Новые адъювантные композиции



Новые адъювантные композиции
Новые адъювантные композиции
Новые адъювантные композиции
Новые адъювантные композиции
Новые адъювантные композиции
Новые адъювантные композиции
Новые адъювантные композиции

 


Владельцы патента RU 2510280:

Пфайзер Инк. (US)

Группа изобретений относится к ветеринарии и касается адъювантных композиций, содержащих комбинацию Quil A или его очищенной фракции, холестерина, диметилдиоктадециламмоний бромида (DDA), полиакриловой кислоты (CARBOPOL) и CpG и/или N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетата; способа приготовления таких адъювантных композиций и применению таких адъювантных композиций в иммуногенных и вакцинных композициях с различными антигенами. Группа изобретений обеспечивает синергетический эффект между вышеперечисленными компонентами композиции. 5 н. и 15 з.п. ф-лы, 25 пр., 1 ил., 30 табл.

 

Предшествующий уровень техники

Область изобретения

Изобретение относится в общем к новым адъювантным композициям для усиления иммунного ответа на антигены для применения в иммуногенных и вакцинных композициях, не продуцирующим токсические или нежелательные побочные действия у субъекта. Изобретение также относится к способам изготовления и применению адъювантной, иммуногенной и вакцинной композиций.

История и описание родственной области техники

Бактериальные, вирусные и паразитарные инфекции широко распространены у людей и животных. Заболевания, вызываемые этими инфекционными агентами, часто резистентны к антимикробной фармацевтической терапии, приводя к тому, что отсутствуют эффективные способы лечения. Поэтому вакцинный подход используют во все большей степени для контроля инфекционного заболевания. Цельный инфекционный патоген можно сделать подходящим для применения в вакцинной композиции после химической инактивации или подходящей генетической манипуляции. Альтернативно, белковая субъединица патогена может быть экспрессирована в рекомбинантной экспрессирующей системе и очищена для применения в вакцинной композиции. Вакцины могут быть приготовлены более эффективно путем включения подходящего адъюванта в композицию.

Также существует растущий интерес к использованию вакцинного подхода для лечения рака у животных и людей. Этот терапевтический подход к лечению рака включает вакцинацию пациентов, страдающих раком, вакциной, содержащей опухолеспецифический антиген и адъювант. Тем не менее, ни одна из множества разрабатываемых противораковых вакцин этой природы не была одобрена надзорными органами. Не было показано, что вакцины уменьшают размер опухолей, что представляет собой стандартный показатель эффективности противоракового лекарства.

Термин "адъювант" как правило, относится к любому материалу, которое увеличивает гуморальный или клеточный иммунный ответ на антиген. Адъюванты используются для осуществления двух задач: они замедляют высвобождение антигенов из области инъекции, и они стимулируют иммунную систему. Традиционные вакцины, как правило, состоят из неочищенного препарата инактивированных или убитых или модифицированных живых патогенных микроорганизмов. Примеси, ассоциированные с этими культурами патологических микроорганизмов, могут действовать как адъювант для усиления иммунного ответа. Однако, иммунитет, вызываемый вакцинами, в которых используются гомогенные препараты патологических микроорганизмов или очищенных белковых субъединиц в качестве антигенов, часто является плохим. Таким образом, возникает необходимость в добавлении некоторых экзогенных веществ, таких как адъювант. Кроме того, синтетические и субъединичные вакцины являются дорогими при изготовлении. Добавление адъюванта может дать возможность для использования меньшей дозы антигена для стимулирования эквивалентного иммунного ответа, таким образом уменьшая стоимость изготовления вакцины. Таким образом, эффективность некоторых инъецируемых медицинских агентов может быть значительно увеличена, когда агент комбинирован с адъювантом.

Множество факторов следует принять к рассмотрению при выборе адъюванта. Адъювант должен эффективно вызывать относительно низкую скорость высвобождения и абсорбции антигена при минимуме токсических, аллергенных, раздражающих и других нежелательных эффектов в отношении хозяина. Для того, чтобы быть желательным, адъювант должен быть невирулицидным, биодеградируемым, способным согласованно вызывать высокий уровень иммунитета, способным стимулировать перекрестную защиту, быть совместимым с множественными антигенами, быть эффективным для множества видов, быть нетоксичным и безопасным для хозяина (например, отсутствие реакций в области инъекции). Желательно, чтобы адъювант обладал способностью к микродозированию, щадящему режиму дозирования, обладал превосходной стабильностью, поддавался высушиванию, мог быть изготовлен без масла, мог существовать в виде либо твердого вещества, либо жидкости, был изотоническим, легко изготавливаемым и недорогим для изготовления. Наконец, весьма желательно, чтобы адъювант можно было изменять таким образом, чтобы вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ или оба в зависимости от требований схемы вакцинации. Однако, количество адъювантов, которые могут удовлетворять вышеприведенным требованиям, ограничено.

Выбор адъюванта зависит от потребностей в вакцине, в зависимости от того, увеличивает ли она степень или функцию гуморального ответа, увеличивает ли опосредованный клетками иммунный ответ, вызывает ли защитные свойства слизистых оболочек или уменьшает ли дозу антигена. Предлагается множество адъювантов, тем не менее, ни для одного из них не показано, что он идеально подходит для всех вакцин. Первый адъювант, о котором сообщалось в литературе, представлял собой полный адъювант Фрейнда (FCA), который содержал эмульсию вода в масле и экстракты микобактерии. К сожалению, FCA плохо переносится и может вызвать неконтролируемое воспаление. С тех пор, как FCA открыли около 80 лет назад, были осуществлены попытки уменьшить нежелательные побочные действия адъювантов.

Некоторые другие вещества, которые используют в качестве адъювантов, включают оксиды металлов (например, гидроксид алюминия), алюминиевые квасцы, неорганические хелаты солей, желатины, различные масла парафинового типа, синтезированные смолы, альгинаты, мукоидные и полисахаридные соединения, казеинаты и вещества, происходящие из крови, такие как фибриновые сгустки. Хотя эти вещества в общем эффективны для стимуляции иммунной системы, ни для одного из них не было обнаружено, чтобы они были полностью удовлетворительными вследствие неблагоприятных побочных действий в отношении хозяина (например, стерильные абсцессы, повреждение органа, канцерогенность или аллергические реакции) или нежелательных фармацевтических свойств (например, быстрой дисперсии или плохого контроля дисперсии из области инъекции, или набухание материала).

Синтезированные масла и продукты нефтепереработки используют в качестве адъювантов, поскольку они демонстрируют относительно медленную дисперсию в организме, но они могут быть нежелательными, поскольку они часто разрушаются до ароматических углеводородов, которые могут быть канцерогенными. Кроме того обнаружено, что некоторые из этих веществ способны приводить к стерильным абсцессам и могут никогда полностью не выводиться из организма. Если масла выбраны подходящим образом и приготовлены в правильных концентрациях, то они могут быть относительно безопасными и нетоксичными.

Сапонины, полученные из коры южноамериканского дерева Quillaja saponaria, используют в качестве адъювантов в течение некоторого времени. Смотри Lacaille-Dubois, M and Wagner H. (A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol.2 pp.363-386. 1996). Множество используемых в настоящее время ветеринарных вакцин содержат Quil A, который представляет собой сапониновую фракцию из коры южноамериканского дерева Quillaja saponaria molina. Дополнительное фракционирование Quil A позволило получить субфракции, включающие QS-7, QS-17, QS-18, и QS-21 (смотри патент США №5057540).

Применение сапонинов в качестве адъювантов связано со множеством недостатков. Сапонины являются растворимыми и таким образом стимулируют неспецифический иммунный ответ. Однако, задача вакцинации заключается в стимулировании направленного ответа на специфический антиген или антигены. Сапонины обладают сильной аффинностью в отношении холестерина. Они образуют комплекс с холестерином, обнаруженным в клеточных мембранах, вызывая гемолиз клетки. Также продемонстрировано, что они вызывают некроз в области инъекции, и их сложно готовить в виде частиц. Когда сапонины готовят в вакцинах, содержащих модифицированных живые вирусы с оболочкой, они разрушают вирусную оболочку и таким образом инактивируют вирусные антигены.

Для преодоления гемолитических и вирулицидных свойств Quil A, его комбинируют с холестерином и фосфолипидами, которые образуют специфическую структуру, известную как иммуностимулирующий комплекс (ISCOM) или ISCOM матрикс (ISCOMATRIX). Смотри Ozel M., et. al.; J. Ultrastruc. and Molec. Struc. Re 102, 240-248 (1989). ISCOM, будучи комбинированным с антигеном, как правило вызывает Th1 цитотоксический Т-клеточный ответ. Тем не менее, хотя комбинация Quil A с холестерином значительно уменьшает гемолитические свойства Quil A, она не устраняет их полностью. Еще одно ограничение ISCOM заключается в том, что белковый антиген должен иметь гидрофобные домены, достаточно большие для того, чтобы взаимодействовать с ISCOM для включения в ISCOM. Белок, являющийся высоко гидрофильным, не может быть включен в ISCOM. Наконец, ISCOM могут стимулировать нежелательный аутоиммунный ответ у субъекта.

Иммуномодуляторы используют в качестве адъювантов, примеры которых включают диметилдиоктадециламмоний бромид (далее "DDA"), и авирдин. DDA представляет собой липофильное четвертичное аммониевое соединение (амин) с двумя 18 углеродными алкильными цепями и двумя метильными группами, связанными с положительно заряженной четвертичной аммониевой молекулой, имеющей молекулярную массу 631. Его применение в качестве адъюванта раскрыто Gall (Immunol. V.11, р.369, 1966). Сообщается, что DDA стимулирует сильные опосредованные клетками иммунные ответы, и также показано, что он вызывает гуморальные иммунные ответы. Опубликовано множество работ, демонстрирующих эффективность DDA в качестве адъюванта для белковых антигенов, гаптенов, опухолей, вирусов, простейших и бактерий (Смотри Korsholm, К S., et al., Immunology, vol.121, pp.216-226, 2007.). Большинство исследований осуществляли на лабораторных животных, тогда как лишь некоторые проводили на более крупных животных, таких как куры (смотри Katz, D., et al. FEMS Immunol Med Microbiol. Vol 7 (4): 303-313, 1993.), свиньи и крупный рогатый скот. DDA эффективен для индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH) у лабораторных животных и крупных животных. Однако, он плохо растворим в воде.

Полимеры также используют в качестве адъювантов, примеры которых включают диэтил-аминоэтил (ОЕАЕ)-декстран, полиэтиленгликоль и полиакриловую кислоту (например, CARBOPOL®). Полисахарид DEAE-декстран известен в области техники как очень сильный адъювант. Однако, он ассоциируется с неприемлемой реакционноспособностью. Полимеры CARBOPOL® представляют собой полимеры акриловой кислоты, перекрестно связанной с полиалкениловыми эфирами или дивинилгликолем. CARBOPOL® используют во множестве вакцин, но его применение в качестве адъюванта не было подтверждено.

Показано, что некоторые адъюванты стимулируют Th2 ответ, где примеры включают N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканоиламид гидроацетат, также известный под товарным знаком Bay R1005®, когда в нем образуется ацетат, и алюминий. Bay R1005® в комбинации с очищенными вирусными вакцинами или субъединичными вакцинами приводит к увеличенной продукции антител у сенсибилизированных вирусом мышей. Преклинические исследования на других видах животных (свиньи, овцы, лошади) дали сравнимые результаты в отношении продукции антител. Увеличение синтеза антител, вызванное Bay R1005®, в особенности зависит от антигена, и не является результатом поликлональной стимуляции.

До настоящего изобретения ни одна из композиций адъюванта не обладала желаемым диапазоном желаемых характеристик, которыми должен обладать идеальный адъювант. Были сделаны попытки найти новые адъюванты для вакцин, которые могли бы преодолеть недостатки обычных адъювантов. В частности, весьма желательна композиция адъюванта, которая вызывает сильный опосредованный клетками и гуморальный иммунный ответы, в отношении широкого диапазона антигенов у людей и животных, лишенная побочных действий и трудностей изготовления, характерных для обычных адъювантов.

Краткое изложение сущности изобретения

Данное изобретение относится к новым адъювантным, иммуногенным и вакцинным композициям. В частности, данное изобретение относится к адъювантным композициям, содержащим стимуляторы Th1, иммуномодуляторы, полимеры и стимуляторы Th2. Данное изобретение также относится к иммуногенным и вакцинным композициям, содержащим такие адъювантные композиции и один или более чем один антиген, а также способам приготовления адъювантных и вакцинных композиций.

В одном из воплощений адъювантные композиции содержат комбинацию сапонина, стерола и четвертичного аммониевого соединения. В одном из воплощений комбинация адъювантов содержит Quil A, холестерин и DDA.

В еще одном воплощении адъювантные композиции содержат комбинацию сапонина, стерола, четвертичного аммониевого соединения и полимера. В одном из воплощений комбинация адъювантов представляет собой Quil A, холестерин, DDA и полиакриловую кислоту.

В еще одном воплощении адъювантные композиции содержат комбинацию сапонина, стерола, четвертичного аммониевого соединения, полимера и гликолипида. В одном из воплощений комбинация адъювантов представляет собой Quil A, холестерин, DDA, полиакриловую кислоту и Bay R1005®.

В одном из воплощений иммуногенную композицию, содержащую адъювантную композицию и иммунологически эффективное количество антигена, где адъювантная композиция содержит сапонин, стерол, четвертичное аммониевое соединение и полимер, готовят способом, при котором

а) готовят композицию антигена в буфере,

б) добавляют сапонин к композиции со стадии (а);

в) добавляют стерол к композиции со стадии (б);

г) добавляют четвертичное аммониевое соединение к композиции со стадии (в),

д) добавляют полимер к композиции со стадии (г).

В одном из воплощений способа сапонин представляет собой Quil A, стерол представляет собой холестерин, четвертичное аммониевое соединение представляет собой DDA, и полимер представляет собой полиакриловую кислоту.

В одном из воплощений вакцину, содержащую адъювантную композицию и иммунологически эффективное количество антигена, где адъювантная композиция содержит сапонин, стерол, четвертичное аммониевое соединение, полимер и гликолипид, готовят способом, при котором

а) готовят композицию антигена в буфере,

б) добавляют сапонин к композиции со стадии (а);

в) добавляют стерол к композиции со стадии (б);

г) добавляют четвертичное аммониевое соединение к композиции со стадии (в),

д) добавляют полимер к композиции со стадии (г), и е) добавляют гликолипид к композиции со стадии (д).

В одном из воплощений этого способа сапонин представляет собой Quil A, стерол представляет собой холестерин, четвертичное аммониевое соединение представляет собой DDA, полимер представляет собой полиакриловую кислоту, и гликолипид представляет собой Bay R1005®.

Обнаружено, что приведенные здесь адъювантные композиции обладают удивительными и неожиданными свойствами кроме тех, которые можно ожидать от такой комбинации. Неожиданно обнаружено, что вирулицидное свойство Quil A / холестерина устраняется в этих адъювантных композициях. Они подходят в качестве разбавителя для лиофилизированных модифицированных живых вирусных антигенов. Описанные здесь адъювантные композиции могут быть изменены для того, чтобы вызывать чрезвычайно сильный иммунный ответ, относящийся к опосредованному клетками иммунному ответу, гуморальному иммунному ответу или обоим. Кроме того, реакции в области инъекции можно в значительной степени избежать при использовании этих адъювантных композиций. Реактогенность является ниже, чем реактогенность некоторых индивидуальных компонентов, которые составляют комбинацию адъювантов. Дополнительно, эти адъювантные композиции обеспечивают способность к длительному хранению.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти новые адъювантные композиции являются высоко иммуногенными при комбинировании с одним или более чем одним из множества различных антигенов широкого диапазона видов. Они могут быть использованы с одним или более чем одним вирусным, бактериальным, паразитарным, рекомбинантным белком и синтетическим пептидным антигенами и их комбинациями. Новые вакцинные адъювантные композиции могут быть использованы в терапевтических вакцинах для лечения рака.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены адъювантные, иммуногенные и вакцинные композиции. Дополнительно предложены способы приготовления композиций. Также предложено их применение в лечении заболевания. Также предложено их применение в изготовлении лекарственного средства для лечения субъекта от заболеваний, в частности от описанных ниже заболеваний. Также предложено их применение в изготовлении лекарственного средства для предупреждения или уменьшения заболевания у субъекта.

Также предложено их применение в изготовлении лекарственного средства для лечения животного семейства кошачьих от инфекции, вызванной вирусом лейкемии кошек, для лечения птицы от кокцидиоза птиц, для лечения животного, являющегося представителем крупного рогатого скота, от заболеваний, вызванных Escherichia со//, для лечения животного, являющегося представителем крупного рогатого скота, от заболеваний, вызванных вирусом диареи крупного рогатого скота, для лечения животного семейства свиней от заболеваний, вызванных Mycoplasma hyopneumonia, для лечения животного семейства кошачьих от заболеваний, вызванных вирусом кошачьего гриппа, субъекта от рака, для лечения животного семейства собачьих от заболеваний, вызванных коронавирусом собак, для лечения животного, являющегося представителем крупного рогатого скота, от заболеваний, вызванных ротавирусом крупного рогатого скота, и для лечения животного семейства собачьих от заболеваний, вызванных вирусом собачьего гриппа. Также предложено применение адъювантов в качестве маркерной вакцины, способствующей идентификации животных, которых вакцинируют. Также предложено применение CpG для усиления действий адъювантов.

Краткое описание графических материалов

На Фиг.1 изображен анализ на геле путем радиоиммунопреципитации, демонстрирующий различия в профиле антител между белками NS2/3 и белками Е2 вируса BVD. Группа, обработанная PreZent А, демонстрирует ответ в виде антител на белки NS2/3 и белки Е2, тогда как группы, обработанные QCDC и QCDCR, демонстрировали ответ в виде антител только на белок Е2, но не на белки NS2/3.

Подробное описание изобретения

Определения

"Около" или "приблизительно", когда используются в связи с измеряемой численной величиной, относятся к указанному значению переменной и ко всем значениям переменной, которые находятся в пределах экспериментальной ошибки указанной величины (например, в пределах 95% доверительного интервала для среднего значения) или в пределах 10 процентов относительно указанного значения, в зависимости от того, что больше, если только "приблизительно" не используется в отношении временных интервалов в виде недель, где "приблизительно 3 недели" составляют от 17 до 25 суток, и от приблизительно 2 до приблизительно 4 недель составляют от 10 до 40 суток.

"Адъювант" обозначает любое вещество, которое увеличивает гуморальный или клеточный иммунный ответ на антиген. Адъюванты как правило используются таким образом, чтобы реализовать две задачи: медленное высвобождение антигенов из области инъекции и стимуляция иммунной системы.

"Алкил" относится к прямоцепочечным и разветвленным насыщенным углеводородным группировкам.

"Амин" относится к химическому соединению, содержащему азот. Амины представляют собой группу соединений, являющихся производными аммиака, путем замещения углеводородных групп на атомы водорода. "Четвертичный амин" относится к соединению, основанному на аммиаке, имеющему четыре углеводородные группы.

"Антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, которая может связываться со специфическим антигеном, как результат иммунного ответа на этот антиген. Иммуноглобулины представляют собой сывороточные белки, состоящие из "легкой" и "тяжелой" полипептидных цепей, имеющих "константную" и "вариабельную" области, и разделяющиеся на классы (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM) на основе состава константных областей.

"Антиген" или "иммуноген" относится к любому веществу, которое стимулирует иммунный ответ. Этот термин включает убитые, инактивированные, ослабленные или модифицированные живые бактерии, вирусы или паразиты. Термин антиген также включает полинуклеотиды, полипептиды, рекомбинантные белки, синтетические пептиды, белковый экстракт, клетки (включающие опухолевые клетки), ткани, полисахариды или липиды или их фрагменты, индивидуально или в любой их комбинации. Термин антиген также включает антитела, такие как антиидиотипические антитела или их фрагменты, и синтетические пептидные мимеотопы, которые могут имитировать антиген или антигенную детерминанту (эпитоп).

"Бактерии" обозначает суспензию одной или более чем один убитой бактерии, которую можно использовать в качестве компонента вакцины или иммуногенной композиции.

"Буфер" обозначает химическую систему, которая предотвращает изменение концентрации другого химического вещества, например протонные донорная и акцепторная системы служат в качестве буферов, предотвращающих значительные изменения концентрации иона водорода (pH). Еще один пример буфера представляет собой раствор, содержащий смесь слабой кислоты и ее соли (конъюгатное основание) или слабого основания и ее соли (конъюгатная кислота).

"Клеточный иммунный ответ" или "опосредованный клетками иммунный ответ" представляет собой иммунный ответ, опосредованный Т-лимфоцитами или другими белыми кровяными клетками или теми и другими, и включает продукцию цитокинов, хемокинов и близких молекул, продуцированных активированными Т-клетками, белыми кровяными клетками или теми и другими.

"Холестерин" относится к белому кристаллическому веществу, имеющему химическую формулу С27Н45ОН. Он представляет собой циклический углеводородный спирт, который классифицируется как липид. Он не растворим в воде, но растворим во множестве органических растворителей.

"Гиперчувствительность замедленного типа (DTH)" относится к воспалительному ответу, который развивается через 24-72 часа после воздействия антигена, который распознается иммунной системой как чужеродный. Этот тип иммунного ответа включает в основном Т клетки, нежели чем антитела (которые продуцируются В-клетками).

"Доза" относится к вакцинной или иммуногенной композиции, вводимой субъекту. "Первая доза" или "примирующая вакцина" относится к дозе такой композиции, вводимой на 0 сутки. "Вторая доза" или "третья доза", или "годовая доза" относится к количеству такой композиции, вводимой за первой дозой, которая может представлять собой ту же самую вакцину или иммуногенную композицию, как первая доза, или нет.

"Эмульгатор" обозначает вещество, используемое для придания эмульсии большей стабильности.

"Эмульсия" обозначает композицию из двух несмешивающихся жидкостей, в которой небольшие капли одной жидкости суспендированы в непрерывной фазе другой жидкости.

"Сложные эфиры" относятся к любому классу органических соединений, соответствующих неорганическим солям, которые образуются в результате реакции конденсации, в которой молекула органической кислоты связывается с молекулой спирта с элиминацией молекулы воды.

"Эксципиент" относится к любому компоненту вакцины, который не представляет собой антиген.

"Гомогенизация" относится к способу смешивания одного или более чем одного компонента, похожего или отличающегося, в однородную смесь.

"Гуморальный иммунный ответ" относится к ответу, который опосредован антителами.

"Гидрофобный" обозначает не растворимый в воде, не абсорбирующий легко влагу, или на который вода отрицательно влияет; несовместимый с водой или обладающий небольшой аффинностью в отношении его.

"Иммунный ответ" у субъекта относится к развитию гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или гуморального и клеточного иммунного ответа на антиген. Иммунные ответы обычно могут быть определены с использованием стандартных иммуноанализов и анализов нейтрализации, которые известны в области техники.

"Иммунологически защитное количество" или "иммунологически эффективное количество" или "эффективное количество для продукции иммунного ответа" антигена представляет собой количество, эффективное для индукции иммунного ответа у реципиента. Иммунный ответ может быть достаточным для диагностических задач или другого тестирования, или может быть адекватным для предупреждения признаков или симптомов заболевания, включающих неблагоприятные действия в отношении здоровья или их осложнения, вызванные инфицированием болезнетворным агентом. Может быть вызван гуморальный иммунитет или опосредованный клетками иммунитет. Иммунный ответ у животного на иммуногенную композицию может быть оценен, например, опосредовано путем измерения титров антител, анализов пролиферации лимфоцитов, или непосредственно путем отслеживания признаков и симптомов после сенсибилизации штаммом дикого типа, тогда как защитный иммунитет, вызываемый вакциной, может быть оценен путем измерения, например уменьшения клинических показателей, таких как смертность, заболеваемость, температура, общее психическое состояние и общее состояние здоровья и поведение субъекта. Иммунный ответ может включать без ограничения индукцию клеточного и/или гуморального иммунитета.

"Иммуногенный" обозначает вызывающий иммунный или антигенный ответ. Таким образом, иммуногенная композиция может представляет собой иммуногенную композицию, которая вызывает иммунный ответ.

"Иммуностимулирующий комплекс" или ISCOM относится к специфической структуре, которая образуется, когда Quil A комбинируют с холестерином и фосфолипидами.

"Иммуностимулирующая молекула" относится к молекуле, которая вызывает иммунный ответ.

"Липиды" относится к любой группе органических соединений, включая жиры, масла, воски, стеролы и триглицериды, которые нерастворимы в воде, но растворимы в неполярных органических растворителях, маслянистые на ощупь, и вместе с углеводородами и белками составляют основной структурный материал живых клеток.

"Липофильный" обозначает демонстрирующий значительное сродство к липидам или растворимость в липидах.

"Липосома" относится к микроскопической сферической частице, образуемой липидным бислоем, закрывающим водный компартмент, используемой в медицине для того, чтобы переносить лекарство, антиген, вакцину, фермент или другое вещество к клеткам-мишеням в организме.

"Медицинский агент" относится к любому агенту, который полезен для предупреждения, лечения или улучшения состояния при заболевании, или предупреждения некоторого физиологического состояния или проявления.

"Парентеральное введение" относится к введению вещества, такого как вакцина, в организм субъекта при помощи или путем, который не включает пищеварительный тракт. Парентеральное введение включает подкожное, внутримышечное, чрескожное, внутрикожное, интраперитонеальное, внутриглазное и внутривенное введение.

"Фармацевтически приемлемый" относится к веществам, которые находятся в объеме тщательной медицинской оценки, подходящим для применения в контакте с тканями субъекта без излишней токсичности, раздражения, аллергического ответа и т.п, сопоставимым с приемлемым отношением выгоды к риску, и эффективным для их предполагаемого применения.

"Реактогенность" относится к побочным действиям, вызываемым у субъекта в ответ на введение адъюванта, иммуногенной или вакцинной композиции. Они могут проявляться в области введения, и обычно оцениваются с точки зрения развития множества симптомов. Эти симптомы могут включать воспаление, покраснение и абсцесс. Их также оценивают с точки зрения частоты, длительности и тяжести. "Низкая" реакция может, например, включать набухание, которое только обнаруживается путем пальпации, но не глазами, или может иметь небольшую длительность. Более тяжелая реакция может представлять собой, например, реакцию, которая видна глазами или имеет большую длительность.

"Комнатная температура" обозначает температуру от 18 до 25°C.

"Сапонин" относится к группе поверхностно-активных гликозидов растительного происхождения, состоящих из гидрофильной области (обычно несколько цепей сахара) в ассоциации с гидрофобной областью стероидной или тритерпеноидной структуры.

