Питательная среда для выделения лактобактерий
Владельцы патента RU 2510416:
Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный аграрный университет" (RU)
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры животных, а также бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника. Питательная среда содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат, глюкозу, уксусную кислоту 70%, агар и капустный отвар в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить селективность питательной среды и упростить ее производство. 8 пр.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры животных, а также бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника.
Микрофлора закрытых полостей человека и животных представлена различными видами бактерий, выделение и идентификация которых является сложной, рутинной работой, и чтобы значительно сократить время исследований используются селективные среды.
Для выделения лактобактерий - основных представителей симбионтной микрофлоры предложен ряд питательных сред.
Известна питательная среда для выделения молочнокислых бактерий (Абросимова Н.А., Кушнарева М.В. Питательная среда для выделения молочно-кислых бактерий // Лабораторное дело, 1991, №3, С.78-79) в состав которой входят, г/л:
| Сухая питательная среда | |
| для контроля стерильности | 33,0 |
| Пептон | 20,0 |
| Агар КД | 30,0 |
| Глюкоза | 18,0 |
| Цитрат аммония | 2,0 |
| Калия дигидрофосфат | 6,0 |
| Ледяная уксусная кислота | 1,32 |
| Раствор солей | 5,0 |
| Вода дистиллированная | до 1 л |
Раствор солей состоит из, масс.%:
| Сульфат магния 7-водный | 11,5 |
| Сульфат марганца 4-водный | 2,86 |
| Сульфат железа (2) 7-водный | 0,68 |
| Дистиллированная вода | остальное |
На данной среде хорошо растут различные молочнокислые бактерии, она обладает селективными свойствами, но ее недостатком является многокомпонентность и труднодоступность ряда ингредиентов.
Известна питательная среда для выделения лактобактерий (Пат. РФ №2202609), которая содержит, г/л:
| Сернокислый марганец | 0,049-0,05 |
| Сернокислый магний | 0,19-0,20 |
| L-цистеин солянокислый | 0,095-0,10 |
| Калий фосфорнокислый 2-замещенный | 1,95-2,0 |
| Пептон | 4,9-5,0 |
| Глюкоза | 19,8-20,0 |
| Агар-агар | 14,9-15,1 |
| Стерильный мел | 9,9-10,0 |
| Гидролизат молозивной | |
| казеино-сывороточной массы | остальное |
На данной среде хорошо растут лактобактерии, индикация колоний которых осуществляется по расплавлению мела под колонией. Однако эта среда не обладает селективными свойствами, и на ней могут расти любые бактерии, в.ч. кишечная палочка или энтерококки, которые также могут вырабатывать кислоты и обесцвечивать среду под колониями. Она не прозрачная, что затрудняет описание выросших колоний. Кроме того, не всем лабораториям доступен гидролизат молозивной казеино-сывороточной массы.
Известна среда для выделения лактобактерий (Пат. РФ №2213779), состав которой представлен в следующем виде, г/л:
| Панкреатический гидролизат казеина сухой | 15-30 |
| Экстракт кормовых дрожжей сухой | 3-7 |
| Глюкоза | 17-25 |
| Цистеин | 0,1-0,3 |
| Железо сернокислое 7-водное | 0,03-0,06 |
| Магний сернокислый 7-водный | 0,6-1,0 |
| Цитрат аммония | 1,5-3,5 |
| Калий фосфорнокислый 1-замещенный | 4,0-8,0 |
| Натрий лимоннокислый 3-замещенный | 6,0-8,5 |
| Натрий уксуснокислый плавленый | 7,0-8,0 |
| Агар микробиологический | 7-12,0 |
| Поваренная соль | 3,0-8,0 |
| Кристалвиолет | 0,002-0,0025 |
| Полимиксин М сульфат | 0,04-0,06 |
| Вода дистиллированная | остальное |
Среда обладает выраженной селективностью, готовится без стерилизации. Однако она имеет фиолетовую окраску, что затрудняет исследование колоний в проходящем свете, ряд компонентов дорогостоящ и труднодоступен.
Известна простая, легко воспроизводимая питательная среда для выделения молочнокислых бактерий (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.60-61, прототип). Данная среда состоит из, масс.%:
| Растительный отвар (капуста) | 10,0 |
| Пептон | 1,0 |
| Глюкоза | 2,0 |
| Этиловый спирт | 8-16 |
| Агар | 2,0 |
| Дистиллированная вода | остальное |
Недостатком данной среды является слабые ростовые и селективные свойства, в результате чего на ней в равной степени растут бактерии других родов, которые могут подавлять рост молочнокислых бактерий, особенно при их низкой концентрации в исследуемом материале.
