Тест-система для обнаружения рнк вируса блютанга методом от-пцр в режиме реального времени


 


Владельцы патента RU 2510851:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложенная тест-система для обнаружения РНК вируса блютанга включает серогруппспецифичные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам консервативного 10-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5' - 3'): BTV/10/qf - ACKggTgCWACgCAAACACA; BTV/10/z - FAM - AARgCTgCATTCgCATCgTACGC - BHQ1; BTV/10/qr - ACRTCATCACgAAACgCTTC. Данная тест-система обладает высокой чувствительностью, специфичностью и быстротой при проведении анализа и позволяет с помощью метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени обнаруживать РНК вируса блютанга 25 серотипов. 2 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для генодиагностики, а именно для обнаружения РНК вируса блютанга.

Вирус блютанга (ВБ), вызывающий заболевание у домашних и диких жвачных животных, является одним из видов рода Orbivirus, семейства Reoviridae [1]. Геном вируса состоит из 10-ти сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [2]. Десять линейных дцРНК сегментов генома ВБ варьируют по размеру от 3944 п.о. до 822 п.о. (пример для ВБ 8 серотипа) [3]. Они обозначены как сегменты 1-10, в соответствии с уменьшением молекулярной массы. Геном ВБ кодирует 10 белков вируса, каждый белок - одним из сегментов дцРНК [4]. Семь белков (VP1-VP7) являются структурными компонентами вирусной частицы, остальные три (NS1,NS2 и NS3) являются неструктурными белками, которые синтезируются во время репликации вируса в инфицированных клетках. Наименьший из неструктурных белков, NS3, кодируемый 10 сегментом, является четвертым наиболее вариабельным из белков ВБ [3], анализ которого позволил разделить изоляты вируса на несколько кладов [3], однако он считается умеренно консервативным относительно других сегментов. Например, NS3 белок вируса АЧЛ имеет чрезвычайно высокий уровень вариаций, что позволило сгруппировать последовательности 10 сегмента в 3 кластера - альфа, бета и гамма [5]. Вне Африки вспышек АЧЛ было относительно немного и поэтому отсутствие любого географического группирования вирусов по 10 сегменту отражает ограничение вируса Африканским континентом. NS3 участвует в процессе освобождения частиц ВБ из инфицированной клетки хозяина [6].

В настоящее время известно о существовании 26-ти генотипов вируса, 25 из которых в антигенном отношении соответствуют 1-24 и 26 серотипам вируса. Данные молекулярной эпидемиологии свидетельствуют о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. На настоящий момент известно более 300-т вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга.

Существует необходимость совершенствования средств и методов лабораторной диагностики, постановки диагноза при бессимптомном течении болезни и появлении новых генетических вариантов вируса, а именно разработка серогруппспецифической тест-системы для обнаружения РНК вируса блютанга методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющей в короткие сроки установить наличие генома возбудителя в образцах биологического материала от инфицированных животных. Трудности в ее разработке обусловлены несколькими факторами: во-первых, это структура генома, так как он представлен 10-ю сегментами дцРНК, и как результат - это известный на данный момент факт частой реассортации вирусов как полевых вариантов, так и полевых с вакцинными, не только внутри одного серотипа, но и между серотипами.

Известен количественный метод ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вакцинных и/или полевых штаммов ВБ. С того момента, как обнаружение ПЦР-продуктов стало основано на флюоресцентной интенсивности, это значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. Были разработаны два универсальных теста, основанных на ОТ-ПЦР в режиме реального времени, они позволили обнаруживать все серотипы ВБ [7, 8, 9]. Все тест-системы были разработаны за рубежом и на период, когда было известно о существовании только 24 серотипов вируса. Существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в РФ, а также валидация только с использованием 24 серотипов, что может привести к ложноотрицательным результатам при исследовании материала, содержащего вирус блютанга новых генетических вариантов, или к снижению специфичности наборов.

