Применение l. casei ssp. paracasei в качестве противогрибкового средства

Авторы патента:

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

A23C9/123 - с использованием только микроорганизмов вида lactobacteriaceae; йогурт (A23C 9/13 имеет преимущество)

Владельцы патента RU 2505599:

КОМПАНИ ЖЕРВЭ ДАНОН (FR)

Изобретение относится к применению штамма бактерий L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518 для придания противогрибковых свойств ферментированному молочному продукту. Ингибирование развития плесени класса аскомицетов в указанном продукте осуществляют ферментацией молочного субстрата в присутствии данного штамма в течение по меньшей мере 5 часов. Изобретение обеспечивает увеличение противогрибковой активности в ферментированном молочном продукте. Диаметр таллома после 7 дней инкубирования составляет 8,8±1 мм. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

Настоящее изобретение относится к применению Lactobacillus casei для защиты молочного продукта от развития плесеней.

Использование микроорганизмов, выбранных с целью улучшения хранения пищевых продуктов, известно тысячелетия. Среди этих микроорганизмов можно назвать молочнокислые бактерии, которые широко используют для хранения молочных продуктов, мясных продуктов или продуктов растительного происхождения, предназначенных для питания человека или животного. Улучшение хранения пищевых продуктов молочнокислыми бактериями основано, большей частью, на их способности продуцировать во время ферментации молочную кислоту и другие органические кислоты, которые ингибируют рост нежелательных микроорганизмов (бактерий и плесеней), понижая рН среды, делая ее неблагоприятной для роста этих микроорганизмов, и/или которые оказывают прямое токсическое воздействие на них. Помимо этих органических кислот, некоторые молочнокислые бактерии продуцируют вещества, обладающие противогрибковыми и/или антибактериальными свойствами такие, как пероксид водорода, диацетил или низин.

В заявке ЕР 0221499 описаны противогрибковые свойства Lactobacillus casei ssp. rhamnosus NRRL-B-15972. Когда эту бактерию культивируют на агаровой среде с добавкой огуречного сока, она способна полностью ингибировать рост Chaetomium olivacium и, частично, рост Aspergillus terreus и Verticillium sp. Зато в этих условиях она не оказывает никакого воздействия на рост Penicillium oxalicum; однако ингибирующее воздействие на этот микроорганизм наблюдали с культурами этой бактерии на огуречном соке при рН порядка 3,7.

В заявке ЕР 0576780 описаны противогрибковые воздействия Lactobacillus casei ssp. rhamnosus LC-705. Культуры этой бактерии, полученные в среде на основе молочной сыворотки, в которую добавлены гидролизат казеина и экстракт дрожжей, могут ингибировать рост Penicillium, Cladosporium, Fusarium и Candida.

В заявке РСТ WO 97/36603 описаны противогрибковые воздействия Lactobacillus casei ssp. Casei № 94/49432. Культуры этой бактерии, полученные на синтетической среде с добавкой экстракта дрожжей, обладают противогрибковым действием на Alternaria, Chaetomtum, Cladosporium, Colletotrichum, Cunninghamella, Dothiorella, Geotrichum, Phoma и Phomopsis.

В заявке ЕР 1308506 описаны противогрибковые и антибактериальные воздействия комбинации Propionibacterium jensenil с некоторыми штаммами Lactobacillus casei ssp. paracasei.

В настоящее время авторы изобретения констатировали, что бактерии вида Lactobacillus casei ssp. Paracasei обладают противогрибковой активностью, в частности, в отношении плесеней рода Penicillium, когда их используют изолированно, то есть без объединения с другими противогрибковыми бактериями, в частности, с Propionibacterium jensenil.

Эта противогрибковая активность обладает следующими характеристиками.

Она не проявляется, когда L. casei культивируют на синтетической среде, но появляется, когда L. casei культивируют на молоке, или среде на основе молока, начиная с 5 часов культивирования. Она становится максимальной после 24-48 часов ферментации.

Она чувствительна к рН. Она исчезает при рН ниже 4, но, тем не менее, вновь появляется, если рН поднимается выше 4.

Равным образом, она чувствительна к нагреванию. Она исчезает после термообработки в течение 1 минуты при 60°С.

С другой стороны, она не связана ни с продуцированием органических кислот, таких как сорбиновая, пропионовая или бензойная кислоты (которые известны из-за их противогрибковой активности), ни с продуцированием пероксида водорода, так как эти вещества не детектируются в культурах L. casei ssp. paracasei, обладающих противогрибковыми свойствами.

