Биорезорбируемый материал на основе аморфного гидроксиапатита и способ его получения

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биоматериалам, представляющим собой наночастицы биорезорбируемого аморфного гидроксиапатита, которые могут использоваться в медицине и в косметике, например, в качестве материала, стимулирующего регенерацию мягкой и костной ткани, в т.ч. в качестве средства, использующегося для заживления ран различной этиологии, в качестве остеопластического материала, в качестве активного компонента средств гигиены полости рта, а также в качестве наноносителя лекарственных средств. Материал включает размещенные в органической матрице наночастицы аморфного гидроксиапатита кальция, частично изоморфно замещенного ионами металлов II группы (М^II) общей формулы Са_10-х М^II _x (РO₄)₆ОН₂, где (М^II) - Mg²⁺ и/или Zn²⁺, 0,01≤x≤2. Способ получения биорезорбируемого материала включает приготовление смеси из гидроксида кальция, монозамещенного фосфата кальция моногидрата и оксидов металлов, в качестве которых используют оксид магния и/или оксид цинка при атомном соотношении (Са+М^II)/P=1,67, Са/Р не ниже 1,33, где (М^II) - Mg²⁺/или Zn²⁺, добавление к смеси водного раствора биополимера в виде гидрогеля с концентрацией полимера 0,01-10,0 мас.% для формирования органической матрицы, осаждение наночастиц аморфного гидроксиапатита при температуре 10-30°С при нейтральных значениях рН 7,0-7,5 с последующим фильтрованием и высушиванием осадка при температуре 20-30°С до получения конечного продукта. Результатом является получение вещества, соответствующего химической формуле гидроксиапатита, со степенью аморфности от 95 до 100%. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к биоматериалам, представляющим собой наночастицы биорезорбируемого, аморфного гидроксиапатита, которые могут использоваться в медицине и в косметике, например, в качестве материала, стимулирующего регенерацию мягкой и костной ткани, в т.ч. в качестве средства, использующегося для заживления ран различной этиологии, в качестве остеопластического материала, в качестве активного компонента средств гигиены полости рта. Изобретение может быть использовано также в качестве наноносителя лекарственных средств.

Создание биоподобных материалов, максимально соответствующих по своей структуре природным тканям организма, является важнейшей задачей современной медицины. Применение ортофосфатов кальция в медицине в основном связано с материалами на основе кристаллического гидроксиапатита, используемыми для восстановления или замещения дефектов костной ткани (RU2402483, МПК: С01В 25/32; RU 2367633, МПК: С04В 35/622; RU 2245152, МПК: А61К 33/06; RU2372313, МПК: С04В 35/447).

Несмотря на положительные характеристики материалов на основе кристаллического гидроксиапатита, материалы на основе аморфных ортофосфатов кальция характеризуются более высокой степенью биосовместимости, способностью к быстрой и полной резорбции.

Из уровня техники известен аморфный, карбонированный и фторированный гидроксиапатит для применения в составе зубных паст и способ его получения (RU 2179437, МПК: А61К 7/16). Гидроксиапатит представляет собой синтезированный материал со структурой гидроксиапатита, при этом он дополнительно содержит карбонатные группы и фтор группы в соответствии с формулой Са10(PO₄)6(ОН)_2-х-у(CJ₃)х/2Fx, где х=0,01-0,3; у-0,01-0,4. Способ получения гидроксиапатита заключается в медленной нейтрализации в инертной атмосфере водного раствора гидроксида кальция смесью ортофосфорной и фтористоводородной кислот при 8-10°С при отдельном и непрерывном введении в реакционный раствор Са(НСО₃)₂. Образцы для контроля качества готовой продукции готовят в инертной атмосфере путем сушки и последующего высокотемпературного отжига.

Данный способ характеризуется сложностью технологического процесса, связанного с многостадийностью и необходимостью проведения процесса в инертной атмосфере, а полученный продукт содержит в своем составе ионы фтора, которые, как известно ("Вестник СумДУ. Серия Физика, Математика, Механика" №2 2007 г. Структура и свойства апатитов кальция с точки зрения биоминералогии и биометериаловедения (обзор) С.Н.Данильченко), способны замещать гидроксильные группы (ОН) в структуре гидроксиапатита с образованием более прочных кристаллов фторапатита, а также обладают токсическим действием по отношению к мягким тканям организма.

