Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи



Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи
Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи
Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи

 


Владельцы патента RU 2511031:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского Сибирского отделения Российской академии наук (RU)
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования" Министерства здравоохранения РФ (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (RU)

Изобретение относится к области биохимии и клинической микробиологии. Проводят выращивание золотистого стафилококка Staphylococcus aureus на питательной среде, содержащей желточно-солевой агар. На стадии подготовки к анализу в питательную среду вводят стимуляторы роста Staphylococcus aureus в виде водных растворов в концентрациях 10-4-10-6 вес.%. В качестве стимуляторов роста используют следующие соединения: трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфанилацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-ил-сульфонилацетат. Изобретение позволяет ускорить выращивание золотистого стафилококка для диагностики инфекций, сокращая время выращивания с 48 до 6-9 часов по сравнению с контролем на стандартной питательной среде (ЖСА). 2 табл., 7 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии, и касается способа ускоренного выращивания золотистого стафилококка (Staphilococcus aureus) для применения в диагностике инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Известен стандартный способ выращивания стафилококка для диагностики инфекций, вызванных этими микроорганизмами, заключающийся в использовании в качестве питательной среды желточно-солевого агара. При этом длительность выращивания по стандартной методике [2,6,7] составляет до 48 часов.

Нерациональное использование антимикробных препаратов привело к развитию резистентности к ним многих патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (в том числе стафилококков) и широкому распространению социально значимых стафилококковых инфекций, принимающих угрожающий характер и являющихся причиной развития внутрибольничных гнойно-воспалительных заболеваний, особенно в хирургических отделениях, родильных домах, педиатрических стационарах (язвенные энтероколиты, энтериты, перитониты, эндокардиты, пневмонии, абсцессы легкого, стафилококковый сепсис и др.) [1,8,9]. Длительность существующего производства бактериологических анализов негативно сказывается на оказании своевременной медицинской помощи пациенту, усложняя быстрое применение адекватной терапии. Поэтому является актуальной разработка способов ускоренного выращивания стафилококков для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Целью изобретения является повышение скорости роста золотистого стафилококка для диагностики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, и сокращение времени выдачи результата анализа для своевременного назначения адекватной антибиотикотерапии.

Поставленная цель достигается тем, что при выращивании золотистого стафилококка для целей диагностики на стадии подготовки к выполнению анализа в питательную среду на основе желточно-солевого агара в качестве стимулятора роста микроорганизмов вводят химические соединения: трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфанилацетат (1) или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфонилацетат (2) или трис(2-гидрокси-этил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат (3) или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4- хлорфенилоксиацетат (4) или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-ил-сульфонилацетат (5) в виде водных растворов в концентрации 10-4-10-6 вес.% (табл.1). При использовании стимуляторов роста 1-5 время роста стафилококка сокращается с 48 (без применения стимуляторов) до 9 часов.

В таблице 1 представлена химическая структура стимуляторов 1-5.

В таблице 2 представлено влияние биостимуляторов 1-5 на рост Staphylococcus aureus.

В качестве стимуляторов роста 24 штаммов St. aureus, выделенных от больных с гнойно-септическими осложнениями из отделения хирургического профиля, впервые исследованы биологически активные соединения - представители нового класса биологически активных протонных (2-гидроксиэтил)аммониевых ионных жидкостей [3-5].

Способы получения и свойства стимуляторов 1-5 приведены в примерах 1-5. Состав и строение соединений 1-5 подтверждали методами ИК, ЯМР-спектроскопии и элементного анализа. ИК спектры (v, см-1) записывали на спектрофотометре Varian 3100 FT-IR75 в КВr. Спектры ЯМР (δ, м.д.) снимали в D2O на спектрометре DPX 400 (400,13 МГц для 1Н и 101,62 МГц для 13С).

Следующие примеры иллюстрируют изобретение:

Пример 1. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфанилацетат (1)

К раствору 2.03 г (0.01 моль) 4-хлорфенилсульфанилуксусной кислоты в 10 мл этанола прикапывали этанольный раствор 1.49 г (0.01 моль) трис-(2-гидроксиэтил)амина (10 мл). Смесь перемешивали при 25°С 3 часа. Растворитель отгоняли в вакууме. Твердый остаток многократно промывали эфиром и высушивали в вакуумном эксикаторе над Р2О5. Получали бесцветный порошок (выход 3.44 г, 98%) с т.пл. 91°С, хорошо растворимый в воде и органических растворителях (ацетон, ТГФ, спирты). ЯМР1H: 7.11-6.32 (м, 4Н, C6H4S), 3.75 (т,6Н, ОСН2), 3.44 (с, 2Н, SCH2COO), 3.28 (т, 6Н, NCH2). ЯМР,13С: 177.19 (С=O), 155.81-111.55 (C6H4S), 60.79(SCH2COO), 55.09(ОСН2), 54.83(NCH2). ИК: 1560 (С=O), 2550-2700 (H+N), 3300 (ОН). Найдено, %: С, 48.11; Н, 6.01; N, 3.93. C14H22ClNO5S. Вычислено, %: С, 47.79; Н, 6.30; N, 3.98.