Объектом настоящего изобретения является применение бактерии вида L. casei ssp. paracasei для придания противогрибковых свойств ферментированному молочному продукту.

В частности, объектом настоящего изобретения является способ ингибирования развития плесени класса аскомицетов (Ascomycetes), в частности, рода Penicillium, в ферментированном молочном продукте, отличающийся тем, что он включает ферментацию молочного субстрата в присутствии бактерии вида L. casei ssp. paracasei в течение времени, достаточного для появления в субстрате противогрибковой активности. Эта противогрибковая активность имеет следствием ингибирование развития указанной плесени в случае загрязнения указанного продукта этой плесенью после ферментации.

Преимущественно, количество указанной бактерии вида L. casei ssp. paracasei, используемое для обсеменения молочного субстрата для указанной ферментации, составляет по меньшей мере 10⁶, предпочтительно, по меньшей мере, 10⁷, более предпочтительно, находится в диапазоне от 10⁷ до 10⁸ КОЕ (u.f.c.) на грамм молочного субстрата.

Согласно предпочтительному варианту осуществления способа согласно изобретению, ферментацию указанного субстрата осуществляют в течение по меньшей мере 5 часов, предпочтительно, в течение по меньшей мере 15 часов, более предпочтительно, в течение 24-48 часов. Чтобы получить противогрибковую активность, используя короткие времена ферментации, предпочтительно использовать относительно значительное количество L. casei ssp. paracasei; например, чтобы наблюдать противогрибковую активность после 5 часов ферментации молочного субстрата, обсеменение должно быть осуществлено из расчета по меньшей мере 10⁷ КОЕ на грамм молочного субстрата.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления способа согласно изобретению, он включает, если необходимо, доведение рН ферментируемого субстрата до величины больше 4, предпочтительно, находящейся в интервале от 4 до 6,5.

Предпочтительно, указанная бактерия вида L. casei ssp. paracasei представляет собой бактерию штамма CNCM I-1518. Этот штамм описан, в частности, в европейской заявке ЕР 0794707; она была подана, согласно положениям Будапештского договора, 30 декабря 1994 г. в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) (Национальную коллекцию культур микроорганизмов), 25 улица Рыжего Доктора (Docteur Roux) в Париже.

Настоящее изобретение будет лучше понято при помощи дополнения к описанию, следующего ниже, которое ссылается на примеры, иллюстрирующие противогрибковую активность штамма L. casei ssp. paracasei.

ПРИМЕР 1. ВЫЯВЛЕНИЕ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ В ПРИСУТСТВИИ L. CASEI SSP. PARACASEI

Ферментированный молочный продукт, содержащий L. casei ssp. paracasei (Actimel®, содержащий штамм CNCM I-1518 в комбинации с S. thermophilus и L. bulgaricus) и ферметированный молочный продукт, содержащий S. thermophilus и L. bulgaricus (контрольный образец), были инокулированы 6 грибковыми видами из расчета 10² спор:

Mucor circinelloides (2 тестируемых штамма); Mucor plumbeus; Penicillium expansum; Penicillium roqueforti; Penicillium brevicompactum.

Эти виды являются типичными представителями загрязнений, обычно встречающихся на свежих молочных продуктах.

Затем продукты инкубировали при 10°С и изучали все 7 дней на предмет появления талломов грибкового роста.

На обоих продуктах наблюдали значительное развитие видов Mucor, начиная с 14 дней в случае Actimel®, и начиная с 7 дней в случае контрольного продукта. Зато наблюдали предельно слабый рост (агрегаты) или отсутствие видимого роста Penicillium на Actimel® после 40 дней инкубирования, тогда как наблюдали поражение поверхности контрольного продукта только через 14 дней.

Во второй серии экспериментов противогрибковую активность штамма CNCM I-1518 оценивали по методике, происходящей из методики антибиограмм. Она заключается в смешивании тестируемого продукта с агаром (80% продукта + 20% раствора агара с концентрацией 15 г/л) и выливании смеси в чашку Петри.

На затвердевшую среду помещали 3 диска из стерильной бумаги, на которые наносили 100 спор тестируемой плесени (P. expansum. LMSA 00083).

Чашки Петри инкубировали при 25°С и при 10°С. Регулярно измеряли диаметр грибкового таллома.

Были протестированы следующие продукты:

Actimel®, молочная смесь Actimel® с S. thermophilus и L. bulgaricus без штамма CNCM I-1518; молочная смесь Actimel® без S. thermophilus и L. bulgaricus, ферментированная в течение 24 часов в присутствии штамма CNCM I-1518.

