Профилактическое или лекарственное средство для воспалительного заболевания

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ профилактики или лечения воспалительного заболевания, включающего стадии получения антитела к NR10, имеющего NR10-нейтрализующую активность, и отбора антитела, подавляющего рост IL-31-зависимой клеточной линии, и введения этого антитела пациенту с воспалительным заболеванием, которое представляет собой атопический дерматит, хронический дерматит, ревматизм или остеоартрит. Данное изобретение может найти дальнейшее применение в терапии воспалительных заболеваний. 9 з.п. ф-лы, 13 ил., 10 пр.

 

Настоящее изобретение относится к новым агентам для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, которые содержат антагонисты NR 10 в качестве действующих ингредиентов. Настоящее изобретение также относится к способам профилактики или лечения воспалительных заболеваний, в которых используются антагонисты NR 10.

Предшествующий уровень техники

Многие цитокины известны как гуморальные факторы, которые вовлечены в рост и дифференцировку различных типов клеток или в активацию функций дифференцированных зрелых клеток. Клетки, стимулированные цитокинами, продуцируют другие типы цитокинов, тем самым образуя в организме сети из множества цитокинов. Биологический гомеостаз поддерживается хрупким балансом взаимной регуляции между цитокинами в этих сетях. Полагают, что многие воспалительные заболевания являются результатом сбоя в таких цитокиновых сетях. Поэтому большое внимание привлекает антицитокиновая терапия на основе моноклональных антител. Например, была продемонстрирована высокая эффективность антител против TNF и рецептора IL-6 при клиническом применении. С другой стороны, есть много неудачных примеров, в которых не был получен терапевтический эффект при блокировании только одного цитокина, такого как IL-4, вследствие активации компенсаторных биохимических путей в реальных патологических состояниях.

Авторам настоящего изобретения удалось выделить новый цитокиновый рецептор NR 10, который имеет высокую степень гомологии с gp130, рецептором сигнального пути IL-6 (патентный документ 1). NR 10 образует гетеродимер с рецептором онкостатина М (OSMR) и функционирует в качестве рецептора IL-31 (непатентный документ 1). Сотрудниками компании Zymogenetics, Inc. было опубликовано, что у трансгенных мышей, со сверхэкспрессией IL-31, развивался зудящий дерматит (патентный документ 2).

Однако не было доказано, что увеличенная экспрессия цитокина у мышей или высокий уровень цитокина в крови в мышиной модели патологии в действительности вызывают болезнь. Не было информации о каких-либо терапевтических эффектах, получаемых при блокировании сигнала антителами. Например, зудящий дерматит развивается у трансгенных мышей, кератиноциты которых сверхэкспрессируют IL-18. Кроме того, концентрация IL-18 в крови повышается при развитии патологических состояний у мышей NC/Nga, которые являются моделью спонтанного атопического дерматита. На основе приведенных выше данных было высказано предположение, что причиной болезни является сверхэкспрессия IL-18. Однако в действительности введение нейтрализующих антител не имело никаких терапевтических эффектов (непатентный документ 2).

Как было описано выше, ингибирование функции цитокина не обязательно оказывает терапевтический эффект на заболевание, при котором повышен уровень экспрессии этого цитокина. На основе уровня экспрессии цитокина трудно предсказать, на какие заболевания в действительности будет оказываться терапевтический эффект. Поэтому важно найти заболевания, при которых ингибирование сигнального пути цитокина-мишени действительно оказывает терапевтический эффект.

Ниже описаны документы предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

Патентный документ 1: WO 00/75314

Патентный документ 2: WO 03/060090

Непатентный документ 1: IL-31 is associated with cutaneous lymphocyte antigen-positive skin homing T cells in patients with atopic dermatitis, J Allergy Clin Immunol. 2006 Feb; 117(2): 418-25

Непатентный документ 2: Administration of anti-interleukin 18 antibody fails to inhibit development of dermatitis in atopic dermatitis-model mice NC/Nga, British Journal of Dermatology 149: 39-45, 2003

Описание изобретения

[Проблемы, которые должно решить изобретение]

Настоящее изобретение было разработано в силу вышеописанных обстоятельств. Задачей настоящего изобретения является предоставление направленных против цитокинов методов лечения воспалительных заболеваний на основе антагонистов цитокиновых рецепторов. Более конкретно, задачей настоящего изобретения является обнаружение воспалительных заболеваний, при которых можно получить терапевтический эффект нейтрализующих антител против NR 10 и предоставление новых способов лечения таких заболеваний. Другой целью настоящего изобретения является предоставление нейтрализующих антител против NR 10 человека, которые применимы для лечения людей.

[Средство решения проблемы]

Авторы настоящего изобретения провели специальные исследования для решения вышеописанных задач. Авторы пытались оценить лекарственную эффективность нейтрализующих антител против мышиного NR 10 на мышиных моделях различных патологических состояний. Результаты продемонстрировали, что нейтрализующие антитела заметно подавляли симптомы в мышиной модели атопического дерматита с использованием мышей NC/Nga и в мышиной модели хронического дерматита, который получали многократным нанесением пикрилхлорида. Это подтвердило, что нейтрализующие антитела действительно пригодны в качестве терапевтического агента. В дополнение, было продемонстрировано, что антитела подавляют симптомы при коллагеновом артрите, в модели ревматизма и при коллагеназном артрите, модели остеоартрита. Эти результаты позволяют предположить, что NR 10-нейтрализующее антитело по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения хронического воспаления. Авторам настоящего изобретения также удалось получить антитела, нейтрализующие NR 10 человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к:

[1] агенту для профилактики или лечения воспалительного заболевания, в котором агент содержит антагонист NR 10 в качестве активного ингредиента;

[2] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [1], в котором антагонист представляет собой антитело, имеющую NR 10-нейтрализующую активность;

[3] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [2], в котором антитело представляет собой моноклональное антитело;

[4] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [2], в котором антитело представляет собой моноклональное антитело, имеющее активность, нейтрализующую NR 10 человека;

[5] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [2]-[4], в котором антитело представляет собой рекомбинантное антитело;

[6] профилактическому или терапевтическому агенту по п. [5], в котором антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека;

[7] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [2]-[6], в котором агент содержит в качестве активного ингредиента фрагмент и/или модифицированный фрагмент антитела с NR 10-нейтрализующей активностью;

[8] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является атопический дерматит;

[9] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является хронический дерматит;

[10] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является ревматизм;

