Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы


 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2510508:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Башкирский государственный университет" (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук (RU)

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития бронхиальной астмы. Осуществляют выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови больного. Проводят генотипирование полиморфных вариантов rs7216389 гена гасдермина В (GSDMB), rs12342831 гена бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1) и rsl496499 гена белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3). При выявлении одного из сочетаний генотипов по трем полиморфным локусам генов: GSDMB*rs7216389C/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/Т-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/T, прогнозируют риск развития бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности. Изобретение обеспечивает эффективный способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы и способствует разработке профилактических мероприятий с учетом индивидуальных особенностей каждого больного. 1 табл., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для прогнозирования риска развития бронхиальной астмы.

Бронхиальная астма (БА) - хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, которое развивается в результате взаимодействия многочисленных факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Хроническое рецидивирующее течение БА, накладывающее значительные ограничения на повседневную жизнь больных, увеличение доли лиц с тяжелой формой заболевания, высокая распространенность и неуклонный рост заболеваемости БА во всем мире свидетельствуют об актуальности изучения сложных механизмов развития этого заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики и профилактики с учетом индивидуальных особенностей каждого больного. Исследование многофакторной природы заболевания предполагает идентификацию главных генов, которые наиболее важны для формирования наследственной предрасположенности, и генов-модификаторов, ускоряющих и усугубляющих патологический процесс. Составление генной сети для каждого многофакторного заболевания и разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента составляет основу нового, быстро развивающегося направления - предиктивной медицины. Существует несколько подходов идентификации генов при исследовании многофакторных заболеваний. Наиболее распространенным подходом является анализ ассоциации заболевания с полиморфными вариантами и мутациями генов-кандидатов, выбор которых основывается на тщательном изучении этиопатогенеза заболеваний с учетом функции белковых продуктов отобранных генов (функциональные гены-кандидаты), а также локализации генов в областях сцепления, определенных при позиционном картировании (позиционно-клонированные гены-кандидаты). Основным недостатком этого метода является отсутствие принципиально новой информации о генах, так как метод существенно ограничен уже имеющимися знаниями. Одним из наиболее перспективных современных методов изучения сложных признаков и многофакторных заболеваний является метод полногеномного анализа ассоциаций (Genome Wide Association Studies - GWAS), в котором проводят генотипирование и тестирование ассоциации с заболеванием сотен тысяч однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП), распределенных по всему геному человека (Manolio et al., 2010). Проведенные в ряде популяций полногеномные анализы ассоциации- бронхиальной, астмы значительно расширили знания о генетических факторах, способствующих формированию наследственной предрасположенности к данной патологии, выявили множество новых ассоциированных полиморфных локусов и генов, для подтверждения роли которых в развитии этого заболевания проводятся репликативные и функциональные исследования.

Несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению бронхиальной астмы, проблема прогнозирования риска развития этого сложного многофакторного заболевания остается практически нерешенной. Опубликованные к настоящему времени результаты исследований свидетельствуют о существовании межпопуляционных различий в подверженности к этой патологии. Вклад полиморфных локусов разных генов в формирование генетической предрасположенности к БА существенно различается в этнических группах, в связи с чем оценка генетического риска для пациента требует наличия информации о маркерах риска, о распределении частот аллелей и генотипов генов-кандидатов развития заболевания именно в той этнической группе, к которой он принадлежит. Кроме того, анализ ассоциации отдельных полиморфных вариантов генов, вовлеченных в контроль многофакторных заболеваний, не дает достаточно полного представления о механизмах формирования наследственной предрасположенности, поскольку отдельные генетические варианты имеют слабый индивидуальный эффект в отношении фенотипа. В основе возникновения многофакторной патологии лежат сложные межгенные взаимодействия, и эффект того или иного полиморфного варианта может значительно увеличиваться в синергизме с другими вариантами, в связи с чем при прогнозировании риска развития заболевания и разработке профилактических мероприятий необходимо учитывать ген-генные взаимодействия.

Таким образом, актуальными для разработки способа прогнозирования риска развития бронхиальной астмы являются поиск маркеров риска и определение моделей межгенных взаимодействий, предрасполагающих к развитию данного заболевания в различных этнических группах. Выявление популяционных и этнических особенностей молекулярно-генетических основ наследственно обусловленного заболевания дает возможность разработать оптимальные для конкретных регионов и этнических групп надежные способы прогнозирования риска его развития, а также разработать наиболее эффективные методы идентификации ассоциированных полиморфных вариантов.

Известен способ прогнозирования риска возникновения БА, заключающийся в том, что пациенту проводят пробы на пыльцевую, пылевую и пищевую аллергии, на непереносимость антибиотиков, анальгетиков, аспирина и при положительных пробах, а также при наличии родственников, страдающих БА, подверженности респираторным инфекциям более двух раз в году, атопического дерматита, экземы, крапивницы и других аллергических синдромов, заболеваний желудочно-кишечного тракта или печени, и профессиональной вредности прогнозируют риск развития заболевания по определенной формуле (патент РФ 2275863, 2006). Несмотря на то, что данный способ основан на расчете риска заболевания по целому ряду различных признаков, в нем не учитываются индивидуальные генетические особенности больного, определяющие генетическую предрасположенность к развитию заболевания.