Известен также способ получения ранозаживляющих и остеопластических материалов на основе гидроксиапатита (RU 2314107, МПК: А61К 33/06), включающий смешение гидроксиапатита и органической основы, в котором используют коллоидный раствор гидроксиапатита с концентрацией 1,4-2,8% по гидроксиапатиту, а в качестве органической основы - глицераты кремния. Компоненты используют при соотношении 1:(1,1-1,5). Ранозаживляющая активность достигается за счет коллоидного состояния и транскутанной активности глицератов кремния, оказывающей положительное воздействие на все виды тканей за счет эссенциального кремня, стимулирующего протекающие в тканях пролиферативно-репаративные процессы.

Известно ранозаживляющее и остеопластическое средство и способ его получения (RU 02117492, МПК: A61L 15/00). Средство содержит композицию из коллагена и кальцийфосфатного вещества, нанесенную на одну сторону пленки, резорбируемой в живых тканях, до общей толщины средства 0,5-10 мм. Композиция может быть нанесена на обе стороны пленки до общей толщины средства 1-15 мм. При этом пленка может быть выполнена из поливинилпирролидона, поливинилкапролактама, полилактида, полигликолида, хитозана, альгината и коллагена, а кальцийфосфатное вещество представляет собой гидроксиапатит, трикальцийфосфат или их смесь. Средство может дополнительно содержать лекарственное вещество в количестве до 30% от массы композиционной структуры и является выбранным из антибиотиков, антисептиков, иммуномодуляторов и факторов роста.

Однако в составе материала по данному изобретению использовано кальцийфосфатное вещество в кристаллической форме, характеризующееся низкой степенью резорбции.

Наиболее близким к заявляемому способу является материал в виде микрогранул на основе гидроксилапатита кальция и способ его получения (RU 2235061, МПК: С01В 25/32). Материал может быть использован при производстве композиционных материалов, биокерамики, а также материалов, стимулирующих восстановление дефектов костной ткани, сорбентов, фармацевтических носителей и им аналогичных материалов. Материал содержит микрогранулы размером 1-2 мкм на основе кристаллического гидроксиапатита кальция, заключенного в органическую матрицу биополимеров с атомным соотношением Са/Р=1,67. Материал получают посредством смешивания гидроксида кальция и монозамещенного фосфата кальция, моногидрата в мольном соотношении Са/Р=1,67, добавления к этой смеси водного раствора, содержащего гидрогель с концентрацией полимера 0,01-10,0 масс.%, осаждения данных веществ при температуре 20-41°С при нейтральных значениях рН 6.8-7.2 с последующим фильтрованием и высушиванием конечного продукта в виде микрогранул при температуре 105-160°С. При этом смешивание и осаждение веществ осуществляют в течение от 1 минуты до 1 часа, а в качестве гидрогеля используют коллаген, и/или желатин, и/или кератин, и/или плаценту, и/или альгинат натрия, и/или ксантан, и/или эфиры целлюлозы, и/или гепарин, и/или хитозан, и/или воду.

Однако полученный данным способом материал характеризуется кристаллической структурой с крупным размером микрогранул, что не позволяет его использовать в качестве ранозаживляющего средства вследствие отсутствия резорбции в мягких тканях.

Задачей данного изобретения является создание биорезорбируемого материала на основе гидроксиапатита, характеризующегося аморфной структурой.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение вещества, соответствующего химической формуле гидроксиапатита со степенью аморфности от 95 до 100%, достигающейся посредством изоморфного замещения катионов кальция катионами магния и цинка, реализуемого в процессе синтеза материала в органической матрице биополимеров.

Таким образом, получаемый материал состоит из наночастиц гидроксиапатита в аморфном состоянии, имеющих сферическую или сфероподобную форму, включенных в органическую матрицу биополимеров, обладает повышенной биосовместимостью, а также способностью быстро и полностью резорбироваться в мягких тканях, что позволяет использовать его в медицине для эффективного заживления ран различной этиологии. Кроме того, материал является максимально схожим с биологическими ортофосфатами кальция, отличающийся от стехиометрического гидроксиапатита кальция некоторыми аспектами, включающими аморфное состояние, обеспечивающее высокую скорость и полную резорбцию в мягких тканях, содержание в составе ионов магния и цинка, благотворно влияющих на процессы ранозаживления.

