Способ использования рибонуклеазы bacillus intermedius



Способ использования рибонуклеазы bacillus intermedius
Способ использования рибонуклеазы bacillus intermedius
Способ использования рибонуклеазы bacillus intermedius

 


Владельцы патента RU 2509801:

Ильинская Ольга Николаевна (RU)
Куриненко Борис Михайлович (RU)
Алексеева Ирина Ивановна (RU)

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Способ предусматривает использование рибонуклеазы бактериальной 7P для увеличения эффективности подавления размножения РНК- и ДНК-содержащих вирусов для лечения острых вирусных заболеваний млекопитающих и теплокровных животных. Преимущества заявляемой РНКазы заключаются в том, что подавление размножения вирусов РНКазой Bacillus intermedius достигается при использовании существенно более низких доз вводимых в инфицированный организм ферментов с повышенной эффективностью подавления размножения вирусов и лечебного процесса. 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 7 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Может быть использовано для подавления размножения вирусов, лечения млекопитающих и теплокровных - человека и животных - от заболеваний, вызываемых РНК и ДНК-содержащими вирусами.

Рибонуклеазы (РНКазы) - ферменты метаболизма РНК, функции которых заключаются в расщеплении мРНК, превращении предшественников РНК в зрелые формы, образовании малых регуляторных РНК, деградации определенных типов РНК, в том числе вирусной РНК.

Известно [1] использование препарата с коммерческим названием «Эндоглюкин», состоящего из фермента - эндонуклеазы (бактериальной), продуцируемой бактериями Serratia marcescens - в смеси с полисахаридом полиглюкином. Недостатком [1] является существенная ограниченность области применения препарата - только для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей. Для достижения других целей аналог неприменим. Кроме того, эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens неустойчива в кислой среде и теряет активность, что также ограничивает область применения.

Известно [2] использование эндонуклеазы бактерии Serratia marcescens в качестве противовирусного препарата для оздоровления картофеля от вирусной инфекции при микроклональном размножении и создании трансгенных форм картофеля. Недостатком [2] является существенная ограниченность области применения препарата - только для профилактики и лечения вирусных заболеваний картофеля.

Общим недостатком аналогов [1] и [2] является то, что средство «Эндоглюкин» и эндонуклеаза Serratia marcescens не пригодны в качестве средства, подавляющего размножение вирусов человека и животных.

Известны результаты исследования рибонуклеазы Actynomices rimosus как возможного средства подавления развития вирусов человека и животных in vitro (в пробирке) [3]. Недостатком аналога [3] является то, что рибонуклеаза Actynomices rimosus не пригодна в качестве средства, способного подавлять размножение вирусов в организме животных.

Наиболее близким по существу заявляемого изобретения, прототипом, является способ подавления размножения вирусов человека и животных путем использования получаемого из поджелудочной железы крупного рогатого скота фермента - панкреатической РНКазы (далее по тексту - РНКаза ПЖ) [4].

Недостатком прототипа [4] является необходимость применения (для получения удовлетворительного результата) очень высокой разовой дозы вводимого в организм фермента. Так, при оценке противовирусной эффективности на новорожденных кроликах противовирусный эффект достигают при дозе фермента 135…200 мг/кг (10 мг/кролик; кролик весом 50…70 г). На мышах эффективная доза равна 250 мг/кг (5 мг/мышь; мышь весом 20 г). Для человека весом 60…70 кг для однократного результативного введения потребуется 10…15 г фермента на одну дозу, Общим недостатком применения прототипа [4] к различным теплокровным живым существам является обязательная для получения положительного результата (подавления размножения вирусов человека и животных) потребность использования удельно-высоких доз фермента (дозы на единицу массы подопытного объекта). Высокие дозы вводимого в организм фермента - чужеродного белка - приводят к нежелательным иммунологическим осложнениям (в организме). К осложнениям, существенным для сохранения здоровья и даже жизнеспособности организма, подвергающегося воздействию чужеродного белка.

Целью предполагаемого изобретения является повышение эффективности подавления размножения вирусов в инфицированном организме, снижение удельного количества и концентрации фермента, требуемых для подавления размножения вирусов, повышение результативности процесса подавления размножения вирусов, повышение лечебного эффекта.

Цели достигают тем, что для увеличения эффективности подавления размножения вирусов в инфицированном организме для лечения вирусных заболеваний используют бактериальный фермент - РНКазу Bacillus intermedius, биназу (далее по тексту - РНКаза Bi). Bacillus intermedius как вид на основе анализа 16S РНК по современной классификации относят к Bacillus pumilus (Gen Bank Accession № HQ 650161.1). Используют структурно идентичную РНКазе исходного штамма Bacillus intermedius 7P рибонуклеазу иных штаммов Bacillus intermedius и штаммов иных микроорганизмов. Термин «иные штаммы» означает селекционированные (клонированные) и инженерные штаммы.

Фермент, являющийся объектом изобретения, представляет собой, например, продукт жизнедеятельности известной бактерии Bacillus intermedius, гуанилспецифичную РНКазу с молекулярной массой 12,3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pl=9,5. РНКаза Bacillus intermedius получена из культуральной жидкости Bacillus intermedius, например - штамма 7P, продуцента внеклеточной щелочной РНКазы [4].

Противовирусную активность заявляемой РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) оценивают общеизвестными способами [6], например in vitro, и путем внутрибрюшинной и/или внутримышечной инъекции оцениваемых препаратов в организм животного. Примером наиболее часто применяемых для указанной цели (оценки действия исследуемого препарата) животных и/или их тканей являются морские свинки, свиньи, цыплята кур, мыши.