[11] профилактическому или терапевтическому агенту по любому одному из пп. [1]-[7], в котором воспалительным заболеванием является остеоартрит;

[12] антителу, имеющему NR 10-нейтрализующую активность;

[13] антителу по п. [12], которое является моноклональным антителом;

[14] антителу по п. [12], в котором NR 10 является NR 10 человека;

[15] антителу по любому одному из пп. [12]-[14], которое является рекомбинантным антителом;

[16] антителу по п. [15], в котором рекомбинантное антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом человека;

[17] фрагменту и/или модифицированному фрагменту антитела по любому одному из пп. [12]-[16];

[18] способу профилактики или лечения воспалительного заболевания, который включает стадию введения антагониста NR 10 пациенту с воспалительным заболеванием и

[19] применению антагониста NR 10 для получения агента для профилактики или лечения воспалительного заболевания.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлен график, показывающий результаты наблюдений подавления роста клеток под воздействием BM095, добавленных в систему анализа клеточного роста с использованием IL-31-зависимых клеток Ba/F3. На оси абсцисс указаны расчетные концентрации mIL-31 (IL-31 мыши) в системе анализа, а на оси ординат указано количество клеток (OD450 (поглощение при 450 нм)). Добавленные количества BM095 (единица измерения: нг/мл) приведены в подписях к чертежу. Наблюдался эффект подавления роста клеток в зависимости от количества добавленных BM095.

На фиг.2 представлен график, показывающий терапевтический эффект, получаемый при введении анти-NR 10 антител мышам, являющимся моделью атопического дерматита. В группе, которой вводили анти-NR 10 антитела, наблюдалось значительное подавление воспалительного процесса по сравнению с группой отрицательного контроля (группой, которой вводили носитель).

На фиг.3 представлен график последовательного изменения веса тела после введения анти-NR 10 антител мышам, являющимся моделью атопического дерматита. В группе, получавшей существующий на сегодняшний момент противовоспалительный агент, наблюдали потерю веса. В отличие от этого, изменение веса не было замечено в группе, получавшей анти-NR 10 антитела. Таким образом, было подтверждено, что анти-NR 10 антитело является безопасным.

На фиг.4 представлен график, показывающий терапевтический эффект, получаемый при введении анти-NR 10 антител мышам-моделям хронического дерматита. В группе, которой вводили анти-NR 10 антитела, было обнаружено значительное подавление опухания ушной раковины.

На фиг.5 представлена фотография иммуногистохимического окрашивания ушной раковины мыши-модели хронического дерматита. Как и у людей, было найдено, что экспрессия мышиного NR 10 усилена в утолщенном эпидермисе.

На фиг.6 представлен график, показывающий эффект подавления артрита, получаемый при введении анти-NR 10 антител мышам-моделям вызванного коллагеном артрита.

На фиг.7 представлен график отношения между площадью под кривой (AUC) и концентрацией BM095, введенных мышам-моделям вызванного коллагеназой артрита (остеоартрита). AUC означает площадь под кривой изменения разницы между шириной левого и правого коленных суставов, которую определяют как величину, представляющую опухание правого коленного сустава.

На фиг.8 представлен график корреляции между концентрацией антител, нейтрализующих NR 10 человека (очищенных антител), и активности, подавляющей клеточный рост в присутствии IL-31. Антитела 1, 2 и 3 проявляли сильную NR 10-нейтрализующую активность.

На фиг.9 представлен график корреляции между концентрацией химерного антитела NA633 против NR 10 человека и активности, подавляющей клеточный рост в присутствии IL-31. NA633 проявляло сильную NR 10-нейтрализующую активность.

На фиг.10 представлена диаграмма сравнения аминокислотных последовательностей NR 10 человека и NR 10 яванского макака. Трансмембранная область подчеркнута двойной чертой.

На фиг.11 представлен график, показывающий активность, подавляющую клеточный рост, химерного антитела NA633 в стимулированной IL-31 человека клеточной линии BaF, экспрессирующей OSMR человека/NR 10 яванского макака. NA633 также показывало нейтрализующую активность по отношению к NR 10 яванского макака.

На фиг.12 представлен график изменения относительного веса тела у мышей-моделей DSS-колита (колита, вызываемого декстрансульфатом натрия).

На фиг.13 представлен график изменения толщины ушной раковины у мышей-моделей острого контактного дерматита, вызванного пикрилхлоридом.

Наилучший вариант осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к агентам для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, которые содержат антагонисты NR 10 в качестве активных ингредиентов. Основой настоящего изобретение является открытие авторами того, что антагонисты NR 10 (например, NR 10-нейтрализующие антитела) значительно подавляют симптомы у модельных мышей с атопическим дерматитом, хроническим дерматитом, ревматизмом, остеоартритом и т.п.

NR 10 является белком, который образует гетеродимер с рецептором онкостатина М (OSMR) и функционирует как рецептор IL-31. NR 10 также известен под другими названиями, такими как glm-r (J Biol Chem 277, 16831-6, 2002), GPL (J Biol Chem 278, 49850-9, 2003) и IL-31RA (Nat Immunol 5, 752-60, 2004). NR 10 по настоящему изобретению включает белки, имеющие такие названия. NR 10 по настоящему изобретению также включает NR 10, полученный из человека, мыши и других млекопитающих. Предпочтительный NR 10 включает NR 10, полученный из человека и мыши, но не ограничен этим. У NR 10 человека существует множество известных сплайсинговых вариантов (WO 00/075314). Из вышеописанных сплайсинговых вариантов NR 10.1 состоит из 662 аминокислот и включает в себя трансмембранный домен. NR 10.2 является растворимым рецептор-подобным белком, состоящим из 252 аминокислот без трансмембранного домена. Кроме того, известные сплайсинговые варианты NR 10, которые функционируют как трансмембранные рецепторные белки, включают NR 10.3 и IL-31RAv3. NR 10 человека по настоящему изобретению конкретно не ограничен при условии, что он образует гетеродимер с рецептором онкостатина М (OSMR) и функционирует в качестве рецептора IL-31. Предпочтительный NR 10 включает NR 10.3 (также упоминаемый как ILRAv4 (Nat Immunol 5, 752-60, 2004)) и IL-31RAv3. NR 10.3 (IL-31RAv4) состоит из 662 аминокислот (WO 00/075314; Nat Immunol 5, 752-60, 2004), а IL-31RAv3 состоит из 732 аминокислот (номер доступа в базе данных GenBank: NM_139017). Аминокислотная последовательность IL-31RAv4 показана в SEQ ID NO: 6, а аминокислотная последовательность IL-31RAv3 показана в SEQ ID NO: 7. Кроме того, NR 10, полученный из мыши, включает белки, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.