Поставленная задача решается тем, что материал включает размещенные в органической матрице наночастицы аморфного гидроксиапатита кальция, частично изоморфно замещенного ионами металлов II группы (M^II) общей формулы Са_10-х M^IIx (PO₄)₆ОН_2, где (M^II) - Mg²⁺ и/или Zn²⁺, 0,01<х<2, при этом наночастицы имеют сферическую и/или сфероподобную форму и размер 5-40 нм. Материал может дополнительно содержать марганец и/или кремний и/или медь и/или серебро и/или селен при массовом соотношении ионов металлов к конечному продукту до 1 мас.%. В качестве органической матрицы использованы полимеры природного происхождения, например, гиалуроновая кислота, и/или альгинат, и/или ксантан, и/или эфиры целлюлозы, и/или гепарин, и/или хитозан, и/или коллаген, и/или желатин, и/или кератин. Аморфная структура материала сохраняется при высушивании до 500°С. Высушивание материала при 550°С приводит к образованию слабозакристаллизованной фазы гидроксиапатита.

Поставленная задача решается также тем, что способ получения биорезорбируемого материала на основе гидроксиапатита включает приготовление смеси из гидроксида кальция, монозамещенного фосфата кальция моногидрата и оксидов металлов, в качестве которых используют, по крайней мере, оксид магния, и/или оксид цинка, при атомном соотношении (Са+M^II)/P=1,67, Са/Р не ниже 1,33, где (M^II) -Mg²⁺ и/или Zn², добавление к этой смеси водного раствора биополимера в виде гидрогеля с концентрацией полимера 0,01-10,0 мас.% для формирования органической матрицы, осаждение наночастиц аморфного гидроксиапатита при температуре 10-30°С при нейтральных значениях рН 7,0-7,5 с последующим фильтрованием и высушиванием осадка при температуре 20-30°С до получения конечного продукта. В качестве гидрогеля используют коллаген, и/или желатин, и/или кератин, и/или альгинат, и/или ксантан, и/или эфиры целлюлозы, и/или гепарин, и/или хитозан, и/или гиалуроновую кислоту. В качестве оксидов металлов дополнительно вводят оксид марганца и/или оксид кремния и/или оксид меди и/или оксид серебра и/или оксид селена при массовом соотношении ионов металлов к конечному продукту до 1 мас.%.

По сравнению с наиболее близким аналогом заявляемый материал отличается компонентным составом, соотношением компонентов, фазовым составом и структурой, формой и размером получаемых частиц, а также режимными параметрами процесса получения материала. Благодаря использованию совокупности существенных признаков, представленных в формуле изобретения, удалось изменить кристаллическую структуру материала и получить новое вещество с новыми свойствами. При этом определенное влияние на изменение кристаллической структуры материала оказало введение магния и цинка на определенном этапе синтеза. Магний - один из основных участников синтеза клеточных пептидов, он входит в состав 13 металлопротеинов и более 300 ферментов, ионы магния оказывают большое влияние на процессы синтеза клетками соединительной ткани. Магний является одним из основных биоэлементов, обеспечивающих физиологический метаболизм соединительной ткани. Цинк является компонентом или активатором более чем 200 ферментов и участвует во множестве жизненных процессов. Цинк играет важнейшую роль в процессах обновления и быстрого ранозаживления кожи. Эпителизация без достаточного уровня цинка в ране оказывается затрудненной.

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 представлена микрофотография просвечивающей электронной микроскопии и дифрактограмма образца материала, изготовленного по примеру 1; на фиг.2 - микрофотография просвечивающей электронной микроскопии и дифрактограмма образца материала по примеру 2; на фиг.3 -рентгенограмма образца материала по примеру 2, высушенного при температуре 550°С; на фиг.4 - микрофотография просвечивающей электронной микроскопии и дифрактограмма образца материала, изготовленного по примеру 3.

Согласно современным представлениям о патогенезе многих заболеваний основная роль принадлежит активации процессов свободнорадикального окисления (СРО) (Зенков Н.К. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты / Н.К. Зенков, В.З. Панкин, Е.Б. Меньшикова. - М.: МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. - 343 с., Швец П. Свободные радикалы, этиопатогенез заболеваний и пути терапевтического воздействия // Словакфарма ревю, 1996.- №4. - С.75-77, Aruoma O.I. Oxygen free radicals and human diseases / O.I. Aruoma, H. Kauer, B. Halliwell // J.R. Soc. Health.-1991. - Vol.111.- P.172-177). Имеются данные, свидетельствующие об инициальной роли СРО как одного из пусковых механизмов развития воспалительно-дистрофических процессов в различных тканях организма (Толстых М.П., 2004; Луцевич О.Э., 2003-2010; Davies K.J., 1995). При этом развитие окислительного стресса обусловлено нарушением баланса между антиоксидантной и прооксидантной системами. Основную роль в этом процессе играют активные формы кислорода, азота и свободные радикалы, образующиеся в процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), обладающие высокой реакционной способностью и вызывающие окислительную модификацию биополимеров, что приводит к нарушению тканевого дыхания в митохондриях и процессов гидроксилирования в микросомах. Установлено, что при моделировании гипоксии введением в среду инкубации субтоксических доз NaCN и динитрофенолом (ДНФ) увеличивается содержание ТБК-активных продуктов в остеобластах на 12 и 18% и фибробластах на 7 и 8% соответственно.