Известен способ прогнозирования пыльцевой бронхиальной астмы путем иммуногенетического исследования, отличающийся тем, что в венозной крови методом полимеразной цепной реакции определяют гены локусов DRB1 и DQB1 системы HLA и при наличии специфичностей HLA-DRB1*01 и/или DQBP05 прогнозируют высокий риск развития пыльцевой бронхиальной астмы у больных сезонным аллергическим ринитом; при наличии специфичности HLA-DQB1*06 прогнозируют резистентность к развитию пыльцевой бронхиальной астмы у больных сезонным аллергическим ринитом (патент РФ 2441242, 2010). Данный способ касается прогнозирования только пыльцевой бронхиальной астмы и является неспецифичным в отношении прогнозирования риска развития бронхиальной астмы в целом.

Известен способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, заключающийся в определении в крови человека генотипов и аллельных вариантов однонуклеотидных замен, отличающийся тем, что определяют полиморфные варианты генов SOCS7 (rs3890580), PIASX (rs9304337), дополнительно учитывают факт наличия/отсутствия описторхоза и рассчитывают вероятность отнесения индивида к группе с низким R1 и высоким R2 риском развития бронхиальной астмы (патент РФ 2383019, 2008). Существующий способ имеет ограниченную область применения, поскольку изученные гены малочисленны. Исследование проводилось с помощью "кандидатного" подхода, недостатком которого является невозможность получения принципиально новой информации о генах. К настоящему времени внедрены более эффективные методы идентификации генов-кандидатов, ассоциированных с многофакторными заболеваниями, основным из которых является метод полногеномного анализа ассоциаций (GWAS).

Кроме этого следует отметить, что известные способы прогнозирования риска развития бронхиальной астмы не учитывают межгенных взаимодействий, которые необходимо принимать во внимание при прогнозировании риска развития заболевания и разработки профилактических мероприятий.

Целью предлагаемого изобретения является разработка способа прогнозирования риска развития бронхиальной астмы с помощью прогностической модели, основанной на данных генотипирования полиморфных вариантов генов предрасположенности, идентифицированных с привлечением нового мощного подхода - полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) БА с сотнями тысяч полиморфных локусов, и исследования межгенных взаимодействий.

Техническим результатом изобретения является получение критериев оценки риска развития бронхиальной астмы с высокой прогностической значимостью. Указанный технический результат достигается предлагаемым способом прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, включающим:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфных вариантов генов гасдермина В (GSDMB), бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1), и белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3);

- прогнозирование риска возникновения бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности с точностью 65,05% в случае идентификации одного из сочетаний генотипов: GSDMB*rs7216389C/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G; GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/T.

Из уровня техники неизвестна возможность прогнозирования риска развития бронхиальной астмы по наличию сочетаний генотипов повышенного риска по полиморфным локусам генов гасдермина В (GSDMB), бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1), белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3).

Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Кровь набирают в пробирку с консервантом, в качестве которого используют глюгицир в соотношении с кровью 1:4 или антикоагулянт К2ЭДТА. Для выделения ДНК к 5 мл крови добавляют 30 мл лизирующего буфера (320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl, pH 7,6) и центрифугируют при 4°C и 4000 об./мин в течение 20 минут. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 20 мл лизирующего буфера и центрифугируют при тех же условиях в течение 10 минут. К полученному осадку добавляют 800 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, pH 8,0, 75 мМ NaCl). Затем ресуспензируют полученный раствор и переносят его в двухмиллилитровые стерильные пластиковые пробирки, добавляют 80 мкл 10% SDS, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют при 37°C в течение 16 часов. Экстракцию ДНК проводят в три этапа: раствором забуференного фенола (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCl, pH 7,8), смесью фенола - хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах (1000 мкл) с плавным перемешиванием на ротаторе в течение 10 мин, центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 минут и отбором водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждают из раствора в стеклянных плоскодонных конических колбах объемом 50 мл 96% раствором охлажденного этанола в соотношении 1:3. Сформированную ДНК промывают 70% раствором этилового спирта, подсушивают на воздухе, растворяют в деионизированной воде и хранят при -20°C.

Исследование полиморфных вариантов генов GSDMB, B4GALT1 и IGFBP3 может осуществляться с помощью разнообразных молекулярно-генетических методов: анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов после полимеразной цепной реакции (ПЦР-ПДРФ), ПНР с использованием аллель-специфичных праймеров, ПНР в реальном времени, анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализа), биочипы, секвенирование и др.

В качестве точного и быстрого способа исследования ДНК-локусов (rs7216389 гена GSDMB, rs12342831 гена B4GALT1, rs1496499 гена IGFBP3) применяют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией. Амплификацию и детекцию результатов проводят на амплификаторах с возможностью анализа флуоресценции по конечной точке - «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия); «iQiCycler», «iQ5», «CFX96» («BioRad», США), ABI 7300/7500/7900 («Applied Biosystems», США) или аналогичных.