"Стероиды" относится к любой группе органических соединений, относящихся к биохимическому классу липидов, которые легко растворимы в органических растворителях и слаборастворимы в воде. Стероиды содержат систему из четырех конденсированных колец, из которых три кольца представляют собой конденсированные кольца циклогексанов (шестиуглеродные) плюс четвертое кольцо представляет собой циклопентан (пятиуглеродное).

"Стеролы" относятся к соединениям у животных, которые биологически продуцируются из терпеноидных предшественников. Они содержат стероидную кольцевую структуру, имеющую гидроксильную (ОН) группу, обычно присоединенную к углероду-3. Углеводородная цепь заместителя жирной кислоты варьирует по длине, обычно от 16 до 20 атомов углерода, и может быть насыщенной или ненасыщенной. Стеролы обычно содержат одну или более чем одну двойную связь в кольцевой структуре и также множество заместителей, присоединенных по кольцам. Стеролы и их эфиры с жирной кислотой по существу нерастворимы в воде.

"Субъект" относится к любому животному, для которого желательно введение адъювантной композиции. Он включает млекопитающих и отличных от млекопитающих особей, включая приматы, домашний скот, домашних животных, лабораторных животных, содержащихся в неволе диких животных, птиц (включая в яйцах), рептилий и рыб. Таким образом, этот термин включает обезьян, людей, свиней; крупный рогатый скот, овец, коз, лошадей, мышей, крыс, морских свинок, хомяков, кроликов, кошек, собак, кур, индюшек, уток, других домашних птиц, лягушек и ящериц, но не ограничивается ими.

"TCID50" относится к "дозе, инфекционной для культуры тканей" и определяется как разведение вируса, которое требуется для инфицирования 50% данной партии инокулированных клеточных культур. Различные способы могут быть использованы для расчета TCID50, включающие способ Спирмана-Карбера (Spearmann-Karber), использованный в данном описании. Описание способа Спирмана-Карбера смотри в B.W. Many & Н.О. Kangro, Virology Methods Manual, p.25-46 (1996).

"Терапевтически эффективное количество" относится к количеству антигена или вакцины, которое будет вызывать иммунный ответ у субъекта, получающего антиген или вакцину, который является подходящим для предупреждения или уменьшения признаков или симптомов заболевания, включая неблагоприятные для здоровья побочные эффекты или его осложнения, вызванного инфицированием патогеном, таким как вирус или бактерия. Может быть индуцирован гуморальный иммунитет или клеточный иммунитет или как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Можно оценивать иммунный ответ животного на вакцину, например, опосредованно, посредством измерения титров антитела, анализов пролиферации лимфоцитов, или путем непосредственного контроля признаков и симптомов после сенсибилизации штаммом дикого типа. Защитный иммунитет, обеспечиваемый вакциной, можно оценивать путем измерения, например, по уменьшению клинических признаков, таких как смертность, заболеваемость, температурные показатели, общее физическое состояние и общее состояние здоровья и поведение субъекта. Количество вакцины, являющееся терапевтически эффективным, может варьировать в зависимости от конкретного используемого адъюванта, конкретного используемого антигена или состояния субъекта и может быть определено специалистом в данной области техники.

"Лечение" относится к предупреждению расстройства, состояния или заболевания, в отношении которого применяется этот термин, или к предупреждению или уменьшению одного или более чем одного симптома такого расстройства, состояния или заболевания.

"Процесс лечения" относится к акту "лечения", определенного выше.

"Тритерпеноиды" относятся к большому и разнообразному классу встречающихся в природе органических молекул, происходящих из шести пятиуглеродных изопреновых (2-метил-1,3-бутадиеновых) мономеров, которые могут быть собраны и модифицированы тысячами путей. Большая часть представляет собой мультициклические структуры, которые отличаются друг от друга функциональными группами и их основными углеродными скелетами. Эти молекулы могут быть найдены во всех классах живых существ.

"Вакцина" относится к композиции, которая включает антиген, как здесь определено. Введение вакцины субъекту приводит в результате к иммунному ответу, как правило против одного или более чем одного специфического заболевания. Количество вакцины, которое является терапевтически эффективным, может варьировать в зависимости от конкретного используемого антигена или состояния субъекта, и может быть определено специалистом в данной области техники.

Компоненты композиций

Тритерпеноиды и CpG

Тритерпеноиды, подходящие для применения в адъювантных композициях, могут происходить из множества источников, растительного происхождения или синтетических эквивалентов, включая Quillaja saponaria, томатин, экстракты женьшеня, грибы и алкалоидный гликозид, структурно близкий к стероидным сапонинами, но не ограничивающихся ими. Таким образом, Тритерпеноиды, подходящие для применения в адъювантных композициях, включают сапонины, сквален и ланостерол. Количество тритерпеноидов, подходящих для применения в адъювантных композициях, зависит от природы используемого тритерпеноида. Тем не менее, они как правило используются в количестве, составляющем от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 4000 мкг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 3000 мкг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2000 мкг на дозу, и от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1000 мкг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 5 мкг до приблизительно 750 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 200 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, от приблизительно 15 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, и в количестве от приблизительно 30 мкг до приблизительно 75 мкг на дозу.

Если используют сапонин, то адъювантные композиции, как правило, содержат иммунологически активную фракцию сапонина из коры Quillaja saponaria. Сапонин может представлять собой, например, Quil A или другой очищенный или частично очищенный препарат сапонина, которые имеются в продаже. Таким образом, экстракты сапонина могут быть использованы в виде смесей или очищенных индивидуальных компонентов, таких как QS-7, QS-17, QS-18 и QS-21. В одном из воплощений Quil A имеет чистоту по меньшей мере 85%. В других воплощениях Quil A имеет чистоту по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

CpG ODN представляют собой описанный недавно класс фармакотерапевтических агентов, которые характеризуются присутствием неметилированного CG динуклеотида в специфических контекстах основной последовательности (мотив CpG). (Hansel TT, Barnes PJ (eds): New Drugs for Asthma, Allergy and COPD. Prog Respir Res. Basel, Karger, 2001, vol 31, pp 229-232, включенная сюда путем ссылки). Эти мотивы CpG не обнаруживаются в эукариотической ДНК, в которой динуклеотиды CG подвергаются супрессии и, когда присутствуют, обычно метилированы, но присутствуют в бактериальной ДНК, которой они придают иммуностимулирующие свойства. Эти иммуностимулирующие свойства включают индукцию ответа Th1-типа со значительным высвобождением IFN-A, IL-12, и IL-18. CpG ODN (длиной 18-24 п.о.) обладают иммуномодулирующими свойствами, близкими к бактериальной ДНК. Белки клеточной поверхности могут захватывать эти молекулы с различными результатами. Тем не менее, с носителем, таким как QCDC, QCDCR и другими комбинациями, цитированными в этом патенте, иммуномодулирующие свойства и захват CpG значительно усиливается.

Количество CpG для применения в адъювантных композициях зависит от природы используемого CpG и предполагаемых видов. Тем не менее, они как правило используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 20 мг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5 мг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 4 мг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 3 мг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг на дозу, и от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1 мг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 5 мкг до приблизительно 750 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 200 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, от 10 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, от приблизительно 15 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, и в количестве от приблизительно 30 мкг до приблизительно 75 мкг на дозу.

Стеролы

Стеролы, подходящие для применения в адъювантных композициях, включают β-ситостерол, стигмастерол, эргостерол, эргокальциферол и холестерин. Эти стеролы хорошо известны в области техники и могут быть приобретены в продаже. Например, холестерин раскрыт в Merck Index, 12th Ed., p.369. Количество стеролов, подходящее для применения в адъювантных композициях, зависит от природы используемого стерола. Тем не менее, они как правило используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 4000 мкг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 3000 мкг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2000 мкг на дозу, и от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1000 мкг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 5 мкг до приблизительно 750 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 200 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, от приблизительно 15 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, и от приблизительно 30 мкг до приблизительно 75 мкг на дозу.

Иммуномодуляторы

Адъювантные композиции дополнительно могут включать один или более чем один иммуномодулирующий агент, такой как, например четвертичные аммониевые соединения (например, DDA (бромид диметилдиоктадециламмония)) и интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Эти вещества имеются в продаже. Количество иммуномодулятора, подходящее для применения в адъювантных композициях, зависит от природы используемого иммуномодулятора и субъекта. Тем не менее, они как правило используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 5000 мкг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 1 мкг до приблизительно 4000 мкг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 3000 мкг на дозу, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2000 мкг на дозу, и от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1000 мкг на дозу. Они также используются в количестве от приблизительно 5 мкг до приблизительно 750 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 200 мкг на дозу, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, от приблизительно 15 мкг до приблизительно 100 мкг на дозу, и в количестве от приблизительно 30 мкг до приблизительно 75 мкг на дозу. Для специфического примера адъювантные композиции, содержащие DDA, могут быть изготовлены путем простого смешивания раствора антигена со свежеприготовленным раствором DDA.

Полимеры

Адъювантные композиции дополнительно могут включать один или более чем один полимер, такой как, например DEAE декстран, полиэтиленгликоль и полиакриловая кислота и полиметакриловая кислота (например, CARBOPOL®). Такое вещество имеется в продаже. Количество полимеров, подходящих для применения в адъювантных композициях, зависит от природы используемых полимеров. Тем не менее, они как правило используются в количестве от приблизительно 0,0001% (об./об.) до приблизительно 75% об./об. В других воплощениях они используются в количестве от приблизительно 0,001% об./об. до приблизительно 50% об./об., от приблизительно 0,005% об./об. до приблизительно 25% об./об., от приблизительно 0,01% об./об. до приблизительно 10% об./об., от приблизительно 0,05% об./об. до приблизительно 2% об./об., и от приблизительно 0,1% об./об. до приблизительно 0,75% об./об. В еще одном воплощении они используются в количестве от приблизительно 0,02 об./об. до приблизительно 0,4% об./об. DEAE-декстран может иметь молекулярную массу в диапазоне от 50000 Да до 5000000 Да, или он может находиться в диапазоне от 500000 Да до 2000000 Да. Такое вещество может быть приобретено в продаже или получено из декстрана.

Еще один специфический пример представляет собой полиакриловую кислоту (например, полимеры CARBOPOL®), которая имеет среднюю эквивалентную массу 76. Ее получают из первичных полимерных частиц, имеющих средний диаметр от приблизительно 0,2 до 6,0 микрон. Полимеры CARBOPOL® набухают в воде до 1000 раз относительно их исходного объема и десять раз относительно исходного диаметра с образованием геля при воздействии среды с pH больше чем pKa карбоксилатной группы. При pH больше, чем pKa карбоксилатной группы, карбоксилатные группы ионизируются, приводя в результате к отталкиванию между отрицательными зарядами, что вносит вклад в набухание полимера.

Стимуляторы Th2

Адъювантные композиции дополнительно могут включать один или более чем один стимулятор Th2, такой как, например, Bay R1005® и алюминий. Количество стимуляторов Th2, подходящее для применения в адъювантных композициях, зависит от природы используемого стимулятора Th2. Тем не менее, они как правило используются в количестве от приблизительно 0,01 мг до приблизительно 10 мг на дозу. В других воплощениях они используются в количестве от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 7,5 мг на дозу, от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 5 мг на дозу, от приблизительно 0.5 мг до приблизительно 2,5 мг на дозу и от 1 мг до приблизительно 2 мг на дозу. Специфический пример представляет собой Bay R1005®, гликолипид, имеющий химическое название "N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамид ацетат". Он может быть синтезирован в соответствии со способом, обнаруженным в Lockhoff, 0. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 30: 1611-1620; 1991). Рекомендуется хранить его при 2-8°C в воздухонепроницаемом контейнере. Его химические или физические свойства заключаются в том, что он слегка гигроскопичен, не образует полиморфы, химически стабилен на воздухе и на свету при температурах до 50°C и в водных растворителях при pH 2-12 при температуре окружающей среды. Он представляет собой амфифильную молекулу, которая образует мицеллы в водном растворе.

Антигены и заболевания

Адъювантные композиции могут содержать один или более чем один антиген. Антигеном может быть любое из множества веществ, способных вызывать желаемый иммунный ответ у субъекта. Хотя Quil A сам по себе является вирулицидным, Quil A детоксифицируется путем добавления холестерина при образовании геликоидальных мицелл (смотри патент США №7122191). Обнаружено, что описанные здесь адъювантные композиции являются невирулицидными и негемолитическими или мембранолитическими. Таким образом, антигены, используемые с этими адъювантными композициями, могут представлять собой один или более чем один из вирусов (инактивированные, ослабленные и модифицированные живые), бактерий, паразитов, нуклеотидов, полинуклеотидов, пептидов, полипептидов, рекомбинантных белков, синтетических пептидов, белкового экстракта, клеток (включая опухолевые клетки), тканей, полисахаридов, углеводородов, жирных кислот, тейхоевой кислоты, пептидогликанов, липидов или гликолипидов, индивидуально или в любой их комбинации.

Антигены, используемые с адъювантами по изобретению, также включают иммуногенные фрагменты нуклеотидов, полинуклеотидов, пептидов, полипептидов, которые могут быть выделены из организмов, упомянутых здесь.

Живые, модифицированные живые и ослабленные вирусные штаммы, которые не вызывают заболевание у субъекта, выделены в невирулентных формах или ослабляются с использованием способов, хорошо известных в области техники, включающих серийный пассаж в подходящей клеточной линии или воздействие ультрафиолетовым светом или химическим мутагеном. Инактивированные или убитые вирусные штаммы представляют собой штаммы, которые инактивируют посредством способов, известных специалистам в области техники, включая обработку формалином, бетапропиолактоном (BPL), бинарным этиленимином (BEI), стерилизующего радиоактивного излучения, тепловой обработки или других таких способов.

Два или более чем два антигена могут быть комбинированы с образованием поливалентной композиции, которая может защищать субъекта от широкого разнообразия заболеваний, вызванных патогенами. В настоящее время, коммерческие производители вакцин, а также потребители предпочитают поливалентные вакцинные продукты. Хотя обычные адъюванты часто ограничены рядом антигенов, с которыми они могут быть эффективно использованы (одновалентно или поливалентно), описанные здесь адъюванты могут быть эффективно использованы с широким диапазоном антигенов, как одновалентно, так и поливалентно. Таким образом, описанные здесь антигены могут быть комбинированы в одной композиции, содержащей описанные здесь адъюванты.

Некоторые примеры бактерий, которые могут быть использованы в качестве антигенов с адъювантными композициями, включают Aceinetobacter calcoaceticus, Acetobacter paseruianus, Actinobacillus pleuropneumoniae. Aeromonas hydrophila, Alicyclobacillus acidocaldarius, Arhaeglobus fulgidus, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophillus, Bacillus subtilis, Bacillus thermocatenulatus, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Burkholderia glumae, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter hyointestinalis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila spp., Chromobacterium viscosum, Erysipelothrix rhusiopathieae, Listeha monocytogenes, Ehrlichia canis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus. Helicobacter suis, Lawsonia intracellulahs, Legionella pneumophilia, Moraxellsa sp., Mycobactrium bovis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Clostridium perfringens, Odoribacter denticanis, Pasteurella (Mannheimia) haemolytica, Pasteurella multocida, Photorhabdus luminescens, Porphyromonas gulae, Porphyromonas gingivalis, Porphyromonas salivosa, Propionibacterium acnes, Proteus vulgaris, Pseudomonas wisconsinensis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens C9, Pseudomonas fluorescens SIKW1, Pseudomonas fragi, Pseudomonas luteola, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas sp B11-1, Alcaliges eutrophus, Psychrobacter immobilis, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsia, Salmonella typhimurium, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella dublin, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraseuis, Salmonella newport, Serratia marcescens, Spirulina platensis, Staphyloccocus aureus, Staphyloccoccus epidermidis, Staphylococcus hyicus, Streptomyces albus, Streptomyces cinnamoneus, Streptococcus suis, Streptomyces exfoliates, Streptomyces scabies, Sulfolobus acidocaldarius, Syechocystis sp., Vibrio cholerae, Borrelia burgdorferi, Treponema denticola, Treponema minutum, Treponema phagedenis, Treponema refringens, Treponema vincentii, Treponema palladium, и Leptospira species, такие как известные патогены Leptospira canicola, Leptospira grippotyposa, Leptospira hardjo, Leptospira borgpetersenii hardjo-bovis, Leptospira borgpetersenii hardjo-prajitno, Leptospira interrogans, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona и Leptospira bratislava, и их комбинации, но не ограничиваются ими.

Как инактивированные вирусы, так и ослабленные живые вирусы могут быть использованы в адъювантных композициях. Некоторые примеры вирусов, которые могут быть использованы в качестве антигенов, включают вирус герпеса птиц, вирусы герпеса крупного рогатого скота, вирусы герпеса собак, вирусы герпеса лошадей, вирус ринотрахеита кошек, вирус болезни Марека, вирусы герпеса овец, вирусы герпеса свиней, вирус псевдобешенства, парамиксовирусы птиц, респираторный синцитиальный вирус крупного рогатого скота, вирус собачьей чумы, вирус парагриппа собак, аденовирус собак, парвовирус собак, вирус парагриппа 3 крупного рогатого скота, вирус парагриппа 3 овец, вирус чумы крупного рогатого скота, вирус пограничной болезни овец, вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV), BVDV тип I, BVDV тип II, вирус классической лихорадки свиней, вирус лейкоза птиц, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, вирус лейкемии крупного рогатого скота, туберкулез крупного рогатого скота, вирус инфекционной анемии лошадей, вирус иммунодефицита кошек, вирус лейкемии кошек (FeLV), вирус псевдочумы, вирус прогрессирующей пневмонии овец, вирус легочной аденокарциномы овец, коронавирус собак (CCV), пантропический CCV, респираторный коронавирус собак, коронавирус крупного рогатого скота, кольцивирус кошек, кишечный коронавирус кошек, вирус инфекционного перитонита кошек, вирус эпидемической диареи свиней, вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита свиней, парвовирус свиней, цирковирус свиней (PCV) тип I, PCV тип II, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS), трансмиссивный вирус гастроэнтерита, коронавирус индеек, рабдовирус крупного рогатого скота, бешенство, ротавирус, вирус везикулярного стоматита, лентивирус, птичий грипп, риновирусы, вирус гриппа лошадей, вирус свиного гриппа, вирус собачьего гриппа, вирус кошачьего гриппа, вирус гриппа людей, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕ), вирус венесуэльского энцефалита лошадей, вирус Западного Нила, вирус западного энцефалита лошадей, вирус иммунодефицита человека, вирус папилломы человека, вирус ветряной оспы, вирус гепатита В, риновирус и вирус кори, и их комбинации, но не ограничиваются ими.

Примеры пептидных антигенов включают Bordetella bronchiseptica p68, GnRH, IgE пептиды, Fel d1 и раковые антигены, и их комбинации. Примеры других антигенов включают нуклеотиды, углеводороды, липиды, гликолипиды, пептиды, жирные кислоты и тейхоевую кислоту, и пептидогликаны и их комбинации.

Некоторые примеры паразитов, которые могут быть использованы в качестве антигенов с адъювантными композициями, включают Anaplasma, Fasciola hepatica (печёночная двуустка), Coccidia, Eimeria spp., Neospora caninum, Toxoplasma gondii, Giardia, Dirofilaria (сердечные черви), Ancylostoma (нематоды), Trypanosoma spp., Leishmania spp., Trichomonas spp., Cryptosporidium parvum, Babesia, Schistosoma, Taenia, Strongyloides, Ascaris, Trichinella, Sarcocystis, Hammondia и Isopsora, и их комбинации, но не ограничиваются ими. Также охвачены внешние паразиты, включая клещей, включая виды Ixodes, Rhipicephalus, Dermacentor, Amblyomma, Boophilus, Hyalomma, и Haemaphysalis, и их комбинации, но не ограничивающиеся ими.

Количество антигена, используемого для того, чтобы вызвать иммунный ответ, в значительной степени варьирует в зависимости от используемого антигена, субъекта и уровня желаемого ответа, и может быть определено специалистом в данной области техники. Для вакцин, содержащих модифицированные живые вирусы или ослабленные вирусы, терапевтически эффективное количество антигена, как правило, находится в диапазоне от приблизительно 102 инфекционной дозы в тканевой культуре (TCID)50 до приблизительно 1010 TCID50 включительно. Для множества таких вирусов терапевтически эффективная доза как правило находится в диапазоне от приблизительно 102 TCID50 до приблизительно 108 TCID50 включительно. В некоторых воплощениях диапазоны терапевтически эффективных доз составляют от приблизительно 103 TCID50 до приблизительно 106 TCID50 включительно. В некоторых других воплощениях диапазоны терапевтически эффективных доз составляют от приблизительно 104 TCID50 до приблизительно 105 TCID50 включительно.

Для вакцин, содержащих инактивированные вирусы, терапевтически эффективное количество антигена, как правило, составляет по меньшей мере приблизительно 100 относительных единиц на дозу, и часто в диапазоне от приблизительно 1000 до приблизительно 4500 относительных единиц на дозу включительно. В других воплощениях терапевтически эффективное количество антигена находится в диапазоне от приблизительно 250 до приблизительно 4000 относительных единиц на дозу включительно, от приблизительно 500 до приблизительно 3000 относительных единиц на дозу включительно, от приблизительно 750 до приблизительно 2000 относительных единиц на дозу включительно или от приблизительно 1000 до приблизительно 1500 относительных единиц на дозу включительно.

Терапевтически эффективное количество антигена в вакцинах, содержащих инактивированные вирусы, может также быть измерено в единицах относительной силы (relative potency, RP) на мл. Терапевтически эффективное количество часто находится в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 50 RP на мл включительно. В других воплощениях, терапевтически эффективное количество антигена находится в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 30 RP на мл включительно, от приблизительно 1 до приблизительно 25 RP на мл включительно, от приблизительно 2 до приблизительно 20 RP на мл включительно, от приблизительно 3 до приблизительно 15 RP на мл включительно или от приблизительно 5 до приблизительно 10 RP на мл включительно.

В одном из воплощений антиген FeLV продуцировали из клеточной линии FL74-UCD-1 (номер в АТСС (Американской коллекции типовых культур) CRL-8012), которую устойчиво инфицировали штаммом вируса лейкемии кошек КТ-FeLV-UCD-1. Количество антигена FeLV в вакцине может быть измерено как количество вирусного белка gp70 на мл. Терапевтически эффективное количество антигена FeLV, будучи измеренное по количеству вирусного белка gp70 на мл как правило находится в диапазоне от приблизительно 100 до приблизительно 350000 нг/мл включительно. В еще одном воплощении диапазон составляет от приблизительно 1000 до приблизительно 300000 нг/мл включительно, или от приблизительно 2500 до приблизительно 250000 нг/мл включительно, или от приблизительно 4000 до приблизительно 220000 нг/мл включительно, или от приблизительно 5000 до приблизительно 150000 нг/мл включительно, или от приблизительно 10000 нг/мл до приблизительно 100000 нг/мл включительно.

Количество клеток для бактериального антигена, вводимое в вакцине, находится в диапазоне от приблизительно 1×106 до приблизительно 5×1010 колониеобразующих единиц (CFU) на дозу включительно. В других воплощениях множество клеток находится в диапазоне от приблизительно 1×107 до 5×1010 CFU/дозу включительно, или от приблизительно 1×108 до 5×1010 CFU/дозу включительно. В других воплощениях множество клеток находится в диапазоне от приблизительно 1×102 до 5×1010 CFU/дозу включительно, или от приблизительно 1×104 до 5×109 CFU/дозу включительно, или от приблизительно 1×105 до 5×109 CFU/дозу включительно, или от приблизительно 1×106 до 5×109 CFU/дозу включительно, или от приблизительно 1×106 до 5×108 CFU/дозу включительно, или от приблизительно 1×107 до 5×109 CFU/дозу включительно.

Количество клеток для паразитарного антигена, вводимое в вакцине, находится в диапазоне от приблизительно 1×102 до приблизительно 1×1010 на дозу включительно. В других воплощениях множество клеток находится в диапазоне от приблизительно 1×103 до приблизительно 1×109 на дозу включительно, или от приблизительно 1×104 до приблизительно 1×108, на дозу включительно, или от приблизительно 1×105 до приблизительно 1×107 на дозу включительно, или от приблизительно 1×106 до приблизительно 1×108 на дозу включительно.

В области техники хорошо известно, что с обычными адъювантами, значительно большее количество инактивированных вирусов по сравнению с модифицированными живыми или ослабленными вирусами необходимо для стимулирования сравнимого уровня серологического ответа. Однако, неожиданно обнаружено, что с описанными здесь адъювантными композициями приблизительно такие же количества инактивированного вируса и модифицированного живого вируса стимулируют близкие уровни серологического ответа. Кроме того, необходимы меньшие количества модифицированного живого, ослабленного и инактивированного вируса с описанными здесь адъювантами по сравнению с обычными адъювантами для достижения того же самого уровня серологического ответа. Эти неожиданные открытия демонстрируют сохранение средств и уменьшение стоимости во время изготовления иммуногенных и вакцинных композиций. Для вакцин с широкой применимостью требуется изготовление миллионов доз в год, таким образом, эта экономия может быть значительной.

Эксципиенты

Водные адъюванты обеспечивают некоторые преимущества. Их как правило легко готовить и вводить, и они могут вызывать реже и менее серьезные реакции в области инъекции. Тем не менее, водные адъюванты с антигеном обладают тенденцией диффундировать из области инъекции, подвергаются метаболизму в печени субъекта и формируют нежелательный неспецифический иммунный ответ. Неожиданно обнаружили, что описанные здесь водные адъювантные композиции остаются в области инъекции до тех пор, пока не подвергнутся биометаболизму, что происходит в течение длительного периода времени и обеспечивает желаемый иммунный ответ.

Масло, добавляемое в виде компонента адъюванта, как правило обеспечивает длительный и медленный профиль высвобождения. В настоящем изобретении масло может быть метаболизируемым или неметаболизируемым. Масло может находиться в форме эмульсии масло-в-воде, вода-в-масле или вода-в-масле-в-воде.

Масла, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают алканы, алкены, алкины и их соответствующие кислоты и спирты, их простые и сложные эфиры, и их смеси. Индивидуальные соединения масла представляют собой легкие углеводороды, т.е. такие компоненты имеют от 6 до 30 атомов углерода. Масло может быть получено синтетически или очищено из нефтепродуктов. Группировка может иметь прямую или разветвленную структуру цепи. Она может быть полностью насыщенной или иметь одну или более чем одну двойную или тройную связь. Некоторые неметаболизируемые масла для применения в настоящем изобретении включают, например, минеральное масло, вазелиновое масло и циклопарафины.