Целью настоящего изобретения является создание серогруппспецифической тест-системы для РНК обнаружения вируса блютанга в пробах биологического материала, основанной на амплификации 10-го сегмента генома вируса блютанга.

Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система для обнаружения генома вируса блютанга путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени включает синтетические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам консервативного 10-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5' - 3'):

BTV/10/qf - ACKggTgCWACgCAAACACA

BTV/10/z - FAM - AARgCTgCATTCgCATCgTACGC - BHQ1

BTV/10/qr - ACRTCATCACgAAACgCTTC

Технический результат заключается в повышении эффективности обнаружения РНК вируса блютанга в образцах различных видов биологического материала, возможность определения серотипа вируса блютанга с помощью ПЦР с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, сокращение времени проведения работы по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных серогруппспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить РНК вируса блютанга 25 серотипов (1-24, 26). Данная система позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.

В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, технология гибридизационных зондов TaqMan, контролирующая кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флуоресценции. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмент.

Таблица 1

Серогруппспецифические праймеры и ДНК-зонд для обнаружения РНК вируса блютанга

ПЦР-мишень праймер/ДНК-зонд нуклеотидная последовательность 5' - 3' локализация (NS3 ген, 8 серотип, FJ183383)
10 сегмент BTV/10/qf ACKggTgCWACgCAAACACA 212-231
BTV/10/z AARgCTgCATTCgCATCgTACGC 242-264
BTV/10/qr ACRTCATCACgAAACgCTTC 266-285

Выбор и анализ серогруппспецифических праймеров и зондов (табл. 1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/BioEdit_708_062707.zip», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 10-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5' конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3' конце BHQ1.

Пример конкретного выполнения

Обнаружение генома вируса блютанга в образцах биологического материала (кровь от инфицированных блютангом животных, культуральный материал вируса, лиофилизированный культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также в образцах интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов).

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препараты полученных комплементарных ДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР в режиме реального времени (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата РНК. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°С в течение 5 минут. Далее необходимо заморозить смесь после денатурации, поместив пробирки в штатив с хладагентом.

Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,5 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл (40 ед) MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки после денатурации вносят по 9,7 мкл смеси для обратной транскрипции. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 30-ти минут. После окончания реакции препарат кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР в режиме реального времени

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 8 мкл смеси для ПЦР, 7 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,2 см3, на поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.

В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.

Профиль реакции:

1. Удержание температуры 95°C - 3 мин

2. Циклирование

95°C - 10 c

60°С - 20 с

72°С - 15 с

Цикл повторить 5 раз.

3. Циклирование с детекцией 2

95° C - 10 c

60° С - 20 с - Детекция

72° С - 15 с

Цикл повторить - 40 раз.

Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 60°С.

Учет и интерпретация результатов амплификации

Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения Ct в соответствующей графе в таблице результатов.

Таблица 2

Результаты обнаружения РНК вируса блютанга методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием серогруппспецифической тест-системы

№ проб Характеристика биоматериала Результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени
1 культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (AJ585122) референтный штамм +
2 культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм +
3 культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм +
4 культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм +
5 культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм +
6 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127) референтный штамм +
7 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128) референтный штамм +
8 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129) референтный штамм +
9 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130) референтный штамм +
10 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм +
11 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм +
12 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм +
13 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм +
14 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм +
15 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ585136) референтный штамм +
16 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137) референтный штамм +
17 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ585138) референтный штамм +
18 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139) референтный штамм +
19 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140) референтный штамм +
20 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (AJ585141) референтный штамм +
21 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142) референтный штамм +
22 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143) референтный штамм +
23 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (AJ585144) референтный штамм +
24 лиофилизированный культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145) референтный штамм +
25 культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (HM590642) +
26 кровь ягненка, экспериментально инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа, 90-е сутки после заражения +
27 кровь крупного рогатого скота, инфицированного вирусом блютанга 14-го серотипа +
28 интактная культура клеток Vero -
29 интактная культура клеток ВНК-21 -
30 кровь от интактного животного (корова) -
31 кровь от интактного животного (овца) -
32 культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси», 1 серотип -

Таким образом, разработана тест-система, позволяющая с помощью метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени обнаруживать РНК вируса блютанга 25 серотипов (1-24, 26).