Заявляемое изобретение иллюстрируют примеры его применения в отношении наиболее типичных вирусов, например для воздействия на вирусы ящура (далее по тексту ВЯ), вируса болезни Ауэски (далее по тексту ВБА) и различных штаммов вируса гриппа. Приведенные примеры не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Противовирусная активность заявляемой РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) при заражении культуры клеток перевиваемых почек эмбрионов свиней (далее по тексту ППЭС) in vitro (в пробирке) РНК-содержащим вирусом ящура (далее по тексту ВЯ)

Оценку противовирусной активности РНКазы Bi и РНКазы ПЖ in vitro проводят следующим образом. Монослой 48-часовой культуры клеток ППЭС в пенициллиновых флаконах предварительно промывают раствором Хенкса, после чего заражают 0,1 мл суспензии ВЯ. Сразу же после заражения в одну часть флаконов с промытым монослоем клеток ППЭС добавляют разведенную средой роста РНКазу ПЖ (прототип), в другую часть флаконов - заявляемую РНКазу Bi. Флаконы оставляют в термостате при плюс 37°C на 1,0-1,5 часа и адсорбируют вирус испытуемыми клетками. После инкубации монослой клеток во флаконах с адсорбированным вирусом промывают раствором Хенкса. Раствор Хенкса после промывки инфицированного монослоя клеток сливают в сосуд сбора заразного материала для последующего уничтожения. Затем в эти же флаконы с монослоем, отмытым от не адсорбированного вируса, добавляют, например, в количестве 2 мл среду роста с соответствующими ферментами - РНКазой ПЖ или РНКазой Bi. Флаконы с монослоем вновь помещают в термостат при +37°. О размножении вируса судят по появлению цитопатогенного эффекта, который оценивают крестами от 1 до 4-х [5, 6]. Исследуемые клетки разрушают, например, путем замораживания и последующего оттаивания. Материал из опытных и контрольных флаконов после замораживания и оттаивания титруют [5, 6]. На каждые разведения берут по 4 пенициллиновых флакона. Результаты учитывают через 48 часов при заражении ВЯ и выражают в ТЦД50 (тканевая цитопатическая доза, вызывающая разрушение 50% монослоя инфицированных клеток, рассчитываемых по Риду и Менчу)[5, 6]. В таблицах числовые значения ТЦД50 выражают в значениях десятичного логарифма (рассчитанных по Риду и Менчу числовых значений ТЦД50), Таблица 1.

Таблица 1
Противовирусная активность РНКазы Bi (заявляемой) и РНКазы ПЖ (прототип) в культуре клеток ППЭС, инфицированных вирусом ящура (ВЯ). ТЦД50 - тканевая цитопатическая доза, вызывающая разрушение 50% монослоя инфицированных клеток
Фермент, вирус Доза фермента,
ед/мл(мг/мл)
Конечный титр ВЯ Ig ТЦД50
РНКаза Bi + вирус 100 ТЦД50 60000 ед (0,08 мг/мл) 2,1±0,24; Р<0,01
РНКаза Bi 60000 ед (0,08 мг/мл) -
РНКаза ПЖ + вирус 100 ТЦД50 175000 ед (0,58 мг/мл) 6,7±0,32; Р<0,15
РНКаза ПЖ 175000 ед (0,58 мг/мл) -
Вирус (контроль) - 7,5±0,0

РНКаза Bi конечный титр вируса ящура снижает до значения Ig ТЦД50=2,1, РНКаза ПЖ - до значения Ig ТЦД50=6,7 (снижение титра вируса РНКазой Bi от значений контроля составляет 5,4 Ig, РНКазой ПЖ - 0,8 Ig). Эффективность подавления размножения ВЯ РНКазой Bi без учета различий в дозах по активности и содержанию белка в три раза больше по сравнению с РНКазой ПЖ (6,7:2,1=3). Используемая доза заявляемой РНКазы Bi (60000 ед/мл или 0,08 мг/мл) в три раза меньше дозы прототипа РНКазы ПЖ (175000 ед/мл или 0,58 мг/мл) по активности (175000 ед : 60000 ед = 3) и в семь раз - по содержанию белка (0,58 мг : 0,08 мг = 7). Эффективность подавления размножения ВЯ РНКазой Bi по сравнению с РНКазой ПЖ с учетом различий в используемых дозах по активности выше в 9 раз (175000 ед : 60000 ед)×3=9, по белку - выше в 21 раз (0,58 мг : 0,08 мг)×3=21.

Пример 2. Противовирусная активность заявляемой РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) при заражении культуры клеток перевиваемых почек эмбрионов свиней (далее по тексту ППЭС) in vitro (в пробирке) ДНК-содержащим вирусом болезни Ауэски (далее по тексту ВБА)

Оценку противовирусной активности РНКазы Bi и РНКазы ПЖ in vitro проводят следующим образом. Монослой 48-часовой культуры клеток ППЭС в пенициллиновых флаконах предварительно промывают раствором Хенкса, после чего заражают 0,1 мл суспензии ВБА. Далее выполняют действия, описанные в Примере 1. Результаты учитывают через 72 и 96 часов при заражении ВБА и выражают в ТЦД50, рассчитываемых по Риду и Менчу [5, 6]. В таблицах числовые значения ТЦД50 выражают в значениях десятичного логарифма (этих числовых значений ТЦД50, рассчитанных по Риду и Менчу), Таблица 2.