ПЦР синтеза ДНК проводят в 10 мкл общего объема смеси, содержащей 2 мкл универсального буфера (670 мМ Tris-HCl (pH 8,8); 0,1% Tween-20, 2 мМ dNTPs, 10 мМ праймеров, 5 мМ зондов), 0,2 мкл Taq-полимеразы и 30 нг геномной ДНК. Перечень исследуемых локусов, последовательности праймеров, зондов, размеры амплифицируемых фрагментов и температурные режимы ПЦР представлены в таблице 1.

Интерпретацию результатов полимеразной цепной реакции в реальном времени проводят с помощью программных средств используемого реал-тайм амплификатора в автоматическом режиме.

Критерии предлагаемого способа оценки риска развития бронхиальной астмы были разработаны на основании анализа данных клинико-генетических исследований 1149 неродственных индивидов в возрасте от 1 года до 67 лет русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих в Республике Башкортостан. Этническая принадлежность обследуемых определялась до третьего поколения путем личного опроса каждого человека. Выборка больных БА составила 560 человек. Обследованные являлись пациентами детского отделения Клиники Башкирского государственного медицинского университета, пульмонологического и аллергологического отделений городской клинической больницы №21 г.Уфы, аллергологического отделения Республиканской клинической детской больницы г.Уфы. Диагноз заболеваний устанавливался квалифицированными врачами на основании данных клинического, общелабораторного и инструментальных методов исследования в соответствии с критериями программных документов по диагностике, лечению и профилактике заболеваний.

В качестве контроля исследована группа, состоящая из 589 практически здоровых лиц, не имеющих проявлений аллергических заболеваний и отягощенной наследственности.

Полногеномное генотипирование 727 образцов ДНК (358 больных БА и 369 индивидов контрольной группы) выполнено на Illumina Platform с использованием биочипа Illumina Human610-Quad BeadChip в Национальном центре генотипирования в г.Эври (Франция). Математическую обработку результатов полногеномного анализа ассоциации полиморфных локусов выполняли с помощью пакета программ PLINK 1.06 (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/index.shtml). Провели строгий контроль качества образцов ДНК и прогенотипированных маркеров. Из анализируемой выборки исключили дуплицированные образцы ДНК, а также образцы ДНК, в которых не прошло генотипирование более чем 5% маркеров и образцы ДНК, у которых выявлено несоответствие между обозначенным и установленным при генотипировании полом. Из дальнейшего анализа также исключили ОНП, по которым не прошло генотипирование более чем у 5% индивидов, ОНП с частотой редкого аллеля менее 0,01 и ОНП со статистически значимым отклонением (p<0,001) от равновесия Харди-Вайнберга. Полногеномный уровень значимости p≤4,79×10-7, при котором ожидаемая доля ложноположительных результатов не превышает 5% (5% false discovery rate), определили с использованием функции q value в среде программирования R (www.r-proiect.org) (Benjamini, Hochberg, 1995; Storey, Tibshirani, 2003). Для учета популяционной гетерогенности исследуемых выборок больных и контроля провели EIGENSTRAT-анализ, позволяющий сделать поправку на наличие популяционной стратификации в полногеномном масштабе (Price et al., 2006).

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и контроля использовали критерий χ2 (p) для таблиц сопряженности 2×2. Для выявления факторов повышенного и пониженного риска развития бронхиальной астмы, проводили оценку показателя соотношения шансов (OR - odds ratio), а также границ его 95% доверительного интервала (CI95%). OR является мерой ассоциации, количественно определяющей взаимосвязь между фактором риска и развитием определенного признака. Степень ассоциаций оценивается в значениях показателя соотношения шансов по формуле:

OR=(a×d)/(b×c),

где a - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера среди больных; с и d - число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. При OR=1 нет ассоциации, OR>1 рассматривается как положительная ассоциация с аллелем или генотипом («фактор повышенного риска») и OR<1 - как отрицательная ассоциация («фактор пониженного риска»).

Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программ MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction) [Ritchie M.D. et al., 2001] и ее модифицированной версии GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) [Lou X.Y. et al., 2007; Chen G.B. et al., 2011] (www.healthsystem.virginia.edu/internet/addictiongenomics/Software). Метод MDR позволяет оценить вклад каждого из исследуемых генотипов, их взаимодействия, учитывая как снижающие, так и усиливающие влияния отдельных маркеров на возникновение заболевания, что дает возможность уменьшить размерность числа рассчитываемых параметров при одновременной оценке большого числа маркеров. Вклад каждого гена и/или их взаимодействия оценивается величиной энтропии Н (величиной информации, снятой неопределенности в терминах теории информации), выраженной в %, где 100% - генотип однозначно определяет к какому классу (больных или здоровых) относится индивид, соответственно 0% - генотип не играет никакой роли в предрасположенности к заболеванию. В программах MDR и GMDR путем многократного перекрестного пересчета вводимых первичных данных выбирается оптимальная модель ген-генного или ген-средового взаимодействия, позволяющая с высокой точностью предсказать человеку наличие или отсутствие предрасположенности к определенному заболеванию. Для каждой из этих моделей программы определяют сбалансированную точность (Balanced Accuracy), которая зависит от чувствительности и специфичности модели, определенными по доле верно и неверно классифицированных моделью случаев при многократных перекрестных проверках.