Антагонисты NR 10 по настоящему изобретению относятся к веществам, которые связывают NR 10 и блокируют передачу сигнала внутри клетки, основанную на активации NR 10, таким образом вызывая потерю или подавление физиологической активности клеток. В данном описании физиологическая активность включает, например, индукцию или подавление продукции физиологически активных веществ (например, хемокинов и воспалительных цитокинов), усиление или ослабление секреции веществ, ростовой активности, вызывающей рост активности, выживания клеток, дифференцировки клеток, вызывающей дифференцировку активности, транскрипционной активности, мембранного транспорта, связывающей активности, протеолитической активности, фосфорилирования/дефосфорилирования, окислительной/восстановительной активности, переноса, нуклеолитической активности, дегидратации, вызывающей клеточную смерть активности и вызывающей апоптоз активности, но не ограничена этим.

Наличие антагонистической активности можно определить способами, которые известны специалистам в данной области. Например, тестируемые соединения вводят в контакт с экспрессированным на поверхности клеток NR 10 в присутствии лиганда и определяют передается ли сигнал внутри клетки, что является индикатором активации NR 10. Это можно определить, например, способом, описанным в документе «Dillon SR, et al., Interleukin 31, a cytokine produced by activated T cells, induces dermatitis in mice. Nat Immunol. 2004 Jul; 5(7):752-60». Считается, что соединения, которые ингибируют передачу внутриклеточного сигнала в ответ на стимуляцию лигандом, действуют как антагонисты NR 10.

Антагонисты по настоящему изобретению могут быть природными или искусственными соединениями. В качестве антагонистов по настоящему изобретению можно использовать известные соединения. Также можно использовать новые соединения, у которых антагонистическая активность была определена способами, описанными выше.

В варианте осуществления настоящего изобретения антагонисты NR 10 включают антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность. «Антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность», по настоящему изобретению относятся к антителам, которые подавляют физиологическую активность на основе NR 10. «Антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность», по настоящему изобретению могут быть поликлональными или моноклональными антителами, и, в качестве предпочтительного варианта осуществления изобретения, включают моноклональные антитела.

Такие моноклональные антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, можно получать, например, по следующей методике: анти-NR 10 моноклональные антитела получают с использованием антигена NR 10 или его фрагмента, полученных из млекопитающего, такого как человек или мышь, известными способами, а затем имеющие NR 10-нейтрализующую активность антитела отбирают из полученных таким образом анти-NR 10 моноклональных антител. Более конкретно, иммунизацию проводят стандартными методами иммунизации, используя в качестве сенсибилизирующего антигена желаемый антиген или клетки, экспрессирующие желаемый антиген. Анти-NR 10 моноклональные антитела можно получить слиянием полученных иммунных клеток с известными родительскими клетками, используя стандартные методы слияния клеток, и проводя их скрининг на клетки, продуцирующие моноклональные антитела (гибридомы), стандартными методами скрининга. Животные, которые должны быть иммунизированы, включают, например, млекопитающих, таких как мыши, крысы, кролики, овцы, обезьяны, козы, ослы, коровы, лошади и свиньи. Антигены можно получить, используя известную последовательность гена NR 10, известными способами, например, способами с применением бакуловирусов (например, WO 98/46777). Как описано ниже в примерах данного описания, антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, можно отобрать, например, тестированием эффекта подавления роста IL-31-зависимой клеточной линии после добавления тестируемого антитела к IL-31-зависимой клеточной линии. Считается, что антитела, которые подавляют рост IL-31-зависимой клеточной линии в описанном выше способе, имеют NR 10-нейтрализующую активность.

Гибридомы можно получить, например, по способу Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) или т.п. Если иммуногенность антигена низкая, иммунизацию можно проводить после присоединения антигена к макромолекуле с высокой иммуногенностью, такой как альбумин.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, включают моноклональные антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека. Нет никаких особых ограничений на иммуноген для получения моноклональных антител, имеющих активность, нейтрализующую NR 10 человека, при условии, что он позволяет получать антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека. Например, известно, что существуют множество вариантов NR 10 человека. В качестве иммуногенов может использоваться любой из вариантов при условии, что он позволяет получить антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека. В качестве альтернативы, как иммуноген в тех же условиях можно использовать пептидный фрагмент NR 10 или последовательность природного NR 10 с искусственно внесенными мутациями. NR 10.3 человека является предпочтительным иммуногеном для получения антител по настоящему изобретению, которые имеют NR 10-нейтрализующую активность.

В данном описании вышеописанные антитела по настоящему изобретению особо не ограничены при условии, что они имеют NR 10-нейтрализующую активность. Эти антитела также включают рекомбинантные антитела, такие как химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека. Химерные антител включают в себя, например, константные области тяжелой и легкой цепей антитела человека и вариабельные области тяжелой и легкой цепей млекопитающего, не являющегося человеком, такого как мышь. Химерные антитела можно получить известными способами. Например, антитела можно получить клонированием гена антитела из гибридов, встраиванием его в соответствующий вектор и введением конструкции в хозяев (см., например, Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990). Конкретнее, кДНК вариабельных областей (V-областей) синтезируют на мРНК гибридом с использованием обратной транскриптазы. После того, как будут получены кДНК, кодирующие V-области представляющего интерес антитела, их соединяют с кДНК, кодирующими константные области (С-области) желаемого антитела человека. Полученные конструкции встраивают в экспрессионные векторы. В качестве альтернативы, кДНК, кодирующие V-области антитела, можно встроить в экспрессионные векторы, содержащие С-области антитела человека. кДНК встраивают в экспрессионные векторы таким образом, что они экспрессируются под контролем экспрессии регуляторных областей, например, энхансеров и промоторов. На следующей стадии трансформируют клетки-хозяева экспрессионными векторами, чтобы осуществить экспрессию химерных антител.