Таблица 2
Противовирусная активность РНКазы Bi (заявляемой) и РНКазы ПЖ (прототип) в культуре клеток ППЭС, инфицированных вирусом болезни Ауэски (ВБА).
ТЦД50 - тканевая цитопатическая доза, вызывающая разрушение 50% монослоя инфицированных клеток.
Фермент, вирус Доза фермента ед/мл(мг/мл) Конечный титр ВБА Ig ТЦД50*
РНКаза Bi + вирус 100 ТЦД50 60000 ед (или 0,08 мг/мл) 2,00±029
Р<0,01
РНКаза Bi 60000 ед (0.08 мг/мл) -
РНКаза ПЖ + вирус 100 ТЦД50 175000 ед (0,58 мг/мл) 3,46±0,11
Р<0,01
РНКаза ПЖ 175000 ед (0,58 мг/мл) -
Вирус (контроль) - 5,25±0,23

РНКаза Bi снижает конечный титр ВБА до значения Ig ТЦД50 = 2,0, РНКаза ПЖ - до значения Ig ТЦД50 = 3,46 (снижение титра вируса РНКазой Bi от значений контроля составляет 3,25 Ig, РНКазой ПЖ - 0,8 Ig). Эффективность подавления размножения ВБА РНКазой Bi без учета различий в дозах по активности и содержанию белка в четыре раза больше по сравнению с РНКазой ПЖ (3,25:0,80=4). Используемая доза заявляемой РНКазы Bi (60000 ед/мл или 0,08 мг/мл) в три раза меньше дозы прототипа РНКазы ПЖ (175000 ед/мл или 0,58 мг/мл) по активности (175000 ед : 60000 ед = 3) и в семь раз - по содержанию белка (0,58 мг : 0,08 мг = 7). Эффективность подавления размножения ВБА РНКазой Bi по сравнению с РНКазой ПЖ с учетом различий в используемых дозах по активности выше в 12 раз (175000 ед : 60000 ед)×4=12, по белку - выше в 28 раз (0,58 мг : 0,08 мг)×4=28.

Пример 3. Противовирусная активность заявляемой РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) при заражении мышей вирусом ящура

Работу с мышами выполняют по известной методике [5]. Оценку противовирусной активности на мышах проводят следующим образом. Берут десять групп белых беспородных мышей массой 18-20 г (в каждой группе по 10 животных), которым внутривенно вводят 100 ЛД50 (ЛД50 - летальная доза, вызывающая гибель 50% животных) ВЯ типа А22-50 ,адаптированного к этим животным. После заражения животным двух контрольных групп вводят изотонический раствор хлорида натрия, одной группе внутримышечно, другой - внутрибрюшинно.

Четырем группам инфицированных животных вводят заявляемую РНКазу Bi. Двум из них вводят фермент в дозе 15000 ед или 0,02 мг / 1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй - внутримышечно. Двум оставшимся группам (мышей) вводят РНКазу Bi в дозе 17500 ед или 0,023 мг/1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй - внутримышечно.

Четырем группам инфицированных животных вводят РНКазу ПЖ (прототип). Двум из них (групп) вводят фермент в дозе 60000 ед или 0,2 мг / 1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй - внутримышечно. Двум оставшимся группам вводят РНКазу ПЖ в дозе 112000 ед или 0,35 мг/1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй группе - внутримышечно

Сравниваемые РНКазы вводят после заражения дважды в сутки, в течение 5 суток. О противовирусном действии ферментов судят по выживаемости животных. Результаты выражают в процентах по отношению к общему числу животных в группе (Таблица 3).

Противовирусная активность РНКазы Bi в дозе 15000 ед или 0,02 мг/на 1,0 г массы мышей колеблется в зависимости от способа вводимого фермента от 25 до 50% выживших животных. Продолжительность жизни животных, которым вводили фермент, но которые не вошли в группу выживших, колеблется от 3-х до 6-ти суток в зависимости способа введения фермента.

Противовирусная активность РНКазы ПЖ в дозе 60000 ед или 0,2 мг / на 1,0 г массы мышей, по активности в 4,0 раза превышающая дозу РНКазы Bi (60000 ед : 15000 ед = 4), а по белку превышающая в 10 раз (0,2 мг : 0,02 мг = 10) при внутрибрюшинном и внутримышечном способе введения не приводит к выживанию животных.

При внутрибрюшинном введении РНКаза Bi в дозе 17500 ед или 0,023 мг / на 1 г массы мышей обеспечивает выживание 30% животных. РНКаза ПЖ при внутрибрюшинном введении 112000 ед или 0,35 мг / на 1 г массы не приводит к выживанию животных.

При внутримышечном введении РНКаза Bi в дозе 17500 ед или 0,023 мг / на 1 г массы обеспечивает выживание 50% инфицированных животных, РНКаза ПЖ (прототип) при внутримышечном введении 112000 ед или 0,35 мг / на 1 г массы обеспечивает выживание 20% животных. Эффективность противовирусного действия РНКазы Bi в отношении ВЯ без учета различий в дозах по активности и содержанию белка в два с половиной раза больше по сравнению с РНКазой ПЖ (50% : 20% = 2,5). Используемая доза заявляемой РНКазы Bi (17500 ед/мл или 0,023 мг/мл) в шесть раз меньше дозы прототипа РНКазы ПЖ (112000 ед/мл или 0,35 мг/мл) по активности (112000 ед : 17500 ед = 6) и в 15 раз меньше по содержанию белка (0,35 мг : 0,023 мг = 15). Эффективность противовирусного действия РНКазы Bi по сравнению с РНКазой ПЖ (прототип), с учетом различий в используемых дозах, по активности больше в 15 раз (112000 ед : 17500 ед)×2,5=15, по белку - больше в 37,5 раз (0,35 мг : 0,023 мг)×2,5=37,5.

Пример 4. Оценка противовирусной активности в отношении вируса ящура на кроликах с использованием РНКазы Bi иного (по отношению к штамму Bacillus intermedius 7P) штамма

Работу с кроликами выполняют по известной методике [5]. Оценку проводят следующим образом. Берут десять групп по 10 новорожденных 4-5 дневных кроликов - две группы контрольные, восемь других - опытные.