Чувствительность модели (Sensitivity, Se) - это доля истинно положительных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью:

Se=(TP/(TP+FN))×100%, где

ТР (True Positives) - верно классифицированные положительные примеры (истинно положительные случаи). При прогнозировании вероятности наличия заболевания положительным случаем является «больной».

FN (False Negatives) - положительные примеры, ложно классифицированные как отрицательные (ложно отрицательные примеры).

Специфичность модели (Specificity, Sp) - доля истинно отрицательных случаев, которые были правильно идентифицированы моделью:

Sp=(TN/(TN+FP))×100%, где

TN (True Negatives) - верно классифицированные отрицательные примеры (истинно отрицательные случаи);

FP (False Positives) - отрицательные примеры, классифицированные как положительные (ложно положительные случаи).

Сбалансированная точность (Balanced Accuracy, Bal.Acc.) и ошибка предсказания (Prediction Error) модели определяются, исходя из специфичности и чувствительности модели, и отражают не только возможность предсказания того или иного события (в частности, наличия или отсутствия заболевания), но и вероятность (точность) развития данного события:

Bal.Acc.=(Sp+Se)/2,

Prediction Error=100-Balanced Accuracy

Проведенный полногеномный анализ ассоциации БА выявил наиболее статистически значимые генетические маркеры риска, предрасполагающие к развитию БА, большинство из которых были обнаружены впервые в мире. Установлена ассоциация полиморфных локусов, локализованных на длинном плече хромосомы 17 в области 17q12-q21, с развитием БА. Пять ОНП были ассоциированы с БА с полногеномным уровнем значимости p≤4,79×10-7 (rs9303277, rs8067378, rs2290400, rs7216389, rs4795405). С наиболее высоким уровнем значимости с БА был ассоциирован ОНП rs7216389 (с.236-1199С>Т), расположенный в первом интроне гена GSDMB (р=1,01×10-7). Ген GSDMB кодирует один из белков семейства гасдерминдомен-содержащих протеинов - гасдермин В, экспрессируется в эпителиальных клетках, лимфоцитах, желудке, кишечнике, печени, легких и других тканях и принимает участие в терминальной дифференцировке эпителиальных клеток (Carl-McGrath et al., 2008). Частота встречаемости аллеля rs7216389*T у больных БА была выше (59,55%), чем в контрольной группе - 45,04% (р=1,01×10-7; OR=1,8 (CI95% 1,45-2,23)). Гомозиготный генотип rs7216389*T/T в группе пациентов определялся в 37,27% случаев, в контроле - в 21,87% (р=1,2×10-5, OR=2,12 (CI95% 1,51-2,98)).

В проведенном полногеномном анализе ассоциации было выявлено еще несколько полиморфных локусов, ассоциированных с БА с высоким уровнем значимости порядка 10-6. Один из них, rs12342831 (с.649-4268Т>С), локализован в области 9р13 во втором интроне гена бета1,4-галактозилтрансферазы 1 B4GALT1. Установлено, что аллель rs12342831*T, определенный с частотой 77,36% у больных и 66,03% в контрольной группе, является маркером повышенного риска развития БА (р=4,2×10-6; OR=1,76 (CI95% 1,38-2,24). Генотип rs12342831*Т/Т у больных БА встречается с частотой 58,05%, у индивидов контрольной группы - 41,98% (p=3,1×10-5; OR=1,91 (CI95% 1,41-2,59)). Ген B4GALT1 является одним из семи генов бета1,4-галактозилтрансферазы и кодирует две изоформы белка, различающиеся по длине цитоплазматического домена (www.ncbi.nlm.nih.gov). Обе изоформы beta-1,4-GalT-I экспрессируются в моноцитарных дендритных клетках и CD4(+) Т лимфоцитах человека и являются одними из ключевых молекул клеточной адгезии, участвующими во взаимодействии дендритных клеток с Т-лимфоцитами (Han et al., 2009; Cheng et al., 2010).

При полногеномном анализе установлена также выраженная ассоциация БА с ОНП rs1496499 (g.45979023T>G), локализованным в области 7р12.3 (р=4,77×10-6). Аллель rs1496499*T, обнаруженный с частотой 55,78% у больных и 43,29% - у здоровых индивидов, оказался маркером повышенного риска развития БА (р=4,77×10-6; OR=1,65 (CI95% 1,33-2,05)). Генотип rs1496499*T/T встречался у больных БА с частотой 30,09%, в контрольной группе - 20,12% (р=0,0028; OR=1,71 (CI95% 1,2-2,43)). Ближайшим геном, расположенным на расстоянии около 18 т.п.н. от ОНП rs1496499, является ген IGFBP3, который кодирует белок 3, связывающий инсулиноподобные факторы роста IGF-I и IGF-II. В ряде работ было выявлено, что инсулиноподобные факторы роста активируются при воспалении дыхательных путей и индуцируют пролиферацию и дифференциацию мезенхимальных клеток, стимулируя выработку коллагена, ангиогенез и гиперплазию гладкомышечных клеток - основных процессов, происходящих при ремоделировании легких (Pascual, Peters, 2005; Veraldi et al., 2009; Kaplan et al., 2011).

