Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка ovis aries, используемый для вирусологических исследований

Авторы патента:

G01N33/569 - микроорганизмов, например протозоа, бактерий, вирусов

C12N5/077 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2507255:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (RU)

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых антигенных препаратов. Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для научно-исследовательской и диагностической работы, обладающего пермиссивностью к лентивирусам мелких жвачных, пригодный для научно-исследовательской работы и конструирования новых антигенных препаратов. Штамм диплоидных клеток СМЯ получен методом культивирования растущих тканевых эксплантантов в питательной среде ДМЕМ с 10% фетальной сыворотки крови телят (FBS). Штамм клеток СМЯ чувствительна к лентивирусам мелких жвачных (вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК) и вирусу висна-маеди (ВВМ)). Штамм клеток СМЯ хранится в коллекции клеточных культур Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии под №64 и депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко под №82. 1 пр.

Изобретение относится к вирусологии и биотехнологии, в частности к культивированию клеток с целью изучения вирусов и конструирования новых иммунобиологических препаратов.

Лентивирусы мелких жвачных (ЛМЖ) репродуцируются в перевиваемых культурах клеток эпендимы и сосудистого сплетения головного мозга овец, в астроцитах человека, африканской зеленой мартышки (Vero), в первичной культуре клеток легкого, селезенки, брюшины, сердца, мозжечка, семенников, надпочечников, почках овцы, синовиальной мембране козленка (СМК).

Сообщается о получении первичной культуры клеток синовиальной мембраны овцы и трансформации субкультуры (вторичной культуры) вирусом SV-40 и приводятся данные о морфологический, кариологических характеристиках данных культур и их чувствительности к вирусам висна-маеди и артрита-энцефалита мелких жвачных. Однако данных по установлению штамма, его криоконсервации и депонировании нет [4].

Известно, что продуктивная репликация ВАЭК связана с запуском механизма клеточного апоптоза. Данный факт является аргументом в пользу малопригодности перевиваемых линий клеток в качестве лабораторной модели, поскольку трансформация, происходящая в процессе адаптации клеток к условиям in vitro во многом изменяет генетический аппарат клеток, становящихся фактически бессмертными. Непригодность перевиваемых культур клеток для культивирования ЛМЖ также подтверждается данными об ограниченном типе репликации вируса в клетке, при котором происходит интеграция провирусной ДНК в геном клетки-хозяина, но стадии синтеза и сборки вирусных белков блокируются защитными механизмами клетки. В данном случае возможна персистенция вируса в форме интегрированного генома, но при отсутствии продуктивной инфекции с формированием полноценных вирусных частиц.

Для получения первичных культур клеток необходимо содержать доноров, производить убой ягнят, что приводит к материальным, временным затратам. Кроме того, у данных культур отсутствует стандартность, и существует высокая возможность контаминирования эндогенными вирусами [1, 2, 3].

Целью изобретения является получение штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка, пермиссивной к лентивирусам мелких жвачных (вирусу артрита-энцефалита коз (ВАЭК) и вирусу висна-маеди (ВВМ)), пригодный для вирусологических исследований и конструирования новых антигенных препаратов.

Для получения штамма диплоидных клеток СМЯ применяют метод выращивания тканевых эксплантатов. После убоя животного в асептических условиях отбирали карпальные и путовые суставы, удаляют кожный покров и обрабатывают 96% спиртом в течение 15-30 секунд. Изолированную синовиальную мембрану переносили в чашку Петри с питательной средой ДМЕМ, содержащей 2% фетальной сыворотки крови телят и антибиотики (бензилненициллина натриевую соль 150 ЕД/мл и гентамицин 100 мкг/мл), механически измельчают с помощью ножниц на тканевые фрагменты до величины 1-2 мм, затем трижды отмывали средой того же состава.

Эксплантаты помещают в культуральные флаконы с питательной средой ДМЕМ, содержащей 10% фетальной сыворотки крови телят и комплексом антибиотиков, и инкубировали в атмосфере с повышенным до 5% CO₂ при 37±0,5°C с относительной влажностью воздуха 90%. Дважды в неделю проводят смену питательной среды.

Определение пермиссивности СМЯ к лентивирусам мелких жвачных (ЛМЖ). Культуру клеток, выращенную на покровных стеклах в пробирках, заражают ВАЭК штаммом - 75G-63 и ВВМ штаммом М-88 путем контакта вируса в течение 2 ч с монослоем клеток в дозе 0,1-0,01 ТЦД/кл.