Гуманизированное антитело, которое также называют видоизмененным антителом человека, получают, замещая определяющими комплементарность областями (CDR) антитела млекопитающего, не являющегося человеком, такого как мышь, CDR антитела человека. Также известны общепринятые методики генетической рекомбинации для получения таких антител. Конкретнее, последовательность кДНК, разработанную для лигирования CDR мышиного антитела с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют ПЦР с использованием нескольких олигонуклеотидов, сконструированных таким образом, чтобы они содержали перекрывающиеся части на своих концах. Гуманизированное антитело можно получить (1) лигированием полученной ДНК с ДНК, которая кодирует константную область антитела человека; (2) включением этой конструкции в экспрессионный вектор; и (3) переносом вектора в хозяина для получения антител (см. европейскую патентную заявку № EP 239,400 и международную публикацию патентной заявки № WO 96/02576). FR антитела человека, которые лигируют через CDR, выбирают такие, где CDR образует подходящий антигенсвязывающий участок. При необходимости, аминокислоты в каркасном участке вариабельной области антитела можно заменить таким образом, чтобы CDR видоизмененного антитела человека образовывала соответствующий антигенсвязывающий участок (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Также известны способы получения антител человека. Например, желаемые антитела человека с антигенсвязывающей активностью можно получить (1) сенсибилизацией лимфоцитов человека антигенами, представляющими интерес, или клетками, экспрессирующими представляющий интерес антиген in vitro; и (2) слиянием сенсибилизированных лимфоцитов с клетками миеломы человека, такими как U266 (см. публикацию японской патентной заявки Kokoku № (JP-B) H01-59878 (проверенная экспертом, одобренная японская патентная заявка, опубликованная для подачи возражения)). В качестве альтернативы желаемое антитело человека также можно получить использованием желаемого антигена для иммунизации трансгенного животного, которое включает в себя полный репертуар генов антител человека (см. международные публикации патентных заявок №№ WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).

Кроме того, известны методики для получения антител человека пэннингом фаговой библиотеки антител человека. Например, на поверхности фагов экспрессируют вариабельные области антитела человека в виде одноцепочечного антитела (scFv) с использованием метода фагового дисплея, и отбирают фаги, которые связываются с антигеном. Анализируя гены отобранных фагов, можно определить последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антител человека, которые связывают антиген. Если последовательности ДНК scFv, которые связывают антиген, определены, то для получения антител человека можно сконструировать соответствующие экспрессионные векторы, включающие в себя эти последовательности. Такие методы хорошо известны (см., WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388).

Аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи может быть аминокислотная последовательность с заменой, делецией, дополнением и/или вставкой одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела с подтвержденной NR 10-нейтрализующей активностью при условии, что сохраняется NR 10-нейтрализующая активность. Известные специалистам в данной области способы получения аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, которое содержит замену, делецию, дополнение и/или вставку одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, включают известные способы введения мутаций в белки. Например, мутантов, функционально равных вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, специалисты в данной области могут получить введением соответствующих мутаций в аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, используя сайт-направленный мутагенез (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492) или т.п. Таким образом, вариабельные области тяжелых цепей или вариабельные области легких цепей, которые содержат мутации одной или более аминокислот в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, также включены в вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи по настоящему изобретению.

При замене аминокислотного остатка предпочтительной мутацией аминокислоты является замена на другую аминокислоту (аминокислоты), которые сохраняют свойства боковой цепи аминокислоты. Примерами свойств боковых цепей аминокислот являются: гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y и V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S и T), аминокислоты, содержащие алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I и P), аминокислоты, включающие в себя боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T и Y), аминокислоты, включающие в себя боковые цепи, содержащие серу (C и M), аминокислоты, включающие в себя боковые цепи, содержащие карбоновую кислоту и амид (D, N, E и Q), аминокислоты, содержащие основные боковые цепи (R, K и H), и аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи (H, F, Y и W), (аминокислоты в круглых скобках представлены однобуквенным кодом). Аминокислотные замены внутри каждой группы называются консервативными заменами. Уже известно, что полипептид, включающий в себя модифицированную аминокислотную последовательность, в которой один или более аминокислотных остатков в данной аминокислотной последовательности удалены, добавлены и/или заменены другими аминокислотами, может сохранять исходную биологическую активность (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA; (1984) 81:5662-6; Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res. (1982) 10:6487-500; Wang, A. et al., Science (1984) 224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79:6409-13). Такие мутанты включают в себя аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 70% идентична аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи по настоящему изобретению, более предпочтительно, идентична, по меньшей мере, на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 90% и, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95%. В данном описании идентичность последовательностей определяют как процент остатков, идентичных остаткам в исходной аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, определяемый после выравнивания последовательностей и введения при необходимости соответствующих разрывов, для того чтобы максимизировать совпадение последовательностей. Идентичность аминокислотных последовательностей можно определить способом, описанным выше.

В качестве альтернативы аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, которая содержит замену, делецию, дополнение и/или вставку одной или более аминокислот в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи и сохраняет NR 10-нейтрализующую активность, можно получить из нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи. Жесткие условия гибридизации для выделения нуклеиновой кислоты, гибридизующейся при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, включают, например, условия - 6М мочевину, 0,4% SDS, 0,5× SSC и 37°C, или условия гибридизации с жесткостью, равной этому. В более жестких условиях, например, условиях 6М мочевины, 0,4% SDS, 0,1× SSC и 42°C, ожидается выделение нуклеиновой кислоты с большей гомологией. Последовательности выделенных нуклеиновых кислот можно определить известными способами, описанными ниже. Общая гомология по нуклеотидной последовательности выделенной нуклеиновой кислоты составляет, по меньшей мере, 50% или выше идентичности по последовательности, предпочтительно, 70% или выше, более предпочтительно, 90% или выше (например, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или выше).

Нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется при жестких условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, также можно выделить, используя вместо вышеописанных способов с использованием гибридизационных методик методы амплификации генов с праймерами, синтезированными на основе информации о нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Более конкретно идентичность двух нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей можно определить, используя алгоритм BLAST, созданный Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 5873-7). Программы, такие как BLASTN и BLASTX, были разработаны на основе этого алгоритма (Altschul et al., J. Mol. Biol. (1990) 215, 403-10). Для анализа нуклеотидных последовательностей согласно BLASTN, основанной на BLAST, устанавливают параметры, например, счет = 100 и длина слова = 12. С другой стороны, параметры, используемые для анализа аминокислотных последовательностей BLASTX, основанной на BLAST, включают, например, счет = 50 и длину слова = 3. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST используются параметры по умолчанию каждой программы. Для таких анализов в данной области известны особые методики (см. веб-сайт Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI), Basic Local Alignment Search Tool (BLAST); http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

В качестве альтернативы антитела по настоящему изобретению могут быть мини-телами. Такие мини-тела по настоящему изобретению включают фрагменты антител, у которых отсутствуют некоторые участки полноразмерного антитела (например, полноразмерного IgG), и которые конкретно не ограничены при условии, что они сохраняют NR 10-нейтрализующую активность. Мини-тела по настоящему изобретению конкретно не ограничены при условии, что они представляют собой участки полноразмерных антител. Мини-тела, предпочтительно, включают в себя вариабельную область тяжелой цепи (VH) или вариабельную область легкой цепи (VL). Особенно предпочтительные мини-тела включают в себя и VH, и VL.

