Способ определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови

Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови. Для этого проводят инкубацию выделенных лимфоцитов в присутствии фермента в инкубационной среде с последующей отмывкой клеток от фермента. Окрашивают моноклональными антителами, содержащими флуоресцентную метку, к соответствующим поверхностным детерминантам клеточных рецепторов и сравнивают с контролем, где клетки инкубируются в среде без содержания ферментов или в присутствии ингибиторов протеолитических ферментов. Экспрессию рецепторов на лимфоцитах определяют методом проточной цитометрии. Использование данного способа позволяет определять чувствительные к протеолизу рецепторы и количественно оценить активность ферментов и их ингибиторов. 3 пр., 1 табл.

 

Изобретение относится к области биохимии, а именно к способам определения действия протеиназ на внеклеточные домены белковых рецепторов, экспрессируемых на поверхности лимфоцитов. Данный способ может быть использован в энзимологии, фармакологии, клинической биохимии, как для скрининга, так и для количественной оценки активности протеолитических ферментов, действующих на белковые клеточные рецепторы.

Протеолитическое отщепление внеклеточной части мембранных белков с поверхности клеток, называемое протеолитическим шеддингом (слущиванием, сходом) или кливеджем (расщеплением) процесс достаточно распространенный и в его реализации участвуют различные типы ферментов, цинк-зависимые, сериновые и аспартил-зависимые протеиназы, так и внутриклеточные протеолитические ферменты клеток. Для разных мембранных антигенов продемонстрировано участие в шеддинге разных протеолитических ферментов.

Особо актуальным с позиции патологической физиологии является действие экзогенных протеиназ, в том числе, и образуемых различными микроорганизмами, на клеточные рецепторы экспрессируемые на иммунокомпетентных клетках. В результате протеолитической модификации поверхностных белков клеток образуются растворимые формы рецепторов, которые характеризуются отсутствием внутриклеточного и трансмембранного доменов и имеет меньшую молекулярную массу, чем мембранная форма. Присутствующие в ее составе внеклеточные домены, как правило, сохраняют свои функциональные возможности, что существенно для выполнения биологической роли, связанной с регуляцией иммунного ответа. Шеддинг чаще всего является следствием активационных процессов, затрагивающих различные популяции клеток.

Для выявления активности ферментов были разработаны различные методы. Однако, эти методы обеспечивают оценку протеолитической активности, не поддаются стандартизации и, работают по отношению к выделенным субстратам в искусственной модели. Наиболее перспективным из современных способов определения протеиназной активности является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса (1). Однако, метод иммуноферментного анализа протеазной активности, наиболее близкий к нашему изобретению, требует изготовления и сорбции на планшете бактериальных антигенов, применения специфических к используемому бактериальному антигену иммуноглобулинов и высокого расхода пула неспецифических иммуноглобулинов (1). С помощью иммуноферментного анализа, невозможно дифференцировать рецепторы, экспрессируемые на клетках и произвести количественный подсчет этих клеток.

В связи с этим цель заявленного изобретения разработка способа, позволяющего определять протеолитическую модификацию белковых рецепторов на лимфоцитах с применением моноклональных антител с флуоресцентной меткой к поверхностным детерминантам клеточных рецепторов на основе метода проточной цитометрии.

Поставленная цель достигается путем разработки способа детекции протеолитического кливедджа внеклеточных доменов поверхностных рецепторов, который предусматривает инкубацию выделенных клеток в присутствии фермента, отмывку клеток от фермента, окрашивание моноклональными антителами, содержащими флуоресцентную метку к соответствующим поверхностным детерминантам клеточных рецепторов и сравнение с контролем методом проточной цитометрии. В контроле клетки инкубируются в среде без содержания ферментов или в присутствии ингибиторов протеолитических ферментов.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения протеиназной активности ферментов в отношении поверхностных детерминант белковых рецепторов лимфоцитов, который характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью за счет флуоресцирующих антител и возможностью определять чувствительные к протеолизу рецепторы и количественно оценивать активность ферментов и ингибиторов.