Для подтверждения ассоциации полиморфных локусов генов GSDMB (rs7216389), B4GALT1 (rs12342831) и IGFBP3 (rs1534151) с развитием БА, проведен анализ данных локусов в независимой выборке больных БА (202 человека) и в контрольной группе (220 человек), который подтвердил наличие их ассоциации с развитием БА.

Проведено исследование роли межгенных взаимодействий исследованных при полногеномном анализе полиморфных локусов в детерминации риска развития бронхиальной астмы с помощью программы MDR [Ritchie M.D. et al., 2001] и ее модифицированной версии - GMDR (Generalized MDR) [Lou X.Y. et al., 2007; Chen G.B. et al., 2011]. Установлены ДНК-локусы исследованных генов, взаимодействующие при развитии наследственной предрасположенности к бронхиальной астме.

С помощью математического моделирования получена модель межгенных взаимодействий, демонстрирующая взаимовлияние изученных нами полиморфных локусов генов GSDMB (rs7216389), B4GALT1 (rs12342831) и IGFBP3 (rs1496499) в формировании предрасположенности к бронхиальной астме. Все три локуса, входящие в эту модель, вносят приблизительно одинаковый вклад в развитие БА с незначительным преимуществом полиморфного локуса гена GSDMB. Показатели энтропии составляют HGSDMB=2,91%; HB4GALT1=2,7% и HIGFBP3=2,38%. Установлено, что полиморфные варианты гена GSDMB и гена B4GALT1, а также генов B4GALT1 и IGFBP3 действуют синонимично, аддитивный эффект проявляют полиморфные варианты генов GSDMB и IGFBP3. Сбалансированная точность (Bal.Acc.) данной модели составила 65,05%, чувствительность (Se) - 60,86%, специфичность (Sp) - 69,15%, воспроизводимость результата (CV Consistency) - 10/10. Выявлены статистически значимые сочетания генотипов, являющиеся маркерами повышенного риска развития БА:

GSDMB*rs7216389C/T - B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/G (p=0,004; OR=2,19, CI95% 1,26-3,79);

GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/G (p=0,0001; OR=3,08, CI95% 1,70-5,59);

GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-IGFBP3*rs1496499T/T (p=0,009; OR=2,63, CI95% 1,24-5,59).

В целом, проведенное полногеномное исследование однонуклеотидных полиморфных вариантов у больных БА и индивидов контрольной группы показало наличие ассоциации БА с полиморфными локусами, локализованными в области 17q12-q21 (в гене GSDMB) и, по данным литературы, ассоциированными с развитием БА в популяциях различного этнического происхождения. Кроме того, впервые в мире обнаружена выраженная ассоциация БА с полиморфными локусами генов B4GALT1 и IGFBP3. Выявлены статистическим значимые модели межгенного взаимодействия полиморфных локусов генов, с помощью которых можно с высокой точностью прогнозировать риск развития бронхиальной астмы.

В связи с вышесказанным, нами разработан способ прогнозирования бронхиальной астмы, основанный на генотипировании полиморфных локусов rs7216389, rs12342831, и rs1496499, ассоциированных с развитием БА по данным проведенного полногеномного анализа, идентификации маркеров повышенного риска развития заболевания и прогнозировании риска развития бронхиальной астмы.

Примеры прогнозирования риска бронхиальной астмы.

Пример 1. Больная Н., 1982 г.р., смешанного этнического происхождения (мать - башкирка, отец - татарин).

Клинический диагноз: Бронхиальная астма, тяжелое течение, стадия обострения. Для проведения анализа полиморфных вариантов генов GSDMB, B4GALT1 и IGFBP3 у больной было взято 8 мл венозной крови, из которой выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных ДНК-локусов проводилось с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате выявлено, что больная Н. является носителем сочетаний генотипов GSDMB*rs7216389T/T - B4GALT1*rs12342831T/T - IGFBP3*rs1496499T/T - маркеров повышенного риска БА.

Пример 2. Больной Г., 2001 г.р., русский (этническое происхождение установлено до третьего поколения путем личного опроса).

Клинический диагноз: Бронхиальная астма, средней степени тяжести, стадия обострения. Сопутствующие: аллергический ринит.

С целью проведения анализа полиморфных вариантов генов GSDMB, B4GALT1 и IGFBP3 у больного было взято 8 мл венозной крови, из которой выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции. Исследование полиморфных ДНК-локусов проводилось с помощью ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией по конечной точке. В результате выявлено, что больной Г. является носителем сочетаний генотипов GSDMB*rs7216389T/T - B4GALT1*rs12342831T/Т - IGFBP3*rs1496499T/G - маркеров повышенного риска БА.