Результаты двух опытов для каждого из тестируемых условий проиллюстрированы в таблице I, следующей ниже.

ТАБЛИЦА I
	Диаметр таллома после	Диаметр таллома (мм)	Диаметр таллома(мм)
	инкубирования (мм)	после 17 дней при 10°С	после 24 дней при 10°С
	Опыт 1	Опыт 2	Опыт 1	Опыт 2	Опыт 1	Опыт 2
	8 дней при 25°С	7 дней при 25°С
Actimel®	17,6±4,4	19,2±4,8	9,6±0,5	10±0,9	10,9±0,8	12,9±1,8
(стандартный)
(коммерческий)
Actimel®	>65	>65	>65	>65	>65	>65
Без L.casei
Молочная смесь
Actimel® фер-
ментированная
24 ч с L.casei	9,4±1	8,8±1	11,4±1	15,1±1,2	14,1±0,9	17,2±1,2
в отсутствие
S. thermophilus и
L. bulgaricus

Оба продукта, содержащих штамм CNCM I-1518 (Actimel®, и молочная смесь Actimel®, ферментированная 24 ч с L.casei в отсутствие S. thermophilus и L. bulgaricus), проявляют противогрибковую активность в противоположность продукту, который его не содержит (молочная смесь Actimel® без L.casei).

ПРИМЕР 2. КИНЕТИКА ПОЯВЛЕНИЯ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИВО ВРЕМЯ ФЕРМЕНТАЦИИ В ПРИСУТСТВИИ L. CASEI SSP. PARACASEI

Тесты на противогрибковую активность осуществляли на смеси (Mix), представляющей собой снятое молоко, в которое добавлено 2% глюкозы и 6% молочных белков (обычные белки снятого молока), обсемененное 10⁷ КОЕ/мл (cfu/ml) штамма CNCM I-1518 в лиофилизированной форме. Образцы смеси отбирали до и после инокулирования штаммом CNCM I-1518, затем после 15 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч ферментации.

Перед тестами на противогрибковую активность отобранные и замороженные образцы облучали дозой 10 кГр для того, чтобы блокировать развитие бактерий с целью избежать их развития и метаболизма во время испытания. Тестируемые образцы предварительно размораживали и доводили рН образцов до 6,2 (рН исходной смеси). Испытания осуществляли, как описано выше, в примере 1.

Результаты этих тестов (измерение диаметра таллома) иллюстрируются таблицей II, следующей ниже. Надписи «Таллом на диске» и «Агрегаты» относятся к следам грибкового роста, наблюдаемым только на диске.

ТАБЛИЦА II
Тест 7 дней при 25°С
Необсемененная смесь	Смесь + L. casei
Т₀	Т 15 ч	Т 24 ч	Т 48 ч	Т 72 ч
36,8 мм±10,2	22,5 мм±3,1	19,3 мм±2,7	Агрегаты	Агрегаты	Агрегаты

Тест 19 дней при 10°С
Необсемененная смесь	Смесь + L. casei
Т₀	Т 15 ч	Т 24 ч	Т 48 ч	Т 72 ч
48,5 мм±1,9	13,8 мм±3,3	Таллом на диске	Агрегаты	Агрегаты	Агрегаты

Эти испытания показывают раннее появление противогрибковой активности, которая, кажется, иногда слабо присутствует с момента инокуляции, но четко появляется только начиная с 15 ч ферментации и становится максимальной между 24 ч и 48 ч. Эта активность всегда присутствует после 48 ч и даже 72 ч при условии, что рН будет больше 4.

ПРИМЕР 3. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТИ К рН

Тесты на противогрибковую активность осуществляли в тех же самых условиях, что в примере 2, приведенном выше, но без регулирования рН перед тестами.

Результаты иллюстрируются таблицей III, следующей ниже.

ТАБЛИЦА III
	Необсемененная смесь	Смесь + L. casei
	Т₀	Т 15 ч	Т 24 ч	Т 48 ч	Т 72 ч
рН	6,32	6,01	5,63	4,8	3,94	3,75
	33,2 ± 2,5	12,8±1,3	Агрегаты	Агрегаты	34,3±11,4	25,2±2,1

Эти результаты показывают, что противогрибковая активность ухудшается, когда рН становится меньше 4.

Однако это ухудшение кажется обратимо, так как противогрибковая активность восстанавливается, если рН довести до величины больше 4.