Также предполагается, что термин масло включает "легкое минеральное масло", т.е. масло, которое аналогично получают путем перегонки жидкого парафина, но которое обладает слегка меньшей специфической плотностью по сравнению со светлым минеральным маслом.

Метаболизируемые масла включают метаболизируемые нетоксичные масла. Масло может представлять собой любое растительное масло, рыбий жир, животное масло или синтетически полученное масло, которое может быть метаболизировано в организме субъекта, которому вводят адъювант, и который не является токсическим для субъекта. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна.

Эмульсия масло-в-воде, предложенная в настоящем изобретении, состоит из композиции AMPHIGEN®. Эта композиция содержит водный компонент, лецитин, минеральное масло и поверхностно-активные вещества. Патенты, в которых описаны компоненты композиции, включают US 5084269 и US 6572861.

Типично, масляный компонент настоящего изобретения представлен в количестве от 1% до 50 об.%; или в количестве от 10% до 45%; или в количестве от 20% до 40%.

Другие компоненты композиций могут включать фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как носители, растворители и разбавители, изотонические агенты, буферы, стабилизаторы, консерванты, сосудосуживающие агенты, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты и т.п. Типичные носители, растворители и разбавители включают воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин, масло и т.п. Типичные изотонические агенты включают хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит, лактозу и т.п. Полезные стабилизаторы включают желатин, альбумин и т.п.

Поверхностно-активные вещества используются для того, чтобы способствовать стабилизации эмульсии, выбранной как носитель для адъюванта и антигена. Поверхностно-активные вещества, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают природные биологически совместимые поверхностно-активные вещества и неприродные синтетические поверхностно-активные вещества. Биологически совместимые поверхностно-активные вещества включают фосфолипидные соединения или смесь фосфолипидов. Предпочтительные фосфолипиды представляют собой фосфатидилхолины (лецитин), такие как соевый или яичный лецитин. Лецитин может быть получен в виде смеси фосфатидов и триглицеридов путем промывания водой неочищенных растительных масел и отделения и сушки получающихся в результате гидратированных смол. Очищенный продукт может быть получен путем фракционирования смеси на не растворимые в ацетоне фосфолипиды и гликолипиды, остающиеся после удаления триглицеридов и растительного масла путем ацетоновой промывки. Альтернативно, лецитин может быть получен из различных коммерческих источников. Другие подходящие фосфолипиды включают фосфатидилглицерин, фосфатидилинозит, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту, кардиолипин и фосфатидилэтаноламин. Фосфолипиды могут быть выделены из природных источников или синтезированы обычным образом.

Неприродные синтетические поверхностно-активные вещества, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают основанные на сорбите неионные поверхностно-активные вещества, например, замещенные жирной кислотой поверхностно-активные вещества на основе сорбита (имеющиеся в продаже под названием SPAN® или ARLACEL®), сложные эфиры жирной кислоты и полиэтоксилированного сорбита (TWEEN®), сложные эфиры полиэтиленгликоля и жирных кислот из источников, таких как касторовое масло (EMULFOR®); полиэтоксилированная жирная кислота (например, стеариновая кислота, имеющаяся в наличии под названием SIMULSOL М-53®), полиэтоксилированный изооктилфенол/формальдегидный полимер (TYLOXAPOL®), полиоксиэтиленовые эфиры жирного спирта (BRIJ®); полиоксиэтиленнефенильные эфиры (TRITON® N), полиоксиэтилен изооктилфенильные эфиры (TRITON® X).

В общем, поверхностно-активное вещество или комбинация поверхностно-активных веществ, если используют два или более чем два поверхностно-активных вещества, представлены в эмульсии в количестве от 0,01% до 10% по объему, предпочтительно от 0,1% до 6,0%, более предпочтительно от 0,2% до 5,0%.

Используемый здесь термин "фармацевтически-приемлемый носитель" включает любые и все растворители, диспергирующие среды, оболочки, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты, замедляющие абсорбцию, и т.п. Носитель(и) должен(ны) быть "приемлемым(и)" с точки зрения совместимости с другими компонентами композиции и не вредны для субъекта. Типично, носители являются стерильными и апирогенными, и выбраны в зависимости от используемого способа введения. Специалистам в данной области техники хорошо известно, что предпочтительные композиции для фармацевтически приемлемого носителя, который содержат композиции, представляют собой те фармацевтические носители, которые одобрены в нормативных актах, опубликованных Департаментом сельского хозяйства или Управлением по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств Соединенных Штатов Америки (US), или аналогичным правительственным органом в странах за пределами США. Таким образом, фармацевтически приемлемый носитель для промышленного изготовления композиций представляет собой носитель, который уже одобрен или будет одобрен соответствующим правительственным органом в США или другом государстве.

Композиции возможно могут включать совместимые фармацевтически приемлемые (т.е. стерильные или нетоксические) жидкие, полутвердые или твердые разбавители, которые служат в качестве фармацевтических разбавителей, эксципиентов или сред. Разбавители могут включать воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Изотонические агенты могут включать среди прочих хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит, и лактозу. Стабилизаторы среди прочих включают альбумин.

Композиции также могут содержать антибиотики или консерванты, включающие, например, гентамицин, мертиолат или хлоркрезол. Различные классы антибиотиков или консервантов, из которых производится выбор, хорошо известны специалистам в данной области техники.

Изготовление композиций

Изготовление адъювантных композиций

ISCOM можно приготовить путем комбинирования сапонина, стерола и фосфолипида. Например, ISCOM может содержать от 5% до 10 масс.% Quil A, от 1% до 5 масс.% холестерина и фосфолипидов, а остаток представляет собой белок. Отношение сапонина к стеролу в адъювантных композициях типично имеет порядок от 1:100 масс.% (масс./масс.) до 5:1 масс./масс. В некоторых воплощениях представлен избыток стерола, где отношение сапонина к стеролу составляет по меньшей мере 1:2 масс./масс., или 1:5 масс./масс. В других воплощениях сапонин находится в избытке относительно стерола, и используют отношение сапонина к стеролу приблизительно 5:1 масс./масс. ISCOM и ISCOMATRIX имеются в продаже от Isconova AB (Sweden).

В некоторых воплощениях CARBOPOL® используют в комбинации с DDA в количестве по меньшей мере 0,1 массовой доли CARBOPOL® на массовую долю DDA. В других воплощениях используют по меньшей мере 0,5 массовой доли CARBOPOL® на массовую долю DDA. В других воплощениях используют по меньшей мере 1 массовую долю CARBOPOL® на массовую долю DDA. Комбинация CARBOPOL® и DDA образует комплекс, в котором функциональная группа третичного амина DDA иммунологически функционализирует боковые группы карбоновых кислот на полимере. Последнее дает возможность специфическим иммунным клеткам нацеливаться на антиген и адъювант одновременно и совместно доставлять антиген и адъювант вместе в оптимальное время и концентрации в указанные клетки.

Описанные здесь адъюванты, как правило, не требуют какого-либо специфического носителя, и их готовят в водном или другом фармацевтически приемлемом буфере. В некоторых случаях вакцины в раскрытых воплощениях представлены в подходящем разбавителе, таком как, например дополнительные липосомы, микросферы или инкапсулированные частицы антигена. Антиген может содержаться в везикулярной мембране или содержаться за пределами везикулярной мембраны. Как правило, растворимые антигены находятся за пределами мембраны, а гидрофобные или липидированные антигены содержатся внутри или за пределами мембраны.

Адъювантные композиции могут быть приготовлены в различных формах в зависимости от пути введения, требований хранения и т.п. Например, они могут быть приготовлены в форме стерильных водных растворов или дисперсий, подходящих для инъецированного применения, или приготовлены в лиофилизированных формах с использованием способов сушки замораживанием, сушки в вакууме или сушки распыления. Лиофилизированные композиции могут быть разведены перед использованием в стабилизирующем растворе, например физиологическом растворе или HEPES. Таким образом, адъювантные композиции могут быть использованы в твердой, полутвердой, или жидкой лекарственной форме.

Адъюванты могут быть приготовлены с использованием способов, известных в области техники. Например, сапонин и холестерин могут быть смешаны в подходящие детергенте, а затем с использованием способа экстракции в растворителе с образованием липосом или ISCOM. Сапонин и холестерин также могут быть комбинированы с образованием объемных мицелл, как описано в патенте США №7122191.

Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) может быть использован в виде водной буферной среды; pH буфера может быть нейтральным или слегка щелочным, или слегка кислым. Соответственно, pH может находиться в диапазоне pH от 6 до 8. Обычно pH от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,3. Ионная сила буфера может составлять от 10 до 50 мМ PO4 и от 10 до 150 мМ PO4. В одном из примеров используют 0,063% PBS. pH может быть скорректирован с использованием NaOH или HCl, как необходимо. Типичные концентрации включают от 1 н. до 10 н. HCl и от 1 н. до 10 н. NaOH.

Количество используемого адъюванта зависит от антигена, с которым его используют, и применяемой дозы антигена. Оно также зависит от предполагаемых видов и желаемого препарата. Обычно количество находится в пределах диапазона, обычно используемого для адъювантов. Например, адъюванты типично содержат от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1000 мкг включительно на дозу 1 мл. Аналогично, антибиотики типично содержат от приблизительно 1 мкг до приблизительно 60 мкг включительно на дозу 1 мл.

Адъювантные композиции могут быть гомогенизированы или микрофлюидизированы. Композиции подвергают способу первичного смешивания, типично путем пропускания один или более чем один раз через один или более чем один гомогенизатор. Для этой задачи может быть использован любой имеющийся в продаже гомогенизатор, например эмульгатор Ross (Hauppauge, NY), гомогенизатор Gaulin (Everett, MA) или Microfluidics (Newton, MA). В одном из воплощений композиции гомогенизируют в течение трех минут при 10000 об./мин. Микрофлюидизация может быть достигнута путем использования имеющегося в продаже микрофлюидизатора, такого как модель номер 11OY, доступная от Microfluidics, (Newton, Mass.); Gaulin Model 30CD (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); и Rainnie Minilab Type 8.30Н (Miro Atomizer Food и Dairy, Inc., Hudson, Wis.). Эти микрофлюидизаторы действуют путем проталкивания жидкостей через небольшие щели под высоким давлением, таким образом, что два жидких потока взаимодействуют с высокими скоростями в камере для взаимодействия с образованием композиции с каплями субмикронного размера. В одном из воплощений композиции микрофлюидизируют путем пропускания через камеру с пределом ограничения 200 микрон при 10000+/-500 ф./кв. дюйм (68947570+/-3447378,5 Па).

Описанные здесь адъювантные композиции могут быть гомогенизированы и микрофлюидизированы. В одном из воплощений антиген добавляют к соответствующему буферу. Раствор перемешивают, и сапонин медленно добавляют к раствору антигена. Стерол затем медленно добавляют к раствору антигена/сапонина, а затем медленно добавляют четвертичное аммониевое соединение к раствору антигена/сапонина/стерола. Получающуюся в результате композицию гомогенизируют и затем микрофлюидизируют. После микрофлюидизации полимер добавляют к микрофлюидизированной композиции. В зависимости от используемых компонентов последовательность этих стадий может быть изменена для оптимизации изготовления композиций.

Изготовление иммуногенных и вакцинных композиций

Описанные здесь адъювантные композиции могут быть использованы в изготовлении иммуногенных и вакцинных композиций. Для вакцинных или иммуногенных композиций каждая доза содержит терапевтически эффективное количество антигена или антигенов, которое может варьировать в зависимости от возраста и общего состояния субъекта, пути введения, природы антигена и других факторов. Количества и концентрации других компонентов в вакцинной или иммуногенной композиции могут быть скорректированы таким образом, чтобы модифицировать физические и химические свойства композиции, и легко могут быть определены специалистами в данной области техники. Благоприятное свойство адъювантных композиций заключается в том, что они являются полностью изменяемыми в зависимости от желаемых характеристик композиции. Например, если желателен больший ответ Th1, то количество стимулятора Th1 может быть увеличено. Аналогично, если желателен больший ответ Th2, то количество стимулятора Th2 может быть увеличено. Также может быть достигнут сбалансированный ответ Th1/Th2. Иммуногенные и вакцинные композиции также могут быть гомогенизированы или микрофлюидизированы, как описано выше.

Введение и применение композиций

Введение композиций

Величины доз композиций типично находятся в диапазоне от приблизительно 1 мл до приблизительно 5 мл включительно в зависимости от субъекта и антигена. Например, для животного семейства собачьих или животного семейства кошачьих типично используют дозу приблизительно 1 мл, тогда как для крупного рогатого скота типично используют дозу приблизительно 2-5 мл. Тем не менее, эти адъюванты также могут быть приготовлены в микродозах, где могут быть использованы дозы приблизительно 100 мкл.

Пути введения адъювантных композиций включают парентеральный, пероральный, ороназальный, интраназальный, внутритрахеальный, местный пути введения и в яйцеклетку. Любое подходящее устройство может быть использовано для введения композиций, включая шприцы, капельницы, безыгольные устройства для инъекций, пластыри и т.п. Путь и устройство, выбранные для применения, зависят от композиции адъюванта, антигена и субъекта, и также хорошо известны специалистам в данной области техники.

Применение композиций

Одно из требований для изготовления любого вакцинного адъюванта для коммерческого использования заключается в установлении стабильности раствора адъюванта в течение длительных периодов хранения. Здесь предложены адъювантные композиции, которые легко готовить и которые стабильны в течение по меньшей мере 18 месяцев. В одном из воплощений композиции стабильны в течение приблизительно 18 месяцев. В еще одном воплощении композиции стабильны в течение от приблизительно 18 до приблизительно 24 месяцев. В еще одном воплощении композиции стабильны в течение приблизительно 24 месяцев. Улучшенные процедуры тестирования также свидетельствуют о том, что описанные здесь композиции являются стабильными.

Благоприятное свойство адъювантных композиций по настоящему изобретению заключаются в том, что они могут быть безопасно и эффективно введены широкому диапазону субъектов. В области техники ожидают, что комбинации адъювантов демонстрируют большую реактогенность по сравнению с индивидуальными компонентами. Тем не менее, описанные здесь композиции демонстрируют уменьшенную реактогенность по сравнению с композициями, в которых используют любой один или два компонента, тогда как действие адъюванта сохраняется. Также неожиданно обнаружили, что описанные здесь адъювантные композиции демонстрируют улучшенную безопасность по сравнению с другими адъювантными композициями.

Описанные здесь адъювантные композиции полезны для получения желаемого иммунного ответа у субъекта. Они эффективны в отношении множества видов. Подходящий субъект представляет собой любое животное, для которого введение композиции адъюванта является желательным. Он включает млекопитающих и отличных от млекопитающих животных, включая приматов, домашний скот, животных компаньонов, лабораторных животных, диких животных, помещенных в неволю, птиц (включая в яйцах), рептилий и рыб. Таким образом, этот термин включает обезьян, людей, свиней; коров, овец, коз, лошадей, мышей, крыс, морских свинок, хомячков, кроликов, кошек, собак, кур, индюшек, уток, других домашних птиц, лягушек и ящериц, но не ограничивается ими.

Описанные здесь адъюванты могут быть использованы для того, чтобы продемонстрировать серологическую дифференцировку между инфицированными и вакцинированными животными. Таким образом, они могут быть использованы в маркерной вакцине, в которой антиген в вакцине вызывает у вакцинированных животных картину антител, отличающуюся от картины для вируса дикого типа. Маркерную вакцину, как правило, используют в сочетании с сопутствующим диагностическим тестом, который измеряет различие в картинах антител и демонстрирует то, какое животное вакцинировано, а какие животные инфицированы вирусом дикого типа. Такие способы полезны для контроля и удаления вирусов из популяции субъектов.

Следующие примеры приведены в качестве иллюстративных воплощений, но их не следует рассматривать, как ограничивающие объем изобретения. Множество изменений, вариаций, модификаций и другие применений и приложений данного изобретение будут понятны специалистам в данной области техники.

Примеры

Пример 1. Растворы Quil A/холестерин (QC)

Quil A (Superfos) растворяли в воде и готовили 50 мг/мл исходный раствор. Холестерин (Fabri Chem Inc.) растворяли в этаноле и готовили 18 мг/мл исходный раствор. Исходный раствор холестерина затем фильтровали с использованием 0,2-микронного фильтра.

Диапазон концентраций Quil A и холестерина в различных композициях составлял от 1/1 мкг/мл Quil A к холестерину до 1000/1000 мкг/мл. Для изготовления исходного раствора Quil A/холестерин 50/50 мкг/мл исходный раствор Quil A разбавляли водой до концентрации 50 мкг/мл. При перемешивании этого раствора исходный раствор холестерина медленно добавляли до конечной концентрации 50 мкг/мл.

Пример 2. Растворы DDA (D)

Диметилдиоктадециламмоний бромид (DDA; Fluka Analytical) растворяли в этаноле, и готовили исходный раствор 18 мг/мл. исходный раствор DDA фильтровали с использованием 0,2-микронного фильтра.

Пример 3. Растворы Quil A/холестерин/DDA (QCD)

Исходный раствор Quil A/холестерин готовили, как в Примере 1, до желаемых концентраций. Исходный раствор DDA готовили, как Примере 2, и медленно добавляли к исходному раствору Quil A/холестерин. Растворы смешивали для достижения желаемых конечных концентраций. pH раствора доводили при помощи NaOH или HCl при необходимости для достижения желаемого конечного рН, значение которого обычно находилось в диапазоне от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,5.

Пример 4. Растворы CARBOPOL® (С)

CARBOPOL® (Noveon, Mexico) растворяли в деионизированной воде и готовили 1,5% исходный раствор. В еще одном воплощении CARBOPOL® растворяли в деионизированной воде и готовили 0,75% исходный раствор.

Пример 5. Растворы DDA/CARBOPOL® (DC).

Исходный раствор DDA готовили, как в Примере 2. 0,75% Исходный раствор CARBOPOL® готовили, как в Примере 4. Растворы смешивали для достижения желаемых конечных концентраций.

Пример 6. Растворы Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL® (QCDC)

Исходный раствор Quil A/Холестерин/DDA готовили, как в Примере 3. 0,75% Исходный раствор CARBOPOL® готовили, как в Примере 4. Исходный раствор CARBOPOL® медленно добавляли к исходному раствору Quil A/Холестерин/DDA CARBOPOL® для достижения желаемой конечной концентрации. pH раствора доводили при помощи NaOH или HCl для достижения желаемого конечного значения рН, которое обычно находилось в диапазоне от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,5.

Пример 7. Растворы Bay R1005® (R)

Для приготовления исходного раствора Bay R1005® гликолипид N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканоиламид растворяли в этаноле (60% об./об.). Затем добавляли Tween 20 и ледяную уксусную кислоту. В одном из примеров 3,49 г N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканоиламида растворяли в 44,64 мл смеси этанол/вода (60% об./об.). Его комбинировали с 1,12 мл Tween 20 и 0,68 мл ледяной уксусной кислоты.

Пример 8. Растворы Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL®/Bay R1005® (QCDCR)

Исходный раствор Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL® готовили, как в Примере 6. Исходный раствор Bay R1005® готовили как в Примере 7. Раствор Bay R1005® медленно добавляли к раствору Quil A/Холестерин/DDA/CARBOPOL® для достижения желаемой конечной концентрации. pH раствора доводили при помощи NaOH или HCl при необходимости для достижения желаемого конечного значения рН, которое обычно находилось в диапазоне от приблизительно 6,9 до приблизительно 7,5.

Пример 9. Растворы DEAE Декстран (X)

Исходный раствор DEAE декстран (X) готовили путем растворения 200 мг/мл DEAE декстрана в воде. Раствор можно автоклавировать в течение приблизительно 20 минут при 120°C.

Пример 10. Quil A/Холестерин/DDA/DEAE Растворы (QCDX)

Исходный раствор Quil A/Холестерин/DDA готовили в соответствии с Примером 3. Исходный раствор DEAE готовили в соответствии с Примером 9. Растворы комбинировали путем их добавления непосредственно в гомогенизатор. При смешивании используют способ быстрого смешивания с использованием силы сдвига больше, чем 1000 с-1. Смешивание осуществляют путем подачи водного раствора непосредственно в маслянистую фазу, содержащую неполярные адъюванты и антигенные компоненты, и перемешивания до достижения гомогенной стабильной смеси. Типично процедура может занять минимально несколько минут или больше в зависимости от желаемого размера частиц.

Пример 11. Масляные композиции (О)

Исходный раствор масла готовили путем комбинирования минерального масла Drakeol с Tween 85 и Span 85, нагревания до приблизительно 55°C и затем охлаждения и стерильной фильтрации. Таким образом, эта смесь может содержать основной компонент масляной фазы для носителя на основе масла. Если холестерин и/или DDA выбраны в качестве совместного иммуномодулятора для одной из этих композиций, они также могут быть добавлены к этой смеси перед фильтрованием, поскольку они растворимы в масляной фазе.

Пример 12. Композиции Quil A/Холестерин/ООАЛЭЕАЕ/масло (QCDXO)

Исходный раствор Quil A/Холестерин/DDA/DEAE готовили в соответствии с Примером 10. Масляную исходную композицию готовили в соответствии с Примером 11. Растворы представляли собой комбинацию Quil-A, DEAE-декстрана и воды для достижения количества при указанных концентрациях. Эту водную фазу смешивали путем непрерывного перемешивания реакционной смеси в течение нескольких минут или дольше при комнатной температуре или более высокой температуре и затем подвергали стерильной фильтрации и хранили для добавления к масляной фазе. Водную фазу медленно добавляли в непрерывно перемешиваемую масляную фазу.

Пример 13. Приготовление иммуногенных композиций или вакцинных композиций

Для приготовления иммуногенной композиции или вакцинной композиции, содержащей антиген и один из описанных выше адъювантов, желаемый антиген добавляли к соответствующему буферу. Затем компоненты желаемого адъюванта добавляли, как описано выше. Получающийся в результате раствор доводили до конечного раствора буфером.

Пример 13а. Антиген, Quil A, холестерин, DDA, CARBOPOL®

Для приготовления иммуногенной композиции или вакцинной композиции, содержащей антиген, Quil A, холестерин, DDA и CARBOPOL®, желаемый антиген добавляли к соответствующему буферу. Исходный раствор Quil A готовили, как в Примере 1, и медленно добавляли к раствору антигена. Исходный раствор холестерина готовили как в Примере 1 и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A. Исходный раствор DDA готовили, как в Примере 2, и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A/холестерин. Раствор антиген/Quil A/холестерин/DDA гомогенизировали и микрофлюидизировали. 0,75% раствор CARBOPOL® готовили, как в Примере 4. После микрофлюидизации раствор CARBOPOL® (0,05% об./об.) добавляли к микрофлюидизированной композиции, и pH доводили при помощи NaOH или HCl до приблизительно от 6,9 до приблизительно 7,5.

Пример 13b. Антиген, Quil A, холестерин, DDA, CARBOPOL®, Bay R1005®

Для приготовления иммуногенной композиции или вакцинной композиции, содержащей антиген, Quil A, холестерин, DDA, CARBOPOL® и Bay R1005®, желаемый антиген добавляли к соответствующему буферу. Исходный раствор Quil A готовили, как в Примере 1, и медленно добавляли к раствору антигена. Исходный раствор холестерина готовили, как в Примере 1, и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A. Исходный раствор DDA готовили, как в Примере 2, и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A/холестерин. Раствор антиген/Quil A/холестерин/DDA гомогенизировали и микрофлюидизировали. 0,75% раствор CARBOPOL® готовили, как в Примере 4. После микрофлюидизации раствор CARBOPOL® (0,05% об./об.) добавляли к микрофлюидизированной композиции, и pH доводили при помощи NaOH или HCl до приблизительно от 6,9 до приблизительно 7,5. Исходный раствор Bay R1005® готовили, как в Примере 7. Компонент Bay R1005® добавляли к водной фазе после добавления DDA.

Пример 13с. Антиген, Quil A, холестерин, DDA, DEAE декстран

Для приготовления иммуногенной композиции или вакцинной композиции, содержащей антиген, Quil A, холестерин, DDA, и DEAE декстран, желаемый антиген добавляли к соответствующему буферу. Исходный раствор Quil A готовили, как в Примере 1, и медленно добавляли к раствору антигена. Композицию гомогенизировали. Исходный раствор холестерина готовили, как в Примере 1, и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A во время гомогенизации. Исходный раствор DDA готовили, как в Примере 2, и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A/холестерин во время гомогенизации. Раствор DEAE декстран готовили, как в Примере 9. Во время гомогенизации раствор DEAE добавляли декстран, и получающуюся в результате композицию доводили до конечного объема.

Пример 13d. Антиген, Quil A, холестерин, DDA, DEAE декстран, масло

Для приготовления иммуногенной композиции или вакцинной композиции, содержащей антиген, Quil A, холестерин, DDA, DEAE декстран и масло, желаемый антиген добавляли к соответствующему буферу. Исходный раствор Quil A готовили, как в Примере 1, и медленно добавляли к раствору антигена. Композицию гомогенизировали. Исходный раствор холестерина готовили, как в Примере 1, и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A во время гомогенизации. Исходный раствор DDA готовили, как в Примере 2, и медленно добавляли к раствору антиген/Quil A/холестерин во время гомогенизации. Раствор DEAE декстран готовили, как в Примере 9. Во время гомогенизации добавляли раствор DEAE декстран. Масляную композицию готовили, как в Примере 11. Во время гомогенизации масляную композицию добавляли путем подачи водной фазы в масляную фазу при гомогенизации, и получающуюся в результате композицию доводили до конечного объема.

Пример 14. Вакцины против вируса лейкемии кошек (FeLV)

Животных случайным образом распределяли на обрабатываемые группы с использованием рандомизированной полноблочной схемы. В таблице 1 представлена схема исследования. Блоки основаны на дате рождения и помете. Животных сортировали по дате рождения и затем помету. Использовали блоки по четыре. В блоке животных случайным образом распределяли для обработки. Для фазы вакцинирования исследования два последовательных блока объединяли с образованием группы из восьми животных. Группы животных случайным образом распределяли по двум комнатам, таким образом, что в каждой комнате содержалось по пять групп (10 блоков) животных. В группе животных их случайным образом распределяли на четыре клетки, располагающиеся рядом друг с другом, таким образом, что в каждой клетке содержалось по два животных для одной и той же обработки. Для сенсибилизирующей фазы исследования животных из одной комнаты для вакцинации случайным образом распределяли в одну или две комнаты для сенсибилизации. Комната для вакцинации выбрана таким образом, чтобы переходить в две комнаты для сенсибилизации, имеет пять блоков, случайным образом выбранных для каждой из комнат для сенсибилизации (2,5 группы; 20 животных). Другая комната для сенсибилизации содержала 10 блоков (5 групп; 40 животных). В комнате для сенсибилизации животных в одном и том же блоке случайным образом распределяли на четыре клетки, расположенные друг рядом с другом.