Проведенное обследование пациентов подтвердило высокую точность прогноза БА с применением предложенного способа. Использование данного способа выявления сочетаний генотипов повышенного риска развития бронхиальной астмы на доклинической стадии заболевания позволило бы провести у носителей генотипов риска профилактические мероприятия, ограничивающие воздействие факторов внешней среды, способствующих развитию бронхиальной астмы.

Таблица 1
Праймеры, зонды и условия проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени
Полиморфный локус Локализация Праймеры и зонды Длина продукта Режим амплификации
rs1496499 7р12.3 FJ, GCTTCCTCTTCATACTAC 194 п.н. Начальная денатурация 95°C - 2:00
RJ, TCCAGATCATTCTTTCAG 40 циклов амплификации 94°C - 0:10
FAM-taTgAcAcAtTcatct-BHQ-1 56°C - 1:30
VIC-taTgAcCcAtTcatct-BHQ-2
rs12342831 9р13 FJ, AAGGCTCAAGGGAATTAG 99 п.н. Начальная денатурация 95°C - 2:00
RJ, CTTCCTACGCATTTCACA 40 циклов амплификации 94°C - 0:10
FAM-attagAgtCtcTcaCagc-BHQ-1, 56°C - 1:30
VIC-attagAgtTtcTcaCagc-BHQ-2,
rs7216389 17q12-21 FJ, GTCGCTGTTGTTTGTATG 103 п.н. Начальная денатурация 95°C - 2:00
RJ, CCCTTATTAGTGCCTGATC 40 циклов амплификации 94°C - 0:10
FAM-cacaaAcaCgcatggac-BHQ-1 60°C - 1:00
VIC-cacaaAcaTgcatggac-BHQ-2

Способ прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови больного, отличающийся тем, что проводят генотипирование полиморфного варианта rs7216389 гена гасдермина В (GSDMB), полиморфного варианта rs12342831 гена бета 1,4-галактозилтрансферазы 1 (B4GALT1) и полиморфного варианта rs1496499 гена белка 3, связывающего инсулиноподобные факторы роста (IGFBP3), и при выявлении одного из сочетаний генотипов по трем полиморфным локусам генов
GSDMB*rs7216389C/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rsl496499T/G;
GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/Т-IGFBP3*rs1496499T/G:
GSDMB*rs7216389T/T-B4GALT1*rs12342831T/T-1GFBP3*rs1496499T/T
прогнозируют риск развития бронхиальной астмы у индивидов различной этнической принадлежности



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики вариантов поражения проводящей системы миокарда при инфекционной кардиомиопатии у детей.
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии золотистого стафилококка. Для этого исследуют чистую культуру золотистого стафилококка в концентрации 1 млрд/мл.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа выявления O-гликозилированных белков в составе клеточных гомогенатов, подготавливаемых к протеомному и фосфопротеомному анализу.