Пример 2. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенилсульфонилацетат (2)

Получали из 4-хлорфенилсульфонилуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 93°С. Выход 97%. ЯМР1Н: 7.19-6.22 (м, 4Н, C6H4SO2), 4.04 (с, 2Н, SO2CH2COO), 3.71 (т,6Н, ОСН2), 3.22 (т, 6Н, NCH2). ИК: 1566 (С=O), 2500-2710 (H+N), 3310(ОН). Найдено, %: С, 44.10; Н, 5.50; N, 3.63. C14H22ClNO7S. Вычислено, %: С, 43.80; Н, 5.77; N, 3.65.

Пример 3. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат (3)

Получали из 2-хлорфенилоксиуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 81-83°С. Выход 99%. ЯМР1Н: 7.26-6.02 (м, 4Н, С6Н4), 4.24 (с, 2Н, ОСН2СОО), 3.70 (т,6Н, ОСН2), 3.22 (т, 6Н, NCH2). ЯМР13С: 178.09 (С=O), 157.01-111.05 (С6Н4O), 60.00(ОСН2СОО), 57.19(ОСН2), 55.93(NCH2). ИК: 1558 (С=O), 2520-2700 (H+N), 3330(ОН). Найдено, %: С, 50.23; Н, 6.50; N, 4.18. C14H22ClNO6. Вычислено, %: С, 50.07; Н, 6.60; N, 4.17.

Пример 4. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлор-фенилоксиацетат (4)

Получали из 2-метил-4-хлор-фенилоксиуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 88°С Выход 98%. ЯМР1Н: 7.72-6.22 (м, 3Н, С6Н3), 4.44 (с, 2Н, ОСН2СОО), 3.78 (т,6Н, ОСН2), 3.38 (т, 6Н, NCH2), 2.25 (СН3). ЯМР13С: 175.19 (С=O), 156.21-111.11 (С6Н3O), 62.23(ОСН2СОО), 58.29(ОСН2), 57.93(NCH2), 14.71 (СН3). ИК: 1563 (С=O), 2500-2720 (H+N), 3310(ОН). Найдено, %: С, 51.72; Н, 6.62; N, 4.04. C15H24ClNO6. Вычислено, %: С, 51.50; Н, 6.91; N, 4.00.

Пример 5. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-илсульфонилацетат (5) Получали из 1-бензилиндол-3-илсульфонилуксусной кислоты и трис-(2-гидроксиэтил)-амина аналогично 1. Бесцветный порошок с т.пл. 109-110°С. Выход 96%. ЯМР 1Н, в (D3C)2SO, (δ, м.д., J/Гц) 3.05 (т, 6Н, 3CH2N, J=5.3); 3.63 (т, 6Н, 3СН2ОН, J=5.3). ИК: 1560, 1600 (С=O), 2500-2720 (H+N), 3290(ОН). Найдено, %: С, 58.05; Н, 6.23; N, 5.87. C23H30N2O7S. Вычислено, %: С, 57.72; Н, 6.31; N,5.85.

Пример 6. Приготовление разведений стимуляторов роста для проведения исследования. В ходе испытания проводили растворение каждого потенциального стимулятора роста по следующей методике:

Растворяли 0.1 г (100 мг) вещества в 100 мл дистиллированной воды, получая 0,1% раствор, который в дальнейшем считали матричным.

Дальнейшие разведения:

Первое разведение: 0.1 мл матричного 0.1% раствора добавляли в 100 мл желточно-солевого агара (ЖСА). Концентрация препарата в среде составила 10-4%.

Второе разведение: 0,1 мл матричного 0.1% раствора добавляем в 1000 мл ЖСА. Концентрация препарата в среде составила 10-5%.

Третье разведение: 0.01 мл матричного 0.1% раствора добавляем в 1000 мл ЖСА. Концентрация препарата в среде составила 10-6%.

В эксперименте используют каждое разведение препарата в питательной среде и чистую культуру возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи.

Пример 7. Проведение эксперимента по выращиванию St. aureus.

Взятие и посев инфицированного материала и учет результатов производили в соответствии с регламентирующими приказами [2,6,7].

Культуры St. aureus получали путем культивирования в термостате при температуре 37°С с применением желточно-солевого агара, который готовили в соответствии с представленной инструкцией на этикетке флакона.