Вакцины для этого исследования готовили, как в Примере 13, за исключением того, что использовали 1,5% исходный раствор CARBOPOL®. Конкретно, LEUKOCELL® 2 (Pfizer, Inc.) готовили путем размножения FeLV, подгрупп А, В и С в FeLV-трансформированныхлимфоидных клетках. Вирусные антигены химически инактивировали, комбинировали со стерильным адъювантом для усиления иммунного ответа и упаковывали в жидкую форму. Готовили в общем 100 мл исследовательского ветеринарного продукта (IVP), содержащего вирус лейкемии кошек и 25 мкг Quil A/гидроксид алюминия (ALHYDROGEL®). В общей сложности 94,5 мл 1,106×105 нг/мл исходного раствора FeLV медленно смешивали в течение 15 минут. pH доводили до 5,9-6,1 при помощи 4 н. HCl или 18% NaOH, при необходимости. При перемешивании 0,5 мл 5,0 мг/мл раствора Quit А добавляли к раствору антигена. Затем медленно добавляли 5,0 мл 100% об./об. ALHYDROGEL®. Композицию перемешивали в течение минимум 2 часов при 4°C. pH при необходимости доводили до 7,0-7,3 при помощи 18% NaOH или 1 н. HCl.

IVP, содержащий вирус лейкемии кошек и 37,5 мкг Quil A/гидроксид алюминия (ALHYDROGEL®) готовили таким же образом, как 25 мкг Quil A IVP, но 7,5 мл исходного раствора Quil A добавляли к раствору антигена.

Готовили в общем 350 мл исследовательского ветеринарного продукта (IVP), содержащего вирус лейкемии кошек, Quil A, холестерин, DDA и CARBOPOL®. При перемешивании 349,3 мл исходного раствора 1,106×105 нг/мл FeLV, 0,14 мл 50,0 мг/мл раствора Quil A медленно добавляли к раствору антигена. Затем медленно добавляли 0,39 мл 18 мг/мл раствора холестерин/этанол. Композицию гомогенизировали в течение трех минут при 10000 об./мин. В общем 0,19 мл 18,0 мг/мл раствора DDA/этанол добавляли к композиции при перемешивании. В общем 5,0 мл 1.5% раствора CARBOPOL® медленно добавляли к 145,0 мл композиции вируса лейкемии кошек, Quil A, холестерина и DDA. pH при необходимости доводили до 7,0-7,3 при помощи 18% NaOH или 1 н. HCl.

За всеми животными наблюдали ежесуточно, и результаты наблюдения регистрировали. Температуру организма регистрировали для всех животных при помощи тимпанального пути за 1 сутки до введения первой дозы вакцины и на 20 сутки до введения второй дозы вакцины. Образец крови (1,0-2,0 мл) отбирали у каждого животного путем венепункции яремной вены, на сутки -2. седативные дозы TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) вводили в соответствии с массой организма (приблизительно 5,0 мг/кг) внутримышечным путем для минимизации стресса у животных и для того, чтобы избежать повреждений у тех лиц, которые держат животных во время отбора крови. Кровь отбирали в пробирки для отделения сыворотки крови (SST) и подвергали отделению сыворотки крови. Сыворотку крови хранили при -20°C или при более низкой температуре до тестирования.

Плацебо или FeLV вакцины вводили котятам подкожным путем в дозе 1,0 мл. Первую вакцинацию осуществляли на 0 сутки, и второе введение вакцины осуществляли на 21 сутки. За всеми животными наблюдали в течение приблизительно одного часа после первой и второй вакцинаций в отношении немедленных локальных реакций (реакций острой боли). Наблюдения документировали. Температуру организма всех животных измеряли тимпанальным путем на 1 и 2 сутки после введения первой дозы вакцины и на 22 и 23 сутки после введения второй дозы вакцины. Реакции в области инъекции (припухлость) также определяли на 1 сутки после первой вакцинации и на 22 и 23 сутки после второй вакцинации. Образец крови (1,0-2,0 мл) отбирали у каждого животного путем венепункции яремной вены, на 35 сутки подвергали отделению сыворотки крови, и хранили при -20°C или при более низкой температуре до тестирования.

На 35 сутки животных помещали в индивидуальные изолирующие клетки. Сенсибилизирующий вирус представлял собой вирус лейкемии кошек (FeLV), штамм Rickard, титровали до приблизительно 106.1 TCID50/мл. Сенсибилизирующий материал FeLV оттаивали и хранили на жидком льду до введения. Животных сенсибилизировали на 37, 40, 42 и 44 сутки путем введения назальным путем 1,0 мл неразведенного сенсибилизирующего материала. Шприц для введения туберкулина объемом 1 мл без иглы заполняли сенсибилизирующим материалом. Каждому котенку вводили приблизительно 0,5 мл в ноздрю. На 42 сутки сенсибилизации введение осуществляли приблизительно через 5 ч после введения DEPO-MEDROL®. После каждых суток сенсибилизации образец сенсибилизирующего материала сохраняли для подтверждающего титрования.

После сенсибилизации образец крови (1,0-2,0 мл) отбирали у каждого животного путем венепункции яремной вены на 64, 85, 106, 127, 134, 141, 148 и 155 сутки. Седативные дозы TELAZOL® (Fort Dodge) вводили, как описано выше. Кровь отбирали в пробирки для отделения сыворотки крови (SST), подвергали отделению сыворотки крови и хранили при -20°C или при более низкой температуре до тестирования. Образцы сыворотки крови тестировали в отношении присутствия антигена FeLV p27 (маркер инфекции FeLV) при помощи ELISA (иммуноферментный анализ) (IDEXX; Westbrook, ME). Конечные результаты оценивали по интенсивности развития окраски и при помощи спектрофотометра при оптической плотности 405/490 нм. Для валидного теста оптическая плотность положительного контроля составляла от 0,131 до 2,999, и отрицательный контроль должен иметь оптическую плотность ниже или равную 0,0039.

Выделение вируса осуществляли с использованием образцов сыворотки крови, отобранных на сутки -2 и 35. Образцы сыворотки крови, отобранные на сутки 127-155, предполагали использовать для оценки эффективности вакцины FeLV. Образцы сыворотки крови, отобранные на 127 сутки (12 неделя), 134 сутки (13 неделя), 141 сутки (14 неделя), 148 сутки (15 неделя) и 155 сутки (16 неделя) тестировали в отношении присутствия FeLV p27 антигена. Полагали, что животное устойчиво инфицировано в том случае, если оно демонстрирует три или более чем три положительных результатов теста на FeLV p27 антиген в течение периода от 127 суток (12 неделя) по 155 сутки (16 неделя).

Температуры анализировали с использованием общей линейной смешанной модели с повторными измерениями, и двухточечные сравнения после обработок осуществляли между обработкой Т01 и обработками Т02, Т03, и Т04 в каждый момент времени, если действие для общей обработки и/или действие для обработки в момент времени являются значимыми. Пределы среднего, 95% доверительные интервалы, минимальные и максимальные значения рассчитывали для каждой обработки в каждый момент времени.

Распределения частот присутствия реакций острой боли рассчитывали для каждой обработки, и данные для моментов времени собирали. Распределения частот присутствия набухания в области инъекции рассчитывали для каждой обработки и данные для моментов времени собирали. Распределения частот присутствия системных реакций после вакцинации рассчитывали для каждой обработки.

Немедленные реакции не обнаружили ни в одной из обрабатываемых групп во время первой и второй вакцинации. Отрицательные реакции не обнаружены ни в одной из обрабатываемых групп через приблизительно один час после первой или второй вакцинаций. Ни гипертермия (температура организма ≥39,5°C), ни гипотермия (температура организма <37,0°C) не обнаружена ни для одной из обрабатываемых групп после первой и второй вакцинаций. Отсутствовали значимые различия в средней температуре организма между обрабатываемыми группами в любой момент времени (p>0,08). Припухлости в области инъекции не обнаружены ни в одной из обрабатываемых групп после первой и второй вакцинаций.

Конечные результаты с недели 12 до недели 16 после сенсибилизации свидетельствовали о том, что 16 из 19 животных (84%), которые получили вакцину плацебо (группа Т01), были устойчиво виремическими в отношении FeLV. 13 из 19 животных (68%) в группе Т02 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV. Уровень защиты был статистически значимым (p=0,0004) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. 12 из 19 животных (63%) в группе ТОЗ были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV. Уровень защиты был статистически значимым (p=0,0013) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. 19 из 20 животных (95%) в группе Т04 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV. Уровень защиты был статистически значимым (p=0,0001) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо.

Таким образом, все вакцины, вводимые группам Т02, Т03 и Т04, как продемонстрировано, были безопасны для котят в минимальном возрасте при введении в двухдозовой схеме, с интервалом в три недели. Дополнительно, вакцины, вводимые этим группам, также способны значительно уменьшить уровень устойчивой виремии FeLV у котят в минимальном возрасте при введении в двухдозовой схеме с интервалом в три недели. Существует статистически значимое уменьшение в образовании устойчивой виремии FeLV у котят в группах Т02, Т03 и Т04. Дополнительно, существует статистически значимое различие между Т04 и другими вакцинируемыми группами (Т02, Т03). Удивительно и необычно, что вакцины, содержащие новую адъювантную композицию, как оказалось, являются более эффективными по сравнению с вакцинами, содержащими адъювантные компоненты, обычно используемые у кошек.

Пример 15. Вакцины против вируса лейкемии кошек

Котят акклиматизировали в течение шестнадцати суток после прибытия. Животных случайным образом распределяли по комнатам и внутри комнаты, случайным образом распределяли на обрабатываемые группы (1 животное на обработку в каждой комнате). Образец крови (1,0-2,0 мл) отбирали у каждого животного путем венепункции яремной вены на сутки исследования -1. Седативные дозы TELAZOL® (Fort Dodge Animal Health) вводили в соответствии с массой тела (приблизительно 5,0 мг/кг) внутримышечным путем для минимизации стресса у животных и для того, чтобы избежать повреждения лиц, удерживающих животных во время отбора крови. Кровь отбирали в пробирки для отделения сыворотки крови и подвергали отделению сыворотки крови. За всеми животными также ежесуточно наблюдали, и результаты наблюдений регистрировали.

Вакцины готовили, как в Примере 13, за исключением того, что использовали 1,5% исходный раствор CARBOPOL®. LEUKOCELL® 2 готовили путем размножения FeLV, подгруппы A, B и C, в FeLV-трансформированных лимфоидных клетках. Вирусные антигены химически инактивировали, комбинировали со стерильным адъювантом для усиления иммунного ответа и упаковывали в жидкие формы. Общее количество 500,0 мл IVP, содержащего вирус лейкемии кошек с относительной силой (RP) 2, Quil A, холестерин и DDA, готовили следующим образом. В общем 20,7 мл исходного раствора FeLV (50,0 RP/мл, где 1 RP=3,624 нг/мл антигена) добавляли к 478,2 мл 0,063% буфера PBS. При перемешивании медленно добавляли 0,21 мл 50,0 мг/мл раствора Quil A к раствору антигена. Затем медленно добавляли 0,58 мл 18 мг/мл раствора холестерин/этанол. В общем 0,29 мл 18,0 мг/мл раствора DDA/этанол медленно добавляли к композиции при перемешивании. Композицию гомогенизировали в течение трех минут при 10000 об./мин. Композицию затем микрофлюидизировали путем однократного пропускания через камеру с ограничением по размеру 200 микрон при 10000 (+/-500) ф./кв. дюйм (68947570 +/-3447378,5 Па). При перемешивании 10,0 мл 1,5% раствора CARBOPOL® медленно добавляли к 290,0 мл композиции вируса лейкемии кошек, Quil A, холестерина и DDA. Значение pH при необходимости доводили до 7,0-7,3 при помощи 18% NaOH или 1 н. HCl.

IVP, содержащий вирус лейкемии кошек с RP 5, готовили тем же самым образом, как IVP с RP 2, с использованием 51,7 мл исходного раствора FeLV и 447,2 мл 0,063% буфера PBS, причем количества других компонентов остаются теми же самыми.

IVP, содержащий вирус лейкемии кошек с RP 10, готовили тем же самым образом, как IVP с RP 2 с использованием 93,1 мл исходного раствора FeLV, 355,9 мл 0,063% буфера PBS, 0,19 мл раствора Quil A, 0,52 мл раствора холестерина, и 0,26 мл раствора DDA (общий объем 450 мл). Затем 8,3 мл 1,5% раствора CARBOPOL® медленно добавляли к 241,7 мл композиции вируса лейкемии кошек, Quit А, холестерина и DDA.

IVP, содержащий вирус лейкемии кошек с RP 15, готовили тем же самым образом, как IVP с RP 10, с использованием 139,7 мл исходного раствора FeLV и 309,4 мл 0,063% буфера PBS, причем количества других компонентов остаются теми же самыми.

IVP, содержащий вирус лейкемии кошек с RP 20, готовили тем же самым образом, как IVP с RP 2, с использованием 206,9 мл исходного раствора FeLV и 292,0 мл 0,063% буфера PBS, причем количества других компонентов остаются теми же самыми.

Для введения 0,5 мл дозы 300,0 мл IVP, содержащего вирус лейкемии кошек с RP 5, Quil A, холестерин, DDA и CARBOPOL®, готовили следующим образом. В общем 21,7 мл исходного раствора FeLV (35,8 RP/мл, где 1 RP=1,864 мкг/мл антигена) добавляли к 277,7 мл 0,063% буфера PBS. При перемешивании 0,12 мл 50,0 мг/мл раствора Quil A медленно добавляли к раствору антигена. Затем медленно добавляли 0,35 мл 18 мг/мл раствора холестерин/этанол. В общем 0,17 мл 18,0 мг/мл раствора DDA/этанол медленно добавляли к композиции при перемешивании. Композицию гомогенизировали в течение трех минут при 10000 об./мин. Композицию затем микрофлюидизировали путем однократного пропускания через камеру с ограничением по размеру 200 микрон при 10000(+/-500) ф./кв. дюйм (68947570 +/-3447378,5 Па). При перемешивании медленно добавляли 3,3 мл 1,5% раствора CARBOPOL® к 96,7 мл композиции вируса лейкемии кошек, Quil A, холестерина и DDA. pH при необходимости доводили до 7,0-7,3 при помощи 18% NaOH или 1 н. HCl.

IVP для введения 1,0 мл дозы вируса лейкемии кошек с RP 5, Quil A, холестерин, DDA и CARBOPOL® готовили тем же самым образом, как для дозы 0,5 мл с количествами, скорректированными соответствующим образом.

Готовили общее количество 300,0 мл IVP, содержащего вирус лейкемии кошек с RP 10 и CARBOPOL®. В общем 62,1 мл исходного раствора FeLV (50,0 RP/мл, где 1 RP=3,624 мкг/мл антигена) добавляли к 237,9 мл 0,063% буфера PBS. Композицию гомогенизировали в течение трех минут при 10000 об./мин. Композицию затем микрофлюидизировали путем однократного пропускания через камеру с ограничением по размеру 200 микрон при 10000 (+/-500) ф./кв. дюйм (68947570+/-3447378,5 Па). При перемешивании 3,3 мл 1,5% раствора CARBOPOL® медленно добавляли к 96,7 мл композиции вируса лейкемии кошек. pH при необходимости доводили до 7,0-7,3 при помощи 18% NaOH или 1 н. HCl.

Плацебо и вакцины FeLV (таблица 2) вводили котятам подкожным путем с использованием иглы 22 калибра × ¾" и шприца 3 мл на 0 сутки исследования и 20 сутки исследования. Обрабатываемой группе Т01 вводили вакцину плацебо в дозе 1,0 мл. Обрабатываемым группам Т02, Т04, Т05, Т06, Т07, Т08 и Т09 вводили вакцины FeLV в дозе 1,0 мл. Обрабатываемой группе Т03 вводили вакцину FeLV в дозе 0,5 мл. Обрабатываемой группе Т10 вводили вакцину FeLV canarypox (Merial) внутрикожным путем с использованием внутрикожного пушечного инжектора.

Таблица 2
Схема эксперимента
Обра-батыва-емая группа Кол-во животных Целевая относительная сила Путь вакцинации Вакцина Адъювант Культуральные клеточные среды (Harvest Bulk)
Т01 10 N.A. SC PBS Отсутствие адъюванта Нормальный физиологический раствор
Т02 10 5 RP sc Инактивированный FeLV Quil A-Холестерин DDA-CARBOPOL® RPM1
Т03 10 5 RP SC/0,5 мл Инактивированный FeLV Quil A-Холестерин DDA-CARBOPOL® RPMI
Т04 10 20 RP SC Инактивированный FeLV Quil A-Холестерин DDA-CARBOPOL® Cellgro
Т05 10 15 RP SC Инактивированный FeLV Quil A-Холестерин DDA-CARBOPOL® Cellgro
Т06 10 10 RP SC Инактивированный FeLV Quil A-Холестерин DDA-CARBOPOL® Cellgro
Т07 10 5RP SC Инактивированный FeLV Quil A-Холестерин DDA-CARBOPOL® Cellgro
Т08 10 2RP SC Инактивированный FeLV Quil A-Холестерин DDA-CARBOPOL® Cellgro
Т09 10 10 RP SC Инактивированный FeLV CARBOPOL® Cellgro
Т10 10 Живой rFeLV (Merial) ID Live rFeLV (Merial) Отсутствие адъюванта Запатентованные (Merial)

За всеми животными наблюдали после первой вакцинации (0 сутки исследования) и второй вакцинации (20 сутки исследования) в отношении симптомов боли после введения тестируемой вакцины, включающих голосовые сигналы, расчесывание/покусывание и агрессивные попытки или попытки побега. Также документировали состояние после вакцинации (нормальное или аномальное). За всеми животными наблюдали в течение приблизительно одного часа после введения вакцины на 0 сутки исследования и 20 сутки исследования в отношении развития неблагоприятных системных реакций. Результаты наблюдений документировали. Области вакцинации пальпировали, и регистрировали боль в области инъекции, покраснение в области инъекции, набухание в области инъекции и размер набухания. Наблюдения осуществляли на 2, 5 и 9 сутки исследования после первой вакцинации, и на 25, 28 и 32 сутки исследования после второй вакцинации. Результаты наблюдения документировали.

Образец крови (1,0-2,0 мл) отбирали у каждого животного путем венепункции яремной вены на 32 сутки исследования (до сенсибилизации). Животных сенсибилизировали на 34, 36, 39 и 41 сутки исследования путем введения назальным путем 1,0 мл неразведенного сенсибилизирующего материала. Шприц для туберкулина объемом 1 мл без иглы заполняли сенсибилизирующим материалом. Каждому котенку вводили приблизительно 0,5 мл в ноздрю. Сенсибилизирующий материал FeLV имел средний титр 1061 TCID50/мл. Образец крови (1,0-2,0 мл) затем отбирали у каждого животного путем венепункции яремной вены на 61, 83, 106, 126, 133, 138, 146 и 152 сутки исследования.

Результаты - Безопасность

Во время первой вакцинации (0 сутки исследования) трое животных в обрабатываемой группе Т09 продемонстрировали немедленные реакции типа острой боли. Во время второй вакцинации (20 сутки исследования) одно животное из обрабатываемой группы Т05, четыре из обрабатываемой группы Т08 и двое из обрабатываемой группы Т09 продемонстрировали немедленные реакции типа острой боли.

Во время первой вакцинации трое животных из обрабатываемой группы Т09 подавали умеренные голосовые сигналы. Животные, демонстрирующие боль при первой вакцинации, также подавали умеренные голосовые сигналы в это же время. Во время второй вакцинации одно животное из обрабатываемой группы Т05, четыре из обрабатываемой группы Т08 и двое из обрабатываемой группы Т09 подавали умеренные голосовые сигналы. Животные, демонстрирующие боль при второй вакцинации, также подавали умеренные голосовые сигналы в это же время.

Во время первой вакцинации трое животных в обрабатываемой группе Т09 продемонстрировали агрессивное поведение/попытку убежать. Во время второй вакцинации одно животное из обрабатываемой группы Т05, четыре из обрабатываемой группы Т08 и двое из обрабатываемой группы Т09 продемонстрировали агрессивное поведение/попытку убежать.

Ни в одной из обрабатываемых групп не продемонстрировано расчесывание/покусывание в области инъекции после первой или второй вакцинации. Реакции в области инъекции не обнаружены ни в одной из обрабатываемых групп после первой или второй вакцинации. Неблагоприятные реакции также не обнаружили ни в одной из обрабатываемых групп.

Результаты - Эффективность

Все животные продемонстрировали отрицательную реакцию в тесте до вакцинации антигеном FeLV p27 из образцов сыворотки крови, отобранных на сутки -1. Все животные также продемонстрировали отрицательную реакцию в тесте до сенсибилизации антигеном FeLV p27 из образцов сыворотки крови, отобранных на 32 сутки.

Конечные результаты, полученные на 12-16 неделе после сенсибилизации (таблица 3) свидетельствуют о том, что 9 из 10 животных (90%) в обрабатываемой группе Т01 (плацебо) были устойчиво виремическими в отношении FeLV. Результаты за тот же самый период свидетельствуют о том, что 6 из 10 животных (60%) в обрабатываемой группе Т02 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты не был статистически значимым (р=0,0573) по сравнению с плацебо вакцинированными котятами. Девять из 10 животных (90%) в обрабатываемой группе ТОЗ были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты был статистически значимым (р=0,0011) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. 10 из 10 животных (100%) в обрабатываемой группе Т04 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты был статистически значимым (р=0,0001) по сравнению с плацебо вакцинированными котятами. 10 из 10 животных (100%) в обрабатываемой группе Т05 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты был статистически значимым (р=0,0001) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. 7 из 10 животных (70%) в обрабатываемой группе Т06 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты был статистически значимым (р=0,0198) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. 10 из 10 животных (100%) в обрабатываемой группе Т07 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты был статистически значимым (р=0,0001) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. 8 из 10 животных (80%) в обрабатываемой группе Т08 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты был статистически значимым (р=0,0055) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. 5 из 10 животных (50%) в обрабатываемой группе Т09 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты не был статистически значимым (р=0,1409) по сравнению с котятами, вакцинированными плацебо. Наконец 6 из 10 животных (60%) в обрабатываемой группе Т10 были защищены от вирулентной сенсибилизации FeLV; этот уровень защиты не был статистически вакцинированными котятами, вакцинированными плацебо.

Таблица 3
Обобщенная информация относительно уровня защиты
Обрабатываемая группа Относительная сила вакцины Уровень защиты Предупреждающая доля
Т01 NA 10%
Т02 4,58 60% 55,6%
Т03 4,58 90% 88,9%
Т04 26,32 100% 100%
Т05 18,58 100% 100%
Т06 11,16 70% 66,7%
Т07 4,77 100% 100%
Т08 1,64 80% 77,8%
Т09 11,12 50% 44,4%

Обсуждение

Вакцины, используемые в обрабатываемых группах Т02, Т03, Т04, Т06 и Т07, демонстрировали удовлетворительный профиль безопасности во время первой вакцинации, поскольку в этот момент не наблюдали никаких реакций. Одно животное в обрабатываемой группе Т05 демонстрировало немедленную реакцию (боль при введении, умеренные голосовые сигналы и попытку агрессии/попытку убежать) после второй вакцинации. Это явление может быть связано с усиленным ответом на вакцинацию для конкретного животного, нежели чем с проблемой в вакцинной композиции. Все вакцины демонстрировали удовлетворительный профиль безопасности после вакцинации, поскольку не обнаружили ни одну из локальных реакций, а также неблагоприятные явления, связанные с вакцинацией.

Вакцины FeLV, вводимые обрабатываемым группам Т03, Т04, Т05, Т07 и Т08, демонстрировали удовлетворительную эффективность, поскольку ≥80% защита (≥75% предупреждающая доля) достигалась после сенсибилизации вирулентным FeLV. То, что вакцина, вводимая группе Т07, обеспечивала 100% защиту, является удивительным и неожиданным, поскольку животные в этой группе получали 25% и 33% дозы антигена животных в группах Т04 и Т05, соответственно. Очевидное преимущество раскрытых и тестированных здесь адъювантов заключается в том, что они дают возможность для использования меньшей дозы антигена, все же вызывая полностью защитный иммунный ответ. Вакцины, вводимые обрабатываемым группам Т02, Т06 и Т09, демонстрировали в некоторой степени уменьшенную эффективность (<80% защита; предупреждающая доля <75%) после сенсибилизации вирулентным FeLV. Уменьшенная эффективность вакцины, вводимой обрабатываемой группе Т02, вероятность обусловлена присутствием в этой группе животных с низким ответом.

Пример 16. In ovo вакцинация против Eimeria у цыплят

Кокцидиоз у птиц представляет собой кишечное заболевание, как правило, вызываемое простейшими рода Eimeria, и представляющее собой серьезную проблему по всему миру для индустрии птицеводства. Паразиты, поглощенные при кормлении, располагаются в кишечном тракте, где они вызывают серьезное поражение кишечных и нижележащих тканей. Возникающие в результате экономические потери для индустрии птицеводства являются очень значительными, поскольку нарушается превращение корма и прирост массы организма бройлеров и несушек. Общее состояние области техники, включая попытки вакцинации против Eimeria с использованием, например, рекомбинантных белков Eimeria в качестве антигена и различных адъювантных систем, описано в следующих публикациях, все из которых включены сюда путем ссылки, как здесь изложено (1) M.S.Lillehoj et al., J. Pahsitol, 91 (3), 2005, pp.666-673; (2) H.S. Lillehoj et al., Avian Diseases, 49 2005, 112-117; и (3) R.A. Dalloul et al. Expert Rev. Vaccines, 5 (1), 2006, pp.143-163. Настоящий пример относится к применению новых вакцинных композиций, в которых используются адъювантные компоненты, которые обеспечивают превосходные характеристики в отношении кокцидиоза.

Высокоэффективные адъюванты по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с антигенным материалом всех видов Eimeria, включая их очищенные или частично очищенные белковые экстракты, или при помощи их одного или более чем одного рекомбинантно экспрессирующихся белков, или фрагментов любого или всех из таких белков, таким образом включая антигенные материалы, полученные среди прочих из Eimeria acervulina, Eimeria ahsata, Eimeria bovis, Eimeria brunetti, Eimeria fraterculae, Eimeria maxima, Eimeria meleagridis, Eimeria mitis, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria stiedae, Eimeria tenella и Eimeria zurnii.

