Способ выделения низкомолекулярных пептидов

Авторы патента:

C12P21/06 - гидролизом пептидной связи, например белковых гидролизатов (получение пищевых продуктов гидролизом белка A23J 3/00)

C07K2/00 - Пептиды с неопределенным числом аминокислот; их производные

C07K1/12 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2510398:

Казьянин Александр Викторович (RU)
Мальгина Дарья Юрьевна (RU)
Волкова Лариса Владимировна (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций. Способ включает ферментативный гидролиз исходного сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. В качестве исходного сырья используют эритромассу крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза. Проводят осветление раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66 °С в течение 15 мин. Изобретение позволяет выделить низкомолекулярные пептиды и повысить их биологическую активность. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций.

Известно, что естественные низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой до 15 кДа способны поддерживать гомеостаз организма, проявляя разнообразную активность - антибактериальную, противовирусную, антиоксидантную, регенеративную. Пептиды с молекулярной массой менее 3 кДа имеют повышенную биодоступность при наружном применении. Обзор литературы показывает, что в результате ограниченного протеолиза биологически активного белка - предшественника-гемоглобина образуются пептиды, модулирующие функции иммунной, нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой и других систем организма [Малкова Н.В. Р-эндорфинподобный пептид иммунорфин: свойства и механизм действия. Дис.к.б.н., М., 2002. 121 с.].

В качестве прототипа принято описание изобретения «Способ выделения низкомолекулярных пептидов» к патенту RU 2416243, МПК A23J 1/20, опубликовано: 20.04.2011, бюл. №11.

Способ осуществляют следующим образом. Получают гидролизат ферментативным гидролизом молозивной казеиново-сывороточной массы с использованием 0,3-0,6 г панкреатина на 1 л гидролизуемой смеси в течение 3-4 часов и с коррекцией среды 25%-ным водным раствором аммиака. К полученному гидролизату добавляют 300 г сефадекса G-25, оставляют на 10 мин, смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочный раствор удаляют, набухший гель элюируют дистиллированной водой, вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Полученные жидкие фракции стерилизуют фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Из одного литра гидролизата получают 118-123 мл фракции, содержащей низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой от 3 до 15 кДа. Для получения сухой формы фракции подвергают лиофильному высушиванию. Наличие низкомолекулярных пептидов во фракции проверяют электрофорезом в ПААГ. В прототипе дано описание выделенных пептидных фракций (табл.1).

Таблица 1
Содержание низкомолекулярных пептидов в гидролизате молозивной казеиново-сывороточной массы (электрофорез в ПААГ)
	%±m
Пептиды с молекулярной массой от 7 до 14 кДа	9,3±4,7
Пептиды с молекулярной массой от 3 до 7 кДа	54,3±14,0
Аминокислоты (молекулярная масса менее 3 кДа)	36,4±4,2

Данные табл.1 показывают, что использование предлагаемого способа выделения низкомолекулярных пептидов из гидролизатов молозивной казеиново-сывороточной массы позволяет получить пептиды с молекулярной массой от 3 до 14 кДа с преобладанием пептидов, имеющих молекулярную массу от 3 до 7 кДа.

Признаки изобретения, общие с прототипом, заключаются в наличии ферментативного гидролиза исходного сырья, центрифугировании с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.

Недостатком прототипа является способ выделения пептидов с использованием сефадекса G-25, обладающего высокой селективностью по молекулярной массе и способного удерживать до элюции узкий спектр пептидов с молекулярной массой от 1 до 5 кДа, что приводит к удалению большей части низкомолекулярных пептидов с другой молекулярной массой вместе с надосадочной жидкостью после центрифугирования, снижая тем самым биологическую ценность гидролизата.

Задача, решаемая изобретением, заключается в повышении биологической активности пептидов.

Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, заключается в снижении молекулярной массы пептидов.

Технический результат достигается тем, что в способе выделения низкомолекулярных пептидов, включающем ферментативный гидролиз исходного сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют эритромассу крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин.

Использование в качестве исходного сырья эритромассы крови доноров, включающей в свой состав широкий спектр низкомолекулярных пептидов, обеспечивает дальнейшую возможность их выделения в технологии. Осуществление операций гемолиза, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза и осветления позволяет выделить больший спектр низкомолекулярных пептидов и изготовить необходимую композицию на их основе.