ПРИМЕР 4. ВЛИЯНИЕ СРЕДЫ ФЕРМЕНТАЦИИ НА ПРОТИВОГРИБКОВУЮ АКТИВНОСТЬ

Чтобы определить, связана ли противогрибковая активность со средой культивирования, были проведены испытания, используя в качестве среды культивирования, с одной стороны, молочную смесь, описанную в примере 2, и, с другой стороны, синтетическую среду следующего состава: пептон 10 г/л; экстракт мяса 10 г/л; экстракт дрожжей 5 г/л; дикалийфосфат 2 г/л; цитрат аммония 2 г/л; сульфат магния 0,1 г/л; сульфат марганца 0,05 г/л; глюкоза 20 г/л; твин 80: 1 мл; деионизированная вода: количество, достаточное для 1 л. Эти среды обсеменяли 10⁷ КОЕ/мл штамма CNCM I-1518 в лиофилизированной форме. После 24 и 48 часов культивирования противогрибковую активность определяли, как описано в примере 2, в течение 7 дней при 25°С и 20 дней при 10°С.

Когда культивирование осуществляли на молочной смеси, наблюдали полное ингибирование грибкового роста, какова бы ни была температура тестирования. Зато никакого ингибирования не наблюдали, когда культивирование осуществляли на синтетической среде, и это при эквивалентной бактериальной популяции.

1. Применение бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518 для придания противогрибковых свойств ферментированному молочному продукту.

2. Способ ингибирования развития плесени класса аскомицетов (Ascomycetes) в ферментированном молочном продукте, отличающийся тем, что он включает ферментацию молочного субстрата в присутствии бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518 в течение времени, составляющего по меньшей мере 5 ч, для появления в субстрате противогрибковой активности.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что количество указанных бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518, используемое для обсеменения молочного субстрата для указанной ферментации, составляет по меньшей мере 10⁶КОЕ на грамм молочного субстрата.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что количество указанных бактерий штамма L. casei ssp. paracasei CNCM I-1518, используемое для обсеменения молочного субстрата для указанной ферментации, составляет по меньшей мере 10⁷КОЕ на грамм молочного субстрата.

5. Способ по п.2, отличающийся тем, что он включает, если необходимо, доведение рН ферментируемого субстрата до величины больше 4.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанная плесень класса аскомицетов принадлежит к роду Penicillium.

Группа изобретений относится к области микробиологии и биотехнологии. Предложены штаммы Lactobacillus crispatus ВКМ B-2727D, Lactobacillus gasseri BKM B-2728D и Lactobacillus plantarum ВКМ В-2731D, обладающие антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Штамм escherichia coli - продуцент гидролазы эфиров альфа-аминокислот из xanthomonas rubrilineans и способ микробиологического синтеза гидролазы эфиров альфа-аминокислот на основе этого штамма // 2502797

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения гидролазы эфиров альфа-аминокислот путем биосинтеза рекомбинантными бактериями. Для осуществления способа сконструирован рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-11271 - продуцент гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, полученный путем трансформации штамма-реципиента Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 1, содержащей ген aehR гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, не модифицированный на 5′-конце последовательностью, кодирующей полигистидиновый «хвост», и находящийся под контролем промотора Т7, а также ген устойчивости к канамицину Kan.

Стимулятор роста yersinia pseudotuberculosis // 2502796

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к применению экзометаболитов морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum. Экзометаболиты, выделенные из морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum путем экстракции этилацетатом культуральной жидкости, получаемой в процессе выращивания морской микроводоросли Phaeodactylum tricornutum с последующим удалением растворителя из этилацетатного экстракта и сушкой этилацетатного экстракта до постоянного веса, применяются в качестве стимулятора роста Yersinia pseudotuberculosis.

Способ определения адгезивных свойств бактерий рода enterococcus с помощью клеточной линии сасо-2 // 2501861

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается способа определения адгезивных свойств бактерий рода Enterococcus. Представленный способ включает подготовку бактериальной суспензии, отделение полученной биомассы бактерий центрифугированием, разведение полученной биомассы в физиологическом растворе, подготовку монослоя клеток СаСо-2, внесение бактериальной культуры, культивирование клеток, промывку физраствором, снятие монослоя с бактериальными клетками и подсчитывание количества связанных с 1000 клетками СаСо-2 бактериальных клеток, при этом бактерии относят к высокоадгезивным, если количество связавшихся клеток составляет от 1010 до 3000, к среднеадгезивным - от 210 до 1000, к низкоадгезивным - от 0 до 200.

Штамм bacillus licheniformis, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к salmonella typhi, staphyloccus aureus, listeria monocytogenes и резистентностью к стрептомицину и налидиксовой кислоте // 2501851

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к штамму Bacillus licheniformis BKM B-2712D. Штамм Bacillus licheniformis обладает антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к антибиотикам: стрептомицину и налидиксовой кислоте.