Адъювантная вакцина по изобретению может быть предложена против любого белка или макромолекулы, которая продуцируется на одной или более чем одной точке в жизненном цикле простейшего организма, включая ооцисту (спорулированную или неспорулированную), спороцисту, спорозоит, шизонт, мерозоит, гаметы самцов или самок, но не ограничивающегося ими. В предпочтительном примере белки, которые распространяются в экскрементах в значительных количествах на стадии ооцисты, представляют собой предпочтительные материалы, действующие в качестве источника рекомбинантного белкового антигена, или частично или полностью очищенные образцы такого белка, очищенные при помощи обычных способов.

Дополнительные примеры белков Eimeria, полезные в качестве источников антигена в композиции вакцин по настоящему изобретению, включают описанные Karkhanis et al. Infection and Immunity, 1991, pp.983-989, включая описанные здесь защитные антигены, имеющие диапазон масс от приблизительно 20 до приблизительно 30 кДа. Дополнительный пример включает белок Eimeria 23 кДа 3-1 Е, и белок Etp100, например выделенный из Е. tenella.

Высокоэффективные адъюванты по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с антигенным материалом из Neurospora caninum.

Дополнительно, высокоэффективные адъюванты по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинации с любым из следующих патогенов простейших: Cryptosporidium parvum (криптоспоридиоз), Cyclospora cayetanensis (циклоспориаз), Isospora belli (изоспориаз), Toxoplasma gondii (токсоплазмоз), Plasmodium (малярия) и Babesia spp. (бабезиоз), и родственные простейшие, как правило группы Apicomplexen, вызывающие эти или близкие заболевания.

Эффективность доставки in ovo вакцины, которая содержит, в частности адъювантные системы, оценивали следующим образом.

Материалы и способы

1. Материалы:

Рекомбинантный белок Е. maxima (белка 3-1 Е) экспрессировали in E. coli и очищали на аффинной колонке. Неочищенный препарат из целых клеток макромолекул Е. maxima (солюбилизированных с детергентом из разрушенных клеток) также использовали в качестве антигена, где этот неочищенный антиген назван как "ЕМ". В предпочтительном примере адъювант представлял собой адъювант, как описано в вышеприведенном примере 8, и его готовят как предложено в соответствии с протоколом примера (смотри стр.41). Таким образом, в типичном примере каждый эмбрион может получать инъекцию в амнион (т.е. включая амниотическую жидкость и пространство) от приблизительно 50 до приблизительно 100 микролитров раствора вакцины, где каждый его 1 мл содержит: приблизительно 50 или 100 микрограмм рекомбинантного белка 3-1 Е или других белковых частиц, или альтернативно, приблизительно 50 или 100 микрограмм неочищенного клеточного экстракта "ЕМ"; приблизительно 20 микрограмм Quil A; приблизительно 20 микрограмм холестерина; CARBOPOL в количестве приблизительно 0,075% (об./об.); приблизительно 10 микрограмм DDA; и приблизительно 250 микрограмм R1005, все находятся, например в 20 мМ PBS.

В связи с выбором сапонина для применения здесь следующая дополнительная информация является полезной. Определенный термин сапонин относится к гликозидам, полученным из растений, множество которых широко исследовалось в отношении их биологических свойств (The Plant Glycosides, Mcllroy, R.J., Edward Arnold and со., London, 1951). Сапонины, преимущественно используемые в области техники для получения вакцин, представляют собой сапонины, полученные из растений Quillaja saponaha molina, Aesculus hippocastanum или Gyophilla struthium. Известны экстракты коры Quillaja saponaria molina, которые, как известно, обладают адъювантной активностью, например, Quil A. Также описаны чистые фракции Quil A, которые сохраняют адъювантную активность, в то же время являются менее токсичными, чем Quil A, например QS21. QS21 также описан в Kensil et al. (1991. J. Immunology vol 146, 431-437). При смешивании с дополнительными адъювантными ингредиентами по настоящему изобретению, описанными ранее и далее, такие сапонинсодержащие материалы становятся высокоэффективными материалами. Дополнительные эффективные композиции включают композиции, в которых используется эсцин, описанный в Merck index (12-е изд.: статья 3737), в виде смеси сапонинов, обнаруженных в семенах конского каштана. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения сапонин относится к "Quil-A", продаваемому в США компанией Е.М Sergeant.

Дополнительно должно быть понятно, что экстракты сапонина могут быть использованы в виде смесей или их очищенных индивидуальных компонентов, такие фракции/продукты включают QS-7, QS-17, QS-18 и QS-21 от Antigenics Company, Massachusetts, USA, или похожие неочищенные фракционированные или очищенные сапониновые продукты, и их смеси, предлагаемые Isconova Company из Швеции. В одном из воплощений Quil A является, по меньшей мере, на 85% чистым. В других воплощениях Quil A является, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% чистым.

2. Вакцинация эмбриона

Яйца приобретали из Moyers Hatchery, Quakertown, PA. Для иммунизации in ovo яйца бройлеров затем инкубировали в течение 18 суток, и просвечивали для отбора (на 18 сутки эмбрионального развития) фертильных яиц, и затем инъецировали 20 мМ PBS и одним лишь адъювантом или адъювантом, приготовленным с рекомбинантным белком 3-1Е или препаратом "ЕМ". Инъекции осуществляли при помощи инъектора in ovo "Intelliject" (Avitech, Hebron, MD) в соответствии с указаниями производителя. В каждое яйцо вводили 100 микролитров образцов в амниотическую полость с использованием иглы длиной 17,5 см 18 калибра, поставляемой Avitech (Hebron, MD). 50 микролитровые дозы также можно вводить при практической реализации настоящего изобретения.

3. Цыплята

Сразу после вылупления цыплят бройлеров (приблизительно на 21-22 сутки) их переносили в лабораторию с использованием одноразовых картонных коробок для переноса цыплят (Frederick Packaging, Inc., Milwaukee, WI) и затем содержали в ящиках Petersime и обеспечивали кормом и водой ad libitum.

Птиц содержали в брудерных ящиках в устройстве без Eimeria и переносили в большие подвесные клетки в различных местах, где их инфицировали живыми ооцистами Eimeria maxima и содержали до конца экспериментального периода.

4. Паразиты

Использовали штамм USDA BARC Eimeria maxima #41, который поддерживали в Animal Parasitic Diseases Laboratory-BARC, и размножали в соответствии с установленным способом в Dr. Lillehoj's laboratory. Недавно полученные ооцисты из штамма E. maxima (Beltsville #41) очищали путем флотации на 5% гипохлорите натрия, трижды промывали PBS, и жизнеспособность оценивали при помощи трипанового синего с использованием гемоцитометра.

5. Сенсибилизирующее инфицирование Eimeria

Семидневных птиц метили бирками на крыльях, и птиц из всех экспериментальных групп, за исключением неинфицированных контрольных групп, инокулировали Е. maxima эзофагеально с использованием иглы для инокуляции и затем помещали в клетки для сбора ооцист.

6. Определение прироста массы тела

Массу тела отдельных птиц определяли на 0 сутки (неинфицированные), 6 и 10 сутки после инфицирования Е. maxima.

7. Подсчет продукции ооцист в экскрементах

Смотрители за животными были проинструктированы не убирать в клетках, и экскременты собирали. Поддоны для сбора помещали под каждую клетку на 5 суток, начиная с 6х суток после инфицирования, и экскременты собирали в большие пластиковые сосуды (2 л). Фекалии, промытые водопроводной водой в каждом сосуде, измельчали в блендере с дополнительным количеством воды (общий объем составляет 3 л), и два случайных образца по 40 мл отбирали из каждого образца и хранили в холодильнике до осуществления подсчета. Для подсчета ооцист кокцидий различные разведения осуществляли исходно для определения оптимальных разведении для подсчета ооцист в каждом образце. Ооцисты подсчитывали под микроскопом с использованием камеры для подсчета McMaster с использованием способа сахарозной флотации, разработанного в Dr Lillehoj's laboratory. Общее количество ооцист на цыпленка рассчитывали с использованием формулы: общее количество ооцист/птицу = (количество ооцист х фактор разведения × объем образца экскремента/объем камеры для подсчета)/количество птиц на клетку.

8. Сбор образцов

Кровь отбирали на 6-е сутки после даты инъекции, и определяли ответ в виде сывороточных антител. Образцы крови отбирали у индивидуальных птиц (N=4-5/группу), оставляли сворачиваться в течение 4 ч при 4°C, и образцы сыворотки крови отбирали. Образцы сыворотки крови тестировали в отношении антител против Eimeria с использованием ELISA. Кратко, микротитровальные планшеты покрывали в течение ночи 10 мкг/лунку рекомбинантных кокцидиальных антигенов Ea3-1E, EtMIF или EtMIC2, промывали PBS-0,05% Tween и блокировали PBS-1% BSA (бычий сывороточный альбумин). Добавляли разведения сыворотки крови (1:20, 1:40, 1:80, 1:160; 100 мкл/лунку), инкубировали путем непрерывного мягкого встряхивания, промывали и связанные АЬ обнаруживали при помощи конъюгированных с пероксидазой кроличьих антител против IgG цыпленка (Sigma) и специфического для пероксидазы субстрата. Оптическую плотность (OD) определяли при 450 нм при помощи микропланшетного ридера (Bio-Rad, Richmond, CA).

Ткани кишечника отбирали при вылупливании и на 6 и 10 сутки после этого, и тестировали в отношении продукции цитокинов (IFN-y, IL-2) с использованием RT-PCR (полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) в режиме реального времени, в качестве показателя стимулирования Th1.

9. Синтез кДНК

Общее количество РНК экстрагировали из интестинальных IEL с использованием TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Пять микрограмм РНК обрабатывали 1,0 Е ДНКазы I и 1,0 мкл 10Х реакционного буфера (Sigma), инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, 1,0 мкл стоп-раствора добавляли для инактивации ДНКазы I, и смесь нагревали при 70°C в течение 10 минут. РНК подвергали обратной транскрипции с использованием системы синтеза первой цепи StrataScript (Stratagene, La Jolla, CA) в соответствии с рекомендациями производителя.

10. Количественная RT-PCR

Олигонуклеотидные праймеры для количественной RT-PCR для куриного интерферона-γ (IFN-γ) и GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа) в качестве контроля перечислены в таблице 4. Амплификацию и обнаружение осуществляли с использованием эквивалентных количеств тотальной РНК из интестинальных IEL с использованием системы М×3000Р и Brilliant SYBR Green QPCR master mix (Stratagene). Стандартные кривые строили с использованием log10 разведенной стандартной РНК и уровни индивидуальных транскриптов нормализовали к уровням GAPDH, анализировали при помощи программы Q-gene. Каждый анализ осуществляли в трех параллелях. Для нормализации уровней РНК между образцами в эксперименте средние величины порогового цикла (Ct) для продуктов амплификации рассчитывали путем объединения значений для всех образцов в этом эксперименте.

Таблица 4
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для количественной RT-PCR куриного IFN-γ и GAPDH
РНК мишень Последовательности праймеров Размер продукта PCR (п.о.)
GAPDH № доступа К01458 264
Прямой 5'-GGTGGTGCTAAGCGTGTTAT-3' SEQ ID NO:1
Обратный 5'-ACCTCTGTCATCTCTCCACA-3' SEQ ID NO:2
IFN-γ № доступа Y07922 259
Прямой 5'-GCTGACGGTGGACCTATTATT-3' SEQ ID NO:3
Обратный 5'-GGCTTTGCGCTGGATTC-3' SEQ ID NO:4
IL-1β № доступа Y 15006 244
Прямой 5'-TGGGCATCAAGGGCTACA-3' SEQ ID NO:5
Обратный 5'-TCGGGTTGGTTGGTGATG-3' SEQ ID NO:6
IL-15 № доступа AF 139097 243
Прямой 5'-TCTGTTCTTCTGTTCTGAGTGATG-3' SEQ ID NO:7
Обратный 5'-AGTGATTTGCTTCTGTCTTTGGTA-3' SEQ ID NO:8

Образцы селезенки отбирали до инокуляции Е. maxima и на 10е DPI (сутки после инфицирования) для анализа пролиферации спленоцитов. Селезенки помещали в чашки Петри с 10 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS), дополненного 100 Е/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, St. Louis, МО). Готовили суспензии единичных клеток лимфоцитов селезенки и осуществляли пролиферацию лимфоцитов. Кратко, спленоциты доводили до 5×106 или 1×107 клеток/мл в среде IMDM (Sigma), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой крови (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 100 Е/мл пенициллина, и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma), которую называют 10% полной средой IMDM. Спленоциты (100 мкл/лунку) инкубировали в 96-луночных плоскодонных планшетах при 41°C в увлажненном инкубаторе (Forma, Marietta, ОН) с 5% СО2 и 95% воздухе в течение 48 ч. Пролиферацию клеток определяли с помощью 2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразолия, мононатриевой соли (WST-8, Cell-Counting Kit-8®, Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD). Оптическую плотность (OD) измеряли при 450 нм с использованием микропланшетного спектрофотометра (BioRad, Richmond, CA).

Результаты

Результаты продемонстрировали, что бройлеры, вакцинированные 100 микролитрами адъювантной композиции (т.е. 100 микролитрами, включающими рекомбинантный белок 3-1 Е в соответствии с ранее определенными дозами), набирали приблизительно дополнительно от 45 до 85 грамм массы организма по сравнению с невакцинированными птицами, но инфицированными Е. maxima.

Вакцины по изобретению также продемонстрировали очевидные эффекты в отношении опосредованного клетками иммунитета, измеренные при помощи анализов митогенной пролиферации лимфоцитов: Результаты пролиферации лимфоцитов селезенки в концентрации 1×107 клеток/мл, инкубированных с Con А в течение 48 часов, продемонстрировали, что спленоциты цыплят, инфицированных Е. maxima, иммунизированных адъювантом Pfizer, с антигеном или без него, в общем демонстрируют более высокие уровни пролиферации лимфоцитов, в особенности, когда была использована дозу 50 мкг. Значительное увеличение продукции IL-1B, продукции IFN-γ и продукции IL-15, в особенности в селезенке обнаруживали после введения адъювантных вакцинных композиций по изобретению. В общем, эти результаты ясно указывают на действие адъюванта по настоящему изобретению на цитокиновый ответ и поддерживают его действие в виде увеличения скорее опосредованного клетками, нежели чем гуморального иммунного ответа.

Вакцины по изобретению также демонстрировали очевидные эффекты в отношении выхода ооцист в экскрементах. Неинфицированные контрольные птицы не продуцировали каких либо ооцист. После инфицирования Е. maxima наблюдали значительные уменьшения выхода ооцист в экскрементах в группах, которые обрабатывали только адъювантами Pfizer. Птиц вакцинировали in ovo неочищенным Eimeria maxim, и адъювант продемонстрировал гораздо меньший выход ооцист в экскрементах по сравнению с группами, инокулированными исключительно неочищенным препаратом Eimeria maxima. Группы ЕМ.

Следует отметить, что хотя очищенный рекомбинантный белок Е. maxima 3-1Е использовали в практической реализации вышеупомянутых экспериментов, использование рекомбинантных антигенов Ea3-1E, EaMIF и EtMIC2, отдельно или в комбинации с 3-1Е, или друг с другом, или в виде любой их комбинации также представляет собой предпочтительное воплощение изобретения, и, как правило, все белковые антигены Eimeria функциональны при практической реализации настоящего изобретения, а также при смешивании с адъювантами по настоящему изобретению.

Пример 17. Оценка бактерина штамма Escherichia coli J5 у крупного рогатого скота

Задача исследования заключается в оценке иммунологического ответа у крупного рогатого скота на антиген Escherichia coli (штамм J-5) при введении в различных новых композициях. Имеющийся в продаже бактерии J5 находится в продаже в виде предупредительной вакцины против колиформного мастита молочного скота, и она умеренно эффективна в композиции по настоящему изобретению. Перед вакцинацией животных определяли, как обладающих низким титром антител против Е. coli J5 на основе соответственно анализа образцов сыворотки крови, отобранных перед вакцинацией.

Мясной скот

Экспериментальные вакцины готовили с использованием инактивированного бактерина Е. coli J5 в качестве антигена, и готовили в соответствии с вышеприведенным примером 13. Каждая обрабатываемая группа исходно содержала семь животных (таблица 5). Одна из обрабатываемых групп получала физиологический раствор (Т01), а другая группа получала имеющуюся в продаже вакцину J5 (Т02 - Enviracor™ Pfizer J-5 Escherichia coli бактерин). Другие обрабатываемые группы получали различные композиции, содержащие адъюванты, обозначенные в таблице 5. Все вакцинации осуществляли путем подкожной инъекции на 0 и 21 сутки исследования. Дозируемый объем составлял 5 мл.

Таблица 5
Вакцинируемые группы - мясной скот
Обра-бат. группа Кол-во животных Обработка Сутки Доза (мл) Путь
Т01 7 Физиологический раствор 0,21 5.0 SC
Т02 7 Бактерин Escherichia coli, J-5 штамм 0,21 5.0 SC
Т03 7 QCDCR 0,21 5.0 SC
Т04 7 QCDO 0,21 5.0 SC
Т05 7 QCDX 0,21 5.0 SC
Т06 7 QCDXO 0,21 5.0 SC

В таблице 5 QC представляет собой сокращение для QuilA/холестерин, D для DDA, С для карбопола, R для R1005, Х для DEAE-декстрана и О для масла.

Исходные растворы готовили, как в вышеприведенных примерах 1-13, следующим образом: Е. coli вводили в количестве приблизительно 4-5 ×109 организмов на дозу, что определяли путем прямого подсчета при помощи световой микроскопии. Quil A в воде в концентрации 50 мг/мл, холестерин в этаноле в концентрации 17 мг/мл, DDA в этаноле в концентрации 17 мг/мл, R1005 в 20 мМ фосфатном буфере в концентрации 5 мг/мл, DEAE-декстран в воде в концентрации 200 мг/мл, TLR агонист в ТЕ буфере в концентрации 20 мг/мл и Iscomatrix в воде в концентрации 5,4 мг/мл. Индивидуальные компоненты добавляли об./об. в порядке буквенных символов слева направо. Например, для QCDC добавляли соответствующий объем Quil A, а затем добавляли холестерин, DDA и наконец карбопол. Когда композиции содержали масло, то отдельные компоненты добавляли смешанными, затем эмульгировали в смеси минерального масла Drakeol® 5 LT с Span 80 и Tween 80 (QCDO) или Span 85 и Tween 85 (QCDXO). Drakeol® представляет собой имеющееся в продаже легкое минеральное масло.

Образцы крови отбирали на 0, 21 и 49 сутки исследования для серологического тестирования. Титры антител для Е. coli J5 в образцах сыворотки крови определяли при помощи специфического в отношении J5 опосредованного анализа ELISA. Изотипы антитела IgG определяли при помощи конъюгатов овечьих антител против бычьих антител (Bethyl Labs). Титры определяли и выражали в виде среднегеометрических значений.

Результаты

Серологические результаты исследования представлены в таблицах 6-8. Более высокие титры антител, как правило, связаны с более хорошей защитой вакцин. Общий титр J5-специфических IgG представлен в таблице 6. Несколько композиций по настоящему изобретению продуцировали гораздо более высокие титры по сравнению с имеющимся в продаже продуктом, даже хотя эти композиции имели близкое количество добавленного антигена J5. Композиции QCDO, QCDX и QCDXO особенно эффективны в индукции хорошего иммунного ответа у этого крупного рогатого скота.

Таблица 6
Титры антитела IgG
Обрабат. группа Обработка Среднегеометрическое титра IgG против J5 на сутки
0 21 48
Т01 Физиологический раствор 1573 3135 2795
Т02 бактерин Escherichia coli 1402 7011 55524
Т30 QCDCR 1573 13975 49494
Т04 QCDO 1764 62289 391951
Т05 QCDX 993 22135 110672
Т06 QCDXO 2221 69877 620779

Определяли изотипы J5-специфического антитела IgG1. Эти результаты представлены в таблице 7. Вновь композиции QCDO, QCDX и QCDXO особенно эффективны в индукции хорошего иммунного ответа у этого крупного рогатого скота. Эти композиции обеспечивали гораздо большие титры даже при единичной вакцинации по сравнению с имеющейся в продаже вакциной после двух инъекций.

Таблица 7
Титры антитела IgG1
Обрабат. группа Обработка Среднегеометрическое титра IgG1 против J5 на сутки
0 21 48
Т01 Физиологический раствор 1250 1250 627
Т02 бактерии Escherichia coli 1114 11105 22135
Т03 QCDCR 1250 12458 22135
Т04 QCDO 1980 31250 139281
Т05 QCDX 789 35057 62289
Т06 QCDXO 1573 247472 439702

Титры антитела IgG2 представлены в таблице 8. Этот изотип антитела часто связан с более хорошим фагоцитозом нейтрофилами в молоке и защитой животного. Композиции QCDO, QCDX и QCDXO особенно эффективны для индукции хорошего иммунного ответа у этого крупного рогатого скота.

Таблица 8
Титры антитела IgG2
Обрабат. группа Обработка Среднегеометрическое титра IgG2 против J5 на сутки
0 21 48
Т01 Физиологический раствор 199 396 396
Т02 бактерин Escherichia coli 280 855 3136
Т03 QCDCR 1114 1402 4966
Т04 QCDO 558 1573 6250
Т05 QCDX 176 3947 9899
Т06 QCDXO 559 8824 87940

Молочный скот

Экспериментальные вакцины готовили с использованием инактивированного бактерина J5 Е. coli в качестве антигена и продуцировали в соответствии с вышеприведенным примером 13. Каждая обрабатываемая группа исходно содержала семь животных (таблица 9). Одна из обрабатываемых групп получала физиологический раствор (Т01), а другая группа получала имеющуюся в продаже J5 вакцину (Т02 - Enviracor™ Pfizer J-5 Escherichia coli бактерин). Другие обрабатываемые группы получали различные композиции, содержащие адъюванты, указанные в таблице 9. Все вакцинации вводили путем подкожной инъекции на 0 и 21 сутки исследования. Дозируемый объем составлял 5 мл.

Таблица 9
Вакцинируемые группы - Молочный скот
Обра-бат. группа Количество животных Обработка Сутки Доза (мл) Путь
Т01 7 Физиологический раствор 0,21 5,0 SC
Т02 7 Бактерии Escherichia coli, штамм J-5 0,21 5,0 SC
Т03 7 QCDCR 0,21 5,0 SC
Т04 7 QCDO 0,21 5,0 SC
Т05 7 ТХО 0,21 5,0 SC

В таблице 9 QC представляет собой сокращение для QuilA/холестерин, D для DDA, С для карбопола, R для R1005, Х для DEAE-декстрана, Т для TLR агониста (CpG-ODN), и О для масла.

Концентрированные растворы готовили следующим образом: Е. coli вводили в количестве приблизительно 4-5×109 организмов на дозу, что определяли путем прямого подсчета при помощи световой микроскопии. Quil A в воде в концентрации 50 мг/мл, холестерин в этаноле в концентрации 17 мг/мл, DDA в этаноле в концентрации 17 мг/мл, R1005 в 20 мМ фосфатном буфере в концентрации 5 мг/мл, DEAE-декстран в воде в концентрации 200 мг/мл, TLR агонист в ТЕ буфере в концентрации 20 мг/мл. Индивидуальные компоненты добавляли об./об. в порядке буквенных символов слева направо. Например, для QCDCR добавляли соответствующий объем Quil A, а затем добавляли холестерин, DDA и наконец карбопол. Когда композиции содержали масло, то отдельные компоненты добавляли смешанными, затем эмульгировали в смеси минерального масла Drakeol 5 LT с Span 80 и Tween 80 (ТХО, QCDO) или Span 85 и Tween 85.

Отбор крови

Образцы крови отбирали на 0, 21 и 49 сутки исследования для серологического тестирования. Титры антител против E. coli J5 в образцах сыворотки крови определяли при помощи специфического в отношении J5 опосредованного анализа ELISA. Изотипы антитела IgG определяли при помощи конъюгатов овечьих антител против бычьих антител (Bethyl Labs). Титры определяли и выражали в виде среднегеометрических значений.

Результаты

Серологические результаты исследования представлены в таблице 10. Более высокие титры антител, как правило, связаны с более хорошей защитой вакцин. Общий титр J5-специфических IgG представлен в таблице 10. Несколько композиций по настоящему изобретению продуцировали гораздо более высокие титры по сравнению с имеющимся в продаже продуктом, даже хотя эти композиции имели близкое количество добавленного антигена J5. Композиции QCDO, ТХО и QCDXO особенно эффективны в индукции хорошего иммунного ответа у этого крупного рогатого скота.

Таблица 10
Титры антитела IgG
Обрабат. группа Обработка Среднегеометрическое титра IgG1 против J5 на сутки
0 21 48
Т01 Физиологический раствор 50 60 110
Т02 Бактерии Eschehchia coli 175,2 275 245
ТОЗ QCDCR 106,5 202,7 209
Т04 QCDO 55,9 328,3 245
Т05 ТХО 90,6 328,3 889

Определяли изотипы J5-специфического антитела IgG1. Эти результаты представлены в таблице 10. Снова, композиции QCDO, ТХО и QCDXO особенно эффективны в индукции хорошего иммунного ответа у этого крупного рогатого скота. Эти композиции обеспечивали гораздо более высокие титры даже при единичной вакцинации по сравнению с имеющейся в продаже вакциной после двух инъекций.

Этот изотип антитела часто ассоциируется с более хорошим фагоцитозом нейтрофилами в молоке и защитой животного. Препарат QCDXO особенно эффективен для того, чтобы вызвать хороший иммунный ответ у этого крупного рогатого скота.

Пример 18. Вакцина против вируса диареи крупного рогатого скота

Задача исследования

В данном исследование сравнивали безопасность, эффективность и перекрестную защиту двух вакцин на основе убитого вируса диареи крупного рогатого скота типа 1 и типа 2 (BVDV-1 и BVDV-2 или BVD-1/2) и одной вакцины на основе экстракта BVDV-1 и -2, приготовленной с адъювантами по изобретению с одним отрицательным (физиологический раствор) и двумя положительными контролями (модифицированная живая вакцина BVDV-2 и доступная в настоящее время убитая вакцина BVDV-1/2) по сравнению с сенсибилизацией BVDV-1 у ранее необработанных телят. В таблице 11 представлена схема исследования.