Пример 1. Определение протеолиза рецепторов на донорских лимфоцитах человека при действии протеолитических ферментов супернатантов 16-ти часовой культуры золотистого стафилококка. Выделяли донорские лимфоциты человека из периферической крови методом изопакфикколовой сепарации. Инкубацию выделенных лимфоцитов проводили с супернатантом в разведении 1:2 с буферным раствором 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, при Т 36°С в течение 60±5 минут. После инкубации лимфоциты отмывали 2-кратно физиологическим раствором хлорида натрия и окрашивали набором моноклональных антител к поверхностным детерминантам лимфоцитарных рецепторов, используя наборы моноклональных антител 6-color TBNK BD Multitest или IMK lymphocyte Kit. В контроле проводили инкубацию этой же взвеси лимфоцитов со стерильной жидкой питательной средой при тех же условиях и составе буферной среды, что и в опыте. Экспрессию рецепторов на лимфоцитах опытных и контрольных проб определяли проточной цитометрией на анализаторе FACSCanto II. Полученные результаты приведены в таблице 1.

При инкубации лимфоцитов с протеолитически активными супернатантами штаммов S. aureus (эталонный и изолированые с кожи и слизистых) выявлено достоверное уменьшение экспрессии рецепторов относящихся к кластерам дифференцировки CD4, CD8, CD 16, по сравнению, с контролем и протеазонеактивными супернатанами (р<0,001 и р<0,0001) (таблица 1). Протеолитически активные супернатанты эталлоного штамма, изолятов кожи, слизистых носа и зева достоверно не изменяли экспрессию таких кластеров дифференцировки, как CD3 и CD19 на ДЛ (р>0,05), таблица 1.

Активность протеолитических ферментов супернатантов в отношении поверхностных клеточных рецепторов рассчитывают по формуле:

A=(Dk-D0)/tCr;

где:

А - активность фермента в усл. единицах,

Dk - % клеток позитивных по данному рецептору в контроле по данным цитометрии,

Do - % клеток позитивных по данному рецептору в опыте по данным цитометрии,

Т - время протеолиза, в мин

Cr - концентрация фермента или общего белка в анализируемом растворе.

Пример 2. Определение протеолиза рецепторов на донорских лимфоцитах человека раствором трипсина. Определение проводят аналогично примеру 1, но вместо супернатантов бактерий, используют 1×10-5 М раствора трипсина. Протеиназную активность трипсина в отношении лимфоцитарных рецепторов рассчитывают на количество трипсина, по формуле в примере 1.

Пример 3. Определение протеолиза рецепторов на донорских лимфоцитах человека раствором трипсина в присутствии различных концентраций ингибитора - (PMSF) проводили аналогично примеру 1, но наряду с раствором трипсина использовали, трипсин с различными концентрациями ингибитора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Тюрин Ю.А. Протеиназная активность микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях у детей. // Автореф. дисс. канд. мед. наук - Казань, 2003. - 21 с.