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

- высокая специфичность и чувствительность тест-системы для обнаружения РНК вируса блютанга, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 10-го сегмента генома вируса;

- быстрота проведения анализа, благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПЦР;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации генома возбудителя.

Источники информации

1. The dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101. - P.3-13.

2. Bluetongue virus assembly and morphogenesis/ P. Roy, R. Noad// Curr Top Microbiol Immunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

3. Sequence analysis of bluetongue virus serotype 8 from the Netherlands 2006 and comparison to other European strains/ S. Maan, N. S. Maan, N. Ross-smith, C. A. Batten, A. E. Shaw, S. J. Anthony, A. R. Samuel, K. E. Darpel, E. Veronesi, C. A. L. Oura, K. P. Singh, K. Nomikou, A. C. Potgieter, H. Attoui, E. van Rooij, P. van Rijn, K. D. Clercq, F. Vandenbussche, S. Zientara, E. Bre´ard, C. Sailleau, M. Beer, B. Hoffman, P.S. Mellor and P. P. C. Mertens// Virology. - 2008. - Vol. 377. - P.308-18.

5. Mertens, P.P.C. Assignment of the genome segments of bluetongue virus type 1 to the proteins which they encode/ P.P.C. Mertens, F. Brown and D.V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-17.

6. Sailleau, C. Nucleotide sequence comparison of the segments S10 of the nine African horsesickness virus serotypes/ C. Sailleau, S. Moulay and S. Zientara// Arch. Virol. - 1997. - Vol.142. - P.965-78.

7. Hyatt, A.D. Release of bluetongue virus-like particles from insect cells is mediated by BTV nonstructural protein NS3/NS3a/ A.D. Hyatt, Y. Zhaoand, P. Roy// Virology. - 1993. - Vol.193. - P.592-603.

8. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// http://www.sciencedirect.com/science/journal/01660934. - 2007. -http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_hubEid=1-s2.0-S0166093407X03136&_cid=271147&_pubType=JL&view=c&_auth=y&_acct=C000228598&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=3ce2e4caaf5a1dbc305c242f8e5a2345 P.115-126.

9. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments/ J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// Journal of Virological Methods. - 2007. - Vol.140. - P.115-123.

10. Rapid detection and quantitation of Bluetongue virus (BTV) using a Molecular Beacon fluorescent probe assay/ G. Orr`u , M. L. Ferrando, M. Meloni, M. Liciardi, G. Savini, P. De Santis// Journal of Virological Methods. - 2006. - Vol.137. - P.34-42.

Тест-система для обнаружения 10-го сегмента генома вируса блютанга путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающая серогруппспецифические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, комплементарные участкам консервативного 10-го сегмента, имеющие следующий нуклеотидный состав (5' - 3'):
BTV/10/qf - ACKggTgCWACgCAAACACA
BTV/10/z - FAM - AARgCTgCATTCgCATCgTACGC - BHQ1
BTV/10/qr - ACRTCATCACgAAACgCTTC



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам прогнозирования течения рака, и может быть использовано в медицине. Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком NSCLC, включает определение уровней экспрессии ChoK бета или ChoK бета и ChoK альфа в образце от указанного пациента.

