Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка sus scrofa, используемый для вирусологических исследований



 


Владельцы патента RU 2506310:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (RU)

Изобретение относится к вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Целью изобретения является получение штамма клеток синовиальной мембраны поросенка (СМП), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для вирусологических и диагностических исследований, обладающего чувствительностью к вирусам-возбудителям болезням свиней, таких как африканская и классическая чума, болезнь Ауески. Штамм клеток СПМ получен методом культивирования растущих тканевых эксплантатов синовиальной мембраны поросенка в питательной среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Культура клеток СМП чувствительна к вирусам классической чумы свиней, африканской чумы свиней, болезни Ауески и может быть использована для изучения вирусов, а также в диагностических исследованиях. Штамм СПМ хранится в коллекции клеточных культур Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии под №65 и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) за №81. 2 пр.

 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью изучения вирусов и использования в диагностических исследованиях.

Для первичной изоляции вирусов африканской чумы свиней (АЧС), классической чумы свиней (КЧС), болезни Ауески (БА) и ряда других используются клетки гемопоэтической системы свиней, так как они являются естесственно-пермиссивными клеточными системами для их репродукции (1, 2, 3).

Эти культуры являются первичными, переживающими (не размножаются в культуре) и для их получения необходимо производить убой подсвинков для получения костной ткани или содержать доноров.

Целью изобретения является получение штамма клеток синовиальной мембраны поросенка (СМП), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для вирусологических и диагностических исследований, обладающего чувствительностью к вирусам - возбудителям болезней свиней, таких как африканская и классическая чума, болезнь Ауески.

Штамм клеток СПМ получен методом культивирования растущих тканевых эксплантатов в питательной среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS).

В качестве анатомического источника эксплантатов синовиальной мембраны были использованы карпальные суставы донора.

Исходная ткань гетерогенна в популяционном составе и включает клетки: макрофагальные синовиациты (А-клетки), фибробластические синовиациты (В-клетки) и промежуточные формы синовиацитов (С-клетки), а также тканевые макрофаги, фибробласты, плазматические клетки, тучные клетки и мононуклеарные клетки крови.

Для выделения и репродукции вируса африканской чумы свиней и производства диагностических препаратов в качестве клеточного субстрата используются культуры клеток костного мозга свиней (ККМС), лейкоцитов свиней (ЛС) и легочных альвеолярных макрофагов, которые является первичными, переживающими (не размножается в культуре) и для их получения необходимо производить убой подсвинков или содержать доноров. Преимуществом штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка Sus scrofa (СМП) является то, что они размножаются в культуре и не нужно производить убой животных. Клетки СМП можно криоконсервировать в жидком азоте и после размораживания они сохраняют свои основные биологические свойства, включая чувствительность к вирусам.

Штамм СМП характеризуется следующими признаками.

Культуралъные свойства. При посевной дозе - 150-200×103 клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 9-10 дней на стекле и до 30 дней на пластике. Коэффициент пересева - 1:2-1:3.

Штамм СМП культивируют в монослойных культурах в среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 2:1 при температуре 37°C. Урожай клеток с литрового матраса составляет 45-50 млн. клеток.

Для криоконсервирования при температуре минус 196°C применяют смесь, состоящую из 70% среды ДМЕМ, 20% FBS и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 6-8×106 в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 70-77%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 100 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 4, 5, 6 пассажа в ГНУ ВНИИВВиМ.

Морфологические признаки. Культура клеток представлена эпителиоподобными клетками средних размеров с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками.

Кариологическая характеристика. (n=38) диплоидный набор хромосом.

Видовая идентичность подтверждена видоспецифической ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Прививаемость изогенным животным отсутствует.

Контроль штамма СМП на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма СПМ на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам.

При изучении чувствительности культуры клеток СМП к вирусам используют культуры РК-15 и вирусы африканской чумы свиней (АЧС_, штамм 691/68, классической чумы свиней (КЧС), штамм ЛК-ВНИИВВиМ, болезни Ауески, штамм Бук-900. Накопление вирусных антигенов в клетках полученной культуры определяют методом прямой иммуноф люоресценции.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка Sus scrofa (СМП) депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) 07.07. 2011 г. за №81. Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример №1.