Задачей предлагаемого изобретения является получение простой в приготовлении и экономичной питательной среды для выделения молочнокислых бактерий из фекалий животных.
Поставленная задача достигается тем, что предложена питательная среда для выделения лактобактерий, включающая капустный отвар, глюкозу, агар, отличающаяся тем, что в качестве дополнительных источников питания и селективности содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, масс.%:
| Молочная сыворотка | 9-10,0 |
| Дрожжевой аутолизат | 9-10,0 |
| Глюкоза | 1,9-2,0 |
| Уксусная кислота 70% | 0,14-0,16 |
| Агар | 1,8-2,0 |
| Капустный отвар | остальное |
Молочную сыворотку получали в условиях лаборатории, для чего в 1 л подогретого до 60-70°C молока с жирностью 2,5% при постоянном помешивании добавляли 2,5-3 мл 70% уксусной кислоты (эссенции), после створаживания сгусток казеина отделяли, а сыворотку фильтровали через ватно-марлевый фильтр и использовали для приготовления среды. Неиспользованный остаток сыворотки можно сохранить, подвергнув его автоклавированию при 115°C в течение 20 мин.
Дрожжевой аутолизат получали по Н.И.Розанову (Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных. М., Гос., из-во с.-х. литературы, 1952. - С.91).
Капустный отвар готовили по Квасникову (Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - С.65).
Взятые компоненты питательной среды смешивают в колбе и доводят до кипения и кипятят 2-3 мин до полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы и автоклавируют 20 мин при 0,5 атм, после остывания среды до 45-50°С в нее вносят уксусную кислоту и разливают в чашки Петри. Готовая для использования среда прозрачная, светло-коричневого цвета, с приятным молочно-растительным с уксусным оттенком запахом, с pH 5,3-5,5.
Новизна заявленного предложения состоит в том, что разработана питательная среда, обладающая выраженными селективными свойствами по отношению к лактобактериям, на которой они дают хороший рост и формируют типичные для них колонии размером 1,5-2 мм. Селективные свойства среды обусловлены содержащейся в ее составе уксусной кислотой, к которой лактобактерии устойчивы, в то время как другие бактерии (стафилострептококки, энтеробактерии, псевдомонады, бациллы и др.) к этому веществу чувствительны.
Примеры конкретного получения питательной среды для выделения лактобактерии.
В качестве тест-штаммов использовали Lactobacillus plantarum, Escherichia coli и Staphylococcus aureus, выделенных из фекалий телят. Испытуемые культуры по отдельности выращивали на агаровых средах при температуре 37°C в течение 24 ч, после чего по оптическому стандарту мутности №10 готовили 1 млрд взвесь каждого тест-штамма. После этого методом десятикратных серийных разведений в физиологическом растворе довели концентрацию микроорганизмов до 1000 микробных клеток в 1 мл. Из этого разведения отбирали по 0,1 мл и вносили в 3 чашки Петри с питательной средой. Посевы инкубировали в анаэростате с использованием газогенерирующих пакетов «Анаэрогаз» в течение 24 ч при 37°C, после чего учитывали количество выросших колоний.
Пример 1. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 7,0; дрожжевой аутолизат 7,0; глюкоза 1,7; уксусная кислота 70% 0,10; агар 1,4; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество колоний лактобактерий составило в среднем 25, эшерихий 54 и стафилококков 33. Среда имеет мягкую консистенцию, что затрудняет работу с бактериологической петлей.
Пример 2. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 8,0; дрожжевой аутолизат 8,0; глюкоза 1,8; уксусная кислота 70% 0,12; агар 1,6; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 43, эшерихий 24 и стафилококков 17. Среда также имеет мягкую консистенцию.
Пример 3. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 9,0; дрожжевой аутолизат 9,0; глюкоза 1,9; уксусная кислота 70% 0,14; агар 1,8; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 56, эшерихий 0 и стафилококков 0. Среда имеет плотную консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.
Пример 4. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 10,0; дрожжевой аутолизат 10,0; глюкоза 2,0; уксусная кислота 70% 0,16; агар 2,0; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 62, эшерихий 0 и стафилококков 0. Среда имеет плотную упругую консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.