Животных одной контрольной группы и четырех опытных групп заражают подкожно лапинизированным (адаптированным к кроликам) ВЯ штамм «0» с титром инфицирующего вируса 5,5 1д ТЦД50 в 0,1 мл (исходный титр вируса на мышах-сосунках составляет 7,5 Ig ТЦД50 в 0,1 мл). Животным четырех опытных групп сразу после заражения вводят РНКазы. Двум группам животных РНКазу Bi в дозе 25000 ед или 0,033 мг / на 1,0 г массы кролика (одной группе внутрибрюшинно, другой - внутримышечно). Животным контрольной группы вместо фермента вводят изотонический раствор хлорида натрия.

В двух других группах животным вводят РНКазу ПЖ в дозе 100000 ед или 0,33 мг / на 1,0 г массы (в одной группе внутрибрюшинно, в другой - внутримышечно),

Животных второй контрольной группы и четырех опытных групп заражают подкожно лапинизированным (адаптированным к кроликам) ВЯ штаммом «0» с титром инфицирующего вируса 3,5 Ig в 0,1 мл. Животным четырех опытных групп сразу после заражения вирусом вводят РНКазы. Двум группам РНКазу Bi по 25000 ед или 0,033 мг/на 1,0 г массы (одной группе внутрибрюшинно, другой - внутримышечно). Двум другим группам вводят прототип - РНКазу ПЖ по 100000 ед или 0,33 мг / на 1,0 г массы (в одной группе внутрибрюшинно, в другой - внутримышечно).

РНКазы вводят 1 раз в сутки в течение 5-суточного периода наблюдения. Животным контрольной группы вместо фермента вводят изотонический раствор хлорида натрия. О противовирусном действии ферментов судят по выживаемости животных. Результаты выражают в процентах по отношению к общему числу животных в группе (Таблица 4).

Таблица 4
Противовирусная активность РНКазы Bi (заявляемой) и РНКазы ПЖ (прототип) при заражении новорожденных кроликов вирусом ящура.
В скобках () - время гибели контрольных животных, которым вводят изотонический раствор хлорида натрия вместо фермента. В контроле, инфицированные вирусом с титром 5,5 Ig в 0,1 мл животные погибли все (100%). Среди инфицированных вирусом с титром 3,5 Ig контрольных животных погибло 80%
Условия оценки противовирусной активности Титр инфицирующего вируса в Ig в 0,1 мл Метод введения фермента Время гибели животных, час Выживаемость, %
РНКаза Bi вирус + фермент 25000 ед (0,033 мг) на 1,0 г массы кроликов 5,5 внутрибрюшинный 48-50 (36) 30
внутримышечный 48-50 (36) 40
3,5 внутрибрюшинный 48-60 (48) 50
внутримышечный 48-60 (48) 60
РНКаза ПЖ вирус + фермент 100000 ед (0,33 мг) на 1,0 г массы кроликов 5,5 внутрибрюшинный 36 (36) 0
внутримышечный 36 (36) 0
3,5 внутрибрюшинный 48 (48) 20
внутримышечный 48 (48) 30

При инфицировании животных вирусом с титром 5,5 Ig в 0,1 мл противовирусная активность РНКазы Bi в дозе 25000 ед (или 0,033 мг/на 1,0 г массы) колеблется в зависимости от способа введения фермента в интервале 30-40% выживших животных. При этом инфицирующем титре вируса РНКаза ПЖ в дозе 100000 ед (или 0,33 мг/на 1 г массы), в 4 раза превышающей дозу РНКазы Bi по активности (100000 ед : 25000 ед = 4) и в 10 раз - по белку (0,33 мг : 0,033 мг = 10), при титре инфицирующего вируса 5,5 Ig в 0,1 мл, не приводит к выживанию животных.

При инфицировании животных вирусом с титром 3,5 Ig в 0,1 мл РНКаза Bi в дозе 25000 ед (или 0,033 мг / на 1,0 г массы) при внутрибрюшинном способе введения обеспечивает выживание 50% животных. При инфицирующем титре вируса 3,5 Ig в 0,1 мл РНКаза ПЖ при внутрибрюшинном введении в дозе 100000 ед (или 0,33 мг / на 1 г массы) в 4 раза превышающей дозу РНКазы Bi по активности (100000 ед : 25000 ед = 4) и в 10 раз по белку (0,33 мг : 0,033 мг = 10) при титре инфицирующего вируса 3,5 Ig в 0,1 мл обеспечивает выживание 20% животных. Противовирусная эффективность РНКазы Bi при внутрибрюшинном способе введения фермента без учета различий в используемых дозах ферментов выше противовирусной эффективности РНКазы ПЖ в 2,5 раза (50% : 20% = 2,5). С учетом различий в используемых дозах противовирусная эффективность РНКазы Bi при внутрибрюшинном способе введения выше противовирусной эффективности РНКазы ПЖ по активности в 10 раз (100000 ед : 25000 ед)×2,5=10, по количеству ферментного белка в 25 раз (0,33 мг : 0,033 мг)×2,5=25 При внутримышечном введении РНКаза Bi в дозе 25000 ед или 0,033 мг / на 1,0 г массы обеспечивает выживание 60% животных, РНКаза ПЖ, используемая в дозе 100000 ед или 0,33 мг / на 1 г массы, обеспечивает выживаемость 30% животных. Без учета различий в используемых дозах противовирусная эффективность РНКазы Bi выше противовирусной эффективности РНКазы ПЖ в 2,0 раза (60% : 30% = 2). С учетом различий в используемых дозах противовирусная эффективность РНКазы Bi выше противовирусной эффективности РНКазы ПЖ по активности в 8 раз (100000 ед : 25000 ед)×2=8, выше по белку в 20 раз (0,33 мг : 0,033 мг)×2=20.