Штамм культуры диплоидных клеток СМЯ характеризуется следующими признаками.

Кулътуцальные свойства. При коэффициенте пересева 1:2-1:3 монослой формируется на 3-5 сутки и сохраняется без смены среды на стекле в течение 8-9 дней, на пластике - до 3-х недель.

Штамм клеток культивируют в среде ДМЕМ, содержащей 10%

фетальной сыворотки крови телят, рН 7,2-7,4.

Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 2:1, подогретую до 37°С. Урожай клеток с литрового матраса составляет 50-55 млн.

Штамм культуры диплоидных клеток СМЯ сохраняет свои морфологические свойства на протяжении 30 пассажей.

Для криоконсервирования при температуре минус 196°С применяют смесь, состоящую из 70% среды ДМЕМ, 20% сыворотки крови телят, 10% диметилсульфоксида при концентрации клеток 10-15 ×10 в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 36-45%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 10 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 3, 4, 5-го пассажей в ГНУ ВНИИВВиМ (регистрационный №64).

Морфологические признаки. Фибробластоподобные клетки средних размеров с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками.

Кариологическая характеристика штамма: (n=54) соответствует диплоидному набору хромосом.

Видовая идентичность подтверждена молекулярно-генетическим (ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией) методом.

Контроль штамма клеток СМЯ на посторонние контаминанты. При обследовании штамма клеток СМЯ на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам. Для определения чувствительности культуры клеток к лентивирусам мелких жвачных используют штамм М-8 8 вируса висна-маеди с инфекционной активностью 3,5 lgТЦД_50/см ³ в перевиваемой линии клеток почки ягненка (ПЯ), штамм 75G-63 вируса артрита-энцефалита коз с инфекционной активностью 5,0 lgТЦД_50/см ³ в сублинии клеток синовиальной мембране козленка (СМК). Максимальное накопление вируса в новой культуре клеток устанавливают через 3-4 суток культивирования по ЦПД. Титр составляет 5,5 lgТЦД_50/см ³ и 5,5 lg ТЦД_50/см ³соответственно).

Чувствительность полученного штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ) к вирусу висна-маеди (штамм М-88) на 2 lg ТЦД_50/см ³ и вирусу артрита-энцефалита коз (штамм 75G-63) на 0,5 lgТЦД_50/см ³ выше, чем в перевиваемой линии клеток почки ягненка (ПЯ) и сублинии клеток синовиальной мембране козленка (СМК) соответственно.

Штамм диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries СМЯ депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) 07.07. 2011 г.под №82.

Штамм клеток СМЯ может быть использован в качестве клеточного субстрата для применения в вирусологических исследованиях и для конструирования новых антигенных препаратов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример №1.

Культуру клеток СМЯ с 90%-м монослоем, не отличающуюся по морфологическим признакам от исходной популяции, использовали для получения вирусных антигенов Клетки культивировали в пластиковых матрасах, объемом 0,5 л. Заражение проводили путем контакта 2-3 см вируссодержащей культуральной жидкости (штамм 75G-63 вируса АЭК и штамм М-88 вируса ВМ) с инфекционной активностью 10^5,0 lgТЦД_50/см ³ с монослоем клеточной культуры в течение 1,5-2 часов при 37±0,5°С. Затем добавляли поддерживающую среду ДМЕМ с 2% FBS. Культуру клеток СМЯ культивировали до проявления характерного ЦПД. После этого проводили 3-кратное замораживание и оттаивание вируссодержащего материала и культуральную жидкость подвергали низкоскоростному центрифугированию (600 g) для осаждения клеточного детрита. Супернатант ультрацентрифугировали при 140 тыс. g в течение 4 ч. Полученный осадок растворяли буферным раствором в 50 раз меньше исходного объема. Полученные антигены использовали для анализа полипептидного состава методом электрофореза в полиакриламидном геле, иммуноблотинга, РДП.

Для получения гипериммунных сывороток вируссодержащий материал (штамм М-88 вируса ВМ с титром 10^5,0ТЦД_50/см ³) вводили ягнятам 2-3-месячного возраста в объеме 1-2 см³ интратрахеально и 2-3 см³интрапульмонально каждые 3 дня в течение месяца. Для получения сыворотки отбор крови проводили каждые 7 дней и исследовали их активность в ИФА (набор фирмы ID Vet, Франция). При этом титр антител составил 1:80-1:160. Максимальный титр антител в ИФА получен на 14 сутки.