Мини-тела по настоящему изобретению, предпочтительно, имеют меньший молекулярный вес, чем полноразмерные антитела. Однако мини-тела могут образовывать мультимеры, например, димеры, тримеры или тетрамеры, и поэтому их молекулярный вес может быть выше, чем молекулярный вес полноразмерных антител.

Мини-тела по настоящему изобретению включают, например, scFv-антитела. ScFv-антитела представляют собой одноцепочечные полипептиды, которые получают объединением вариабельной области тяжелой цепи ([VH]) и вариабельной области легкой цепи ([VL]) через линкер или аналогичным образом (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Plickthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113, eds., Resenburg and Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994)). Порядок расположения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, которые должны быть соединены вместе, конкретно не ограничен, и их можно расположить в любом порядке. Примеры расположений приведены ниже.

[VH] линкер [VL]

[VL] линкер [VH]

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи может включать в себя замену, делецию, дополнение и/или вставку. Кроме того, у вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи также могут отсутствовать некоторые участки или могут быть добавлены другие полипептиды при условии, что соединенные вместе они связывают антиген. В качестве альтернативы вариабельные области могут быть химеризованы или гуманизированы.

В настоящем изобретении линкеры, которые связывают вариабельные области антитела, включают в себя произвольные пептидные линкеры, которые можно ввести, используя методы генетической инженерии, или синтетические линкеры (например, линкеры, раскрытые в «Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996»).

Предпочтительными линкерами в настоящем изобретении являются пептидные линкеры. Длина пептидных линкеров конкретно не ограничена, и специалисты в данной области могут соответственно выбрать длину в зависимости от своей цели. Типичной является длина до 100 аминокислот, предпочтительно, от 3 до 50 аминокислот, более предпочтительно, от 5 до 30 аминокислот, и, особенно предпочтительно, от 12 до 18 аминокислот (например, 15 аминокислот).

Аминокислотные последовательности таких пептидных линкеров включают, например:

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 8)

Ser·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 9)

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 10)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 11)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 12)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 13)

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 14)

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 15)

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 10))n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 11))n

где n является целым числом от 1 или больше.

Синтетические линкеры (химические сшивающие агенты) включают сшивающие агенты, которые обычно используют для перекрестного сшивания пептидов, например, N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS³), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцинат) (EGS), этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат) (sulfo-EGS), дисукцинимидилтартарат (DST), дисульфосукцинимидилтартарат (sulfo-DST), бис[2-(сукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES), и бис[2-(сульфосукцинимидоксикарбонилокси)этил]сульфон (sulfo-BSOCOES). Эти сшивающие агенты коммерчески доступны.

Антитела по настоящему изобретению включают антитела, у которых к аминокислотной последовательности антитела по настоящему изобретению добавлены два или более аминокислотных остатка. Кроме того, в настоящее изобретение включены слитые белки, которые являются результатом слияния одного из вышеописанных антител и второго пептида или белка. Слитые белки можно получить лигированием с сохранением рамки считывания полинуклеотида, кодирующего антитело по настоящему изобретению, и полинуклеотида, кодирующего второй пептид или полипептид, встраиванием этой конструкции в экспрессионный вектор и экспрессией слитой конструкции в хозяине. Для этой цели подходят некоторые методики, известные специалистам в данной области. Добавочный пептид или полипептид для слияния с антителом по настоящему изобретению может представлять собой известный пептид, например FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6x His, состоящий из шести остатков His (гистидина), 10× His, гемагглютинин вируса гриппа (HA), фрагмент c-myc человека, фрагмент VSV-GP, фрагмент p18HIV, T7-таг, HSV-таг, E-таг, фрагмент T-антигена SV40, lck-таг, фрагмент α-тубулина, B-таг, фрагмент белка С. Другие добавочные полипептиды для слияния с антителами по настоящему изобретению включают, например, GST (глутатион-S-трансферазу), HA (гемагглютинин вируса гриппа), константную область иммуноглобулина, β-галактозидазу и MBP (мальтоза-связывающий белок). Полинуклеотид, кодирующий один из этих коммерчески доступных пептидов или полипептидов, можно слить с полинуклеотидом, кодирующим антитело по настоящему изобретению. Слитый полипептид можно получить экспрессией слитой конструкции.

Антитела по настоящему изобретению могут отличаться по аминокислотной последовательности, молекулярному весу, изоэлектрической точке, наличию/отсутствию цепей сахаров и конформации в зависимости от клетки или хозяина, продуцирующего антитело, или способа очистки. Однако полученное антитело включают в настоящее изобретение при условии, что его функции совпадают с функциями антитела по настоящему изобретению. Например, когда антитело по настоящему изобретению экспрессируется в прокариотических клетках, например в E. coli, к N-концу исходной аминокислотной последовательности антитела присоединен остаток метионина. Такие антитела включены в настоящее изобретение.

Антитело по настоящему изобретению можно получить способами, известными специалистам в данной области. Антитело можно получить, например, с помощью рекомбинантных методик, известных специалистам в данной области, на основе последовательности антитела, распознающего NR 10. Более конкретно, такое антитело можно получить созданием конструкции кодирующего антитело полинуклеотида на основе последовательности антитела, которое распознает NR 10, встраиванием конструкции в экспрессионный вектор и затем экспрессией его в соответствующих клетках-хозяевах (см., например, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Векторы включают векторы M13, векторы pUC, pBR322, pBluescript и pCR-Script. В качестве альтернативы, если целью является субклонирование и вырезание кДНК, то в дополнение к вышеописанным векторам векторы включают, например, pGEM-T, pDIRECT и pT7. При использовании векторов для получения антител по настоящему изобретению особенно подходят экспрессионные векторы. Например, если целью является экспрессия в клетках E. coli, таких как JM109, DH5α, HB101 и XL1-Blue, то экспрессионные векторы имеют не только описанные выше свойства, которые разрешают амплификацию вектора в E. coli, но также должны нести промотор, который обеспечивает эффективную экспрессию в E. coli, например, lacZ-промотор (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB-промотор (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), T7-промотор или т.п. Такие векторы в дополнение к описанным выше векторам включают pGEX-5X-1 (Pharmacia), векторы из «QIAexpress system» (Quiagen), pEGFP или pET (в этом случае предпочтительно, чтобы клетками-хозяевами являлись клетки BL21, которые экспрессируют РНК-полимеразу фага Т7).