Пример 5. Противовирусная активность заявляемой РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) при заражении мышей вирусом болезни Ауески (ВБА).

Работу с мышами выполняют по известной методике [5]. Оценку противовирусной активности на мышах проводят следующим образом. Берут десять групп белых беспородных мышей массой 18-20 г (в каждой группе по 10 животных), которым подкожно вводят 10 ЛД50 (ЛД50 - летальная доза, вызывающая гибель 50% животных) ВБА, патогенного для лабораторных животных. После заражения животным двух контрольных групп вводят изотонический раствор хлорида натрия, одной группе внутримышечно, другой - внутрибрюшинно.

Четырем группам инфицированных животных вводят заявляемую РНКазу Bi. Двум из них вводят фермент в дозе 17000 ед или 0,02 мг / 1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй - внутримышечно. Двум оставшимся группам мышей вводят РНКазу Bi в дозе 30000 ед или 0,035 мг / 1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй - внутримышечно.

Четырем группам инфицированных животных вводят РНКазу ПЖ (прототип). Двум группам вводят фермент в дозе 65000 ед или 0,2 мг/1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй - внутримышечно. Двум оставшимся группам вводят РНКазу ПЖ в дозе 107250 ед или 0,33 мг / 1,0 г массы мышей, одной группе внутрибрюшинно, второй группе - внутримышечно

Сравниваемые РНКазы вводят спустя 1,0 час после заражения животных в течении 10 суток. После десятого введения РНКазы животных наблюдают еще 20 суток. О противовирусном действии ферментов судят по выживаемости животных. Результаты выражают в процентах по отношению к общему числу животных в группе (Таблица 5).

Противовирусная активность РНКазы Bi в дозе 17000 ед или 0,02 мг / на 1,0 г массы мышей колеблется в зависимости от способа вводимого фермента от 10 до 30% выживших животных. Продолжительность жизни инфицированных животных, которым вводили фермент, но которые не вошли в группу выживших, колеблется от 5-ти до 8-ми суток в зависимости способа введения фермента.

Противовирусная активность РНКазы ПЖ в дозе 65000 ед или 0,2 мг / на 1,0 г массы мышей, по активности в 3,8 раза превышающая дозу РНКазы Bi (65000 ед : 17000 ед = 3,8), а по белку превышающая в 10 раз (0,2 мг : 0,02 мг = 10), при внутрибрюшинном и внутримышечном способе введения не приводит к выживанию животных.

При внутрибрюшинном введении РНКаза Bi в дозе 30000 ед или 0,035 мг / на 1 г массы мышей обеспечивает выживание 30% животных. РНКаза ПЖ при внутрибрюшинном введении 107250 ед или 0,33 мг / на 1 г массы не приводит к выживанию животных.

При внутримышечном введении РНКаза Bi в дозе 30000 ед или 0,035 мг / на 1 г массы, обеспечивает выживание 50% инфицированных животных, РНКаза ПЖ (прототип) при внутримышечном введении 107250 ед или 0,33 мг / на 1 г массы не приводит к выживанию животных.

Используемая доза заявляемой РНКазы Bi (30000 ед/мл или 0,035 мг/мл) в 3,6 раз меньше дозы прототипа РНКазы ПЖ (107250 ед/мл или 0,33 мг/мл) по активности (107250 ед : 30000 ед = 3,6) и в 9,4 раза меньше по содержанию белка (0,33 мг : 0,035 мг = 9,4). Противовирусное действие РНКазы Bi в отношении ВБА имеет четкую зависимость доза-эффект, тогда как РНКаза ПЖ (прототип) в исследованных концентрациях, значительно превышающих концентрации РНКазы Bi по активности и по белку, не приводит к выживанию животных, но увеличивает продолжительность их жизни, что свидетельствует о слабой противовирусной активности РНКазы ПЖ.

Таким образом, данные по противовирусному действию РНКазы Bi in vivo свидетельствуют о том, что РНКаза Bi обладает способностью подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов, например вируса болезни Ауески, что находится в соответствии с результатами in vitro (таблица 2).

Пример 6. Оценка противовирусной активности РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) при заражении вирусом гриппа куриных эмбрионов («in ovo»)

Оценку противогриппозной активности РНКаз «in ovo» проводят на 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах [5]. Препарат вводят по профилактической схеме, т.е. за 1 час до инокуляции вируса, и по лечебной схеме, т.е. через 1 час после инокуляции вируса. Инфицирующая доза вируса - 100 ЭИД/0,2 мл (ЭИД - эмбриональная инфекционная доза); ферменты вводят в дозе 150000 ед/эмбрион (Таблица 6).

Противовирусная активность сравниваемых рибонуклеаз (заявляемого и прототипа) оценивается в равных дозах по активности, но доза РНКазы ПЖ по белку равна 0,5 мг на эмбрион, а доза РНКазы Bi - 0,2 мг на эмбрион, т.е. доза РНКазы ПЖ по белку в 2,5 раза больше. Противовирусная активность РНКазы Bi и РНКазы ПЖ в отношении штаммов вируса гриппа A/PR/8/34, выраженная индексом защиты (ИЗ) независимо от схемы лечения для обоих ферментов, достоверно не различается и находится в диапазоне 67-71,2% выживших эмбрионов при заражающей дозе 100 ЭИД (Таблица 6).