Таблица 1
Экспрессия кластеров дифференцировки CD3, CD4, CD19, CD8, CD16 на донорских лимфоцитах (ДЛ) после инкубации с супернатантами штаммов S. aureus
Супернатанты штаммов S. aureus Экспрессия кластеров дифференцировки на донорских лимфоцитах (ДЛ), %, М±m
CD3 CD19 CD4 CD8 CD16
Эталонный штамм АТСС 29213 (К+) 74,7±0,2 8,7±0,2 2,9±0,4*** 3,7±0,6◆◆◆ 5,4±0,3••
Изоляты носа №№30, 39, 38, 11, 37, 12, 10, 9, 32, 31, 36, n=11 74,4±0,15 8,41±0,1 2,06±0,7*** 6,4±0,9◆◆◆ 6,5±0,3••
Изоляты зева №№24, 23, 20, 26, 22, 8, 40, 42, 27, 41, 21, 25, n=12 74,5±0,24 8,3±0,13 3,07±0,8** 5,4±0,6◆◆◆ 6,5±0,5••
Изоляты кожи №№5, 34, 6, 35, 19, 33, 18, 7, 4, 2, 1, 3, n=12 74,6±0,23 8,1±0,09 1,02±0,2*** 0,6±0,06◆◆◆ 6,6±0,2••
протеазонеактивные изоляты, n=10, №№43, 44, 45, 13, 14, 15, 16, 17, 28, 29 74,6±0,32 8,2±0,1 13,7±0,16 36,5±0,2 9,1±0,13
Контроль (К-) 75,4±0,5 8,9±0,3 13,1±0,2 35,8±0,2 9,4±0,15
••• *** ◆◆◆ - Различия в средних значениях между группой эталлоный штамм, изоляты носа, зева и кожи и группой протеазонеактивных изолятов и контролем достоверны при р<0,0001
** •• - Различия в средних значениях между группой эталлоный штамм, изоляты носа, зева и кожи и группой протеазонеактивных изолятов и контролем достоверны при р<0,001

Способ определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови, отличающийся тем, что предусматривает инкубацию выделенных лимфоцитов в присутствии фермента в инкубационной среде, с последующей отмывкой клеток от фермента, окрашивание моноклональными антителами, содержащими флуоресцентную метку, к соответствующим поверхностным детерминантам клеточных рецепторов и сравнение с контролем методом проточной цитометрии, где клетки инкубируются в среде без содержания ферментов или в присутствии ингибиторов протеолитических ферментов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для прогнозирования туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью у впервые выявленных больных туберкулезом легких (ТБ).
Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано у больных гемобластозами для прогноза развития рецидива заболевания после проведения аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток (АТСКК).

Изобретение относится к медицине, а именно к детской гастроэнтерологии, и может быть использовано для прогноза эффективности интерферонотерапии гепатита С. .
Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, иммунологии, и может быть использовано для оценки эффективности антибактериальной терапии С. .

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно - к областям диагностической медицинской микробиологии, медицинской биохимии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка летального фактора сибирской язвы (LF) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.
Изобретение относится к области медицины, а именно к педиатрии, и может быть использовано для диагностики гнойно-септических заболеваний у новорожденных детей. .
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для прогнозирования замедленной консолидации костной ткани при внеочаговом остеосинтезе.

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, конкретно к областям диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем для иммунофлуоресцентного определения протективного антигена (ПА) возбудителя сибирской язвы в образцах биологического происхождения.
Изобретение относится к области биосенсорики и может быть использовано для изучения белков методом люминесценции. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253». Способ предусматривает обеззараживание и выделение РНК из вируссодержащего материала, постановку реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени» с использованием специфичных праймеров RV5-5'-GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3', RV6-5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3' и зонда RV7-5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2. Количественную оценку вируса определяют на основании регистрации сигнала флуоресценции исследуемого образца и сравнения его с сигналом флуоресценции ПЦР-стандартов, содержащих различные количества ДНК-мишеней. Предложенный способ позволяет определить количественное содержание вируса в рабическом антигене органо-тканевого и культурального происхождения. Использование изобретения способствует стандартизации этапа приготовления рабического антигена в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина. 2 табл., 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани. Для этого проводят окраску клеточного субстрата одновременно моноклональными антителами к антигену CD34 и нуклеотропным (ядерным) красителем Syto16, при этом подсчет клеток-предшественников (CD34+) осуществляют в пределах Syto16+ клеток. Использование данного способа позволяет количественно учесть всю популяцию CD34+CD45 клеток в пределах ядросодержащих Syto16+ без предварительного ограничения области анализа на основании экспрессии антигена CD45 и избежать занижения процента CD34+ клеток-предшественников. 1 пр., 2 ил.