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования сроков формирования абсцесса в фазу секвестрации острого панкреатита и, как следствие, неблагоприятного течения заболевания.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования in vitro способности популяции клеток, полученных из сустава, продуцировать стабильный гиалиновый хрящ in vivo.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и ветеринарии и предназначено для диагностики вируса инфекционного некроза поджелудочной железы лососевых.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования риска развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизма -308G/A гена фактора некроза опухоли α и при выявлении аллеля -308A TNFα прогнозируют повышенный риск развития ангиопатии нижних конечностей у больных сахарным диабетом 2-го типа.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования сроков наступления реактивной фазы острого панкреатита. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проводят анализ полиморфизма гена фактора некроза опухоли α и при выявлении генотипов -308 АА или -308 GA TNFα прогнозируют риск позднего наступления реактивной фазы острого панкреатита.
Изобретение относится к области косметики и представляет собой способ определения водостойкости антиперспиранта, включающий: a) отбор участников исследования; b) выполнение требований участниками исследования о не использовании каких-либо продуктов или использовании продуктов, не содержащих антиперспирант, в подмышечных областях в течение требуемого периода; c) очистку подмышечных областей каждого участника исследования; d) нанесение необходимого количества антиперспирантного продукта на одну подмышечную область и плацебо на другую подмышечную область каждого участника исследования; e) выполнение стадии d) до достижения необходимого числа нанесений, если выбирается более одного нанесения; f) после выполнения последнего нанесения проводят водное испытание, включающее круговое движение участников исследования в бассейне и/или плавание в течение периода времени активности в бассейне с глубиной воды, достаточной для смачивания подмышечных областей; g) проведение оценки потоотделения; и h) определение того, проявляет ли антиперспирантный продукт по меньшей мере стандартную антиперспирантную эффективность.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ выявления мутации c.-53-2A>G в гене SLC26A5, сопровождающийся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Представлен способ, основанный на измерении в вагинальных соскобах уровня экспрессии мРНК генов интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 относительно представленности мРНК референсных генов B2M, GUS, TBP или HPRT; на основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) следующим образом: Y=1,09*IL1B-0,61*IL8+0,21*IL10-0,11*IL18-0,91 (формула 1), где IL1B - относительный уровень экспрессии IL1B, IL8 - относительный уровень экспрессии IL8, IL10 - относительный уровень экспрессии IL10, IL18 - относительный уровень экспрессии IL18; IL=2^(Cpmin-Cpil)/NF (формула 2), где IL - относительный уровень экспрессии гена интерлейкина, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии, для IL1B Cpmin=17,9; IL8 Cpmin=16,6; IL10 Cpmin=28,8; IL18 Cpmin=23,3; Cpil - значение порогового цикла соответствующего IL в образце, определяемого автоматически; NF - фактор нормировки, вычисляется по формуле 3: (формула 3), где NF - фактор нормировки, вычисляемый как среднее геометрическое 4 факторов нормировки для референсных генов (см. формулу 4); NFref=2^(Cpmin-Cpref) (формула 4), где NFref - фактор нормировки для референсного гена, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии референсного гена, Cpref - показания прибора порогового значения в образце; значения Cpmin для референсных генов следующие: GUS Cpmin=26,5; HPRT Cpmin=26,8; B2M Cpmin=18,9; ТВР Cpmin=28,4; при этом, если значение КЛДФ≤0,1, делается заключение об отсутствии вагинита, значения КЛДФ>0,1 соответствуют вагиниту. Изобретение позволяет объективно выявить наличие вагинита у беременной женщины. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к медицине. Сущность способа определения липидов заключается в том, что к 10 мл хлороформного экстракта липидов добавляют 25 мкл 10% раствора тезита при одновременном перемешивании смеси с помощью шейкера при 20°C и частоте колебаний платформы 120 в минуту в течение 30 минут получают прозрачный раствор липидов для ферментативного определения триацилглицеридов. Способ позволяет повысить эффективность и точность определения липидов тканей. 1 табл.
Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для выявления развития гиперплазии неоинтимы и рестеноза сонных артерий после ангиореконструктивных операций на них у больных с прогрессирующим церебральным атеросклерозом без использования ангиовизуализации. Больному с прогрессирующим церебральным атеросклерозом после проведения ангиореконструктивных операций на сонных артериях не более чем через 6 месяцев иммуноферментным методом определяют в сыворотке крови содержание биомаркера липопротеин-ассоциированной фосфолипазы A2 (Lp-PLA2) и при значении его уровня 360 нг/мл и более выявляют развитие гиперплазии неоинтимы и рестеноза в оперированной сонной артерии. Способ обеспечивает высокую точность выявления развития гиперплазии неоинтимы и рестеноза у больных с прогрессирующим церебральным атеросклерозом после ангиореконструктивных операций на сонных артериях.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам лабораторной диагностики негативного воздействия формальдегида на нарушение конъюгационной и элиминационной функций глутатионовой системы у детей, проживающих на территории, характеризующейся повышенным содержанием данного соединения в атмосферном воздухе. Способ заключается в следующем: производят отбор пробы крови у детей, определяют в цельной крови содержание формальдегида, а также определяют в сыворотке крови активность следующих лабораторных показателей: глутатионпероксидазы, глутатион-S-трансферазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Затем устанавливают корреляционную зависимость между содержанием формальдегида в крови и указанными лабораторными показателями. При одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенное содержание формальдегида - пониженная активность глутатионпероксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и повышенная активность глутатион-S-трансферазы - судят о негативном воздействии формальдегида на осуществление конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы детского организма. Способ обеспечивает возможность на ранней стадии прогнозировать нарушение конъюгационной и элиминационной функции глутатионовой системы. 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам липокалина слезной жидкости человека, и может быть использовано в медицине. Мутеин липокалина слезной жидкости человека (hTLc) имеет обнаруживаемую аффинность связывания с рецепторной тирозинкиназой Met (c-Met) человека, или ее доменом, или фрагментом c-Met человека. Мутеин содержит от 6 до 18 аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека (SWISSPROT DATABANK ENTRY P31025; SEQ ID NO:36), которые выбраны из группы, состоящей из Arg 26→Thr, Val, Pro, Ser, Gly; Glu 27→Gln, Gly, Val, Ser; Phe 28→Met, Asp; Pro 29→Leu, Ile, Ala, Trp; Glu 30→Leu, Gly, Arg, Phe; Met 31→Ser; Asn 32→Leu, Arg, Val, Gln; Leu 33→Tyr, Val, Ile, Thr, Phe; Glu 34→Val, Arg, Ala; Leu 56→Asn; Ile 57→Gln; Ser 58→Ile, Val; Asp 80→Tyr; Lys 83→Ala; Glu 104→Asp; Leu 105→Thr; His 106→Trp и Lys 108→Gly. Также мутеин может дополнительно содержать следующие замены: Cys 61→Ser; Cys 101→Ser; Cys 153→Ser; Arg 111→Pro; Lys 114→Trp; Thr 37→Ser; Met 39→Ile, Leu; Asn 48→Ser; Lys 52→Thr, Met; Met 55→Leu; Lys 65→Arg, Leu; Ala 79→Leu, Ser; Ala 86→Thr; Ile 89→Ser, Gln, Thr, His; Thr 40→Cys; Glu 73→Cys; Arg 90→Cys; Asp 95→Cys; Lys 121→Cys; Asn 123→Cys и Glu 131→Cys. Изобретение позволяет эффективно лечить патологические расстройства, в которые вовлечен путь HGF/c-Met, а также проводить идентификацию c-Met человека в образце. 12 н. и 38 з.п.ф-лы, 16 ил., 9 табл., 25 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу дифференциальной диагностики гепатита и цирроза печени. Сущность способа состоит в том, что у больного дополнительно в сыворотке крови определяют уровень IgG антител к ламинину-1. При значении этого показателя от 0 до 11,9 Ед/мл определяют гепатит, при от 12 до 17,9 Ед/мл - сомнительный результат, требующий через три месяца повторного исследования, а при уровне IgG антител к ламинину - 18 Ед/мл и более выявляют цирроз печени. Использование способа позволяет повысить достоверность диагностики, по сравнению с биопсийным методом, снизить травматичность исследования, упростить диагностику, сократить время дифференциальной диагностики и стоимость исследования, обеспечить более обоснованную тактику лечения. 4 табл., 4 пр.
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения чувствительности рака почки к иммунотерапии после проведения нефрэктомии, включающий верификацию диагноза, проведение нефрэктомии рака почки, забор опухолевой и нормальной ткани почки для определения уровня экспрессии цитокинов IL-4, IL-6, IL-10, TGFβ и расчет соотношения уровня экспрессии цитокинов в опухолевой и нормальной ткани почки. При превышении уровня экспрессии цитокинов в опухолевой ткани почки над нормальной терапию считают показанной. Изобретение позволяет эффективно определять чувствительность рака почки к иммунотерапии на основании данных экспрессии цитокинов в опухолевой ткани. 2 табл., 1 пр.