Противовирусная эффективность РНКазы Bi и РНКазы ПЖ в отношении штаммов вируса гриппа А (Одесса) 2882/82 в равных дозах по активности и вводимых по профилактической схеме достоверно не различается - ИЗ равен 70,8-72%, ИЗ для лечебной схемы равен 76,0-77,7% (Таблица 6). С учетом различий в дозах вводимых ферментов по ферментому белку противовирусная эффективность РНКазы Bi в 2,5 раза выше эффективности РНКазы ПЖ (прототипа).

РНКаза Bi обладает эффективностью в отношении человеческого вируса гриппа типа В (Таблица 7).

Таблица 7
Противовирусная активность заявляемой РНКазы Bi в отношении вируса гриппа В (В/Ленинград/369/75) при заражении вирусом гриппа куриных эмбрионов «in ovo». Инфицирующая доза вируса - 1080 ЭИД50/0,2 мл (эмбриональных инфицирующих доз, вызывающих гибель 50% эмбрионов). - РНКаза Bi в дозе 0,5 мг/эмбрион
И3 - Индекс защиты рассчитывают по формуле: ИЗ=((Мс-Ме)/Мс)×100%, где
Мс и Ме - смертность в контрольной и опытной группе соответственно
Препарат Антивирусная активность, индекс защиты (И3)%
Количество эмбрионов Схема введения И3,%
РНКаза Bi 30 Профилактическая 65,1
29 Лечебная 67,3

Противовирусная активность РНКазы Bi в отношении вируса гриппа В при инфицирующей дозе вируса 1080 ЭИД50/0,2 мл независимо от способа лечения колеблется в диапазоне ИЗ 65-67%. Данные о влиянии РНКазы ПЖ на инфекцию, вызванную вирусом гриппа В, отсутствуют (не обнаружены).

Пример 7. Оценка противовирусной активности РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) при заражении вирусом гриппа мышей

Оценку противогриппозной активности на белых беспородных мышах [5] весом 16-18 г проводят следующим образом. Используют лечебно-профилактическую схему введения препарата внутримышечно, т.е. за 24 и 1 час до инфицирования, а также через 24, 48 и 72 часа после интраназального инфицирования животных под легким эфирным наркозом [5]. Разовая доза РНКаз - 750000 ед/кг. Инфицирующая доза вируса 5 ЛД50/0,05 мл (Таблица 8).

Таблица 8
Противогриппозная активность заявляемой РНКазы Bi и РНКазы ПЖ (прототип) при инфицировании белых мышей вирусом гриппа A/PR /8/34. ИЗ - Индекс защиты рассчитывают по формуле: ИЗ=((Мс-Ме)/Мс)×100%, где Мс и Me - смертность в контрольной и опытной группе соответственно
Препарат * Способ введения препаратов Разовая доза препарата в мг/кг Количество мышей в группе Эффективность лечения животных на 8-е сутки
Летальность, % ИЗ, %
Контроль (плацебо) Внутримышечно - 18 77,6 -
РНКаза Bi Внутримышечно 750000 ед (1,0 мг/кг) 16 25,0 67,7
РНКаза ПЖ Внутримышечно 750000 ед (2,5 мг/кг) 22 81,8 Неактивна

При лечении по лечебно-профилактической схеме РНКазой Bi мышей, инфицированных 5 ЛД50 вируса A/PR/8/34, дозой фермента 750000 ед или 1,0 мг/кг в течение 5 суток, индекс защиты равен 67,7%. РНКаза ПЖ в дозе 750000 ед или 2,5 мг/кг, используемая для лечения по той же схеме, противогриппозной активностью не обладала.

Приведенные примеры 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 проявления противовирусной эффективности рибонуклеаз наглядно свидетельствуют о том, что РНКаза Bi, с учетом различия в используемых дозировках ферментов и эффективности подавления размножения вирусов, активнее прототипа - РНКазы ПЖ (панкреатического фермента).

Например, эффективность подавления размножения вируса ящура (ВЯ) РНКазой Bi (заявляемый) по сравнению с РНКазой ПЖ (прототип) с учетом различий в конечных титрах вируса и различиях в дозах заявляемого фермента и прототипа в 9 раз выше по активности и в 21 раз по белку (Пример 1, Таблица 1).

Эффективность подавления размножения ВБА РНКазой Bi (заявляемый фермент) по сравнению с РНКазой ПЖ (прототип) с учетом различий в конечных титрах вируса и различиях в дозах заявляемого фермента и прототипа выше в 12 раз по активности и в 28 раз по белку (Пример 2, Таблица 2).

Заявляемая РНКаза Bi с учетом различий в количестве выживших животных и различий в используемых дозах ферментов эффективнее РНКазы ПЖ (прототип) предотвращает гибель инфицированных вирусом ящура мышей в 15 раз по активности и 37,5 раз по ферментному белку (Пример 3, Таблица 3).

Заявляемая РНКаза Bi иного (по отношению к штамму Bacillus intermedius 7P) штамма с учетом различий в количестве выживших животных и различий в используемых дозах ферментов эффективнее противовирусной эффективности РНКазы ПЖ (прототип) предотвращает гибель инфицированных вирусом ящура кроликов по активности в 8 раз, по белку в 20 раз (Пример 4, Таблица 4).

Заявляемая РНКаза Bi эффективнее РНКазы ПЖ в отношении ДНК-содержащего вируса болезни Ауески (ВБА). РНКаза Bi в 3,6 раз меньшей дозе по сравнению с прототипом РНКазой ПЖ по активности и в 9,4 раза меньшей по содержанию белка обладает противовирусной эффективностью в отношении ВБА и имеет четкую зависимость доза-эффект. РНКаза ПЖ (прототип) в исследованных концентрациях, значительно превышающих концентрации РНКазы Bi по активности и по белку, не приводит к выживанию животных, увеличивая только продолжительность их жизни (Пример 5, Таблица 5). Это свидетельствует о слабой противовирусной активности РНКазы ПЖ в отношении ДНК-содержащего вируса.