Это исследование также продемонстрировало, что адъюванты по изобретению может быть использовано для отличия животных, вакцинированных вакцинными композициями по настоящему изобретению, от животных, в природе подвергнутых воздействию BVDV.

Животные

Использовали здоровых отлученных от матери телят мясного крупного рогатого скота любого пола в возрасте от 7 до 15 месяцев, которые были серонегативными в отношении BVDV-1 и BVDV-2.

Таблица 11
Схема исследования
Груп-па Вакцина Адъювант Доза Сутки Кол-во животных Сутки сенсибилизации Путь Доза
Т01 Физ. раствор нет 2 мл, SC левая сторона шеи 0 и 21 10 42 IN 5 мл
Т02 BVD-2 MLV нет 2 мл, SC левая сторона шеи 0 10 42 IN 5 мл
Т03 BVD-1/2 не активная PreZent-A 2 мл, SC левая сторона шеи 0 и 21 10 42 IN 5 мл
Т04 BVD-1/2 не активная QCDC 2 мл, SC левая сторона шеи 0 и 21 10 42 IN 5 мл
Т05 BVD-1/2 не активная QCDCR 2 мл, SC левая сторона шеи 0 и 21 10 42 IN 5 мл
Т06 BVD-1/2 не активный экстракт QCDC 2 мл, SC левая сторона шеи 0 и 21 10 42 IN 5 мл

QC представляет собой сокращение для QuilA/холестерин, D - DDA, С - Carbopol®, R - Bay R1005®

Вакцинация

На 0 и 21 сутки исследования животных (N=10/группу) вакцинировали, как описано в таблице 11. Антиген (BVDV) вводили в количестве 5500 относительных единиц силы (RU) на дозу, что определяли при помощи анализа ELISA. Телята в группе Т01 служили в качестве контрольной группы. Они получали 0,9% стерильный раствор хлорида натрия. Телята в группах Т02-Т06 получали экспериментальные вакцины BVDV 1/2 с адъювантом, как представлено в таблице 11. Группа Т02 получала только одну вакцинацию (О сутки исследования). Она получала вакцину на основе модифицированного живого вируса (MLV) BVDV-2, которая не содержала адъювант. Группа ТОЗ получала вакцину на основе убитого вируса BVDV-1/2, содержащую 2,5% эмульсию масло-в-воде (Amphigen) и адъюванты Quil A/холестерин (PreZent A®). Группа Т04 получала вакцину на основе убитого вируса BVDV-1/2, содержащую Quil A/холестерин, DDA и карбопол. Группа Т05 получала вакцину на основе убитого вируса BVDV-1/2, содержащую Quil A/холестерин, DDA, карбопол и R1005. Группа Т06 получала убитый вирус BVDV-1/2, экстракт с высоким титром, содержащий Quil A холестерин, DDA и карбопол на 0 сутки, и близкую вакцину на основе экстракта с низким титром на 21 сутки. Все обработки осуществляли путем подкожного введения разовой дозы 2 мл на 0 и 21 сутки, за исключением группы 2.

QCDC +/-R содержала 100 мкг Quil A, 100 мкг холестерина, 50 мкг DDA и 0,075% карбопол и включала 1000 мкг R1005, все на дозу 2 мл, как описано ранее.

Сенсибилизация

На 42 сутки всех животных сенсибилизировали интраназально приблизительно 4 мл (приблизительно 2 мл на ноздрю) нецитопатического штамма BVDV-1 (Strain NY-1 ; CVB, USDA, Ames, IA) с концентрацией 5,4 log10 TCID50 на дозу 5 мл.

Наблюдения

Наблюдения за областью инъекции регистрировали на 0 (превакцинация), 1, 2, 3, 7 и 21 сутки для области первой инъекции (левая половина шеи). Наблюдения для второго сайта инъекции (также левая половина шеи) регистрировали на 21 (превакцинация), 22, 23, 24, 28 и 35 сутки. Измеряли все пальпируемые реакции в области инъекции (Д×Ш×В, см). Ректальную температуру регистрировали на -1, 0 (превакцинация), 1, 2 и 3 сутки для первичной вакцинации. Температуры для сенсибилизирующей вакцинации регистрировали на 20, 21 (превакцинация), 22, 23 и 24 сутки.

Отбор крови

Образцы крови отбирали у каждого животного с использованием пробирок для отделения сыворотки крови (SST) на -1, 20, 34 и 49 сутки исследования. Образцы крови отбирали с использованием пробирок EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) на 33-35 (до сенсибилизации) и 36-49 сутки исследования. Образцы крови отбирали с использованием пробирок для клеточного препарата (СРТ) на 34 (до сенсибилизации) и 36-49 сутки исследования.

Результаты

В таблице 12 представлены геометрическое среднее наименьших квадратов (geometric least squares mean, GLSM) для титра сывороточного нейтрализующего антитела на вирус BVD в анализе гемагглютинации для суток проведения исследования. Результаты демонстрируют адъюванты по изобретению, обеспечивающие увеличение титров антител против BVDV-1 и BVDV-2 по мере проведения исследования. Приемлемый для UDSA (Министерство сельского хозяйства США) титр превышает титр 8. Эти данные демонстрируют титры выше 5000, которые свидетельствуют о сильной продукции антител, которая способна остановить живой вирус, когда он проникает в животное с потенциалом для инфицирования и заболевания.

В таблице 13 представлены данные для лейкопении для 43-56 суток исследования. Результаты лейкопении для суток проведения исследования демонстрируют, что вакцина MLV (T02) предупреждала инфицирование этим специфическим сенсибилизирующим вирусом. Степень лейкопении представляет собой критерий для лицензирования продукта MLV со стороны USDA. Тем не менее, для инактивированного вируса лейкопения не представляет собой критерий в соответствии с USDA, но, как предполагают данные, адъюванты по изобретению увеличивали лейкопению лишь у 20% животных, тогда как наиболее инактивированные вирусные вакцины имеют 100% лейкопению. Последнее указывает на то, что адъюванты по изобретению способны вызывать сильный ответ Th1 с инактивированным антигеном. Описанное сложно осуществить и редко обнаруживается в инактивированных продуктах.

Таблица 13
Лейкопения на сутки проведения исследования
Сутки проведения исследования Т01 Физ. раствор Т02 Модифицированные живые ТОЗ PreZent A T04 QCDC T05 QCDCR T06 QCDC Экстракт
43 сутки 0 0 0 0 0 0
44 сутки 0 0 0 0 0 0
45 сутки 0 0 0 0 0 0
46 сутки 2 0 0 0 0 0
47 сутки 5 0 1 1 1 3
48 сутки 5 0 1 2 2 3
49 сутки 8 0 1 2 2 6
50 сутки 8 0 1 0 1 3
51 сутки 6 0 0 0 0 0
52 сутки 2 0 0 0 0 0
53 сутки 2 0 0 0 0 0
54 сутки 2 0 0 0 0 0
55 сутки 2 0 0 0 0 0
56 сутки 2 0 0 0 0 0

В таблице 14 представлены титры сывороточных нейтрализующих антител на 41 сутки (20 сутки после второй вакцинации, до сенсибилизации). Модифицированный живой вирус способен только вызывать ответы в виде антител точно на тот вирус, который находится в вакцине. Это проявляется в том, что Группа Т02 демонстрирует защиту против только BVDV-2. Тем не менее, адъювантные инактивированные вакцины Т03 (PreZent-A), T04 (QCDC), и T05 (QCDCR) вызывали сильный ответ в виде антител в самом начале иммунного ответа и в жизненной фазе во время исследования животного в направлении серологически разнообразной панели BVDV. Последнее демонстрирует, что эти адъюванты обладают способностью обеспечивать безопасность и эффективность в модели сенсибилизации для защиты крупного рогатого скота не только в гомологической, но и гетерологической сенсибилизации.

Таблица 14
Титры нейтрализующих сывороточных антител на 41 сутки
Перекрестная защита со стороны сывороточного титра антител в обрабатываемой группе, Титр антитела Log 2
Т01 Физ. раствор Т02 Модифицированный живой Т03 PreZent А Т04 QCDC Т05 QCDCR Т06 QCDC эктракт
Среднее BVDV1a <1 0,8 4,0 2,5 2,9 1,9
Среднее BVDV1b <1 0,7 3,9 2,4 2,9 1,5
Среднее BVDV2 <1 4,5 8,8 8,1 8,0 6,5

Маркерная активность. Здесь представлены данные, которые демонстрируют то, что адъюванты по изобретению могут быть использованы для отличия животных, вакцинированных вакцинными композициями по настоящему изобретению, от животных, в природе подвергнутых воздействию BVDV. Последнее может быть обнаружено путем определения различий в профиле антител между структурными и неструктурными генными продуктами вируса. Маркерная активность продемонстрирована в анализе радиоиммунопреципитации на геле (Фиг. 1). Ответ в виде антител на белки NS2/3 и Е2 BVDV весьма выражен у животного, вакцинированного вакциной MLV, или животного, в природе подвергнутого воздействию BVDV или PreZent-A адъювантной инактивированной вакциной. Тем не менее, адъюванты по изобретению демонстрировали ответ в виде антитела только на белок Е2, но не на белки NS2/3. Таким образом, животное, вакцинированное инактивированной вакциной BVDV, содержащей адъюванты по изобретению, может быть дифференцировано от животного, инфицированного в природе, или животного, вакцинированного MLV, или животного, вакцинированного PreZent-A. Эту вакцину можно рассматривать как маркерную, что важно для устранения этих типов заболеваний в животных популяциях.

Пример 19. Mycoplasma hyopneumonia у свиней

Предшествующий уровень техники

Mycoplasmal pneumonia свиней (MPS) или энзоотическая пневмония представляет собой широко распространенное хроническое заболевание, характеризующееся кашлем, задержкой роста и уменьшение эффективности кормления. Этиологический агент представляет собой М. hyopneumoniae; тем не менее, встречающееся в природе заболевание часто возникает в результате комбинации бактериальной и микоплазменной инфекций.

MPS вызывает значительные экономические потери во всех областях, где выращивают свиней. Исследования, проведенные в различных областях по всему миру, указывают на то, что поражения, типичные для обнаруженных при MPS, возникают у 30%-80% мясных свиней. Поскольку микоплазменные поражения могут проявляться до того, как домашние свиньи достигнут мясной массы, реальная частота может быть выше. Сообщали о том, что преобладание инфекции М. hyopneumoniae при хронической пневмонии свиней находится в диапазоне 25%-93%. Свиньи всех возрастов чувствительны к MPS, но заболевание наиболее обычно для растущих и завершающих рост свиней. Существующие в настоящее время данные указывают на то, что М. hyopneumoniae переносится посредством аэрозоля или прямого контакта с секретом респираторного тракта инфицированных свиней. Возможен перенос от свиноматки к поросенку во время лактации. После обнаружения MPS возникает из года в год у инфицированного стада, варьируя по тяжести с такими факторами окружающей среды, как сезон, вентиляция и плотность поголовья свиней.

Задача исследования

Сравнение эффективности вакцин Mycoplasma hyopneumoniae, приготовленных с новыми адъювантами по изобретению, по сравнению с эффективностью экспериментальной серии имеющегося в продаже бактерина Mycoplasma hyopneumoniae после внутритрахеальной сенсибилизации вирулентным легочным гомогенатом М. hyopneumoniae.

Животные

В исследовании использовали шестьдесят шесть (66) клинически здоровых кроссбредных поросят в возрасте приблизительно 17 суток без истории заболевания, вызванного М. hyopneumoniae и вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), или вакцинации против тех же организмов. Перед доставкой в сайт исследования и в течение 2 суток после прибытия свиньям внутримышечно вводили Naxcel® в заднюю ногу в соответствии с указаниями на этикетке для предотвращения связанного со стрессом заболевания, такого как Streptococcus suis. Животных распределяли для обработок по отсекам в соответствии с планом рандомизации. Схема исследования представлена в таблице 15.

Таблица 15
Схема эксперимента
Обраба-тыва-емая группа Обработка Кол-во животных Вакцинация Путь Сенсибилизация
Т01 Отрицательный контроль 63464-70 12 0 сутки 14 сутки Внутримышечный Легочный гомогенат M. hyo
Т02 ООА/карбопол/Р1005 (OCR) 12 0 сутки 14 сутки Внутримышечный Легочный гомогенат M. hyo
Т03 QAC/DDA/карбопол (QCDC) 12 0 сутки 14 сутки Внутримышечный Легочный гомогенат M. hyo
Т04 QAC/DDA/карбопол/R1005 (QCDCR) 12 0 сутки 14 сутки Внутримышечный Легочный гомогенат M. hyo
Т05 Бактерии M. hyo 12 0 сутки 14 сутки Внутримышечный Легочный гомогенат M. hyo
NTX Отсутствие 6 Н/Д Н/Д Н/Д

QAC представляет собой сокращение для QuilA/холестерин,

Исследовательские ветеринарные продукты (IVP)

Антигены и исследовательские ветеринарные продукты (IVP) представлены в таблице 16. Вакцины для обрабатываемых групп Т02, ТОЗ и Т04 (все за исключением Т05) готовили в соответствии с примером 13 с использованием концентраций компонентов, представленных в нижеприведенной таблице 16. Компоненты добавляли в последовательности, представленной в таблице.

Солевой наполнитель добавляли в сосуд, и гомогенизацию начинали и продолжали в течение процедуры приготовления. Инактивированную M. hyopneumoniae готовили из смешанного объема 75 литров ферментата на 800 литров конечного приготовленного продукта, и добавляли до концентрации 0,09375 мл на дозу. QuilA добавляли до концентрации, представленной в таблице 16. Затем добавляли раствор холестерин/этанол. Добавляли раствор DDA/этанол, а затем добавляли раствор гликолипида Bay R1005. Затем добавляли карбопол, и раствор доводили до конечного объема при помощи солевого наполнителя.

Вакцина для обрабатываемой группы Т05 (вакцинная композиция, основанная на Amphigen) представляла собой имеющийся в продаже продукт Respisure® (Pfizer, Inc).

Вакцинация

Животных в обрабатываемой группе NTX не вакцинировали или сенсибилизировали. В возрасте приблизительно 3 недель (0 сутки - правая половина шеи) и 5 недель (14 сутки - левая половина шеи), животных в группах Т01, Т02, Т03, Т04 и Т05 вакцинировали внутримышечно по 2 мл на дозу квалифицированные лица, случайным образом отобранные для обрабатываемой группы.

Сенсибилизирующий материал

Животных в Т01-Т05 сенсибилизировали внутритрахеально через 3 недели после второй вакцинации (в возрасте приблизительно 8 недель - 35 сутки исследования). Животных сенсибилизировали дозой 5 мл разведения 1:50 в среде Фрииса 10% замороженного легочного гомогената штамма М. hyo 11 (LI36).

Отбор крови

На -1 или 0 сутки (перед 1-й вакцинацией), 13 или 14 сутки (перед 2-й вакцинацией), 34 или 35 сутки (перед сенсибилизацией) и 63 сутки (при вскрытии) образцы крови (приблизительно от 5 до 10 мл в пробирки для отделения сыворотки крови) отбирали у всех поросят и тестировали в отношении серологии М. hyopneumoniae (ELISA - IDEXX).

Масса

Всех животных взвешивали при прибытии с целью распределения, на 34 или 35 сутки (перед сенсибилизацией), и на 62 или 63 сутки (перед вскрытием).

Вскрытие

На 63 сутки всех выживших животных подвергали эвтаназии в соответствии с сайт-специфичными процедурами. Легкие оценивали макроскопически в отношении характерных поражений, присущих для инфекции М. hyopneumoniae, и присваивали оценку поражений, присущих сенсибилизации М. hyopneumoniae. Оценку легочных поражений регистрировали в виде процента легочных поражений на каждую легочную долю. Процент консолидации для каждой доли (левой верхней, левой средней, левой нижней, правой верхней, правой средней, правой нижней и добавочной оценивали в виде действительного значения в диапазоне 0-100%. Процент для каждой доли легкого использовали в формуле с весовыми коэффициентами для расчета общего процента пораженных легких. Шесть (6) животных NTX умерщвляли на 34 или 35 сутки перед сенсибилизацией, и легкие оценивали в отношении поражений.

Оценка легочных поражений

Процентную долю всех пораженных легких рассчитывали с использованием следующей формулы: процентная доля всех пораженных легких = 100×{(0,10×верхняя левая)+(0,10×левая средняя)+(0,25×левая нижняя)+(0,10×правая верхняя)+(0,10×правая средняя)+(0,25×правая нижняя)+(0,10×добавочная)}. Трансформацию в виде квадратного корня арксинуса применяли в отношении процентной доли всех пораженных легких до анализа. Трансформированные оценки легочных поражений анализировали при помощи общей линейной смешанной модели. Линейные комбинации оценок параметра использовали в заранее заданных сравнениях после тестирования в отношении эффекта обработки. Рассчитывали обратно трансформированные пределы среднего значимой (Р≤0,10) процентной доли всех легких, подвергшихся поражениям, стандартные отклонения и их 90% доверительные интервалы, а также минимумы и максимумы.

Результаты

Результаты, представленные в приведенной ниже таблице 17, указывают на то, что адъюванты по изобретению функционировали в равной степени, а также обрабатываемая группа Т05, в которой масло содержало адъювант Amphigen®. Типично, оценку легочного поражения больше 3 рассматривают в качестве эффекта, который обеспечивает обработка вакциной. Все комбинации адъювантов по изобретению удовлетворяют этим критериям, и QCDCR обеспечивала наилучшую оценку и диапазон среди индивидуальных животных.

Таблица 17
Процентная доля легких с поражениями
Сигнал: Положительный ответ (S/P); Серологическое отношение, 34 сутки LSM Диапазон
Т01 - Плацебо 0,00 8,4 0-25,55
Т02 - DRC 0,28 2,4 0-20,13
Т03 - QCDC 0,15 2,1 0-23,18
Т04 QCDCR 0,23 0,5 0-2,7
Т05 - RespiSure 0,46 0,6 0-2,33
N=12 на группу, за исключением Т05, где N=11

Пример 20. Применение вакцины на основе вируса птичьего гриппа в отношении кошек (FAIV)

В этом исследовании оценивали эффективность в отношении кошек противогриппозной вакцины с использованием адъюванта по изобретению путем сенсибилизации вирулентным штаммом вируса птичьего гриппа.

Способы и результаты

Перед вакцинацией определили, что животные являются отрицательными в отношении вируса гриппа и антител против вируса гриппа на основе, соответственно, орофарингеальных мазков и анализа образцов сыворотки крови, взятых перед вакцинацией.

Экспериментальные вакцины готовили с использованием инактивированного патогенного вируса птичьего гриппа и очищенного гемагглютинина (НА). Каждая обрабатываемая группа исходно содержала шесть животных (таблица 18). Две обрабатываемые группы получали экспериментальные вакцины FAIV (для Т01 вакцинный антиген представлял собой очищенный белок Н5 НА; и для Т02 вакцинный антиген представлял собой инактивированный штамм H5N2), одна обрабатываемая группа получала вакцину на основе инактивированного модифицированного штамма вируса H5N1 (Т03), одна контрольная группа плацебо получала вакцину, содержащую только адъювант (Т04), и одна отрицательная контрольная группа получала только физиологический раствор (Т05). Все вакцинации вводили путем подкожной инъекции на 0 и 21 сутки исследования. Дозируемый объем составлял 1 мл. После вакцинации за животными постоянно наблюдали, пока они не восстанавились и были способны сидеть прямо для гарантии того, что неблагоприятные реакции отсутствуют. Регистрировали наблюдения приблизительно в течение одного часа после вакцинации, а также любое другое осложнение, которое обнаруживали после вакцинации.

Адъювантная композиция представляла собой описанную выше композицию в примере QCDC с использованием Quil A (20 мкг), холестерина (20 мкг), DDA (10 мкг) и карбопола (0,05%) на дозу. Антиген представлял собой инактивированный целый вирус или очищенный белок Н5 НА.

Животных оценивали в отношении реакции в области инъекции и серологического ответа на вакцину. Трех животных (двоих в группе Т02-инактивированный H5N2, и одно в группе Т05-физиологический раствор) умерщвляли вследствие врожденной гипероксалурии перед сенсибилизацией. На 49 сутки исследования всех выживших кошек сенсибилизировали внутритрахеальным путем штаммом H5N1 A/Vietnam/1194/04 для оценки эффективности вакцин-кандидатов. Животных сенсибилизировали 5,0 мл материала, содержащего 105 TCID50, которая высвобождалась чуть выше разветвления с использованием небольшого катетера, который вводили в трахею с использованием трахеоскопа. За животными наблюдали, и образцы отбирали в течение пяти суток после сенсибилизации. В конце фазы содержания животных (54 сутки исследования) всех выживших животных умерщвляли, и каждое подвергали вскрытию.

Таблица 18
Вакцинируемые группы
Обрабат. группа Вакцина Доза Путь введения Сутки исследования Животные
Т01 Вакцина на основе очищенного рекомбннантного белка гемагглютинина (НА) (25600 НА единиц/дозу) 1,0 мл Подкожный 0 и 21 6
Т02 Вакцина на основе ннактивнрованного модифицированного вируса H5N2 (25600 НА единиц/дозу) 1,0 мл Подкожный 0 и 21 6
Т03 Вакцина на основе инактивированного модифицированного вируса H5N1 (25600 НА единиц/дозу) 1,0 мл Подкожный 0 и 21 6
Т04 Плацебо - Только адъювант 1,0 мл Подкожный 0 и 21 6
Т05 Плацебо - Только физиологический раствор 1.0 мл Подкожный 0 и 21 6

Образцы крови отбирали на -14 сутки перед вакцинацией, 0, 21 и 49 сутки для серологического тестирования. На 49 и 54 сутки исследования образцы крови отбирали для вирусологического тестирования. На 42 сутки исследования не предусмотренный графиком образец крови отбирали у всех выживших животных для тестирования почечной функции по образцам сыворотки крови перед сенсибилизацией.

Орофарингеальные мазки брали у всех животных -14 сутки исследования, на 49 сутки исследования перед сенсибилизацией и 50-54 сутки исследования. Ректальные мазки брали у всех животных на 49 сутки исследования перед сенсибилизацией и 50-54 сутки исследования. Забор мазков осуществляли непосредственно перед сенсибилизацией на 49 сутки исследования.

Во время вскрытия все легочные доли асептически удаляли, взвешивали и оценивали в общем в отношении характеристических поражений, присущих инфекции FAIV. Процентные доли использовали для идентификации степени легочной консолидации. Левое легкое фиксировали 10% нейтрально забуференным формалином для гистопатологии. Правое легкое извлекали, и образцы отбирали для врусологического тестирования. В дополнение к легким также отбирали образец почки и любые ткани с явной патологией и хранили в 10% нейтрально забуференном формалине для гистопатологии.

Вирусные титры в образцах крови, орофарингеальных и ректальных мазках и в образцах легочной ткани определяли с использованием H5N1-специфической TaqMan PCR. Кратко, РНК выделяли с использованием системы ЖХ MagnaPure с использованием набора для выделения нуклеиновых кислот MagnaPure LC Total nucleic acid isolation kit (Roche Diagnostics; Almere, The Netherlands), и вирус гриппа А обнаруживали с использованием RT-PCR анализа в режиме реального времени. Данные выражали в виде единиц контрольного разведения (Control Dilution Units, CDU). CDU определяли по стандартной кривой, построенной на основе исходного раствора вируса, который подвергали серийным разведениям, причем для каждого разведения осуществляли экстракцию нуклеиновой кислоты и TaqMan PCR амплификацию тем же самым образом, как для тестируемых образцов.

Положительные в соответствии с RT-PCR орофарингеальные мазки и образцы легочной ткани также анализировали путем выделения вируса и титрования на клетках собачьей почки Мадин-Дарби (MDCK). Результаты выражали в виде log10 50% инфекционной дозы в тканевой, культуре на миллилитр или грамм образца (log10TCID50/мл или log10TCID50/г).

Образцы плазмы крови анализировали путем нейтрализации вируса и путем ингибирования гемагглютинации. Для анализа ингибирования гемагглютинации (HI) вирусную суспензию штамма вируса гриппа Vietnam 1194/04 (H5N1, клад 1) или Indonesia 05/2005 (H5N1, клад 2) инкубировали с серийными (2-кратными) разведениями образца сыворотки крови, предварительно обработанного холерным фильтратом (приготовленным из культур Vibrio cholerae). Затем эритроциты добавляли к разведениям и после инкубации максимальное разведение агентов, демонстрирующее полное ингибирование гемагглютинации, определяли как титр HI.

Анализ нейтрализации вируса (VN) основан на конечном титровании сыворотки крови. Кратко, постоянное количество вируса смешивали с серийным (2-кратным) разведением образца сыворотки крови. Нейтрализацию вируса регистрировали с использованием клеток MDCK в качестве индикаторных клеток и визуализировали по агглютинации эритроцитов. Титры VN оценивали, принимая во внимание наибольшее разведение сыворотки крови, при котором 50% инокулированных клеточных культур демонстрировали агглютинацию эритроцитов.

Левое легкое извлекали при вскрытии и фиксировали 10% нейтрально забуференным формалином для гистопатологии. После фиксации ткани погружали в парафин, готовили тканевые срезы и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования. Регистрировали описание и степень обнаруженных патологических изменений.

Результаты

Ни одно из животных в пяти обрабатываемых группах не демонстрировало какой-либо боли или набухания в области инъекции после первой и второй вакцинации. Кроме того, никакие кожные аномалии не были зарегистрированы в областях инъекций. После вакцинаций и перед сенсибилизацией отсутствовали значимые различия на 0,1 доверительном уровне в температуре организма между обработками при анализе с помощью линейной смешанной модели. Одно животное в группе Т01 оставалось фебрильным (≥40°C) перед первой вакцинацией на 0 сутки и в течение нескольких суток после этого. Спорадическую температуру организма, которая увеличивалась у отдельных животных до 40°C или выше, регистрировали (0 и 21 сутки). Никаких аномалий в здоровье, связанных с вакцинацией, не обнаружили во время исследования. Трех животных (два в Т02 - H5N2, и одно в Т05-физиологический раствор) умерщвляли по причине врожденной гипероксалурии перед сенсибилизацией. Несколько животных из всех обрабатываемых групп демонстрировали раневые осложнения после имплантации температурного датчика. Никакие одновременные обработки не проводились с 0 суток до завершения исследования.