Выделенную синовиальную мембрану 3-х кратно промывают средой DMEM (pH 7,2-7,4) с добавлением комплекса антибиотиков (пенициллин/стрептомицин) и измельчают в чашке Петри на фрагменты размером не более 2 мм. Далее, полученные эксплантаты еще раз трехкратно промывают и переносят в культуральные флаконы с питательной средой DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крови телят и комплекс антибиотиков. Среду вносят небольшими количествами так, чтобы тканевые фрагменты не плавали в среде, а соприкасались с поверхностью матраса, но, в тоже время, и не подсыхали. Матрасы помещают в CO2-инкубатор с автоматическим регулированием и контролем температуры (37,0±0,5°C), повышенным до 5% содержанием углекислого газа и относительной влажностью 90%. Дважды в неделю производят смену питательной среды.

Пример №2.

Для определения чувствительности культуры клеток к вирусу болезни Ауески используют вакцинный штамм Бук 900 с инфекционной активностью 7,5 в перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15. Максимальное накопление вируса БА в новой культуре клеток устанавливают через 48 часов культивирования по ЦПД и методом прямой иммунофлуоресценции (титр составляет 7,5 и 7,5 соответственно).

Изучение чувствительности культуры клеток СМП к вирусу КЧС (штамм ЛК-ВНИИВВиМ) проводят в 3-5 последовательных пассажах. В качестве исходного инфекционного материала используют освеженный в 2-х пассажах в первичной культуре тестикул ягнят вирус с инфекционной активностью не ниже 5,5 . Инфекционную активность вируса КЧС каждого пассажа, выращенного в культуре СМП, определяют титрованием в перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15 методом прямой иммунофлуоресценции. Установлено, что культура клеток СМП без адаптации чувствительна к вирусу КЧС, накопление которого достигает 4,5-5,5

При оценке пермиссивности культуры клеток СМП к вирусу АЧС (штамм 691/68) максимальное накопление вируса отмечают через 96 часов культивирования и титр вируса составляет 4,0 . Наличие антигенсодержащих клеток определяют методом прямой иммунофлуоресценции.

При использовании перевиваемых линий клеток для наработки вирусного сырья и в диагностических исследованиях необходима адаптация вируса, особенно полевых изолятов, что влечет за собой изменение биологических свойств вируса. Штамм диплоидных клеток СМП является естественно пермиссивной системой и не требует адаптации вирусов.

Таким образом, штамм клеток СМП может быть использован в вирусологических исследованиях для изучения вирусов классической чумы свиней, африканской чумы свиней, болезни Ауески, а также в диагностических целях.

Источники информации.

1. Malmquist W.A., Hay D. Hemadsorption and cytopathic effect produced by african swine fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures // Amer. J. Vet. Res., 1960, v.21, 80, p.104-108.

2. Mulder W.A.M., Priem J., Pol J.M.A., Kimman T.G., et. al. Expression of the envelope glycoprotein El of classical swin fever viruse by pseudorabies virus vector strains does not affect the in vitro replication of these vector viruses in porcine peripheral blood mononuclear cells // Immun. of viral infections, Proceeding 3rd Congress of the European Society for Veterinary Virology Interlaken, Switzerland, 4-7 September, 1994, 1995, p.74-78.

3. Boynton W.H. Preliminary report on the propagation of hog cholera virus in vitro // Vet. Med., 1946, (41), p.346-347.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны поросенка Sus scrofa (СМП) депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) за №81, используемый для вирусологических исследований.