Противогриппозная эффективность РНКазы Bi и РНКазы ПЖ «in ovo» (при заражении вирусом гриппа А куриных эмбрионов), оцениваемая в равных дозах по активности, достоверно не различается. Однако доза вводимого в эмбрионы ферментного белка РНКазы Bi в два с половиной раза меньше. Противогриппозная эффективность РНКазы Bi, оцениваемая количеством ферментного белка, вводимого в эмбрионы, в 2,5 раза выше противовирусной эффективности РНКазы ПЖ (Пример 6, Таблица 6).

РНКаза Bi подавляет размножение не только вируса типа А, но и вируса типа В. Данные о способности РНКазы ПЖ подавлять размножение вируса типа В отсутствуют (Пример 6, Таблица 7).

При лечении РНКазой Bi мышей, инфицированных вирусом гриппа А, индекс защиты животных составил 67,7% (при летальности 25%). Панкреатическая РНКаза ПЖ в этой же дозе по активности (в 2,5 раза большей по ферментному белку) по индексу защиты не активна (летальность 81,8%) (Пример 7, Таблица 8).

Аналогичные результаты подавления размножения вирусов получены при использовании РНКазы другого штамма Bacillus intermedius, структурно идентичной РНКазе исходного штамма Bacillus intermedius 7P, описанного в вышеупомянутых примерах (пример 4).

Приведенные примеры предполагаемого изобретения показывают его полезность для медицины и ветеринарии. Преимущества заявляемой РНКазы (РНКазы Bacillus intermedius) no сравнению с прототипом (панкреатической РНКазой ПЖ) заключаются в следующем.

1. Подавление размножения вирусов РНКазой Bacillus intermedius достигается при использовании более низких доз фермента (для млекопитающих in vivo в 12,0-20,0 раз ниже по ферментативной активности, и в 20,0-37,5 раз ниже по ферментному белку), вводимых в инфицированный организм. Это позволяет уменьшить количество фермента, которое необходимо ввести в организм для достижения необходимого эффекта подавления размножения вирусов. Уменьшение количества вводимого в организм фермента уменьшает риск иммунных осложнений, вызываемых вводимым в организм чужеродным белком; кроме того, соответственно уменьшается риск стимуляции ферментом аллергенных свойств других веществ, попадающих в организм на фоне введения РНКазы. Эти факторы повышают результативность и эффективность лечебного процесса.

2. Производство бактериальной РНКазы Bacillus intermedius может функционировать стабильно, вне зависимости от наличия, местонахождения, сезона и загруженности мясокомбинатов, поставщиков сырья для производства прототипа - панкреатической РНКазы.

3. Производство заявляемой РНКазы Bacillus intermedius может быть размещено вне зависимости от расположения мясокомбинатов - поставщиков сырья для прототипа.

4. Применение РНКазы Bacillus intermedius для подавления размножения вирусов позволяет исключить дефицит РНКазы как лекарственного препарата, обеспечивает потребности медицины и ветеринарии в РНКазе - средстве для лечения вирусных инфекций.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как заявляемый способ использования РНКазы Bacillus intermedius для подавления размножения вирусов реализуется при существенно меньших по сравнению с прототипом дозах применения и подавляет размножение вирусов существенно действеннее аналогов и прототипа.

Способ использования РНКазы Bacillus intermedius для подавления размножения вирусов имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены способы использования других РНКаз для подавления размножения вирусов с такой же эффективностью, как заявляемый способ использования РНКазы Bacillus intermedius. Заявляемый способ позволяет значительно результативнее (от 2 до 37 раз по сравнению с аналогами и прототипом) подавлять размножение вирусов в инфицированных организмах млекопитающих и других теплокровных животных.

Заявляемый способ позволяет применять ранее не известное средство для подавления размножения как РНК-, так и ДНК-содержащих вирусов у инфицированных млекопитающих и теплокровных животных. Выявление такого средства подавления размножения вирусов расширяет в медицине и ветеринарии перечень лекарственных средств (по сравнению с перечнем известных средств) для профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями вирусного происхождения.

Заявляемый способ - безопасный, применяемые при выделении бактериальной рибонуклеазы Bacillus intermedius компоненты абсолютно безвредны для человека. Способ позволяет успешно лечить млекопитающих и теплокровных животных от широкого перечня болезней вирусной природы - биологических объектов, недоступных для прототипа и аналогов, то есть заявленное изобретение обладает расширенной (по сравнению с прототипом) областью применения. Приведенные результаты применения заявляемого способа подтверждают его новизну. Заявляемый способ является осуществимым с применением стандартных технических устройств и оборудования в промышленном производстве лечебных препаратов, в деятельности организаций здравоохранения, животноводства. Это соответствует предъявляемому к изобретениям критерию «промышленная применимость».

Предлагаемый способ полезен и необходим для применения специалистам из области медицины и ветеринарии, например для профилактики и лечения вирусных заболеваний людей и животных. Примеры применения предлагаемого изобретения показывают его полезность. Применение предлагаемого способа расширяет перечень средств, используемых в лечебных целях, например при борьбе с острыми вирусными инфекциями.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявляемый способ использования рибонуклеазы Bacillus intermedius имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве лекарственных препаратов, в деятельности организаций фармацевтической промышленности, здравоохранения, животноводства посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.

Источники информации

1. Детиненко Л.Д., Клименко В.П., Подгорный В.Ф. и др. Средство "Эндоглюкин" для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей. Описание изобретения к патенту RU 2038776, МПК 6 A01K 51/00. Приоритет от 22.01,1993. Опубликовано 09.07.1995.