Настоящее изобретение относится к биологии и медицине, а именно к области биохимических анализов, и позволяет определять качественно или количественно наличие лиганда в образце. Сущность изобретения заключается в способе определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, в котором выбирают агент или носитель, имеющий блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, причем на изменение детектируемого сигнала, по которому определяют лиганд в образце, влияет пространственная или пространственно-электростатическая блокировка упомянутого блокируемого объекта. Технический результат при использовании изобретения состоит в повышении чувствительности метода к определяемому лиганду, сокращении времени проведения анализа, уменьшении количества требуемых реагентов для проведения анализа, повышении удобства проведения анализа, обеспечении возможности проведения анализа, в том числе в полевых условиях. 7 н. и 35 з.п. ф-лы, 10 пр., 7 ил.
Изобретение относится к области медицины и предназначено для прогнозирования флотирующего тромбоза глубоких вен в системе нижней полой вены. Проводят клинико-лабораторные и инструментальные методы исследования и при наличии признаков, связанных с тромбозом глубоких вен, дополнительно проводят молекулярно-генетический анализ гена ингибитора активатора плазминогена первого типа (PAI-1). При выявлении полиморфного варианта -675 4G/4G гена PAI-1 прогнозируют наличие флотации тромба. Изобретение обеспечивает эффективный способ прогнозирования флотации тромба в системе нижней полой вены и позволяет целенаправленно использовать медикаментозную коррекцию фибринолиза. 2 табл., 5 пр.

Настоящее изобретение относится к области микробиологии. Группа изобретений включает способ и систему для определения количества культивируемых микробных клеток, таких как E.coli, Ps.aeroginosa, или смеси микробных клеток (например, для определения суммарного количества микробов) в исследуемом образце. При этом указанный способ включает (i) приведение во взаимодействие исследуемого образца, который может содержать культивируемые микробные клетки, с по меньшей мере одним сигнальным агентом, способным связываться с мембраной микробной клетки, указанное приведение во взаимодействие производится в течение предварительно определенного первого периода времени (T1), достаточного для интернализации сигнального агента в микробную клетку до такого уровня, при котором сигнал, испускаемый образцом, по существу достигает плато; (ii) удаление из указанного исследуемого образца неинтернализованного сигнального агента; (iii) в течение второго периода времени (T2), следующего за указанным первым периодом времени (T1), на протяжении которого указанный сигнал по существу сохраняется на уровне указанного плато, обнаружение среди сигнальных объектов в указанном образце сигнальных культивируемых клеток, основанное на параметрах отбора, предварительно определенных для указанных культивируемых клеток; и (iv) определение на основании указанных выбранных сигнальных объектов количественного значения, указывающего на количество культивируемых клеток в исследуемом образце. Группа изобретений позволяет, практически в реальном времени, получить высокоточное количественное значение, отражающее содержание микробных клеток в образце, которое может быть эквивалентом КОЕ. 2 н. и 37 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.
Наверх