Изобретение относится к области онкологии и молекулярной биологии. Предложен способ определения чувствительности клеток немелкоклеточного рака легких к действию препаратов, реактивирующих р53 белок, включающий выделение РНК из образцов, синтез кДНК генов CDKN1A, BTG2 и E2F1 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени с последующим определением соотношения количества кДНК гена E2F1 к количеству кДНК гена CDKN1A или гена BTG2, где при величине соотношения E2F1/CDKN1A>3 или E2Fl/BTG2>1,5 считают клетки немелкоклеточного рака легких чувствительными к препаратам, реактивирующим белок р53.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в диагностических исследованиях, направленных на выявление возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ).

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ диагностики чувствительности М. tuberculosis (МБТ) к инъекционным противотуберкулезным препаратам резервного ряда.

Группа изобретений относится к области молекулярной биологии и электрохимии. По первому варианту способ осуществляют путем регистрации циклических вольтамперограмм рабочего электрода, модифицированного углеродными нанотрубками с нековалентно иммобилизованным на их поверхности олигонуклеотидным зондом, до и после внесения в исследуемый раствор образца нуклеиновой кислоты и по изменению емкостной характеристики делают вывод о наличии или отсутствии в образце участка, комплементарного олигонуклеотидному зонду.

Изобретение относится к паразитологии и касается способа видовой ДНК-дифференциации гельминтов - возбудителей церкариального дерматита человека. Дифференциацию четырех видов Trichobilharzia: Т.

Изобретение относится к молекулярной генетике. Способ включает: получение кДНК EML4-ALK с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) на матрице РНК гена EML4-ALK с использованием специфичных праймеров; амплификацию фрагментов гена EML4-ALK методом мультиплексной ПЦР на матрице кДНК, полученной на первом этапе ОТ-ПЦР, с помощью набора высокоспецифичных праймеров; получение флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта на втором этапе ОТ-ПЦР; создание биочипа для анализа транслокаций EML4-ALK, содержащего набор иммобилизованных зондов; гибридизацию флуоресцентно-меченого ПЦР-продукта с зондами в гелевых ячейках на пластиковой подложке биочипа; регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.
Изобретение относится к молекулярной биологии и генетике клетки. Предложен способ, включающий этапы предварительной экстракции геномной ДНК, выделения специфической фракции однонитевых G-оверхенгов теломерной ДНК и последующей амплификации их минусовой цепи с дуплекс-специфическим анализом, причем этапы амплификации включают модификацию 3'-концов теломерных оверхенгов с помощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и осуществляются с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 1-5.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа видовой идентификации лактобацилл L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum, L.rhamnosus. Предлагаемый способ включает постановку реакции ПЦР с видоспецифическими праймерами, причем конструируют праймеры, специфичные к первому гену оперона F1F0 АТФ синтазы (гену субъединицы а) и предшествующего ему гена урацилфосфорибозилтрансферазы для L.casei/paracasei и L.rhamnosus и гена урацилтранспортного белка для L.plantarum и L.