Пример 5. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 11,0; дрожжевой аутолизат 11,0; глюкоза 2,1; уксусная кислота 70% 0,18; агар 2,2; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерий составило в среднем 46, эшерихий 0 и стафилококков 0. Несмотря на хороший рост лактобактерий на данной среде, выросшие колонии более мелкие, чем на вариантах сред в примерах 3 и 4. Среда имеет плотную упругую консистенцию и не скарифицируется при работе бактериологической петлей.
Пример 6. Тест-штаммы выращивали на питательной среде, содержащей, масс.%: молочная сыворотка 12,0; дрожжевой аутолизат 12,0; глюкоза 2,2; уксусная кислота 70% 0,20; агар 2,4; капустный отвар - остальное. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний лактобактерии составило в среднем 23, эшерихий 0 и стафилококков 0. На данном варианте среды рост лактобактерий более замедлен, а формирующиеся колонии значительно меньшего размера (0,5-0,7 мм), чем на вариантах сред в примерах 3 и 4, на которых тест-штамм лактобактрий формировал колонии размером 1-2 мм.
Пример 7. Исследовали фекалии от 30-дневного теленка. Для этого физиологическим раствором осуществили десятикратные разведения 1 г фекалий до значения 10-9. Из пробирок с разведением 10-3, 10-5, 10-7 и 10-9 отобрали 0,1 мл суспензии и засеяли на питательную среду, содержащую, масс.%: молочная сыворотка 9,0; дрожжевой аутолизат 9,0; глюкоза 1,9; уксусная кислота 70% 0,14; агар 1,8; капустный отвар - остальное. Через 24 ч инкубации при температуре 37°C в условиях повышенного содержания CO2 учитывали рост бактерий. Из разведения 10-3 на среде выросло 265 колоний, которые по морфологии соответствовали колониям лактобактерий, при микроскопии это были грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10-5 выросло 96 колоний, типичных для колоний лактобактерий, при микроскопии колоний установлено, что их образовывали грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10-7 и 10-9 бактериальный рост полностью отсутствовал. Следовательно, в фекалиях теленка количество лактобактерий было 9,6·106 колониеобразующих единиц в 1 г.
Пример 8. Исследовали фекалии от 30-дневного теленка. Для этого физиологическим раствором осуществили десятикратные разведения 1 г фекалий до значения 10-9. Из пробирок с разведением 10-3, 10-5, 10-7 и 10-9 отобрали 0,1 мл суспензии и засеяли на питательную среду, содержащую, масс.%: молочная сыворотка 10,0; дрожжевой аутолизат 10,0; глюкоза 2,0; уксусная кислота 70% 0,16; агар 2,0; капустный отвар - остальное. Через 24 ч инкубации при температуре 37°C в условиях повышенного содержания CO2 учитывали рост бактерий. Из разведения 10-3 на среде выросло 215 колоний, которые по морфологии соответствовали колониям лактобактерий, при микроскопии это были грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было. Из разведения 10-5 выросло 63 колонии, типичных для колоний лактобактерий, при микроскопии колоний установлено, что их образовывали грамположительные палочки. Колоний, характерных для энтеробактерий, стафилококков, бацилл, не было.
Из разведения 10-7 и 10-9 бактериальный рост полностью отсутствовал. Следовательно, в фекалиях теленка количество лактобактерий было 6,3×106 колониеобразующих единиц в 1 г.
Таким образом, полученные результаты позволяют определить оптимальные соотношения ингредиентов питательной среды для выделения лактобактерий, а именно - молочная сыворотка 9,0-10%; дрожжевой аутолизат 9,0-10%; глюкоза 1,9-2,0%; уксусная кислота 70% 0,14-0,16%; агар 1,8-2,0%; капустный отвар - остальное. Данная среда обеспечивает хороший рост лактобактерий при полном подавлении роста эшерихий, стафилококков и др. бактерий, а поэтому может использоваться в качестве селективной при выделении лактобактерий от животных.
Питательная среда для выделения лактобактерий, включающая капустный отвар, глюкозу, агар, отличающаяся тем, что в качестве дополнительных источников питания и селективности содержит молочную сыворотку, дрожжевой аутолизат и уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| молочная сыворотка | 9-10,0 |
| дрожжевой аутолизат | 9-10,0 |
| глюкоза | 1,9-2,0 |
| уксусная кислота 70% | 0,14-0,16 |
| агар-агар | 1,8-2,0 |
| капустный отвар | остальное |