Изобретение относится к медицине. При осуществлении способа через 3 ч после перорального введения препарата «Аласенс» в дозе 15 мг/кг массы тела получают трехканальное RGB флуоресцентное изображение зоны интереса. Оценивают долю участия красного канала в изображении опухоли. Оценивают значение Rcut=(R/(R+G+B))·100%, где Rcut - доля участия красного канала в изображении здоровой кожи, R, G и В - яркости красного, зеленого и синего каналов изображения здоровой кожи. Из полученного трехканального RGB флуоресцентного изображения формируют изображение в оттенках серого I(x,y). Для каждой точки изображения I(x,y) вычисляют отношение , где R(x,y), G(x,y), В(x,y) - яркости красного, зеленого и синего каналов RGB флуоресцентного изображения с координатами x, y. Выполняют действие I(x,y)=0 для точек, в которых значение меньше 10%. При отображении опухоли на полученном результирующем изображении I(x,y) диагностируется злокачественная опухоль, а при исчезновении опухоли - доброкачественная. Способ позволяет повысить информационную способность за счет более точного отображения границ недоброкачественной опухоли. 1 прим.
Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования развития инфекционного синдрома у больных острым лейкозом. Для этого проводят определение содержания CD16+ нейтрофилов в костном мозге больного. При содержании CD16+ нейтрофилов в костном мозге менее 50% прогнозируют развитие инфекционного синдрома с клиническими проявлениями. Использования данного способа позволяет прогнозировать развитие инфекционного синдрома при манифестации острого лейкоза до проведения химиотерапии. 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гепатологии, и может использоваться для прогнозирования эффективности противовирусной терапии у взрослых больных хроническим гепатитом C с генотипом 1b. Для этого определяют относительные количества содержания субпопуляций лимфоцитов крови и рассчитывают прогностический показатель, при этом подсчет процента субпопуляций лимфоцитов осуществляют методом проточной цитофлуориметрии. При значении показателя ПП<350 прогнозируют достижение быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию ХГС, при значении показателя ПП>350 прогнозируют отсутствие быстрого вирусологического ответа на противовирусную терапию хронического гепатита C с генотипом вируса 1b. Использование данного способа позволяет получить точный прогноз быстрого вирусологического ответа у больных хроническим гепатитом C с генотипом вируса 1b на противовирусную терапию 2 пр., 1 ил.

Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии при адъювантной терапии опухолей, а также при длительном наблюдении за пациентами после оперативного удаления опухолей. Способ описывает определение циркулирующих раковых клеток, чувствительных к адъювантной гормональной терапии, в крови больных раком молочной железы, включает выделение и обогащение циркулирующих опухолевых клеток с использованием антител с магнитными метками, получение лизатов циркулирующих опухолевых клеток, извлечение мРНК из лизатов циркулирующих опухолевых клеток, получение кДНК, получение амплифицированной ДНК, определение экспрессии маркерных генов, при этом в случае наличия одного из маркеров GA733-2, MUC-1, HER2 делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, и при обнаружении маркеров ESR1, PGR делается заключение о наличии циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к гормональной терапии. Способ позволяет значительно увеличить вероятность обнаружения циркулирующих опухолевых клеток, чувствительных к адъювантной гормональной терапии, повысить точность измерений и увеличить число анализируемых характеристик циркулирующих опухолевых клеток, повысить чувствительность методов анализа и эффективность диагностики при работе с больными раком молочной железы для оценки прогноза и эффективности терапии, улучшить эффективность лечения и выживаемость онкологических больных. 5 ил., 1 пр.

