-14% PCL. В долевом соотношении ПГБВ:PCL в растворе по сухой массе полимеров относительно друг друга будут выглядеть следующим образом: от 23,1:76,9 (это если конечная концентрация в растворе 3% ПГБВ и 10% PCL) до 36,4:63,6 (если конечная концентрация в растворе 8% ПГБВ и 14% PCL) с промежуточными вариациями. Полученные нетоксичные биосовместимые биодеградируемые сополимерные композиции разного состава, обладают адекватной скоростью биорезорбции и физико-механическими свойствами для создания сосудистых протезов малого диаметра, пригодных выступить в роли, как бесклеточного протеза, так и в роли матрикса для создания гибридного сосудистого графта с привлечением методов клеточных технологий и тканевой инженерии.

Основные характеристики полимерных конструкций поясняются данными исследований, где в таблице 1 представлены темпы биодеградации полимерных конструкций при подкожной имплантации крысам линии Wistar в течение 8 месяцев.

Таблица 1
Полимерные конструкции	1 мес.	2 мес.	3 мес.	4 мес.	5 мес.	6 мес.	7 мес.	8 мес.
5% ПГБВ + 10% PCL	-	-	±	+	+	+	+	+
7,5% ПГБВ + 10% PCL	±	+	+	+	+	+	+	++

Необходимо отметить, что до 8 месяца наблюдения биорезорбция указанных полимерных конструкций определялась только микроскопически.

Анализ цитотоксичности полученных матриц на основе разного состава полимерной композиции проводили на основании состояния посаженных на матриксы мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), культивированных на матриксах в течение 7 суток. При этом оценивали относительное число клеток в состоянии раннего апоптоза, позднего апоптоза и некроза.

Таблица 2
Относительное число ММСК жизнеспособных, в апоптозе и некрозе
№ серии испытания	Матрицы	Живые ММСК, %	Ранний апоптоз ММСК, %	Поздний апоптоз ММСК, %	Некроз ММСК, %
1	5% ПГБВ + 10% PCL	73,5	25,1	1,3	0,2
2	7,5% ПГБВ + 10% PCL	72,8	24,9	1,7	0,5
3	10% PCL (образец для сравнения)	43,7	54,4	1,3	0,5

Таким образом, проведенные исследования демонстрируют пригодность биорезорбируемых трубчатых полимерных конструкций на основе ПГБВ и PCL для создания сосудистого импланта малого диаметра и подтверждают перспективность их использования в сердечно-сосудистой хирургии.

Дополнительно в состав полимерной композиции вводят белковые компоненты, оптимизирующие клеточную адгезию и способствующие воссозданию неоинтимы сосудистого импланта на основе аутологичных клеток, что позволит избежать иммунологического конфликта, повысить гемосовместимость и долгосрочную проходимость сосудистых имплантов малого диаметра. Коллаген IV типа и фибронектин, вводимые в состав композиции, образуют аналог базальной мембраны при формировании внутренней поверхности трубчатой конструкции, а ростовой фактор bFGF призван активировать хемотаксис собственных фибробластоподобных клеток организма в стенку импланта, для формирования стенок сосуда.

Изготовление биорезорбируемого трубчатого полимерного импланта малого диаметра осуществляют методом двухфазного электроспиннинга, что позволяет создавать максимально пористую трубчатую конструкцию за счет хаотичного распределения полимерных нитей на намоточном коллекторе диаметром 2-6 мм. Наиболее оптимальным для заселения импланта клетками является размер пор 30-150 мкм как при использовании клеточных технологий in vitro, так и через естественный кровоток in vivo.

Образование нитей из полимерной композиции с введенными белковыми субстратами происходит в сильном электрическом поле, возникающем между двумя электродами противоположной зарядности. При выходе раствора полимеров из шприца через иглу полимер застывает и образует волокно, которое наматывается на штифтовой коллектор выбранного диаметра, располагаясь при этом хаотично и формируя пористость.

Преимуществом данного метода выполнения трубчатого каркаса помимо формирования пористости является низкий температурный режим, позволяющий объединять полимеры с теплочувствительными белковыми компонентами с сохранением биоактивности последних. Запаивание белковых субстратов в полимерное волокно обеспечивает сохранность их функций как при стерилизации трубчатой полимерной конструкции, так и в процессе длительного срока биорезорбции после имплантации в организм.

Процесс электроспиннинга разделен на 2 фазы, что обусловлено необходимостью введения в раствор полимеров трех биологически активных веществ разнонаправленного действия с последующей их локализацией во внутреннем и наружном слоях трубчатой полимерной конструкции.

Способ осуществляют следующим образом. Полимерную композицию изготавливают путем смешивания сухого вещества эпсилон-поликапролактона (поликапролактон, PCL) молекулярной массой 80000 Кда и полигидроксибутирата с оксивалератом (ПГБВ) молекулярной массой 2307 Кда с включением оксивалерата от 8,5% до 37%. в долевом соотношение ПГБВ:PCL в растворе сухой массы - 23,1-36,4:76,9-63,6. В качестве растворителя полимеров выступает хлороформ, количество которого будет зависеть от требуемого конечного объема раствора (например, от 10 мл до 100 мл). Смешивание полимеров в растворителе проводят при комнатной температуре на магнитной мешалке до полного растворения полимеров.