Штамм lactobacillus paracasei subspecies paracasei, обладающий антимикробными и иммуномодулирующими свойствами, и пищевой продукт на его основе // 2501850

Изобретение относится к штамму Lactobacillus paracasei subspecies paracasei, обладающему антимикробными и иммуномодулирующими свойствами, и к продукту, содержащему указанный штамм. Штамм депонирован в CNCM под номером I-3689.

Штамм bacillus licheniformis вкм b-2713d, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к salmonella typhi, staphyloccus aureus, listeria monocytogenes и резистентностью к стрептомицину и налидиксовой кислоте // 2501849

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в ветеринарии. Штамм Bacillus licheniformis BKM B-2713D обладает выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes.

Способ очистки водного раствора, содержащего соль меди, от ионов меди // 2501745

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ очистки водного раствора, содержащего соль меди, от ионов меди.

Питательная композиция, способствующая здоровому развитию и росту // 2501553

Изобретение относится к области фармацевтики и представляет собой питательную композицию для младенца или ребенка, содержащую липид или жир; источник белка; источник полиненасыщенных жирных кислот с длинной цепью, который содержит докозагексаеновую кислоту; до 2,5 вес.% источника дополнительного кальция, причем по меньшей мере 20% источника дополнительного кальция представляет собой глюконат кальция, и от 0,015 до 0,1 миллионных долей (пг/мкг) ТРФ-β.

Иммуномодулирующие экстракты из бактерий lactobacillus и способы их получения и применения // 2500412

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к экстракту одного или более бактериальных штаммов Lactobacillus. Экстракт одного или более бактериальных штаммов Lactobacillus, представляющий собой растворимый экстракт, где экстракт содержит химически модифицированные бактериальные молекулы, полученные в результате воздействия щелочной среды на один или более бактериальных штаммов Lactobacillus, экстракт полезен в лечении заболеваний, связанных с дисбалансом продукции противовоспалительных цитокинов.

Улучшение роста бифидобактерий в ферментированных молочных продуктах // 2499041

Изобретение относится к получению ферментированного молочного продукта. Способ получения ферментированного продукта включает инокулирование молока бактериями, ферментацию молока и упаковывание готового продукта.

Способ выращивания ацидофильных кисломолочных микроорганизмов // 2497946

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве пищевых и кормовых добавок для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний.

Способ получения нежирного йогурта // 2490917

Изобретение относится к молочной промышленности. .

Изолированный штамм микроорганизма lactobacillus plantarum inducia dsm 21379 в качестве пробиотика, усиливающего врожденный иммунитет организма, продукт и композиция, содержащие упомянутый микроорганизм, и применение упомянутого микроорганизма для изготовления лекарственного средства, которое усиливает клеточный иммунитет // 2486234

Изобретение относится к штамму бактерий Lactobacillus plantarum Inducia DSM 21379, используемого в качестве пробиотика. .

Капсула, содержащая питательные ингредиенты и способ доставки питательной жидкости из капсулы // 2483586

Изобретение относится к доставке питательных жидкостей, таких как молоко для детей, из капсулы. .

Йогурт с низким содержанием сахара // 2478295

Способ производства йогурта с синбиотическими свойствами // 2478294

Изобретение относится к молочной промышленности, в частности к производству кисломолочных продуктов функционального назначения. .

Изолированный штамм микроорганизма lactobacillus plantarum tensia dsm 21380 как противомикробный и гипотензивный пробиотик, продукт питания и композиция, содержащая упомянутый микроорганизм, и применение упомянутого микроорганизма для получения гипотензивного лекарственного средства, способ подавления патогенов и побочных лактобактерий в продукте питания // 2477750

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности и медицине. .

Штамм lactobacillus gallinarum, используемый для приготовления кисломолочных продуктов // 2477312

Изобретение относится к биотехнологии и молочной промышленности. .

Консорциум пробиотических штаммов lactobacillus rhamnosus и lactobacillus plantarum для изготовления бактериального препарата и закваски прямого внесения для производства ферментированного молока и ферментированного свекольного сока // 2506308

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии. Предложен консорциум штаммов Lactobacillus rhamnosus ВКМ B-2726D и Lactobacillus plantarum ВКМ B-2725D. Консорциум применяют для изготовления бактериального препарата и закваски прямого внесения для производства ферментированного молока и ферментированного свекольного сока в качестве продуктов функционального питания. 15 табл., 13 пр.