Векторы могут содержать сигнальные последовательности секреции антител. В качестве сигнальной последовательности секреции антител, можно использовать сигнальную последовательность pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379), при наличии которой белок секретируется в периплазму E. coli. Вектор можно ввести в клетки-хозяева, например, трансформацией с использованием хлорида кальция или электропорацией.

В дополнение к векторам для E. coli, векторы для получения антител по настоящему изобретению включают, например, векторы для экспрессии в клетках млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17), p5322), pEF и pCDM8), векторы для экспрессии в клетках насекомых (например, векторы бакуловирусной системы экспрессии «Bac-to-BAC baculovirus expression system» (Gibco-BRL) и pBacPAK8), векторы для экспрессии в растительных клетках (например, pMH1 и pMH2), экспрессионные векторы на основе вирусов животных (например, pHSV, pMV и pAdexLcw), ретровирусные экспрессионные векторы (например, pZIPneo), векторы для экспрессии в дрожжах (например, векторы из набора для экспрессии в дрожжах «Pichia Expression Kit» (Invitrogen), pNV11 и SP-Q01) и векторы для экспрессии в Bacillus subtilis (например, pPL608 и pKTH50).

Если целью является экспрессия в клетках животных, таких как клетки CHO, COS и NIH3T3, векторы должны иметь промотор, необходимый для экспрессии в этих клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), промотор MMLV-LTR, промотор EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) и CMV-промотор, и, более предпочтительно, чтобы эти векторы имели ген для селекции трансформированных клеток (например, ген устойчивости к лекарственному средству, который позволяет определить трансформированные клетки, используя селективный агент (неомицин, G418 или т.п.). Векторы с такими характеристиками включают, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

В дополнение, можно использовать следующий способ для стабильной экспрессии генов и амплификации генов в клетках: в клетки СНО, у которых нарушен один из путей биосинтеза нуклеиновых кислот, встраивают вектор (например, pSV2-dhfr (Molecular Cloning 2^nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)), который несет ген DHFR, компенсирующий этот недостаток, и вектор амплифицируют в присутствии метотрексата (MTX). В качестве альтернативы, для транзиентной экспрессии генов можно использовать следующий способ: клетки COS, несущие на своей хромосоме ген, экспрессирующий Т-антиген SV40, трансформируют вектором (pcD или аналогичным вектором) с точкой начала репликации SV40. Также можно использовать точки начала репликации вируса полиомы, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) и т.п. Для амплификации гена в клетках-хозяевах экспрессионные векторы могут, кроме этого, нести селективные маркеры, такие как ген аминогликозид-трансферазы (APH), ген тимидин-киназы (ТК), ген ксантин-гуанин фосфорибозил-трансферазы E. Coli (Ecogpt) и ген дегидрофолат-редуктазы (dhfr).

Желаемые антитела, полученные описанными выше способами, можно выделить из клеток или из клеточного окружения (среды или аналогичного носителя) и очистить до гомогенного состояния. Антитела можно выделить и очистить способами, обычно используемыми для выделения и очистки антител, причем тип способа не ограничен. Например, антитела можно выделить и очистить, соответственно подбирая и совмещая методы колоночной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, обессоливания, осаждения растворителем, экстракции растворителем, перегонки, иммунопреципитации, электрофореза в SDS-полиакриламидном геле, изоэлектрофокусирования, диализа, перекристаллизации и т.п.

Хроматографические методы включают, например, аффинную хроматографию, ион-обменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, обращенно-фазовую хроматографию и абсорбционную хроматографию (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Описанные выше хроматографические методы можно провести, используя жидкостную хроматографию, например HPLC и FPLC. Колонки, которые можно использовать для аффинной хроматографии, включают колонки с белком А и колонки с белком G. Колонки с белком А включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose FF (GE Amersham Biosciences). Настоящее изобретение включает в себя антитела, высокоочищенные с использованием этих способов очистки.

Настоящее изобретение также связано с агентами для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, которые содержат в качестве активных ингредиентов фрагменты и/или продукты модификации антитела по настоящему изобретению. Фрагменты и/или продукты модификации антител по настоящему изобретению включают фрагменты антитела, у которых отсутствуют некоторые участки антител по настоящему изобретению (полноразмерные антитела (например, полноразмерных IgG), рекомбинантные антитела (например, химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека) и мини-тела (например, scFv-антитела)), которые конкретно не ограничены при условии, что они сохраняют способность связывать свои антигены. Фрагменты антител по настоящему изобретению конкретно не ограничены при условии, что они являются участками полноразмерных антител. Фрагменты предпочтительно содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или вариабельную область легкой цепи (VL). Аминокислотная последовательность VH или VL может включать в себя замены, делеции, дополнения и/или вставки. У VH и/или VL могут отсутствовать некоторые участки при условии, что они сохраняют способность связывать антиген. Кроме того, вариабельная область может быть химеризована или гуманизирована. Более конкретно, фрагменты антител включают, например, Fab, Fab', F(ab')2 и Fv. Такие фрагменты антител можно получить созданием конструкций генов, кодирующих фрагменты антител, встраиванием их в экспрессионные векторы и затем экспрессией их в соответствующих клетках-хозяевах (см., например, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут быть конъюгированными антителами, к которым присоединены любая из ряда молекул, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), радиоактивные вещества, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, ферменты и токсины. Такие конъюгированные антитела можно получить химической модификацией полученных антител. Способы модификации антител широко известны в данной области (примерами являются US 5057313 и US 5156840). «Антитела» по настоящему изобретению также включают такие конъюгированные антитела.

Активность связывания антитела с NR 10 можно определить способами, известными специалистам в данной области. Способы определения антигенсвязывающей активности антитела включают, например, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), EIA (иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммунный анализ) и иммунофлуоресцентный анализ. Например, при использовании иммуноферментного анализа содержащие антитела образцы, такие как очищенные антитела и культуральные супернатанты антителообразующих клеток, добавляют к планшетам, покрытым антигеном. Добавляют вторичное антитело, меченное ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и инкубируют планшеты. После промывания, добавляют субстрат фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и измеряют поглощение, чтобы оценить антигенсвязывающую активность.