2. Леонова Н.С. Применение бактериальной эндонуклеазы для оздоровления картофеля от вирусов. Леонова Н.С., Салганик Р.И. // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1991, №5. - С.25-28.

3. Баталина Т.А., Лихошвай Е.В., Пензикова Г.А. Исследование влияния рибонуклеазы Actynomyces rimosus на репродукцию некоторых вирусов // Антибиотики, 1977, т.22, №1, 25-28.

4. Лещинская И.Б. Нуклеодеполимеразы сапрофитных бактерий. - Казань: Изд-во Казанского университета, 1975, 180 с.

5. Штарке Г. Практическая вирусология. - М.: Колос, 1970. - С, 126-128.

6. Карышва А.Ф., Сюрин В.Н. Руководство по практической вирусологии (Справочное пособие). - Кишинев: Изд-во «Штиница», 1980. - 212 с.

1. Способ использования рибонуклеазы бактериальной для подавления размножения вирусов, заключающийся в том, что для увеличения эффективности подавления размножения РНК- и ДНК-содержащих вирусов в инфицированном организме, для лечения острых вирусных заболеваний млекопитающих и теплокровных животных используют бактериальный фермент РНКазу Bacillus intermedius 7P.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют структурно идентичную РНКазе исходного штамма Bacillus intermedius 7P рибонуклеазу иных штаммов Bacillus intermedius - селекционированных, клонированных и инженерных штаммов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 - продуцента фитазы. Рекомбинантный штамм получен путем трансформации штамма Yarrowia lipolytica Polf ATCC MYA-2613 и содержит ген фитазы PhyA Obesumbacterium proteus.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения гидролазы эфиров альфа-аминокислот путем биосинтеза рекомбинантными бактериями. Для осуществления способа сконструирован рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-11271 - продуцент гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, полученный путем трансформации штамма-реципиента Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 1, содержащей ген aehR гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, не модифицированный на 5′-конце последовательностью, кодирующей полигистидиновый «хвост», и находящийся под контролем промотора Т7, а также ген устойчивости к канамицину Kan.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам переработки шкур рыб для получения гиалуроновой кислоты и коллагена. Способ предусматривает следующее.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-11246 - продуцента гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915 и способа микробиологического синтеза такой гидролазы.
Проводят ферментацию питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом. Проводят ультрафильтрацию полученного фильтрата культуральной жидкости с активностью 4250±250 ИЕ/см3 через мембраны с отсечением 5 кДа.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и касается штамма бактерий Planomicrobium koreense 78k. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм бактерии Microbacterium testaceum 17В, депонированный под ВКПМ В-10628 во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика, являющийся продуцентом сайт-специфической эндонуклеазы MteI.

Изобретение относится к биотехнологии и фармакологии, в частности к способу получения препарата Фортелизин, обладающего фибринолитическими свойствами, и его применению для лечения инфаркта миокарда.
Изобретение относится к медицине, и в частности к препаратам для терапии опухолевых заболеваний, лечения аллергии, профилактики и общего оздоровления организма человека.

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к акушерству и гинекологии. Средство для лечения и профилактики субклинического, клинического, острого и хронического мастита у сельскохозяйственных и домашних животных, включает действующее вещество - трифенил-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксибензил)фосфоний бромид и фармацевтически приемлемый носитель - вазелин в соотношении 1:2000.
Изобретение относится к области медицинской вирусологии. Предложен вакцинный штамм вируса гриппа A/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), характеризующийся температурочувствительностью и высокой степенью холодоадаптированности.
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает иммунизацию ассоциированной инактивированной вакциной из равных частей вакцины против сальмонеллезного аборта из штамма бактерий Sal.

Настоящее изобретение в целом относится к области иммунологии, в частности к области укрепления иммунной системы в пожилом возрасте, и представляет собой композицию.
Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша. Для этого штаммы Bordetella pertussis выращивают на казеиново-угольном агаре с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды и устанавливают в полученной суспензии концентрацию микробных клеток 60-80 ME и рН 8,4±0,1.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой композицию для лечения ран, язв, эрозий, ожогов, обморожений, рубцов, а также инфекций, вызываемых грамположительными и грамотрицательными бактериями Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Shigella spp., Escherichia spp., Salmonella spp., Proteus spp., Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Klebsiella spp., Antracoides spp., Cryptococcus spp., патогенными грибами рода Microsporum, Trichophyton, Nocardia, Aspergillus, дрожжеподобными грибами рода Candida (в т.ч.

Изобретение относится к антибактериальному средству для лечения желудочно-кишечных заболеваний, преимущественно острых кишечных инфекций, в том числе неустановленной этиологии. Заявляемый препарат представляет собой смесь антибиотика и биологического компонента, где в качестве антибиотика используется хлорамфеникол, а в качестве биологического компонента комплекс иммуноглобулинов IgG(56-60):IgA(16-22):IgM(22-24) при следующем соотношении, мг/капсулу: хлорамфеникол - 300 мг, комплекс иммуноглобулинов IgG, IgA, IgM - 120 мг. Технический результат заключается в значительном сокращении сроков заболевания приматов острой кишечной инфекцией.
Изобретение относится к антибактериальному средству для лечения желудочно-кишечных заболеваний, преимущественно острых кишечных инфекций, в том числе неустановленной этиологии.

Изобретение относится к штамму Lactobacillus paracasei subspecies paracasei, обладающему антимикробными и иммуномодулирующими свойствами, и к продукту, содержащему указанный штамм. Штамм депонирован в CNCM под номером I-3689.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в медицине. Пептид структуры DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD используют для подавления аллергического воспаления дыхательных путей, в профилактике и лечении артрита, а также для ослабления боли.
Наверх