Для приготовления питательной среды необходимое количество сухого вещества размешивали в 1 л дистиллированной воды, кипятили в течение 3 мин до полного расплавления агара, фильтровали через ватно-марлевый фильтр, разливали в стерильные флаконы и стерилизовали автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Среду охлаждали до температуры 45-50°С, разливали в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм. После застывания среды, соблюдая правила асептики, чашки подсушивали при температуре (37±1)°С в течение 40-60 мин.

Посев на чашки Петри проводили стандартным методом. Идентификацию выделенных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем фирмы LACHEMA (Чехия): «STAPHYtest»

Из идентифицированной культуры St. aureus готовили взвесь 104 в физ. растворе по стандарту мутности.

Далее брали три разведения препарата в ЖСА, разливали агар по чашкам (по три чашки каждого разведения препарата в питательной среде). На чашки высевали по 0.1 мл приготовленной взвеси золотистого стафилококка и инкубировали при 37°С, просмотр чашек производили каждые 2-3 часа, отмечая рост колоний. В качестве контроля были произведены посевы на ЖСА без стимулятора роста.

Подсчет колоний, выросших на поверхности агара, производили с помощью лупы (Х5) или прибора для счета колоний. Для этого помещали чашку вверх дном на темный лист бумаги (обеспечивая тем самым лучшую видимость колоний). Для удобства каждую подсчитанную колонию отмечали со стороны дна чашки карандашом или маркером. 1 При применении стимуляторов 1-5 в среде ЖСА для ускоренного роста культур St. aureus устанавливали всхожесть микроорганизмов. Результаты ростостимулирующей активности отображены в табл.2.

Из данных, представленных в таблице 2, видны значительные различия во всхожести штаммов St. aureus на средах со стимуляторами роста разной концентрации, а также на контрольной среде ЖСА. Так, при использовании всех стимуляторов роста при концентрациях 10-4-10-5 вес. %, а также стимулятора №5 при концентрациях 10-4-10-6 вес. % через 3 часа имел место пылевидный рост микроорганизмов, через 6 часов отмечались единичные колонии, через 9 часов после высева наблюдался рост St. aureus с выраженной лецитиназной активностью. При добавлении в питательную среду стимуляторов роста 1-4 в концентрации 10-6 вес. % через 3 и 6 часов после посева отмечался пылевидный рост микроорганизмов, через 9 часов - рост единичных колоний.

При посеве исследуемых культур на желточно-солевой агар без стимуляторов роста через 3 и 6 часов роста не отмечалось, и только через 9 часов появлялся пылевидный рост микроорганизмов. За 9 часов культивирования St. aureus в контроле не наблюдалось ни роста единичных колоний микроорганизмов, ни роста исследуемых культур с выраженной лецитиназной активностью.

Способ выращивания микроорганизмов апробирован на 24 штаммах St. aureus, выделенных от больных с гнойно-септическими осложнениями из отделения хирургического профиля с положительным результатом при осуществлении микробиологического мониторинга

Проведенные исследования позволили впервые установить, что исследованные соединения 1-5 стимулируют рост культуры St. aureus, существенно сокращая время их роста по сравнению с контролем на стандартной питательной среде (ЖСА). Эти результаты могут быть использованы для разработки усовершенствованной методики ускоренной диагностики госпитальных инфекций, вызванных S. aureus, что позволит значительно уменьшить время выдачи результата анализа и своевременно назначить адекватное лечение больного.

Литература

1. Брискин Б.С., Н. Н.Хачатрян. Внутрибольничные инфекции и их профилактика: взгляд хирурга // Хирургия: - 2005. - №2. - 26-30.

2. А.С.Лабинская, Л.П.Блинкова, А.С.Ещина, Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований // М., ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 600 с.

3. Мирскова А.Н., Мирсков Р.Г., Адамович С.Н., Воронков М.Г., Синтез и фармакологическая активность 2-гидроксиэтиламмониевых солей органилсульфанил(сульфонил) уксусных кислот - новых фармакологически активных соединений // Химия в интересах устойчивого развития. - 2011. - Т. 19. - №5. - С.467-478.

4. Мирскова А.Н., Левковская Г.Г., Ступина А.Г., Чхенкели В.А., Воронков М.Г. Влияние трис(2-гидроксиэтил)аммоний арокси-, арилтио- и арилсульфонилацетатов на жизнедеятельность бифидобактерий // Докл. АН. - 2003. - Т. 390. - №2. - С.280-282.

5. Мирскова А.Н., Левковская Г.Г., Мирсков Р.Г., Воронков М.Г. Алканоламмониевые соли органилсульфанил (сульфонил) уксусных кислот - новые стимуляторы биологических процессов // ЖОрХ. - 2008. - Т. 44. - Вып.10. - С.1501-1508.

6. Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями: приказ №720 МЗ СССР. М., 1978.

7. Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-диагностических учреждений: приказ №535 МЗ СССР. М., 1985.

8. Онищенко Г.Г. Национальная концепция профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. - 2011. с.21.

9. Скала Л.3., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г. Практические аспекты современной клинической микробиологии. - М.: Лабинформ, 2004. С.64-69.

Таблица 1
Соединение Формула
1. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфанилацетат
2. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфонилацетат
3. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенил-оксиацетат
4. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлор-фенилоксиацетат
5. Трис(2-гидроксиэтил)аммоний-1-бензилиндол-3-илсульфонилацетат
Таблица 2
№ стимулятора роста Время, час Концентрация, %
10-4 10-5 10-6
1 3 а а а
6 б б а
9 с с б
2 3 а а а
6 б б а
9 с с б
3 3 а а а
6 б б а
9 с с б
4 3 а а а
6 б б а
9 с с б
5 3 а а а
6 б б б
9 с с с
Контроль (без стимулятора роста) 3 д «-» «-»
6 д «-» «-»
9 а «-» «-»
Примечания: а - пылевидный рост микроорганизмов, б - единичные колонии микроорганизмов, с - рост микроорганизмов с выраженной лецитиназной активностью, д - отсутствие роста микроорганизмов, «-» - исследования не проводились.

Способ ускоренного выращивания золотистого стафилококка Staphylococcus aureus для диагностики инфекций, заключающийся в выращивании золотистого стафилококка на питательной среде, содержащей желточно-солевой агар с добавлением биостимулятора, отличающийся тем, что в качестве биостимулятора используют следующие соединения: трис(2-гидроксиэтил)аммоний 4-хлорфенил-сульфанилацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 2-метил-4-хлорфенилоксиацетат или трис(2-гидроксиэтил)аммоний 1-бензилиндол-3-ил-сульфонилацетат, которые вводят в питательную среду в концентрациях 10-4-10-6 вес.% в виде водного раствора.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и касается рекомбинантного штамма E. coli TG1(pRVMoscow3253G-L) для получения ПЦР-стандартов для количественного определения кДНК вируса бешенства штамма «Москва 3253».

Изобретение относится к биохимии и молекулярной биологии. Проводят консервацию клеток Escherichia coli в присутствии забуференного 80-90% глицерина.
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение питательной среды, создающей оптимальные условия для выращивания легионелл, содержащей: ферментативный гидролизат легкого свиньи, ферментативный гидролизат желтка куриного яйца, калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, L-цистеина гидрохлорид, уголь активный, агар микробиологический и дистиллированную воду при заданном соотношении ингредиентов.
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при изучении микрофлоры животных, а также бактериологической диагностике дисбактериоза кишечника.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при биологической очистке сточных вод гальванических цехов от солей тяжелых металлов. Способ предусматривает внесение в сточную воду биомассы дрожжей в виде отходов пивоваренных производств, содержащих ассоциацию дрожжей различных штаммов Saccharomyces cerevisiae с жизнеспособностью 90-95% в заданном количестве.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ диагностики чувствительности М. tuberculosis (МБТ) к инъекционным противотуберкулезным препаратам резервного ряда.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов, выделенных из нефтезагрязненной почвы, Acinetobacter species В-1037, Pseudomonas species В-989, Bacillus species B-1040, депонированных в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Bacillus subtilis subsp.subtilis BKM B-2711D обладает выраженным антагонизмом по отношению к Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, резистентностью к антибиотикам стрептомицину и тетрациклину.
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКМ B-2714D обладает выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, резистентностью к антибиотикам тетрациклину и триметоприму.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для обнаружения колиформных бактерий и Е.coli в образцах пищевых продуктов и воды при проведении бактериологических исследований.
Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано для определения адгезии золотистого стафилококка. Для этого исследуют чистую культуру золотистого стафилококка в концентрации 1 млрд/мл.
Изобретение относится к области микробиологии. .
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков, выделенных от человека и объектов окружающей среды при его бактериологической идентификации, для характеристики его вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к биополимерным молекулам.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для ускоренной индикации и дифференциации энтеробактерий. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для идентификации видов Streptococcus по появлению трех разных оттенков выявляемых микроорганизмов и появлению испускания флуоресценции в дополнение к изменениям окраски среды.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической лабораторной диагностике инфекционных заболеваний. .

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и эпидемиологии. .
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения спорового материала бактерий рода Clostridium предусматривает получение инокулята бактерий в полноценной синтетической питательной среде, засев инокулята и культивирования в подходящих условиях в питательной среде, включающей картофель, глюкозу, сернокислый аммоний и мел.
Наверх