Вакцинированные животные в группах Т01, Т02 и Т03 демонстрировали меньше клинических сигналов и отсутствие смертности после сенсибилизации по сравнению с контрольными животными в группах Т04 и Т05. В группе Т01 одно животное демонстрировало подавленность и увеличенное дыхательное усилие через двое суток после сенсибилизации. Ни одно из оставшихся пяти животных в группе Т01 не продемонстрировало каких либо аномалий здоровья после сенсибилизации. В группах Т02 (n=4) и Т03 (n=6) все животные оставались здоровыми после сенсибилизации. В группе Т04 (n=6) первые аномальные клинические сигналы (подавленность и увеличенное дыхательное усилие) обнаруживали у двух животных через двое суток после сенсибилизации. Через трое суток после сенсибилизации все шесть животных в группе Т04 были подавленными и демонстрировали увеличение дыхательного усилия. Поэтому двух животных вынуждены были умертвить по причинам, связанным со здоровьем. Через четверо суток после сенсибилизации (53 сутки) обнаружили, что одно животное погибло, а оставшиеся трое животных в группе Т04 демонстрировали подавленность, увеличенное дыхательное усилие, выпячивание третьего века и выделения из носа, и их умерщвляли по причинам, связанным со здоровьем. В группе Т05 (n=5) первые аномальные клинические проявления подавленности и увеличенного дыхательного усилия обнаружили у одного животного через сутки после сенсибилизации. Через двое суток после сенсибилизации еще двое животных начали демонстрировать эти проявления. Через трое суток после сенсибилизации обнаружили, что одно животное погибло, а оставшиеся четверо животных демонстрировали подавленность, увеличенное дыхательное усилие и выпячивание третьего века. Одно животное затем умертвили по причинам, связанным со здоровьем. Через четверо суток после сенсибилизации дыхательное усилие ухудшилось у одного из трех оставшихся животных, и еще одно животное дополнительно демонстрировало выделения из носа. Всех трех оставшихся животных умерщвляли по причинам, связанными со здоровьем, через четверо суток после сенсибилизации (53 сутки).

После сенсибилизации средняя температура организма оставалась ниже 40,0°C у вакцинированных животных (Т01, Т02 и Т03). Средние температуры для контрольных животных (Т04 и Т05) возрастали до s 40,0°C, начиная через сутки после сенсибилизации. Различия в средней температуре организма между обработками были значимыми (р=0,0001) в соответствии с анализами на линейной смешанной модели. Данные для отдельных животных продемонстрировали, что у небольшого количества животных в группах Т01, Т02 и Т03 температура организма вырастала до 40,0° С и выше в отдельные моменты времени на 53 сутки. В группе Т01 два животных имели фебрильную температуру организма (диапазон от 40,0 до 40,1°C) в один из моментов времени. В группе Т02 двое животных имел фебрильную температуру организма (диапазон от 40,0 до 40,3°C) в один и три момента времени, соответственно. В группе Т03 одно животное имело фебрильную температуру организма (диапазон от 40,0 до 40,3°C) в три момента времени. В группах Т04 и Т05 все животные имели фебрильную температуру организма в течение по меньшей мере двенадцати часов перед 50-51 сутками.

Титры антител HI против штаммов вируса гриппа Vietnam 1194/04 (H5N1, клад 1) и Indonesia 05/2005 (H5N1, клад 2) определяли перед первой и второй вакцинацией и перед сенсибилизацией. Нижний предел обнаружения равен 5. Перед вакцинацией титры во всех 5 обрабатываемых группах были ниже нижнего предела, равного 5. После вакцинации у всех вакцинированных животных (Т01, Т02, и Т03) формировались титры антител HI больше 5, и они демонстрировали по меньшей мере шестикратное увеличение титров по сравнению со значениями до вакцинации. В группах Т01 и Т03 титры против Vietnam 1194/04 находились в диапазоне от 20 до 160 после первой вакцинации, и от 140 до 960 после второй вакцинации. В группе Т02 титры против Vietnam 1194/04 были ниже титров, обнаруженных в Т01 и Т03, находясь в диапазоне от 5 до 30 после первой вакцинации, и от 5 до 70 после второй вакцинации. Титры антител HI против Indonesia 05/2005 были близки титрам против Vietnam 1194/04.

Образцы плазмы крови, взятые до и после сенсибилизации, тестировали при помощи H5N1-специфической RT-PCR в режиме реального времени в отношении вирусной нагрузки. Все животные имели вируснегативные образцы до сенсибилизации. После сенсибилизации вирус не был обнаружен в плазме крови животных в группе Т01 и Т03. Наоборот, 25% (1 из 4) животных в группе Т02, 67% (4 из 6) животных в группе Т04 и 60% (3 из 5) животных в группе Т05 имели вируспозитивные образцы плазмы крови после сенсибилизации. Различия между обработками были значимыми (р=0,0247) в соответствии с анализом на основе линейной смешанной модели.

Выделение вируса после сенсибилизации оценивали в образцах мазка из глотки при помощи RT-PCR в режиме реального времени и титрования вируса, и в образцах ректальных смывов при помощи RT-PCR в режиме реального времени. Никакого выделения вируса из глотки не обнаруживали в группе животных Т01 после сенсибилизации. В группе Т02 все четверо животных (100%) выделяли вирус в один из моментов времени после сенсибилизации. В группе Т03 в общем двое из шести животных (33%) выделяли вирус после сенсибилизации. В группе Т04 трое из шести животных (50%) выделяли вирус после сенсибилизации. В группе Т05 четверо из пяти животных (80%) выделяли вирус после сенсибилизации. Никакие образцы не отбирали у животных в группах Т04 и Т05 через пять суток после сенсибилизации, поскольку все животные погибли. Тем не менее, для задач статистического анализа животных, которые погибли или были умерщвлены до последних суток исследования, использовали результаты последних тестов, проведенных до последних суток исследования.

Образцы из глотки, имеющие положительные результаты в соответствии с RT-PCR (≥1,8 CDU), также использовали в анализах титрования вируса. Титрование вируса подтвердило, что все образцы, положительные в соответствии с RT-PCR, содержали инфекционный вирус гриппа (данные не представлены). Титры инфекционного вируса были ниже у вакцинированных животных (Т02 и Т03) по сравнению с контрольными животными (Т04 и Т05). Эти различия были достоверными через трое суток после сенсибилизации при сравнении Т02 или Т03 с Т04, и трое, четверо и пятеро суток после сенсибилизации при сравнении Т02 или Т03 с Т05. Титры у животных в группах Т02 и Т03 составляли 0,5 log10 TCID50. Титры, обнаруженные в группе Т04, находились в диапазоне от 2,3 до 4,3 log10 TCID50. Титры, обнаруженные в группе Т05, находились в диапазоне от 1,5 до 3,8 log10 TCID50.

Выделение вируса в экскрементах, оцениваемое в ректальных мазках, обнаружили во всех обработанных группах, за исключением Т02, через трое или четверо суток после сенсибилизации. Количества вируса, обнаруживаемые при помощи RT-PCR, составляли от 2,2 до 2,3 log10 CDU в Т01, 3,2 log10 CDU в Т03, от 2,0 до 2,7 log10 CDU в Т04, и 2,2 log10 CDU в Т05. Отсутствовали значимые различия на 0,1 доверительном уровне между обработками в какие-либо из суток после сенсибилизации.

Легочная патология была менее тяжелой у вакцинированных (Т01, Т02 и Т03), чем у контрольных животных (Т04 и Т05). Все вакцинированные животные демонстрировали мягкую, многоочаговую, субострую бронхоинтерстициальную пневмонию. Контрольные животные демонстрировали умеренную (двое животных в Т04 и одно животное в Т05) или тяжелую (четверо животных в Т04 и четверо животных в Т05), субострую бронхоинтерстициальную пневмонию с многоочаговым распространением у всех контрольные животных, за исключением двух (одно животное в Т04 и одно в Т05), которые демонстрировали диффузное распространение. Целое легкое оценивали в отношении степени консолидации, которую выражали в виде процентной доли консолидации относительно общей легочной ткани. В соответствии с обнаруженным для легочной патологии процентная консолидация была значительно ниже у вакцинированных животных (Т01, Т02, и Т03) по сравнению с контрольными животными (Т04 и Т05).

Вирусную нагрузку в легочной ткани, извлеченной в момент гибели или или умерщвления, оценивали путем титрования вируса и H5N1 RT-PCR. Легочная ткань вакцинированных животных (Т01, Т02 и Т03) имела значительно меньшие средние вирусные титры по сравнению с контрольными животными (Т04 и Т05). Отсутствовали значимые различия между средними титрами в легочной ткани вакцинированных животных (Т01, Т02 и Т03). Анализ при помощи RT-PCR привел к тем же результатам.

После сенсибилизации высокопатогенным штаммом вируса птичьего гриппа H5N1 клинические проявления, включая лихорадку, смертность, виремию, выделение вирусов из глотки и в экскрементах, вирусное инфицирование легкого и легочную патологию, включая консолидацию, наблюдали у контрольных животных, которые получали адъювант (Т04) или физиологический раствор (Т05).

Вакцинация очищенным белком Н5 НА (Т01) предупреждала виремию, выделение вируса из глотки и смертность у шести молодых кошек после сенсибилизации высокопатогенным штаммом вируса птичьего гриппа H5N1. Кроме того, вакцинация очищенным белком Н5 НА (Т01) уменьшала клинические проявления, включая лихорадку, вирусную нагрузку в легком и легочную патологию, включая консолидацию.

Вакцинация инактивированным штаммом H5N2 (Т02) предупреждала клинические проявления, выделение вируса в экскрементах и смертность у четырех молодых кошек после сенсибилизации высокопатогенным штаммом вируса птичьего гриппа H5N1. Кроме того, вакцинация инактивированным штаммом H5N2 (Т02) уменьшала виремию, лихорадку, выделение вируса из глотки, вирусную нагрузку в легком и легочную патологию, включая консолидацию.

Вакцинация инактивированным штаммом H5N1 (Т03) предупреждала клинические проявления, виремию и смертность у шести молодых кошек после сенсибилизации высокопатогенным штаммом вируса птичьего гриппа H5N1. Кроме того, вакцинация инактивированным штаммом H5N1 (Т03) уменьшала лихорадку, выделение вируса из глотки, вирусную нагрузку в легком и легочную патологию, включая консолидацию.

Заключение

Отсутствие реакции в области инъекции наблюдали с вакцинами, приготовленными с инактивированным или очищенным антигеном НА с адъювантом QC/DC. Эти вакцины обеспечивали полную защиту от клинического заболевания и смертности у вакцинированных кошек, значительно уменьшали вирусную нагрузку в крови и ткани и значительно уменьшали выделение вируса.

Пример 21. Рак

Предшествующий уровень техники

Данное исследование проводили у иммунодефицитных и иммунокомпетентных крыс с использованием человеческих и крысиных клеток гепатоклеточной карциномы для образования гетеротопической и ортотопической моделей.

Животные

Бестимусные (CrI: NIH-rnu) самцы крыс в возрасте 6-8 недель приобретены в Charles River (Wilmington MA). Крыс содержали попарно в микроизоляторных клетках из поликарбоната и обеспечивали ad libitum водой после обратноосмотической очистки и облученным стандартным кормом для крыс; всю воду и подстилку автоклавировали. Массы тел регистрировали два раза в неделю; животных поддерживали в течение приблизительно 7 недель и умерщвляли при помощи ингаляции CO2 в конце эксперимента

Схема эксперимента включала две фазы. В фазе I крыс случайным образом распределяли на две группы на основе их массы организма. Крысам в группе 1 не проводили инъекцию опухолевых клеток, тогда как крысы в группе 2 получали подкожную инъекцию опухолевых клеток. Через три недели после инъекции опухоли крыс в группе 2 произвольным образом (на основе размера опухоли и частоты приживания - смотри таблицу 19) делили на две группы для фазы II, одна из которых включала две подгруппы: 1) не имеющие опухоль контроли, получающие физиологический раствор (контрольная группы); 2) имеющие опухоли контроли, обработанные только адъювантом (опухолевая группа); и 3) имеющие опухоль субъекты (несущие опухоль, обработанные), которым вводили дозу вакцины (две подкожные инъекции с интервалом в две недели). Всех животных вскрывали через 14 суток после второго введения вакцины.

Вакцина

Вакцину вводили путем подкожной инъекции 0,2 мл на дозу.

Вакцинный препарат

Вакцины готовили с использованием Quil-A (20 мкг/дозу), холестерина (20 мкг/дозу), DDA (10 мкг/дозу), Carbopol (0,05%) с или без гликолипида Bay R1005® (1000 мкг/дозу) и антигена. Композицию смешивали с использованием гомогенизатора и добавляли в последовательности добавления, приведенной выше.

Приготовление антигена

Клетки HepG2 (клон НВ-8065) получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, VA). HepG2 представляет собой непрерывную клеточную линию, которая получена из ткани печени 15-летнего мужчины европеоидной расы с хорошо дифференцированной гепатоклеточной карциномой. Клетки делились в условиях стандартной клеточной культуры, и их готовили для инъекции в концентрации 1 х 107 клеток/мл в Matrigel. Каждой крысе подкожно инъецировали 0,5 мл клеточной суспензии в область второго соска молочной железы.

Измерения

Размер опухоли измеряли дважды в неделю путем исследования при помощи штангель-циркуля, где объем в см3={[(W(мм)×W/мм)]/2×1-(мм)}/1000. Кровь отбирали при помощи ретроорбитального кровозабора на химию сыворотки крови и измерения биомаркеров. Животных слегка анестезировали в процессе процедуры кровопускания при помощи CO2/O2. Химические показатели анализировали с использованием автоматического анализатора Hitachi 917 (Roche, Indianapolis, IN). Конечную кровь отбирали под анестезией CO2 при помощи пункции сердца. Показатели сыворотки крови оценивали с использованием имеющихся в продаже анализов ELISA: альфа-фетопротеин (R & D Systems, Minneapolis MN) и человеческий альбумин (Bethyl Laboratories, Montgomery TX). Животных умерщвляли под действием ингаляции СО2. Опухоли извлекали, взвешивали и помещали в формалин для гистологических исследований.

Непарный Т-тест Стьюдента использовали для сравнения различных параметров между обрабатываемой и контрольной группой крыс. Все значения выражены в виде среднего ±СО, и р значение <0,05 рассматривали как статистически значимое.

Результаты

Измерения массы тела корректировали путем вычитания массы опухоли (на основе объемных данных и предположения того, что 1 см3=1 г). Данные анализировали двумя путями: по обрабатываемой группе, и по животным, имеющим и не имеющим опухоль. При сравнении масс тел животных с опухолями с животными без опухолей существовало значимое различие между группами в конечный момент времени; на базовом уровне отсутствовало различие. Даже хотя массы тел не отличались значимо при сравнении по обрабатываемой группе ввиду кратковременной длительности исследования, существовала заметная тенденция уменьшения массы тела в обеих группах, имеющих опухоль, по сравнению с контролями и положительная тенденция в направлении восстановления у животных, получающих вакцину, по сравнению с животными, имеющими опухоль, получающими разбавитель без антигена (таблица 20). Также существовала умеренная корреляция между процентным изменением массы тела в течение эксперимента и объемом опухоли (r2=0,72) или массой (извлеченной) в конце эксперимента (r2=0,73).

Таблица 20
Изменение массы тела с течением времени между экспериментальными группами. Затемненные поля указывают на даты, когда вводили вакцину
Масса тела (г)
Сутки Контроль Имеющие опухоль Имеющие опухоль, обработанные
0 242,7±11,4 260,0±16,3 245,0±12,1
6 263,9±13,5 278,1±17,5 258,6±14,6
9 270,1± 14,0 280,6±19,2 260,1±15,1
13 280,6±16,2 290,3±20,2 262,0±15,1
16 283,8±15,0 289,0±18,5 261,1±15,3
20 292,6±16,1 284,1±17,3 259,2±14,6
23 299,8±15,6 283,2±17,0 252,7±14,2
27 298,7±14,0 276,1±15,5 259,4±14,4
30 307,6±15,9 274,2±3,4 260,9±14,5
34 317,8±16,2 262,6±14,6 267,8±15,1
37 318,1±16,6 263,1±15,0 268,4±14,8
41 323,4±15,3 264,4±14,7 274,9±15,2
44 328,5±16,6 262,5±14,6 278,3±15,1
48 331,2±17,0 263,0±14,1 281,6±15,0
49 330,5±17,1 262,6±14,4 281,2±14,3

Размер опухоли

Размер опухоли у контрольных крыс сравнивали с размером опухоли у крыс, обработанных вакциной, в течение четырехнедельного периода. Хотя не обнаружены статистически значимые различия между сравниваемыми группами (вследствие значительной вариации в размере опухоли), существовала жесткая тенденция в направлении уменьшения общего объема опухоли (таблица 21), и также уменьшении средней извлеченной массы опухоли (таблица 22) у крыс, которые получали вакцину.

Таблица 21
Изменения в размере опухоли между группой, обработанной разбавителем (имеющие опухоль), и группой, обработанной вакциной (имеющие опухоль, обработанные). Затемненные поля указывают на даты, когда вводили вакцину
Размер опухоли (см3)
Сутки Имеющие опухоль Имеющие опухоль, обработанные
6 4,6±2,1 4,7±2,0
9 4,9±2,0 4,8±1,8
13 4,6±1,8 5,0±2,2
16 12,2±2,7 12,3±2,5
20 22,6±3,8 13,4±2,6
23 33,3±4,8 14,1±2,8
27 34,5±4,6 13,8±2,8
30 35,6±4,6 13,5±3,4
34 37,7±8,0 14,1±2,9
37 38,6±10,2 13,7±2,3
41 44,5±12,1 12,5±2,1
44 52,9±13,9 13,0±2,1
48 61,7±15,1 16,9±2,9
Таблица 22
Различие в массе опухоли при вскрытии
Экспериментальная группа
Имеющие опухоль Имеющие опухоль, обработанные
Масса опухоли (г) 5,14±6,08 1,24±2,21

Анализы сыворотки крови

Человеческий альфа-фетопротеин (AFP) измеряли при помощи ELISA в различные моменты времени во время исследования. Эти данные использовали в сочетании с данными по массе организма и размеру опухоли для случайного распределения животных по обрабатываемым группам. Данные в результате этого исследования и исторические данные указывают на то, что AFP обнаруживают только у животных, имеющих опухоль. Сравнение продолжительных данных по AFP в имеющих опухоль контрольных и обработанных группах указывает на то, что AFP уменьшается у обработанных животных после первой инъекции вакцины, и оказывался гораздо меньше у обработанных крыс по сравнению с имеющими опухоль контрольными животными в конце исследования; 4,78±3,2 нг/мл у обработанных разбавителем по сравнению с 0,97±2,5 нг/мл у обработанных вакциной крыс, соответственно. Дополнительно, AFP демонстрировал корреляцию как с объемом опухоли, так и с массой извлеченной опухоли.

Человеческий альбумин (hALB) измеряли при помощи ELISA в различные моменты времени в течение исследования. Данные в результате этого исследования и исторические данные свидетельствуют о том, что hALB обнаруживается только у животных, имеющих опухоль. Сравнение данных hALB для имеющих опухоль контрольных и обработанных групп указывает на то, что hALB меньше у обработанных крыс по сравнению с имеющими опухоль контрольными крысами к концу исследования (данные не представлены). Дополнительно, hALB по аналогии с AFP демонстрировал корреляцию с объемом опухоли и массой извлеченной опухоли (данные не представлены).

Основную химическую панель сыворотки крови анализировали в различные моменты времени в течение исследования. Панель включала: AST (аспартатаминотрансферазу), ALT (аланинаминотрансферазу), холестерин, щелочную фосфатазу, GGT (гамма-глутамилтранспептидазу), BUN (азот мочевины крови), глюкозу, креатинин, общий билирубин, общий белок, альбумин, глобулин и минеральные вещества Са, Р, Na, К и Cl. По аналогии с массой тела данные анализировали двумя путями: по обрабатываемой группе и по животных, имеющим и не имеющим опухоль. Единственные конечные показатели, по которым наблюдали различия, представляли собой: AST, ALT и холестерин. В обоих сравнениях отсутствовали значимые различия между группами в базовый момент времени (данные не представлены). При сравнении химических показателей у животных, имеющих опухоль, с показателями у животных без опухоли обнаружено значимое различие между группами в конечный момент времени с увеличениями AST, ALT и холестерина у животных, имеющих опухоль (данные не представлены).

Заключение

Взятые вместе данные, полученные авторами настоящего изобретения, демонстрируют, что опухолевая масса уменьшалась у животных, обработанных вакциной, приготовленной против опухолевой клеточной линии HepG2, по сравнению с контрольной имеющей опухоль группой, получающей разбавитель.

Пример 22. CpG

Предшествующий уровень техники

Описанные здесь адъюванты представляют собой сильное адъювантное основание для вакцины, которая может быть усилена с использованием ORN/ODN олигорибонуклеотида/олигодезоксинуклеотида (цитозин-фосфат-гуанин, CpG) для усиления иммунного ответа с использованием адъювантов в качестве систем доставки для CpG.

Материалы и способы

Самок крыс С57В1/6 (n=10 на группу), имеющих массу тела приблизительно 18-20 г, использовали в исследовании. Их иммунизировали путем внутримышечной (IM) инъекции в левую переднюю большеберцовую мышцу общим объемом 50 мкл на 0, 14 и 21 сутки исследования.

Доза реагента

Доза композиции содержала в различных комбинациях один или более чем один из следующих компонентов:

Буфер: NaH2PO4·2H2O (229,32 мг/л), NaCl (1168,00 мг/,) и Na2HPO4 (1144,00 мг/л, растворенный в WFI (вода для инъекций) и подвергнутый стерильной фильтрации через фильтр 0,1 мкм.

Овальбумин (OVA - Антиген): 10 мкг

CpG ODN: 10 мкг

Холестерин:1 мкг

Quil A: 1 мкг

DDA: 0,5 мкг

Карбопол: 0,0375%

R1005: 50 мкг

Приготовление вакцины

Буфер помещали в колбу объемом 50 мл с мешалкой и перемешивали при постоянной скорости в течение следующих стадий. Компоненты добавляли в следующей последовательности: Антиген (OVA); CPG ODN; QuilA; холестерин (по каплям); DDA (по каплям); Carbopol®; и Bay R1005®. Композицию перемешивали при комнатной температуре (приблизительно 25°C) в течение минимум 30 минут, защищая от света путем закрывания фольгой. Раствор продавливали через иглу 25G в шприц для разрушения каких-либо крупных плавающих частиц с получением однородной (мутной) суспензии, и переносили в стерильные стеклянные флаконы для хранения.

Отбор образца

Отбирали следующие образцы;

Плазма крови: 4 недели после первичной вакцинации (1 неделя после второй бустерной вакцинации)

Цитотоксический Т-лимфоцит (CTL) (6 недель после первичной вакцинации (3 недели после второй бустерной вакцинации)

Секреция цитокина в супернатант (4 недели после первичной вакцинации)

24-часовой супернатант (IL-2, IL-4, IL-10, TNF (фактор некроза опухоли))

72-часовой супернатант (IFN-g (интерферон гамма))

Тетрамер (4 недели после первичной вакцинации)

Цитокинпродуцирующие Т клетки (6 недель после первичной вакцинации)

Результаты приведены в виде относительной оценки для каждого адъюванта, демонстрирующей действие адъюванта. Конечные значения представляют собой относительную шкалу, основанную на сумме индивидуальных ответов в виде цитотоксических Т-лимфоцитов.

Результаты и обсуждение

Как представлено в таблице 23, QCDCR плюс OVA обеспечивают более сильные ответы в виде CTL по сравнению с их субкомпонентами, тем не менее, общие ответы были низкими (<20%). Комбинация QCDCR или ее субкомпонентов с CPG значительно улучшала OVA-специфические ответы в виде CTL. В общем QCDCR/CPG плюс OVA обеспечивали самый высокий ответ в виде CTL, тем не менее, отсутствовало значимое различие в ответах между этой группой и холестерин/CPG плюс OVA (в отношении 25:1). Культуральные супернатанты спленоцитов, стимулированных OVA (1 мг/мл), анализировали в отношении цитокинов при помощи ELISA. Сама QCDCR или ее субкомпоненты обеспечивали лишь очень слабые цитокиновые ответы. Комбинация QCDCR или ее субкомпонентов с CPG усиливала секрецию антигенспецифического IL-2 и IFN-g (Th1-основанные цитокины). QCDCR и CpG равны по силе вызывания клеточных иммунных ответов. Их комбинирование демонстрирует синергизм. Когда анализировали субкомпоненты QCDCR с CpG, тогда комбинации с Quil A обеспечивают наилучшие ответы с последующим включением холестерина с CpG.

Таблица 23
Относительные ответы в виде CTL
Группы CTL IFN-g Тетрамер IL-2 Общее
QCDCR-CpG+OVA 18 16 18 18 70
QCDC-CpG+OVA 15 18 17 16 66
Ch+CpG+CR+OVA 12 14 15 17 58
Ch+CpG+DC+OVA 8 17 13 15 53
Ch+CpG+DCR+OVA 16 9 14 13 52
C+CpG+OVA 9 13 16 11 48
DCR+CpG+OVA 13 13 12 9 47
CR+CpG+OVA 10 10 11 8 39
DC+CpG+OVA 11 11 -8 6 36
CpG+OVA 14 8 9 3 34
QCDCR+OVA 7 5 7 14 33
CR+OVA 5 7 4 7 23
QCDC+OVA 3 6 2 10 21
CR+OVA 4 3 5 4 16
DCR+OVA 6 2 6 2 16
DC+OVA 2 4 3 5 14
OVA 1 1 1 1 4
QC представляет собой сокращение для QuilA/холестерин, Ch - холестерин, D - DDA, С - Carbopol®, R - Bay R1005®

Пример 23. Коронавирус собак (CCV)

Область

Применяли мышиную модель с использованием коронавируса собак (CCV) и новых комбинированных адъювантов для оценки эффективности адъюванта сданным антигенным компонентом.

Животные

Десяти мышам CF-1 на обрабатываемую группу подкожно вводили 0,2 мл на животное в каждой обрабатываемой группе.

Обрабатываемые группы

Тестируемые композиции, представленные в таблице 24, готовили в виде 1,0 мл объема дозы с приведенными ниже концентрациями. Только 0,2 мл вакцины вводили каждой мыши.