 

Похожие патенты:
Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и описывает способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп, включающий получение иммунных кроличьих сывороток с последующей их сенсибилизацией на полимерный носитель в виде микросфер для обнаружения клеток штаммов L.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения антител к Mycobacterium leprae. Способ включает выявление в сыворотках крови антител к Mycobacterium leprae с помощью иммуноферментного метода.
Изобретение относится к области лабораторных исследований и может быть использовано для оценки эффективности лечения хронического тонзиллита. Способ оценки эффективности терапии хронического тонзиллита включает микробиологическое исследование содержимого лакун небных миндалин с определением видов микроорганизмов и их концентрации, которое осуществляют на 5-7 сутки от начала лечения и при наличии в составе слизистой микрофлоры микроорганизмов S.
Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способам получения R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). .

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.
Изобретение относится к урологии и может быть использовано, в частности, для определения роли микроорганизмов в развитии инфекционных заболеваний урогенитальной сферы.
Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных.
Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса болезни Ньюкасла. .
Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано при производстве сыворотки для диагностики сибирской язвы.
Изобретение относится к области медицины, иммунологии и биотехнологии и касается способа диагностики клещевого риккетсиоза. .
Изобретение относится к области клеточной технологии, биотехнологии, пищевой промышленности. Предложен способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов, где в качестве культивируемых клеток используют иммортализованные миобласты животного, клетки выращивают с использованием питательной среды с белками неживотного происхождения, а также содержащей гемоглобин, при этом клетки поддерживают в пролиферативном состоянии с помощью факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов для образования биомассы, а затем вызывают дифференцировку миобластов в миоциты путем удаления из среды факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов, а в случае нормальных по экспрессии миостатина клеток в среду добавляют ингибитор миостатина.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии. Описан способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего, экспрессирующих поверхностные маркеры c-kit, и/или sca-1, и/или MDR1, в ходе которого выделяют образцы ткани миокарда, измельчают их, обрабатывают коллагеназой и трипсином, проводят культивирование на культуральной чашке с покрытием из фибронектина методом эксплантной культуры измельченных образцов с последующей иммуноселекцией.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения биотрансплантата для роговицы. Способ получения биотрансплантата для роговицы, включающий нанесение на матрицу, представляющую собой полимерную пленку из немодифицированной наноструктурированной гиалуроновой кислоты, клеток роговицы, в качестве которых используют аутогенную смешанную культуру клеток с содержанием эпителиальных прогениторов роговицы и роговичных фибробластов, взятых в определенном соотношении с последующим культивированием на среде, содержащей культуральную концентрацию антибиотиков.
Изобретение относится к медицине, андрологии, репродуктологии, ветеринарии. Предложены среда и способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, где сперматозоиды из нативной или размороженной спермы, полученные путем центрифугирования эякулята в градиенте плотности или отобранные в результате флотации, переносятся в среду для иммобилизации с пониженным осмотическим давлением 100-170 мОсм/кг на время от 1 мин до 2 часов при составе газовой среды от 0,1 до 8% углекислого газа и температуре среды от 0 до 39°C.

Изобретение относится к области фармацевтики и биологии и представляет собой способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.

Представленная группа изобретений относится к области биотехнологии и касается новых нуклеотидных последовательностей вируса Torque teno (TTV) и векторов, содержащих такие последовательности.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена композиция, применяемая для клеточной терапии.

Изобретение относится к области биотехнологии, биологии и медицины. Предложена клеточная линия huFSHIK - продуцент рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), секретируемого в культуральную жидкость.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению вакцин против рака, и может быть использовано в медицине. Выделенный пептид, обладающий способностью индуцировать цитотоксический Т-лимфоцит (ЦТЛ) в присутствии антигенпрезентирующей клетки, несущей HLA-A*2402, используют для получения антигенпрезентирующих клеток и соответственно ЦТЛ.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Предложен способ получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Т-лимфоцитов центральной памяти, и может быть использовано в медицине. Получают популяцию клеток, имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Тcm) и не индуцирующих GVHD против третьей стороны, в которой по меньшей мере 50% клеток имеет сигнатуру CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45 RO+. Изобретение позволяет получить популяцию индуцирующих толерантность клеток, которые способны к хоумингу в лимфоузлы после трансплантации. 2 н. и 13 з.п. ф-лы, 13 ил., 9 пр.
Наверх