В отличие от перевиваемых и первичных культур клеток, используемых для изучения и репродукции вирусов - возбудителей медленных инфекций (висна-маеди, артрита- энцефалита коз) монослой штамма диплоидных клеток синовиальной мембраны ягненка Ovis aries (СМЯ) сохраняется до трех недель, что целесообразно при работе с исследуемыми патогенами, особенно полевыми изолятами вирусов с низким титром активности.

Источники информации

1. Инфекционная патология животных: в 2Т / Под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. - М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. - 1911 с.

2. Сидельников Г.Д., Биологические свойства вируса артрита-энцефалита коз: Дис.… канд. вет.наук 16.00.03 / Георгий Дмитриевич Сидельников - Покров, 2009. - 117 с.

3. Сюрин, В.Н. Частная ветеринарная вирусология / В.Н. Сюрин, Н.Ф. Фомина.- М.: Колос, 1979. - 472 с.

4. Establishment and partial characterization of an ovine synovial membrane cell line obtained by transformation with Simian Virus 40 Т antigen / U.M. Costa, D. Reischak, J. da Silva, A.P. Ravazzolo // Journal of Virological Methods. - 2005. - Vol.128, Issues 1-2. - P. 72-78.

Изобретение относится к вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Целью изобретения является получение штамма клеток синовиальной мембраны поросенка (СМП), стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для вирусологических и диагностических исследований, обладающего чувствительностью к вирусам-возбудителям болезням свиней, таких как африканская и классическая чума, болезнь Ауески.

Способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления legionella pneumophila 1,3 и 6 серогрупп (варианты) // 2505819

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и описывает способ конструирования полимерного иммуноглобулинового диагностикума для выявления Legionella pneumophila 1, 3 и 6 серогрупп, включающий получение иммунных кроличьих сывороток с последующей их сенсибилизацией на полимерный носитель в виде микросфер для обнаружения клеток штаммов L.

Способ определения антител к mycobacterium leprae // 2500423

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу определения антител к Mycobacterium leprae. Способ включает выявление в сыворотках крови антител к Mycobacterium leprae с помощью иммуноферментного метода.

Способ оценки эффективности лечения хронического тонзиллита // 2495435

Изобретение относится к области лабораторных исследований и может быть использовано для оценки эффективности лечения хронического тонзиллита. Способ оценки эффективности терапии хронического тонзиллита включает микробиологическое исследование содержимого лакун небных миндалин с определением видов микроорганизмов и их концентрации, которое осуществляют на 5-7 сутки от начала лечения и при наличии в составе слизистой микрофлоры микроорганизмов S.

Способ изготовления r-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) // 2491553

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к способам получения R-бруцеллезного эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). .

Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета // 2488117

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и касается иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Способ определения способности к персистенции staphylococcus aureus // 2487929

Изобретение относится к урологии и может быть использовано, в частности, для определения роли микроорганизмов в развитии инфекционных заболеваний урогенитальной сферы.

Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе // 2484481

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных.

Штамм вируса болезни ньюкасла для использования при серодиагностике болезни ньюкасла в ртга // 2482184

Изобретение относится к области вирусологии и касается штамма вируса болезни Ньюкасла. .

Способ получения сыворотки для диагностики сибирской язвы и диагностический набор // 2478647

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к ветеринарной микробиологии, и может быть использовано при производстве сыворотки для диагностики сибирской язвы.

Способы получения волосяных микрофолликулов и de novo сосочков и их применение для in vitro тестов и in vivo имплантаций // 2507254

Группа изобретений относится к области дерматолгии, в частности к способу получения волосяного микрофолликула и de novo сосочка, а также кожных эквивалентов, имплантатов и трансплантатов на их основе.

Т-клетки центральной памяти против третьей стороны, способы их получения и их применение в трансплантации и лечении заболеваний // 2506311

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению популяции Т-лимфоцитов центральной памяти, и может быть использовано в медицине. Получают популяцию клеток, имеющих фенотип Т-лимфоцитов центральной памяти (Тcm) и не индуцирующих GVHD против третьей стороны, в которой по меньшей мере 50% клеток имеет сигнатуру CD8+, CD62L+, CD45RA-, CD45 RO+.

Способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов для пищевых целей // 2506309

Изобретение относится к области клеточной технологии, биотехнологии, пищевой промышленности. Предложен способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов, где в качестве культивируемых клеток используют иммортализованные миобласты животного, клетки выращивают с использованием питательной среды с белками неживотного происхождения, а также содержащей гемоглобин, при этом клетки поддерживают в пролиферативном состоянии с помощью факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов для образования биомассы, а затем вызывают дифференцировку миобластов в миоциты путем удаления из среды факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов, а в случае нормальных по экспрессии миостатина клеток в среду добавляют ингибитор миостатина.

Способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего из образцов миокарда // 2505602

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии. Описан способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего, экспрессирующих поверхностные маркеры c-kit, и/или sca-1, и/или MDR1, в ходе которого выделяют образцы ткани миокарда, измельчают их, обрабатывают коллагеназой и трипсином, проводят культивирование на культуральной чашке с покрытием из фибронектина методом эксплантной культуры измельченных образцов с последующей иммуноселекцией.

Способ получения биотрансплантата для роговицы // 2505303

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения биотрансплантата для роговицы. Способ получения биотрансплантата для роговицы, включающий нанесение на матрицу, представляющую собой полимерную пленку из немодифицированной наноструктурированной гиалуроновой кислоты, клеток роговицы, в качестве которых используют аутогенную смешанную культуру клеток с содержанием эпителиальных прогениторов роговицы и роговичных фибробластов, взятых в определенном соотношении с последующим культивированием на среде, содержащей культуральную концентрацию антибиотиков.

Способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных // 2504581

Изобретение относится к медицине, андрологии, репродуктологии, ветеринарии. Предложены среда и способ витальной иммобилизации сперматозоидов человека и животных, где сперматозоиды из нативной или размороженной спермы, полученные путем центрифугирования эякулята в градиенте плотности или отобранные в результате флотации, переносятся в среду для иммобилизации с пониженным осмотическим давлением 100-170 мОсм/кг на время от 1 мин до 2 часов при составе газовой среды от 0,1 до 8% углекислого газа и температуре среды от 0 до 39°C.

Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи // 2502999

Изобретение относится к области фармацевтики и биологии и представляет собой способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, включающий забор биоптата кожи на глубину 2 мм, гомогенизацию ткани в 0,9% водном растворе хлорида натрия при температуре +23…+25°C, извлечение гомогената, фильтрование гомогената через инертную фильтровальную перегородку с диаметром пор 20 мкм, центрифугирование гомогената при 400 g в течение 5 минут при температуре +23…+25°C.

Выделенная полинуклеотидная молекула, кодирующая вирус torque teno, молекула рнк и вектор экспрессии // 2502801

Представленная группа изобретений относится к области биотехнологии и касается новых нуклеотидных последовательностей вируса Torque teno (TTV) и векторов, содержащих такие последовательности.

Способ перепрограммирования соматических клеток // 2502799

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена композиция, применяемая для клеточной терапии.

Рекомбинантная плазмидная днк pci-ub-polyepi, содержащая эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов для колоректального рака, и способ ее применения для стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа против клеток колоректального рака // 2507265

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к созданию рекомбинантных плазмид, обеспечивающих экспрессию полиэпитопных опухоль-ассоциированных антигенов в дендритных клетках, способных стимулировать специфические цитотоксические клетки, и может быть использовано в медицине. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCI-UB-POLYEPI содержит 11 эпитопов опухоль-ассоциированных антигенов колоректального рака, имеет размер 6 355 п.н. и экспрессирует следующую аминокислотную последовательность: DYKDDDDK-LLGVGTFVV-ADRIW-GLKAGVIAV-AAYARY-VLAFGLLLA-ADRIW-YQLDPKFITSI-AAYARY-IMIGVLVGV-ADRIW-YLSGADLNL-AAYARY-CGIQNSVSA-AAYARY-LLLLTVLTV-ADRIW-QYIKANSKFIGITEL-ANIY-SIINFEKL-ARY-SASFDGWATVSVIAL-ARY-SERVRTYWIIIELKHKARE-ARY-IQNDTGFYTLHVIKSDLVNEE. Сконструированной плазмидной ДНК pCI-UB-POLYEPI трансфицируют зрелые дендритные клетки, полученные добавлением к незрелым дендритным клеткам провоспалительного цитокина ФНО-α, таким образом активируя их. Затем активированные дендритные клетки культивируют совместно с мононуклеарными клетками периферической крови больных колоректальным раком для генерации антиген-специфических противоопухолевых цитотоксических клеток. Изобретение позволяет эффективно генерировать антигенспецифические цитотоксические клетки с противоопухолевой активностью in vitro, необходимые для иммунного ответа по T-хелпер 1 типу на антигены колоректального рака. 2 н.п .ф-лы, 1 ил., 4 пр.