Изобретение относится к области генетики, медицины и молекулярной биологии. Предложен способ определения трисомии хромосом плода, где из плазмы беременных женщин выделяют внеклеточную ДНК, подвергают её бисульфидной конвертации с последующей ПЦР и дальнейшему массовому параллельному секвенированию дифференциально метилированных участков; в качестве контроля дифференциально метилированных участков используют участки с различным уровнем метилирования у матери и плода, анализируют данные путем определения отношения количества чтений, полученных при секвенировании дифференциально метилированных участков ДНК на целевой и контрольной хромосомах, где в случае трисомии, при константном количестве чтений ДНК плода, картированных на дифференциально метилированных участках хромосом, будет наблюдаться количество чтений, картированных на целевую хромосому к количеству чтений на контрольных хромосомах, равное 3/2, тогда как в норме это отношение будет постоянным и равным 1.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Представлен способ, основанный на измерении в вагинальных соскобах уровня экспрессии мРНК генов интерлейкинов IL1B, IL8, IL10 и IL18 относительно представленности мРНК референсных генов B2M, GUS, TBP или HPRT; на основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ) следующим образом: Y=1,09*IL1B-0,61*IL8+0,21*IL10-0,11*IL18-0,91 (формула 1), где IL1B - относительный уровень экспрессии IL1B, IL8 - относительный уровень экспрессии IL8, IL10 - относительный уровень экспрессии IL10, IL18 - относительный уровень экспрессии IL18; IL=2^(Cpmin-Cpil)/NF (формула 2), где IL - относительный уровень экспрессии гена интерлейкина, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии, для IL1B Cpmin=17,9; IL8 Cpmin=16,6; IL10 Cpmin=28,8; IL18 Cpmin=23,3; Cpil - значение порогового цикла соответствующего IL в образце, определяемого автоматически; NF - фактор нормировки, вычисляется по формуле 3: (формула 3), где NF - фактор нормировки, вычисляемый как среднее геометрическое 4 факторов нормировки для референсных генов (см. формулу 4); NFref=2^(Cpmin-Cpref) (формула 4), где NFref - фактор нормировки для референсного гена, Cpmin - коэффициент минимального значения уровня экспрессии референсного гена, Cpref - показания прибора порогового значения в образце; значения Cpmin для референсных генов следующие: GUS Cpmin=26,5; HPRT Cpmin=26,8; B2M Cpmin=18,9; ТВР Cpmin=28,4; при этом, если значение КЛДФ≤0,1, делается заключение об отсутствии вагинита, значения КЛДФ>0,1 соответствуют вагиниту. Изобретение позволяет объективно выявить наличие вагинита у беременной женщины. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 3 пр.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Candida albicans методом полимеразной цепной реакции. Указанный набор включает специфичные к фрагменту гена gr1 микроорганизма Candida albicans праймеры 5′-TTGCCATTCTTGGACGAAGG-3′ и 5′-CAACAATGGCAACTTTTTTAGG-3′, а также зонд (BHQ1)-5′-TCCTCCTTCAG(FdT)CCCTGGTGCTGA-3′-Р, где BHQ1 означает присоединенный к 5'- концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т. Предлагаемое изобретение является эффективным маркером для обнаружения присутствия в биологическом материале микроорганизма Candida albicans.
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК пародонтопатогенного микроорганизма Treponema denticola методом полимеразной цепной реакции. Указанный набор включает специфичные к фрагменту гена licCA микроорганизма Treponema denticola праймеры 5'-TAG CCG GAA AAA CGA AGG AGT G-3' и 5'-CCC TGC TTG TTT GCA AAC ATA G-3', а также зонд (BHQ1)-5'-AAC CCA GCC G(FdT)T TCG TCC TCC GAC-3'-P, где BHQ1 означает присоединенный к 5'- концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т. Предлагаемое изобретение является эффективным маркером для обнаружения присутствия в биологическом материале микроорганизма Treponema denticola.

Изобретение относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli TG1(pRVMoscow3253G-L) для получения ПЦР-стандартов для количественного определения кДНК вируса бешенства штамма «Москва 3253». Рекомбинантный штамм создан на основе штамма E. coli TG1 путем трансформирования плазмидой pRVMoscow3253G-L. Плазмида получена лигированием фрагмента G-L области генома фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253», имеющего последовательность SEQ ID NO1, в плазмиду pGem-T. Также предложен набор ПЦР-стандартов для количественного определения кДНК вируса бешенства штамма «Москва 3253» в рабическом антигене. Набор содержит растворы ДНК плазмиды pRVMoscow3253G-L в концентрациях 108, 107, 105, 103 ГЭ/мл. Определение концентрации осуществляют методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Изобретение способствует стандартизации этапа приготовления рабического антигена в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора, включающего олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченный зонд для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Представленные праймеры и зонд имеют следующую структуру: внешний праймер 5'→3' 5'-AATGTARTTGGGTCTGTTRGGCAT-3' внутренние праймеры 5'→3' 5'-CCCWTCGATGMTGCCCC-3' 5'-TCMACGGGYACRAAGCGCA-3' зонд 5'→3' ROX-CCTGTCCGGCGATGTGCAT-BHQ2. Изобретение обладает более высокой гомологией к циркулирующим в настоящее время аденовирусам и позволяет идентифицировать ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21. 3 ил., 1 табл.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и фармакологии. Предложен способ для предсказания фармакологической эффективности адалимумаба для лечения ревматоидного артрита, где способ включает измерение уровня, по меньшей мере, одной из мРНК ADAMTS4 и мРНК ADAMTS5 в образце, полученном от субъекта, и определение того, эффективен ли адалимумаб против ревматоидного артрита у субъекта, на основе уровня, по меньшей мере, одной из мРНК ADAMTS4 и мРНК ADAMTS5, выступающего в качестве показателя. Способ может быть использован в медицине при лечении ревматоидного артрита. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 8 табл.