Изобретение поясняется примерами конкретного выполнения. При этом пример 1 характеризует состав материала-аналога, примеры 2 и 3 демонстрируют возможность получения нового материала.

Пример 1 (сравнительный).

5,00 г гидроксида кальция и 7,50 г однозамещенного фосфата кальция моногидрата тщательно перемешивали в течение 1 минуты при температуре 20°С, постепенно добавляя 120.00 мл 0,5% водного раствора альгината натрия. Полученный осадок (рН 7,0) отделяли и высушили при 160°С. Результаты просвечивающей электронной микроскопии показали, что образец имеет тонковолокнистое строение и кристаллическую структуру с толщиной микрокристаллов 2-5 нм и длиной 10-50 нм (фиг.1).

Апробация данного материала в лечении первичных и вторичных гнойных ран различной локализации показала отсутствие ранозаживляющих свойств.

Пример 2.

4,00 г гидроксида кальция, 0,41 г оксида магния, 0,27 г оксида цинка и 7,50 г однозамещенного фосфата кальция моногидрата тщательно перемешивали в течение 1 минуты при температуре 25°С, постепенно добавляя 120.00 мл 0,1% водного раствора гиалуроновой кислоты. Полученный осадок (рН 7,4) отделяли и высушивали при 25°С. Результаты просвечивающей электронной микроскопии показали, что образец состоит из сферических и сфероподобных наночастиц гидроксиапатита размером 5-40 нм и имеет аморфную структуру (фиг.2)

На фиг.3 представлена рентгенограмма образца, высушенного при 550°С, на которой прослеживается образование кристаллической фазы гидроксиапатита, посторонние фазы и примеси отсутствуют.

При клинической апробации предложенного материала в лечении первичных и вторичных гнойных ран различной локализации установлено благотворное влияние на течение гнойного раневого процесса, в том числе и заживление гнойных ран. В стадии воспаления при применении предложенного материала усиливается трансформация полибластов в клеточные структуры, представляемые профибробластами и макрофагами. В стадии регенерации предложенный материал стимулирует рост грануляционной ткани и, как следствие, полноценный процесс эпителизации.

Свойства, характеризующие заявляемый материал, и его влияние на течение гнойного раневого процесса подтверждены экспериментально.

В ходе исследования протекторных свойств предложенного материала на жизнеспособность фибробластов, как в норме, так и в условиях гипоксии, вызванной цианидом Na (NaCN) и динитрофенолом (ДНФ), установлено, что материал нетоксичен для фибробластов в нормальных условиях, а в условиях экспериментальной гипоксии, вызванной субтоксическими дозами NaCN и ДНФ, снижает уровень ТБК-активных продуктов в клетках, нормализует протекающие с участием свободных радикалов окислительные процессы и предупреждает разрушение биомембран клеток, связанное с активацией ПОЛ.

Внесение в среду инкубации NaCN и ДНФ вызывало снижение степени адгезии к субстрату, оцениваемой по уменьшению их площади и увеличению межклеточного расстояния. При этом NaCN и ДНФ угнетали рост фибробластов - на 75 и 47%. Учитывая, что ДНФ вызывает увеличение окислительных процессов и уменьшение образования макроэргических соединений, можно предполагать участие свободнорадикальных механизмов повреждения в его цитотоксическом действии. NaCN блокирует дыхательную цепь, вызывая накопление продуктов цикла трикарбоновых кислот. В ходе эксперимента установлено, что введение заявленного материала в среду инкубации способствовало нормализации метаболических процессов в условиях NaCN гипоксии и защищало культивируемые фибробласты от действия метаболических гипоксантов: NaCN и ДНФ.

Пример 3.