Для создания биорезорбируемой трубчатой полимерной конструкции используют следующие режимы: напряжение - 10-50 кВ, скорость подачи раствора полимеров - 1-10 мл/час, расстояние между иглой и коллектором - 1-20 см, скорость вращения коллектора - 10-300 об/мин.

Первый этап электроспиннига заключается в том, что к готовому раствору полимеров добавляют коллаген IV типа в концентрации 100 мкг на 1 мл раствора полимеров и человеческий фибронектин в концентрации 10 мкг на 1 мл композиции. Нити полимерной композиции, содержащие фидерные компоненты, наматывают на коллектор выбранного диаметра в течение 10-15 минут до образования толщины стенки импланта 75-125 мкм, таким образом, формируя его внутреннюю поверхность.

Формирование наружной стенки биорезорбируемого импланта осуществляют на втором этапе электроспиннинга, для чего в раствор полимеров вводят человеческий фактор роста фибробластов (bFGF) в концентрации 0,01 мкг на 1 мл раствора полимеров и продолжают намотку нитей в заданном режиме электроспиннера до формирования стенки трубчатой конструкции 300-500 мкм.

Ниже представлены результаты физико-механических испытаний полученных образцов, изготовленных из полимерной композиции на основе ПГБВ и PCL с введенными в состав композиции белковых компонентов, оптимизирующие клеточную адгезию.

Таблица 3.
№ серии испытания	Время синтеза матриц (ПГБВ+PCL)	Диаметр матрицы, мм	σ, МПа	□, %	Емод, Н/мм2
1	5% ПГБВ + 10% PCL 30 мин	2,0	2,0±0,28	284,7±11,53	4,62±0,81
2	7,5% ПГБВ + 10% PCL 30 мин	3,0	1,75±0,09	369,1±51,43	4,18±0,42
3	5% ПГБВ + 10% PCL 60 мин	4,0	1,4±0,05	287,9±21,45	2,31±0,23
Примечание: σ - разрушающее напряжение при растяжении; □ - относительное удлинение; Емод - модуль упругости.

Ниже приведен пример осуществления способа.

Пример 1. Изготовление полимерного каркаса сосудистого импланта диаметром 4 мм на основе 3% ПГБВ и 10% PCL. Для чего выполняют навеску сухих полимеров из расчета 0,3 г ПГБВ (с включением оксивалериата 37%) и 1,0 г PCL, в качестве растворителя вводят 10 мл хлороформа. Перемешивание ингредиентов выполняют на магнитной мешалке до полного растворения полимеров. Процесс электроспиннинга осуществляют при следующих параметрах: напряжение - 25 кВ, скорость подачи раствора полимеров - 1 мл/час, расстояние между иглой и коллектором - 15 см, скорость вращения коллектора - 150 об/мин.

Для осуществления первой фазы электроспиннинга к 2,5 мл раствора полимеров (¼ от общего объема раствора полимеров) добавляют раствор коллагена IV типа в концентрации 100 мкг/мл, и раствор человеческого фибронектина в концентрации 10 мкг/мл. Готовой композицией заполняем первый стерильный шприц и запускаем процесс изготовления полимерной матрицы методом двухфазного электроспиннинга. Формируемые нанонити в течение 7,5 минут хаотично наматываются на штифт диаметром 4 мм до полного опустошения шприца, после чего подающее устройство отключают и вынимают шприц.

Второй этап электроспиннинга осуществляют с использованием состава, приготовленного из оставшихся 7,5 мл полимерной композиции (¾ от общего объема раствора полимеров) и дополнительно введенного раствора человеческого ростового фактора bFGF в концентрации 0,01 мкг/мл. Полученным составом заполняют второй стерильный шприц и, не изменяя параметры электроспиннинга, продолжают формировать нанонити, которые в течение 22,5 минут хаотично намываются на первый (внутренний) слой стенки импланта до полного опустошения второго шприца.

Таким образом, внутренний диаметр полученного сосудистого графта составляет 4 мм, а его пористая стенка состоит из двух слоев (внутреннего и наружного), каждый из которых содержит соответствующие компоненты, необходимые для формирования собственного сосуда в месте имплантации.

1. Способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого импланта малого диаметра, включающий использование биодеградируемой полимерной композиции, полученной путем смешивания в хлороформе полигиброксибутирата молекулярной массой 2307 Кда с включением оксивалериата от 8,5% до 37% и эпсилон-поликапролактона молекулярной массой 80000 Кда и выполненный методом двухфазного электроспиннинга, где размер пор между хаотично расположенными нитями составляет 30-150 мкм, отличающийся тем, что соотношение полимеров в сухой смеси композиции ПГБВ:PCL составляет 23,1-36,4:76,9-63,6, при этом в первую фазу электроспиннинга к раствору полимера добавляют коллаген IV типа в концентрации 100 мкг на 1 мл раствора и человеческий фибронектин в концентрации 10 мкг на 1 мл композиции, а во вторую фазу электроспиннинга осуществляют с использованием полимерной композиции, дополненной фактором роста фибробластов в концентрации 0,01 мкг на 1 мл раствора.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что внутренний диаметр изготавливаемого сосудистого импланта составляет от 2 до 6 мм, при этом толщина внутренней стенки составляет 75-125 мкм, а общая толщина стенки импланта 300-500 мкм.