Кроме того, можно определить NR 10-нейтрализующую активность, например, способом, описанным в примерах, который включает в себя исследование эффекта подавления роста IL-31-зависимой клеточной линии.

Антагонисты NR 10 или антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность по настоящему изобретению, можно использовать в агентах для профилактики или лечения воспалительных заболеваний. Авторы настоящего изобретения доказали, что введение антител, нейтрализующих мышиный NR 10, дает заметный терапевтический эффект при различных воспалительных заболеваниях у модельных животных. Кроме того, было опубликовано, что в утолщенном эпидермисе пациентов с атопическим дерматитом усилена экспрессия NR 10 человека (непатентный документ 1). С помощью иммуногистохимического окрашивания авторы настоящего изобретения подтвердили, что как и у людей, экспрессия мышиного NR 10 усилена в утолщенном эпидермисе ушной раковины мышей-моделей хронического дерматита, описанных выше (пример 5). Эти данные позволяют предположить, что NR 10 вовлечен аналогичным образом в воспалительные заболевания животных всех видов, и что, подобно антителам, нейтрализующим мышиный NR 10, антитела, нейтрализующие NR 10 человека, эффективны для профилактики и лечения различных воспалительных заболеваний. Кроме того, как и в случае данных, описанных в этом примере, также ожидают, что, кроме антител, другие антагонисты NR 10 обладают терапевтическим эффектом в отношении различных воспалительных заболеваний.

В настоящем изобретении воспалительное заболевание относится к заболеваниям с патологическими признаками, вовлеченными в цитологические и гистологические реакции, которые происходят в пораженных кровеносных сосудах и прилегающих тканях в ответ на ранение или анормальную стимуляцию, вызванную физическими, химическими или биологическими агентами (Stedman's Medical Dictionary, 5th Ed., MEDICAL VIEW CO., 2005). Обычно воспалительные болезни включают дерматит (атопический дерматит, хронический дерматит и т.п.), воспалительные заболевания кишечника (колит и т.п.), астму, артрит (ревматоидный артрит, остеоартрит и т.п.), бронхит, Th2-аутоиммунные заболевания, системную красную волчанку, злокачественную миастению, хроническую GVHD (трансплантат против хозяина), болезнь Крона, деформирующий спондилит, боль в пояснице, подагру, воспаление после хирургического вмешательства или ранения, опухание, невралгию, ларингофарингит, цистит, гепатит (неалкогольный стеатогепатит, алкогольный гепатит и т.п.), гепатит В, гепатит С и атеросклероз.

Предпочтительные примеры воспалительных заболеваний, которые являются объектами настоящего изобретения, включают атопический дерматит, хронический дерматит, ревматизм, остеоартрит и хроническую астму.

Авторы изобретения обнаружили, что антитела-антагонисты NR 10 обладают терапевтическим эффектом в отношении атопического дерматита, хронического дерматита, ревматизма и остеоартрита. С другой стороны, было выявлено, что антитела-антагонисты NR 10 не оказывают воздействия на модели острого контактного дерматита и острого DSS-колита.

Агенты для профилактики или лечения воспалительных заболеваний по настоящему изобретению содержат в качестве активного ингредиента антагонист NR 10 или антитело, имеющее NR 10-нейтрализующую активность, описанную выше. Фраза «содержит антагонист NR 10 в качестве активного ингредиента» означает содержание антагониста NR 10 в качестве, по меньшей мере, одного из активных ингредиентов и не ограничивает состав. В дополнение агенты для профилактики или лечения воспалительных заболеваний по настоящему изобретению также могут содержать, в комбинации с антагонистом NR 10, другие ингредиенты, которые способствуют профилактике или лечению воспалительных заболеваний.

Рецептуры с антагонистом NR 10 по настоящему изобретению можно составить стандартными способами (см., например, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA). Кроме того, при необходимости они могут содержать фармацевтически приемлемые носители и/или добавки. Например, они могут содержать поверхностно-активные вещества (например, ПЭГ ил Tween), наполнители, антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту), красители, вкусоароматические агенты, консерванты, стабилизаторы, буферные агенты (например, фосфорную кислоту, лимонную кислоту и другие органические кислоты), хелатирующие агенты (например, EDTA), суспендирующие агенты, изотонические агенты, связывающие вещества, разрыхлители, смазывающие агенты, усилители текучести и корригенты. Однако носители, которые могут содержаться в агентах для профилактики или лечения воспалительных заболеваний по настоящему изобретению, не ограничены этим списком. В действительности, соответственно могут содержаться другие обычно используемые носители, такие как безводная кремниевая кислота, лактоза, кристаллическая целлюлоза, маннит, крахмал, кальция кармеллоза, натрия кармеллоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилацетальдиэтиламиноацетат, поливинилпирролидон, желатин, триглицериды жирных кислот средней длины, полиэтоксилированное гидрированное касторовое масло 60, сахароза, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, неорганическая соль и т.д. Композиции могут также содержать другие низкомолекулярные полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулин, и аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин. Когда композицию приготавливают в виде водного раствора для инъекций, антагонисты NR 10 можно растворить в изотоническом растворе, включающем в себя, например, физиологический раствор, декстрозу и другие вспомогательные вещества. Вспомогательные вещества могут включать, например, D-сорбит, D-маннозу, D-маннит и хлорид натрия. В дополнение, параллельно можно использовать подходящие солюбилизирующие агенты, например, спирты (например, этанол), полиспирты (например, пропиленгликоли и ПЭГ) и неионные детергенты (полисорбат 80 и HCO-50).

При необходимости антагонисты NR 10 можно заключить в микрокапсулы (микрокапсулы, изготовленные из гидроксицеллюлозы, желатина, полиметилметакрилата и т.п.) и превратить в компоненты систем доставки коллоидных лекарственных средств (липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) (например, см. “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition” &, Oslo Ed. (1980)). Более того, известны способы изготовления лекарственных средств с замедленным высвобождением, и их можно применять для антагонистов NR 10 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12, 98-105; патент США № 3,773,919; европейская патентная заявка (EP) № 58,481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22, 547-56; EP 133,988).