4,00 г гидроксида кальция, 0,41 г оксида магния, 0,27 г оксида цинка, 0,07 г оксида селена и 7,50 г однозамещенного фосфата кальция моногидрата тщательно перемешивали в течение 1 минуты при температуре 25°С, постепенно добавляя 120.00 мл 0,1% водного раствора гиалуроновой кислоты. Полученный осадок (рН 7,2) отделяли и высушивали при 25°С. Результаты просвечивающей электронной микроскопии показали, что образец состоит из сферических и сфероподобных наночастиц гидроксиапатита размером 5-40 нм и имеет аморфную структуру (фиг.4).

Пример 4.

4,28 г гидроксида кальция, 0,39 г оксида магния и 7,50 г однозамещенного фосфата кальция моногидрата тщательно перемешивали в течение 1 минуты при температуре 25ºС, постепенно добавляя 120,00 мл 0,1 % водного раствора гиалуроновой кислоты. Полученный осадок (рН 7,2) отделяли и высушивали при 25ºС. Результаты просвечивающей электронной микроскопии показали, что образец состоит из сферических и сфероподобных наночастиц гидроксиапатита размером 5-40 нм и имеет аморфную структуру (см. фиг. 5).

Пример 5.

4,64 г гидроксида кальция, 0,31 г оксида цинка и 7,50 г однозамещенного фосфата кальция моногидрата тщательно перемешивали в течение 1 минуты при температуре 25ºС, постепенно добавляя 120,00 мл 0,1 % водного раствора гиалуроновой кислоты. Полученный осадок (рН 7,0) отделяли и высушивали при 25ºС. Результаты просвечивающей электронной микроскопии показали, что образец состоит из сферических и сфероподобных наночастиц гидроксиапатита размером 5-40 нм и имеет аморфную структуру (см. фиг. 6).

1. Биорезорбируемый материал, включающий размещенные в органической матрице биополимеров наночастицы аморфного гидроксиапатита кальция, частично изоморфно замещенного ионами металлов II группы (M^II) общей формулы Са_10-х M^II _x (PO₄)₆ОН₂, где (M^II) - Mg²⁺ и/или Zn²⁺, 0,01≤x≤2.

2. Биорезорбируемый материал по п.1, характеризующийся тем, что в качестве органической матрицы использованы полимеры природного происхождения.

3. Биорезорбируемый материал по п.2, характеризующийся тем, что в качестве полимеров природного происхождения использованы гиалуроновая кислота, и/или альгинат, и/или ксантан, и/или эфиры целлюлозы, и/или гепарин, и/или хитозан, и/или коллаген, и/или желатин, и/или кератин.

4. Биорезорбируемый материал по п.1, характеризующийся тем, что наночастицы имеют сферическую и/или сфероподобную форму и размер 5-40 нм.

5. Биорезорбируемый материал по п.1, характеризующийся тем, что его аморфная структура сохраняется при высушивании до 500°С.

6. Биорезорбируемый материал по п.1, характеризующийся тем, что он дополнительно содержит ионы марганца, и/или кремния, и/или меди, и/или серебра, и/или селена при содержании ионов металлов в конечном продукте до 1 мас.%.

7. Способ получения биорезорбируемого материала на основе аморфного гидроксиапатита, включающий приготовление смеси из гидроксида кальция, монозамещенного фосфата кальция моногидрата и оксидов металлов, в качестве которых используют оксид магния и/или оксид цинка при атомном соотношении (Са+M^II)/P=1,67, Са/Р не ниже 1,33, где (M^II) - Mg²⁺ и/или Zn²⁺, добавление к этой смеси водного раствора биополимера в виде гидрогеля с концентрацией полимера 0,01-10,0 мас.% для формирования органической матрицы, осаждение наночастиц аморфного гидроксиапатита при температуре 10-30°С при нейтральных значениях рН 7,0-7,5 с последующим фильтрованием и высушиванием осадка при температуре 20-30°С до получения конечного продукта.

8. Способ по п.7, характеризующийся тем, что в качестве биополимеров используют гиалуроновую кислоту, и/или коллаген, и/или желатин, и/или кератин, и/или альгинат, и/или ксантан, и/или эфиры целлюлозы, и/или гепарин, и/или хитозан.

9. Способ по п.7, характеризующийся тем, что дополнительно вводят оксид марганца, и/или оксид кремния, и/или оксид меди, и/или оксид серебра, и/или оксид селена при содержании ионов металлов в конечном продукте до 1 мас.%.