Изобретение относится к области генной инженерии, конкретно к анализу нарушений, связанных с раком яичников, и может быть использовано в медицине. Способ включает определение геномного статуса метилирования CpG-динуклеотидов в каждой последовательности из группы последовательностей SEQ ID NO:1-10 с использованием набора зондов, специфичных для указанных последовательностей и способных гибридизоваться с последовательностью по всей длине. Указанные последовательности используются в составе чипа для детекции, диагностики или мониторинга пролиферативных нарушений, связанных с пролиферацией клеток яичника, а также для детекции предрасположенности к пролиферативным нарушениям или лечения пролиферативных нарушений яичника. Изобретение позволяет проводить идентификацию пролиферативных нарушений в клетках яичника и выявлять генетическую предрасположенность к указанным нарушениям. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253». Способ предусматривает обеззараживание и выделение РНК из вируссодержащего материала, постановку реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени» с использованием специфичных праймеров RV5-5'-GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3', RV6-5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3' и зонда RV7-5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2. Количественную оценку вируса определяют на основании регистрации сигнала флуоресценции исследуемого образца и сравнения его с сигналом флуоресценции ПЦР-стандартов, содержащих различные количества ДНК-мишеней. Предложенный способ позволяет определить количественное содержание вируса в рабическом антигене органо-тканевого и культурального происхождения. Использование изобретения способствует стандартизации этапа приготовления рабического антигена в производстве гетерологичного антирабического иммуноглобулина. 2 табл., 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области хронобиологии. Способ определения циркадного цикла у субъекта на основе временных рядов данных по уровням экспрессии, полученных при измерении уровней экспрессии двух часовых генов в биологических образцах, которые берут у субъекта три раза в сутки. Причем часовые гены имеют разные фазы циркадного цикла изменений уровня экспрессии. Способ позволяет определить биологический ритм с большой точностью и сводит к минимуму количество раз взятия биологических образцов у субъекта. 3 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу дифференциации возбудителя сибирской язвы от других близкородственных видов рода Bacillus на основе определения различий в структуре хромосомных генов. Способ предусматривает пробоподготовку, выделение ДНК, постановку ПЦР. При этом при проведении ПЦР применяют олигонуклеотидные праймеры, комплементарные последовательностям хромосомных генов fliC и hom2, имеющие следующие последовательности:fliC-F: 5'-TGGAGCAGTAACAATTGG-3', fliC-R: 5'-GCACCACTGATAGAAATGTTAG-3', hom2-F: 5'-GACGTGTTAAAAGAAGCCCA-3', hom2-R: 5'-CACCAATTTCGTCTTTTACA-3' с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации, при котором образование продукта амплификации размером 153 п.н. свидетельствует о принадлежности исследуемого штамма к виду В.anthracis, образование продукта амплификации размером 550 п.н. свидетельствует о принадлежности исследуемого штамма к другому виду рода Bacillus. Изобретение позволяет эффективно дифференцировать возбудителя сибирской язвы от других бациллярных видов. 1 ил., 1 пр.
Наверх