Признаки изобретения, отличающиеся от прототипа, заключаются в использовании в качестве исходного сырья эритромассы крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66 °С в течение 15 мин.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве сырья используют эритромассу крови доноров. Отобранная для переработки эритромасса должна пройти вирусологический контроль (HBS-антиген к вирусу гепатита В, антитела к вирусу гепатита С и ВИЧ отсутствуют), рН (6,81±0,23), содержание аминного азота (249,90±36,35) мг%. Физико-химические параметры могут варьироваться в зависимости от сезона кроводачи, возраста и пола донора.

Гидролизат получают ферментативным гидролизом предварительно гемолизированной и вирусинактивированной эритромассы крови доноров с 2% пепсина от исходного объема в течение 144 ч и с коррекцией среды (0,01-0,1)М раствором соляной кислоты до рН (1,5-2,0), инактивируют фермент, осветляют гидролизат раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин и осаждают балластные вещества методом центрифугирования при 1,3*10³ об/мин в течение 15 мин. Полученную жидкую фракцию подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Определение молекулярной массы пептидов в гидролизате проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). С 1 л исходного сырья эритромассы получают (100-110) г сухого вещества, что соответствует содержанию аминного азота (390-430) мг%, представленного низкомолекулярными пептидами, аминокислотами (табл.2).

Таблица 2
Содержание низкомолекулярных пептидов в гидролизате эритромассы (метод ВЭЖХ)
	%±m
Пептиды с молекулярной массой от 4,5 до 6,0 кДа	89,00±1,20
Пептиды с молекулярной массой от 2 до 4,5 кДа	7,00±0,12
Мелкие пептиды и аминокислоты с молекулярной массой до 1,0 кДа	4,10±0,09

Данные таблицы 2 показывают, что использование предлагаемого способа выделения низкомолекулярных пептидов из эритромассы позволяет получить пептиды с молекулярной массой до 6,0 кДа с преобладанием пептидов, имеющих молекулярную массу от 4,5 до 6,0 кДа (до 90%). Нужно отметить, что при хроматографии образцов обнаруживаются пептиды с молекулярной массой от 2,0 до 4,5 кДа и до 1,0 кДа. Способ обеспечивает получение депротеинизированного раствора, содержащего спектр низкомолекулярных пептидов до 6 кДа, без потерь на фракционирование.

Способ выделения низкомолекулярных пептидов, включающий ферментативный гидролиз исходного сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют эритромассу крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66 °С в течение 15 мин.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и медицинской диагностики. Предложен способ детекции белков в амилоидном состоянии, в котором получают образец лизата культуры дрожжей или ткани млекопитающего, добавляют к образцу ионный детергент, концентрируют белки в амилоидной форме на ацетатцеллюлозной мембране и детектируют их с использованием аптамеров, их конъюгатов или антител, специфичных к амилоидной форме белков.

Способ выделения рекомбинантных белков // 2499052

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при получении рекомбинантных форм представляющих практический интерес белков. Предложен способ получения рекомбинантного белка через его гибридный предшественник с природным сайтом расщепления энтеропептидазой, который обеспечивает повышение качества (гомогенности) и выхода целевого продукта в условиях, когда гибридный белок обнаруживает дополнительные (скрытые) сайты расщепления энтеропептидазой.

Способ получения аналогов инсулина из их соответствующих предшественников (варианты) // 2458989

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов инсулина из их соответствующих предшественников, и может быть использовано в медицине.

Дрожжевой экстракт, содержащий двунатриевую соль инозината и двунатриевую соль гуанилата, и способ его получения // 2456347

Гибридный белок (варианты), штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка (варианты) и способ получения безметионинового интерферона альфа-2 человека // 2453604

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной инженерии, биотехнологии. .

Способы получения симвастатина // 2447152

Изобретение относится к биотехнологии. .

Гибридный белок, штамм бактерий escherichia coli - продуцент гибридного белка и способ получения безметионинового интерферона альфа-2b человека из этого гибридного белка // 2441072

Способ получения безметионинового интерферона-альфа2b человека // 2432401

Изобретение относится к микробиологической промышленности, медицинской биотехнологии и генной инженерии. .

Способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и ферментативный гидролизат молочного гриба // 2421513

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как стимулятор роста или компонент питательных сред для культивирования лактобактерий, а также в медицинской микробиологии.

Биологически активный пептид, полученный из молочного белка // 2415943

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биологически активному пептиду, который обладает антигипертонической активностью. .

Способ получения нового полимерного соединения, обладающего противовирусной активностью, сополимеризацией 2,5-дигидроксибензойной кислоты и желатина с помощью фермента лакказы // 2494119

Изобретение относится к химической технологии и технологиям получения ветеринарных, медицинских и фармацевтических препаратов. Способ получения нового противовирусного вещества на основе 2,5-дигидроксибензойной кислоты и желатина включает в себя окисление 2,5-дигидроксибензойной кислоты ферментом лакказой до промежуточных феноксирадикалов и семихинонов, которые далее сополимеризуются с желатином, и отделение полученного сополимера от низкомолекулярных компонентов с помощью диализа; оптимальными концентрациями компонентов реакционной смеси являются для 2,5-дигидроксибензойной кислоты - 15-80 мМ, для желатина - 1-13 мг/мл реакционной смеси, для лакказы - 0,5-10 Ед активности/мл реакционной смеси.

Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе // 2485133

Изобретение относится к биологической субстанции, получаемой из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, предназначенной в качестве биологически активной субстанции, для производства фармацевтических препаратов и косметической продукции, стимулирующей физиологическую и репаративную регенерацию кожи, проявляющуюся уменьшением выраженности признаков ее старения с омолаживающим эффектом и защитой от вредных факторов внешней среды, и способу ее получения.

Белково-полипептидный комплекс, обладающий антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе // 2485132

Изобретение относится к биологически активной субстанции - белково-полипептидному комплексу (БПК), получаемому из эмбриональной нервной ткани копытных сельскохозяйственных животных, обладающей антигипоксическим, сосудистым и нейропротективным действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях центральной и периферической нервной системы, гипоксических состояниях, в медицине катастроф, спортивной медицине, способу ее получения и фармкомпозиции на его основе.

Комбинация пептидов // 2482127

Изобретение относится к комбинациям пептидов с одинаковой в каждом случае длиной последовательности (SEQL), которые могут быть получены в стабильном воспроизводимом качестве и количестве из смеси (А), содержащей число х аминокислот с защищенными кислотными группами или число z пептидов с защищенными с помощью защитных групп кислотными группами и активированными аминогруппами, причем аминокислоты в смеси (А) находятся в определенном установленном молярном соотношении, и смеси (В), содержащей число y аминокислот с защищенными с помощью защитных групп аминогруппами, причем молярное соотношение аминокислот смеси (В) такое же, как молярное соотношение аминокислот смеси (А), и при этом число х=y, и х является числом от 11 до 18.

Активирующий люминесценцию белка гидридный комплекс // 2475493

Изобретение относится к области биосенсорики и может быть использовано для изучения белков методом люминесценции. .

Способ получения и очистки ингибина-а человека // 2434018

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Штамм staphylococcus hominis klp-1 - продуцент низкомолекулярных пептидных соединений, ингибирующих развитие грамположительных бактерий // 2428470

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской микробиологии и микробиологической промышленности и касается получения штамма Staphylococcus hominis KLP-1, продуцента низкомолекулярных пептидных соединений, ингибирующих развитие грамположительных микроорганизмов.

Очистка белков с помощью катионного поверхностно-активного вещества // 2426738

Изобретение относится к области очистки белков с использованием поверхностно-активных веществ. .

Способ прогнозирования вторичной структуры белка // 2425837

Изобретение относится к области биоинформатики и биотехнологии, в частности к прогнозированию вторичной структуры белка, и может быть использовано в молекулярной биологии и медицине.

Пептид, стимулирующий образование специфических антител против олигомерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках // 2401275

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новое биологически активное соединение, такое как пептид, позволяющий получать антитела, селективно выявляющие олигомерную форму белка нуклеофозмина в препаратах, содержащих мономерные и олигомерные формы белка.

Хроматографические способы и соединения, очищенные этими способами // 2508294

Изобретение относится к хроматографическому способу очистки аналога инсулина, выбранного из аспартата, лизпро и гларгина, атозибана или эптифибатида из смеси, содержащей по меньшей мере одну родственную примесь.