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для получения костного мозга (КМ) от доноров-трупов. Для этого пунктируют крылья подвздошных костей в передней и задней трети крыльев, устанавливая в каждое по два троакара. Сбор КМ выполняют методом простой аспирации, аспирации-промыванием или их комбинированием при разряжении 0,6 Атм при помощи устройства. Устройство для заготовки КМ включает одноразовую многоканальную закрытую систему, модуль аспирации-накопления и модуль перфузии. Группа изобретений также относится к способу оценки заготовленного костного мозга. Использование данного способа получения костного мозга (КМ) обеспечивает заготовку стерильного богатого жизнеспособными мультипотентными мезенхимальными стромальными и гемопоэтическими прогенеторными клетками КМ, при этом результат достигается за счет автоматизации миелоаспирации, путем заготовки биоматериала специальным разработанным устройством для сбора КМ. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 ил., 1табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, и может быть использовано для прогнозирования течения и исходов бактериальных гнойных менингитов (БГМ) различной этиологии у детей. Для этого определяют в цереброспинальной жидкости иммуноцитохимическим методом наличие CD31 и S100 позитивных клеток в 1-2 день заболевания. При содержании CD31 более 0,5% и наличии S100 позитивных клеток прогнозируют неблагоприятное течение БГМ. При содержании CD31 менее 0,5% и отсутствии S100 позитивных клеток прогнозируют благоприятное течение заболевания. Применение предложенного способа ликворо-цитологического прогноза течения БГМ у детей позволяет прогнозировать на ранних сроках болезни благоприятное и неблагоприятное течение заболевания, проводить мониторинг состояния сосудов микроциркуляторного русла головного мозга в ходе заболевания и корректировать терапию. 1 табл., 2 ил., 3 пр.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования задержки внутриутробного роста плода. Для этого в венозной крови женщины на ранних сроках беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровня С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R). Вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле: PI=-0,8911X1-0,0321Х2-2,3669Х3+11,0779, где X1 - относительное содержание CD3+CD16+CD56+-лимфоцитов, %; X2 - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл; Х3 - концентрация sTNF-R, нг/мл. При PI<0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI>0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния. Предлагаемый способ является малоинвазивным, позволяет с ранних сроков гестации выявить группу риска по формированию задержки внутриутробного роста плода, что дает возможность осуществления превентивных мероприятий, направленных на профилактику данного патологического состояния. 5 пр.
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования развития гематогенных метастазов после комбинированного лечения при раке почки. Для этого в ткани опухоли определяют экспрессию NF-kB p50, HIF-1α содержание сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF. Рассчитывают дискриминантные функции Y1, Y2 по уравнениям: Y1=-3,2+0,026·Х1+0,03·Х2-0,02·Х3+0,34·Х4+0,3·Х5; Y2=-33,3-0,01·Х1+0,11-Х2-1,2·Х3+1,57·Х4+1,8·Х5, где X1 - тотальная активность протеасом ·10-3 МЕ/мг белка; Х2 - содержание VEGF, пг/мг белка ; Х3 - экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке; Х4 - экспрессия NF-kВ p50, УЕ/мг белка в лунке. При значениях Y1>Y2 прогнозируют отсутствие, а при Y1<Y2 - развитие гематогенных метастазов. Использование данного способа позволяет прогнозировать прогрессирование рака почки, а следовательно, назначить своевременное назначение наиболее адекватных лечебных мероприятий. 1 табл., 2 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для определения протеолитической модификации клеточных рецепторов на модели выделенных лимфоцитов периферической крови. Для этого проводят инкубацию выделенных лимфоцитов в присутствии фермента в инкубационной среде с последующей отмывкой клеток от фермента. Окрашивают моноклональными антителами, содержащими флуоресцентную метку, к соответствующим поверхностным детерминантам клеточных рецепторов и сравнивают с контролем, где клетки инкубируются в среде без содержания ферментов или в присутствии ингибиторов протеолитических ферментов. Экспрессию рецепторов на лимфоцитах определяют методом проточной цитометрии. Использование данного способа позволяет определять чувствительные к протеолизу рецепторы и количественно оценить активность ферментов и их ингибиторов. 3 пр., 1 табл.

Наверх