Таблица 24
Тестируемые композиции
Тестируемые композиции Концентрация адъюванта:мкг/2 мл (за исключением карбопола) CCV/дозу
1 PBS Отсутствие Отсутствие
2 Антиген PBS 6040
3 AblSCO-100 100 6040
4 AblSCO-200 100 6040
5 AblSCO-300 100 6040
6 Quil-A/Холестерин 100/100 6040
7 R1005 1000 6040
8 R1005/Карбопол 1000/0,075% 12079
9 DDA/R1005/Карбопол 50/1000/0,075% 12079
10 Quil-A/Холестерин/Р1005 100/100/1000 6040
11 Quil-A/Холестерин/DDA Карбопол 100/100/50/0,075% 6040
12 Quil-A/Холестерин/R1005/Карбопол 100/100/1000/0,075% 12079
13 Quil-A/Холестерин/DDA/R1005/Карбопол 100/100/50/1000/0,075% 12079

Приготовление вакцины

Приготовление вакцины для адъювантов по изобретению описано в примерах 1-13 выше. Концентрации адъювантных компонентов приведены в таблице 24. Адъюванты добавляли в последовательности, приведенной в таблице.

Солевой наполнитель добавляли в сосуд и начинали гомогенизацию. Инактивированный CCV добавляли до концентрации, представленной в таблице 24. Холестерин добавляли в концентрации, представленной в таблице 24. Затем добавляли раствор холестерина в этаноле при продолжающейся гомогенизации. Затем добавляли раствор DDA/этанола во время гомогенизации. Смесь микрофлюидизировали при 10000 ф./кв. дюйм (68947570 Па). Затем добавляли карбопол при перемешивании, и pH доводили до 6,8-7,2. Затем добавляли гликолипид Bay R1005® при перемешивании. Наконец композицию доводили до конечного объема при помощи солевого расширителя.

Вакцину для обрабатываемых групп, получающих имеющиеся в продаже продукты AblSCO (Isconova, Sweden), готовили в соответствии с указаниями на этикетке. Продукты AblSCO основаны на сапонинах quillaja и способе ISCOM с использованием высокоочищенных сапонинов.

Способ анализа: Нейтрализация бета CCV сыворотки крови

Сыворотку крови инактивировали нагреванием при 56°C в течение 30-40 минут. В прозрачном стерильном планшете серийные разведения каждого образца сыворотки крови (неразведенный, 2, 4, 8…) осуществляли путем дозирования 120 мкл в 120 мкл разбавителя. По меньшей мере использовали по две повторные лунки/разведение. При необходимости исходно использовали разведение 1:16. Рабочий исходный раствор для сенсибилизации готовили путем разбавления живого CCV до уровня, содержащего приблизительно 240 вирусных частиц в 120 мкл. Затем 120 мкл каждого разведения сыворотки крови комбинировали с 120 мкл вирусного раствора для получения в общем 240 мкл. Раствор перемешивали и оставляли при комнатной температуре (приблизительно 25°) на 30-60 минут для обеспечения нейтрализации. Затем 120 мкл каждого серийного разведения переносили в ожидающие "голые" монослои клеток NLFK, высеянных на 7-12 суток раньше. СРЕ оценивали через 4-6 суток. Обратное титрование подтвердило, что от 50 до 316 вирусных частиц попадают в каждый монослой.

Результаты

Таблица 25
Нейтрализация сыворотки крови
Обрабатываемая группа Нейтрализующие титры в сыворотке крови
Физиологический раствор 2
Только антиген 64
AblSCO-100 256
AblSCO-200 23
AblSCO-300 11
Quil-A/Холестерин 315
R 512
RC 11
DRC 630
QCR 1024
QCDC 630
QCRC 724
QCDRC 1448

Обобщение

Комбинированные действия адъювантов, приготовленных с CCV с учетом химических свойств каждого компонента, обеспечили превосходные свойства для вакцинного адъюванта.

Серологические результаты исследований представлены в таблице 25. Более высокие титры нейтрализующего антитела в сыворотке крови как правило ассоциированы с более хорошей защитой, обеспечиваемой вакцинами. Некоторые из адъювантных композиций по изобретению продуцировали гораздо более высокие титры по сравнению с имеющимися в продаже адъювантными продуктами, даже хотя эти композиции обладали близким значением добавленного антигена CCV. Композиции QCDC, QCR, DRC, QCRC, и QCDRC были особенно эффективны в индуцировании хорошего иммунного ответа у мышей.

Пример 24. Антиген ротавируса крупного рогатого скота

Область

Применяли мышиную модель с использованием ротавируса крупного рогатого скота и комбинированных адъювантов для оценки эффективности адъюванта с данным антигенным компонентом.

Животные

Десяти мышам CF-1 на обрабатываемую группу подкожно вводили 0,2 мл на животное в каждой обрабатываемой группе.

Обрабатываемые группы

Тестируемые композиции, представленные в таблице 26, готовили в виде 2,0 мл объема дозы с приведенными ниже концентрациями. Только 0,2 мл вакцины вводили каждому животному.

Таблица 26
Тестируемые композиции
Тестируемые композиции Концентрация адъюванта: мкг/2 мл (за исключением карбопола) Ротавирус В223/дозу
1 Фосфатный буфер PBS NA
2 Антиген PBS 6,09 мкг
3 AblSCO-100 100 6,09 мкг
4 AblSCO-200 100 6,09 мкг
5 AblSCO-300 100 6,09 мкг
6 Quil-A/Холестерин 100/100 6,09 мкг
7 Quil-A/Холестерин/DDA Карбопол 100/100/50/0,075% 6,09 мкг
8 R1005 1000 6,09 мкг
9 Quil-A/Холестерин/RI 005 100/100/1000 6,09 мкг
10 Quil-A/Холестерин/DDA/R1005/Карбопол 100/100/50/1000/0,075% 6,09 мкг
11 Quil-A/Холестерин/DDA/Карбопол 100/100/50/0,075% 12,18 мкг
12 Quil-A/Холестерин/Kap6onon/R1005 100/100/0,075%/1000 12,18 мкг
13 Quil-A/Холестерин/DDA/R1005/Карбопол 100/100/50/1000/0,075% 12,18 мкг
14 DDA/R1005/Карбопол 50/1000/0,075% 12,18 мкг
15 R1005/Карбопол 1000/0,075% 12,18 мкг

Приготовление вакцины

Приготовление вакцины для адъювантов по изобретению описано в примерах 1-13 выше. Концентрации адъювантных компонентов приведены в таблице 26. Адъюванты добавляли в последовательности, приведенной в таблице.

Солевой наполнитель добавляли в сосуд и гомогенизацию начинали. Инактивированный ротавирус крупного рогатого скота добавляли до концентрации, представленной в таблице 26. Quil A добавляли в концентрации, представленной в таблице 26. Затем добавляли раствор холестерина/этанола при продолжающейся гомогенизации. Затем добавляли раствор DDA/этанола во время гомогенизации. Смесь микрофлюидизировали при 10000 ф./кв. дюйм (68947570 Па). Затем добавляли Carbopol® при перемешивании, и pH доводили до 6,8-7,2. Затем добавляли гликолипид Bay R1005® при перемешивании. Наконец композицию доводили до конечного объема при помощи солевого наполнителя.

Вакцину для обрабатываемых групп, получающих имеющиеся в продаже продукты AblSCO (Isconova, Sweden), готовили в соответствии с указаниями на этикетке. Продукты AblSCO основаны на сапонинах quillaja и способе ISCOM с использованием высокоочищенных сапонинов.

Результаты

Таблица 27
Нейтрализующие титры в сыворотке крови
Тестируемые композиции Нейтрализующие титры в сыворотке крови (SN)
Физиологический раствор ≤3
Только антиген 23
AblSCO-100 16
AblSCO-200 16
AblSCO-300 14
Quil-A/Холестерин 14
QCDC 16
R 10
QCR 16
QCDCR 16
QCDC 3
QCCR 5
QCDCR 39
DRC 20
RC 3
QC представляет собой сокращение для QuilA/холестерин, D - DDA, С - Carbopol®, R - Bay R1005®

Объединенные эффекты адъювантов, приготовленных с ротавирусом крупного рогатого скота, принимая также во внимание химические свойства каждого компонента, обеспечивали превосходные свойства для адъюванта вакцины (смотри таблицу 27).

Хотя несколько из адъювантных композиций обеспечивали близкие уровни титров нейтрализующих антител в сыворотке крови, адъювант QCDCR обеспечивал наивысший уровень.

Пример 25. Вирус собачьего гриппа

Область/Схема исследования

Модель на собаках применяли с использованием вируса собачьего гриппа (CIV) и новых комбинированных адъювантов для оценки эффективности адъюванта сданным антигенным компонентом.

Исследование имело рандомизированную полноблочную схему (смотри таблицу 28) Животных сортировали по дате рождения с формированием блоков, имеющих размер, равный 5. В блоке животных случайным образом распределяли по обрабатываемым группам. Животных в одном и том же блоке случайным образом распределяли по отсекам (клеткам), располагающимся рядом друг с другом. Животные имели хорошее здоровье без истории гиперчувствительности к имеющимся в продаже вакцинам. Животные не получали вакцины против CIV.

Таблица 28
Схема исследования
Обраб. группа Кол-во животных Обработка Сутки Доза Путь
Т01 8-10 Адъювант Плацебо (отр. контроль) 0 1 мл SQ
Т02 8-10 Препарат для исследования безопасности (полож. контроль) 0 1 мл SQ
Т03 8-10 QCDC высокая доза 0 1 мл SQ
Т04 8-10 QCDC средняя доза 0 1 мл SQ
Т05 8-10 QCDC низкая доза 0 1 мл SQ
QC представляет собой сокращение для QuilA/холестерин, D - DDA, С Carbopol®
Таблица 29
Вакцинная композиция
Т01 Адъювант плацебо, отрицательный контроль
Композиция Quil A - холестерин - DDA - карбопол (20/20/10/.075)
Т02
Непатентованное название CIV исследование безопасности, серийные, положительный контроль
Композиция Iowa - 05 штамм гриппа (H3N8) @ 760 НА, комбинированный с 5% Rehydragel LV
Т03
Непатентованное название CIV + высокая доза QCDC
Композиция Iowa - 05 штамм гриппа (H3N8) @ 760 НА, комбинированный с Quil A - холестерин - DDA - карбопол (20/20/10/.075)
Т04
Непатентованное название CIV + средняя доза QCDC
Композиция Iowa - 05 штамм гриппа (H3N8) @ 760 НА, комбинированный с Quil A - холестерин - DDA - карбопол (10/10/10/.075)
Т05
Непатентованное название CIV + низкая доза QCDC
Композиция Iowa - 05 штамм гриппа (H3N8) @ 760 НА, комбинированный с Quil A - холестерин - DDA - карбопол (5/5/10/.075)

Приготовление вакцины

Приготовление вакцины для адъювантов по изобретению описано в примерах 1-13 выше. Концентрации адъювантных компонентов приведены в таблице 29. Адъюванты добавляли в последовательности, приведенной в таблице.

Солевой наполнитель добавляли в сосуд, и начинали гомогенизацию. Инактивированный вирус гриппа собак добавляли до концентрации, представленной в таблице 29, Quil A добавляли в концентрации, представленной в таблице 29. Затем добавляли раствор холестерина/этанола при продолжающейся гомогенизации. Затем добавляли раствор DDA/этанола во время гомогенизации. Смесь микрофлюидизировали при 10000 ф./кв. дюйм (68947570 Па). Затем добавляли карбопол при перемешивании, и pH доводили до 6,8-7,2. Наконец композицию доводили до конечного объема при помощи солевого наполнителя.

Тестирование

Серологию оценивали с использованием анализа ингибирования гемагглютинации (HAI) при помощи стандартного способа анализа для USDA

Результаты/Обобщение

В таблице 30 представлены серологические результаты THE средних титров HAI Geo на 42 и 180 сутки.

Таблица 30
Титры HAI
Обработка HAI Geo. Средние на 42 сутки HAI Geo. Средние на 180 сутки
Т01 (плацебо) 8 8
Т02 (полож. контроль, алюм) 172 32
Т03 (низкая доза) 65 41
Т04 (средн. доза) 65 32
Т05 (высокая доза) 216 69

Объединенные действия адъювантов, приготовленных с вирусом гриппа, и с учетом химических свойств каждого компонента, придают превосходные свойства адъювантам вакцины.

Более высокие титры антител, как правило, ассоциированы с более хорошими защитными свойствами вакцины. Как правило, алюминиевый адъювант (Т02) и адъюванты по изобретению (Т03, Т04, и Т05) приводили к увеличению титров HAI, но ответ, вызванный адъювантами по изобретению, был выше с более высокими титрами на 180 сутки в группе, получающей высокую дозу (Т05). Титры для низкой и средней доз адъювантов по изобретению были эквивалентны титрам для традиционной алюминий-содержащей противогриппозной вакцины. Кроме того, поскольку адъюванты по изобретению обеспечивают иммунный ответ, опосредованный Т хелперами 1, тогда как алюминий не обеспечивает его, следовательно, ожидают, что длительность иммунитета будет большей при более быстром механизме отклика.

1. Иммуногенная композиция, содержащая адъювантную композицию и иммунологически эффективное количество антигенного компонента, где адъювантная композиция содержит Quil A или его очищенную фракцию, холестерин, диметилдиоктадециламмоний бромид (DDA), полиакриловую кислоту (CARBOPOL) и CpG и/или N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетат.

2. Способ приготовления иммуногенной композиции по п.1, при котором:
а) готовят композицию антигенного компонента в буфере;
б) добавляют Quil А или его очищенную фракцию к композиции со стадии (а);
в) добавляют холестерин к композиции со стадии (б);
г) добавляют диметилдиоктадециламмоний бромид (DDA) к композиции со стадии (в);
д) добавляют полиакриловую кислоту к композиции со стадии (г);
е) добавляют один из CpG или N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетата к композиции со стадии (д);
ж) возможно, добавляют другой из CpG или N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетата к композиции со стадии (е).

3. Вакцинная композиция, содержащая адъювантную композицию и иммунологически эффективное количество антигенного компонента, где адъювантная композиция содержит Quil A или его очищенную фракцию, холестерин, диметилдиоктадециламмоний бромид (DDA), полиакриловую кислоту (CARBOPOL) и CpG и/или N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетат.

4. Композиция по любому из п.1 или 3, дополнительно содержащая масло.

5. Способ приготовления вакцинной композиции по п.3, при котором:
а) готовят композицию антигенного компонента в буфере;
б) добавляют Quil A или его очищенную фракцию к композиции со стадии (а);
в) добавляют холестерин к композиции со стадии (б);
г) добавляют диметилдиоктадециламмоний бромид (DDA) к композиции со стадии (в);
д) добавляют полиакриловую кислоту к композиции со стадии (г);
е) добавляют один из CpG или N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетата к композиции со стадии (д);
ж) возможно, добавляют другой из CpG или N-(2-дезокси-2-L-лейциламино-β-D-глюкопиранозил)-N-октадецилдодеканамида ацетата к композиции со стадии (е).

6. Способ по п.2 или 5, при котором дополнительно осуществляют стадию добавления композиции со стадии (д) к масляной фазе.

7. Способ по п.2 или 5, при котором дополнительно осуществляют стадию добавления композиции со стадии (е) к масляной фазе.

8. Способ по п.2 или 5, при котором дополнительно осуществляют стадию, включающую микрофлюидизацию композиции со стадии (г).

9. Композиция по п.1 или 3, где антигенный компонент включает:
(а) вирус лейкемии кошек;
(б) бактерии штамма J-5 Escherichia coli;
(в) вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV);
(г) BVDV тип 1 (BVDV-1) и BVDV тип 2 (BVDV-2);
(д) Mycoplasma hyopneumonia (M. hyopneumonia);
(е) вирус кошачьего гриппа (FIV);
(ж) антиген рака;
(з) коронавирус собак (CCV);
(и) ротавирус крупного рогатого скота; или
(к) вирус собачьего гриппа (CIV).

10. Вакцинная композиция по п.9 (а) для лечения животного семейства кошачьих от инфекции, вызванной вирусом лейкемии кошек.

11. Вакцинная композиция по п.9 (б) для лечения животного, являющегося представителем крупного рогатого скота, от инфекции, вызванной Escherichia coli.

12. Вакцинная композиция по п.9 (в) или 9 (г) для лечения животного, являющегося представителем крупного рогатого скота, от инфекции, вызванной вирусом диареи крупного рогатого скота (BVDV).

13. Вакцинная композиция по п.9 (д) для лечения животного семейства свиней от инфекции, вызванной М. hyopneumonia.

14. Вакцинная композиция по п.9 (е) для лечения животного семейства кошачьих от инфекции, вызванной вирусом кошачьего гриппа (FIV).

15. Вакцинная композиция по п.9 (ж) для лечения субъекта от рака.

16. Вакцинная композиция по п.9 (з) для лечения животного семейства собачьих от инфекции, вызванной коронавирусом собак (CCV).

17. Вакцинная композиция по п.9 (и) для лечения животного, являющегося представителем крупного рогатого скота, от инфекции, вызванной ротавирусом крупного рогатого скота.

18. Вакцинная композиция по п.9 (к) для лечения животного семейства собачьих от инфекции, вызванной вирусом собачьего гриппа (CIV).

19. Способ дифференцировки животного, инфицированного BVDV в природе, от животного, вакцинированного вакцинной композицией по п.9 (в) или 9 (г), при котором получают образец у тестируемого животного и измеряют уровни белка E2 и белков NS2/3 в указанном образце, где отсутствие белков NS2/3 указывает на то, что животное было вакцинировано указанной вакцинной композицией.

20. Композиция по п.1 или 3, содержащая CpG.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области иммунологии. Представлено антитело против ангиопоэтина-2 (Ang-2), причем указанное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID No:7 (MEDI5) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из SEQ ID No:3 (MEDI1); SEQ ID No:4 (MEDI2); SEQ ID No:5 (MEDI3); и SEQ ID No:6 (MEDI4).
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложен способ in vitro генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника.

Изобретение относится к биотехнологии. Раскрыта вакцина, включающая четыре РНК, кодирующих простат-специфический антиген (ПСА), простат-специфический мембранный антиген (ПСМА), антиген стволовых клеток предстательной железы (АСКП) и шестой трансмембранный эпителиальный антиген предстательной железы (ШТЭАП).

Группа изобретений относится к медицине и касается композиции для направленного устранения мутационного ускользания от воздействия противоопухолевых терапевтических средств; набора для вызывания иммунного ответа, где набор содержит указанную композицию.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения гриппа различных типов. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, содержащее активированную-потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека (ИФН-γ), активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору и активированную-потенцированную форму антител к гистамину.

Изобретение относится к области биотехнологии. Раскрыты способы, композиции и наборы для диагностики остеоартрита у животных семейства кошачьих.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии и неврологии, и касается лечения кинетозов. Для этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую активированную-потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 и активированную-потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе.
Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии и касается способа получения антигена для серологической диагностики анаплазмоза мелкого рогатого скота.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения бактериальных инфекций. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, содержащее активированную-потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека (ИФН-γ), активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору и активированную-потенцированную форму антител к гистамину.
Изобретение относится к области ветеринарии и медицины. Предложен способ лечения гриппа птиц A/H5N1 с помощью высокополимерной дрожжевой РНК.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Иммуноферментная тест-система для определения вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, в сыворотке (плазме) крови человека. Тест-система включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека 1 типа (env ВИЧ-1 и ВИЧ-1 группы О), раствор для разведения образцов (РРС) и детектирующие реагенты (конъюгаты, хромоген/субстрат). Изобретение относится также к способу определения вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, в сыворотке (плазме) крови человека путем исследования сыворотки крови больного при помощи описанной иммуноферментной тест-системы. Изобретение позволяет быстро и просто определять вероятные сроки заражения ВИЧ-инфекцией. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ создания антитела и его функциональных фрагментов, направленных против опухолевого антигена, экспрессируемого на поверхности опухоли, устойчивой по меньшей мере к одному противоопухолевому соединению, основанный на применении для иммунизации измельченного гомогената, и/или суспензии, и/или клеточного лизата, происходящих из такой опухоли. Также рассмотрено применение способа по изобретению для получения моноклональных антител и их функциональных фрагментов, моноклональные антитела, полученные этим способом, кодирующие их нуклеиновые кислоты, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин и способ получения антитела с их использованием, а также гибридомы, способные секретировать эти антитела, применение антител и их функциональных фрагментов для изготовления лекарства, противоопухолевая композиция и ее применение в качестве лекарства. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии резистентных опухолей. 16 н. и 26 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 пр., 6 табл.
Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к вирусологии, и касается профилактики инфицирования ВИЧ, комплексной профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ или ассоциированных с ВИЧ, в том числе СПИДа. Для этого вводят композицию, содержащую один или несколько антиретровирусных препаратов в сочетании с активированной-потенцированной формой антител к белку или пептиду иммунной системы, который взаимодействует с ВИЧ или содержание и/или функциональная активность которого изменяется в связи с инфицированием ВИЧ. Это обеспечивает эффективное ингибирование репликации ВИЧ при уменьшении концентрации антиретровирусных препаратов и повышение концентрации лимфоцитов у данной группы больных. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 2 табл.
Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к вирусологии, и касается профилактики инфицирования ВИЧ, профилактики и эффективного лечения заболеваний, вызываемых ВИЧ, в том числе СПИДа. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, содержащее активированную - потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную - потенцированную форму антител к CD4 рецептору. Включение этого средства в комплексную терапию повышает эффективность профилактики и лечения указанных выше заболеваний и патологических состояний за счет снижения вирусной нагрузки и увеличения количества CD4 лимфоцитов. 2 н. и 8 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для профилактики инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота. Способ профилактики инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота включает вакцинацию вакциной ассоциированной против инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа I, при этом за 29-31 день до вакцинации животным вводят подкожно в область верхней трети шеи в дозе 0,045-0,055 мл/кг живой массы иммуностимулирующий препарат «Кероконвитин», полученный на основе цитотоксической сыворотки из крови лошадей-доноров путем гипериммунизации их антигеном, приготовленным из тканей глаз - конъюнктивы и роговицы крупного рогатого скота, переболевшего инфекционным конъюнктиво-кератитом. Ткани глаз крупного рогатого скота получают при забое животных. Изобретение позволяет на 40% по сравнению с использованием одной вакцины повысить эффективность профилактики инфекционного конъюнктиво-кератита крупного рогатого скота, обеспечивает более высокий иммунный статус организма животных. 3 табл., 1 пр., 2 ил.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для получения композиции для стимуляции иммунной системы. Для этого композиция содержит: первый экстракт из источников иммунных модуляторов, содержащий экстракт молозива или яиц и имеющий верхний предел молекулярной массы 10000 Да, где первый экстракт содержит фактор переноса и нанофракцию иммуномодулирующих молекул, обладающих молекулярными массами 3000 Да или менее; и второй экстракт из источника иммунных модуляторов, содержащий экстракт молозива или яиц и имеющий верхний предел молекулярной массы 3000 Да, где второй экстракт не содержит фактор переноса, но содержит нанофракцию иммуномодулирующих молекул, обладающих молекулярными массами 3000 Да или менее. Группа изобретений относится также к вариантам указанной композиции и способу модулирования иммунной системы. Использование данных композиций, содержащих нанофракции иммуномодулирующих молекул и фактор передачи, позволяет угнетающе регулировать нежелательную Т-клеточную активность, при этом увеличивая, или стимулирующе регулируя активность Т-хелперных клеток, Т-клеток памяти и ЕК-клеток против патогенов. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл., 7 пр., 4 ил.

Группа изобретений относится к медицине и касается способов лечения дефицита гормона роста или инсулиноподобного фактора роста 1 у пациента, включающих введение иммуногенного количества вакцины, содержащей химерный полипептид соматостатина-14, связанный с инактивированной хлорамфениколацетилтрансферазой (САТ), и адъювант; вакцины для лечения пациента, имеющего дефицит гормона роста или инсулиноподобного фактора роста 1; способа лечения ожирения у пациента, включающего введение иммуногенного количества вакцины. Группа изобретений обеспечивает иммуногенность для соматостатина и повышенное высвобождение эндогенно продуцируемого гормона роста и/или инсулиноподобного фактора роста 1. 5 н. и 17 з.п. ф-лы, 8 пр., 6 ил., 2 табл.

Предложено: применение средства, увеличивающего всасывание, содержащего сложный эфир жирной гидроксикислоты и полиэтиленгликоля 660 (в частности, Solutol® HS15) в составе фармацевтической композиции в качестве средства для увеличения всасывания терапевтического средства через слизистую оболочку, где терапевтическое средство имеет значение log Р менее чем приблизительно 1 и (a) представляет собой пептид, белок, нуклеиновую кислоту, антиген или вакцину; и/или (b) не является субстратом для Р-гликопротеина (P-Gp). Также предложены фармацевтическая композиция вышеуказанных веществ (варианты), способ ее получения и способ введения, и применение сложного эфира жирной гидроксикислоты и полиэтиленгликоля 660 для получения вышеуказанного лекарственного средства. Показано увеличение всасывания инсулина из заявленного средства против его всасывания из состава с ПЭГ и ПЭГ-гидроксистеариновой кислоты, при этом Solutol® HS15 оказывал незначительный эффект на открытие плотных клеточных контактов клеток эпителия. 6 н. и 29 з.п.ф-лы, 8 ил., 9 пр.

Изобретение раскрывает иммуноиндуцирующее средство, включающее в качестве эффективного(ых) ингредиента(ов) по меньшей мере один полипептид, выбранный из следующих полипептидов, где полипептид(ы) обладает(ют) иммуноиндуцирующей активностью/активностями, или в качестве эффективного(ых) ингредиента(ов) рекомбинантный(ые) вектор(а), который(ые) включает(ют) полинуклеотид(ы), кодирующий(ие) полипептид(ы), и способен(ны) к экспрессии полипептида(ов) in vivo, может использоваться для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли: (a) полипептид, состоящий по существу не менее чем из 7 последовательных аминокислот в любой из аминокислотных последовательностей с нечетными номерами SEQ ID NO: 3-95, приведенными в списке последовательностей; (b) полипептид, обладающий не менее чем 90% идентичностью последовательности с указанным полипептидом (а) и состоящий по существу не менее чем из 7 аминокислот; и (с) полипептид, включающий указанный полипептид (a) или (b) в качестве своей частичной последовательности. Данное изобретение эффективно в лечении, профилактике, а также в выявлении рака в живом организме путем измерения уровня антител в образце, поскольку указанный(ые) выше полипептид(ы) взаимодействует(ют) с антителами, специфически присутствующими в сыворотке пациента со злокачественной опухолью. 11 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 пр.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к неврологии, и касается лечения синдрома дефицита внимания. Для этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую активированную-потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 и в качестве дополнительного - усиливающего компонента активированную - потенцированную форму антител к эндотелиальной NO-синтазе. Способ обеспечивает эффективное лечение синдрома дефицита внимания за счет синергетического действия активных компонентов фармацевтической композиции. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил., 2 пр.
Наверх