Агенты для профилактики или лечения воспалительных заболеваний по настоящему изобретению можно вводить или перорально, или парентерально, но предпочтительным путем введения является парентеральный. Более конкретно, агенты вводят пациентам инъекцией или подкожным введением. Инъекции включают, например, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции и подкожные инъекции, для системного или местного введения. Агенты можно вводить в участки, где должно быть подавлено воспаление, или в окружающие участки области с помощью локальной инфузии, в частности, внутримышечной инъекции. Способы введения должны выбираться в соответствии с возрастом и состоянием пациента. Дозу для однократного введения можно выбрать, например, в пределах от 0,0001 до 100 мг активного ингредиента на кг веса тела. В качестве альтернативы при введении агентов человеку дозу активного ингредиента можно выбрать в пределах от 0,001 до 1000 мг/кг веса тела. Доза для однократного введения предпочтительно содержит, например, антагонист NR 10 в количестве от примерно 0,01 до 50 мг/кг веса тела. Однако эти примеры не ограничивают дозу агента для профилактики или лечения воспалительных заболеваний по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится к антителам, имеющим NR 10-нейтрализующую активность (включая фрагменты антител, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, и/или продукты их модификации; такое же определение используется в описании ниже). Антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность по настоящему изобретению, пригодны в качестве активных ингредиентов в вышеописанных агентах для профилактики или лечения воспалительных заболеваний. Антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность по настоящему изобретению, могут быть поликлональными или моноклональными антителами, но предпочтительно являются моноклональными антителами. Такие моноклональные антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, можно получить способами, описанными выше. Моноклональные антитела по настоящему изобретению имеют активность, нейтрализующую NR 10 млекопитающих или их фрагменты, предпочтительно, нейтрализующую NR 10 человека или мыши или их фрагменты, и, более предпочтительно, нейтрализующую NR 10 человека или его фрагменты. NR 10 человека или его пептидный фрагмент можно использовать в качестве иммуногена для получения моноклональных антител, нейтрализующих NR 10 человека. В качестве альтернативы, антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 по настоящему изобретению, могут быть рекомбинантными антителами. Рекомбинантные антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность по настоящему изобретению, включают, но не ограничены этим, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека и мини-тела.

В настоящем изобретении антитела, имеющие NR 10-нейтрализующую активность, включают, например, антимышиный NR 10 антитела, которые включают в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 3.

Настоящее изобретение также включает моноклональные антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека. Моноклональные антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека по настоящему изобретению, можно получить, получая моноклональные антитела с использованием NR 10 человека или его пептидного фрагмента в качестве иммуногена и затем отбирая из моноклональных антител против NR 10 человека антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека, на основе вышеописанной аналитической системы с использованием IL-31-зависимой клеточной линии.

В настоящем изобретении антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека, включают антитела, описанные в любом из пунктов:

(а) антитела, имеющие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, которые состоят из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 18, 19 и 20, соответственно;

(b) антитела, имеющие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, которые состоят из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 21, 22 и 23, соответственно;

(c) антитела, имеющие вариабельную область тяжелой цепи по п. (а) и вариабельную область тяжелой цепи по п. (b); и

(d) антитела, которые узнают такой же эпитоп, как эпитоп, узнаваемый антителами по любому одному из пп. (а)-(c).

Узнает ли антитело такой же эпитоп, что и другое антитело, можно подтвердить конкуренцией между двумя антителами за этот эпитоп. Конкуренцию между антителами можно оценить методами конкурентного связывания с использованием методик, таких как ELISA, метод резонансной передачи энергии флуоресценции (FRET) и методика анализа флуориметрии в микрообъеме (FMAT(R)). Количество связанных с антигеном антител косвенно коррелирует с связывающей способностью испытуемых конкурентных антител (тестируемых антител), которые конкурентно связывают такой же эпитоп. Другими словами, если количество или аффинность тестируемых антител против того же эпитопа увеличивается, то количество связанных с антигеном антител уменьшается, а количество тестируемых антител, связанных с эпитопом, увеличивается. Более конкретно, соответственно меченые антитела и антитела, оценку которых нужно провести, одновременно добавляют к антигену, и, таким образом, детектируют связанные антитела, используя метку. Количество связанных с антигеном антител легко определить, заблаговременно вводя метку в антитела. Такая метка конкретно не ограничена, а способ мечения выбирают, исходя из используемой методики анализа. Способ мечения включает флуоресцентное мечение, радиоактивное мечение, энзиматическое мечение и т.п.

Например, антитела, меченные флуоресцентной меткой, и немеченые антитела или тестируемые антитела одновременно добавляют к животным клеткам, экспрессирующим NR 10, и проводят детекцию меченых антител методом флуориметрии в микрообъеме.

IC₅₀ представляет собой концентрацию, при которой количество связанных с эпитопом меченных антител понижается до 50% в результате связывания немеченых антител. В настоящем описанииантитела, которые узнают тот же эпитоп, являются антителами, которые могут снизить количество меченных антител, связанных с эпитопом, по меньшей мере, до 50%, когда концентрация тестируемых антител в 10 раз выше, чем IC₅₀ немеченых антител.

Антитела, имеющие активность, нейтрализующую NR 10 человека, которые используют в настоящем изобретении, предпочтительно, далее связывают NR 10 яванского макака, и, более предпочтительно, нейтрализуют NR 10 яванского макака. NR 10 яванского макака, содержащий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 24, можно использовать при измерении нейтрализующей активности или связывания с NR 10 яванского макака.

Настоящее изобретение также относится к способам терапии, описанными ниже. Интерпретация NR 10, антагонистов, моноклональных антител, рекомбинантных антител, воспалительных заболеваний и другого в способах такая же, как описано выше.

(1) способ профилактики или лечения воспалительного заболевания, который включает в себя стадию введения антагониста NR 10 пациенту с воспалительным заболеванием;

(2) способ по п. (1), в котором антагонист NR 10 является антителом, имеющим NR 10-связывающую активность;

(3) способ по п. (2), в котором антитело является моноклональным антителом;

(4) способ по п. (2), в котором антитело является моноклональным антителом, которое связывает NR 10 человека;

(5) способ по любому одному из пп. (2)-(4), в котором антитело является рекомбинантным антителом;

(6) способ по п. (5), в котором рекомбинантное антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом человека;

(7) способ по любому одному из пп. (2)-(6), в котором фрагмент антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, и/или продукт его модификации включены в качестве активного ингредиента;

(8) способ по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является атопическим дерматитом;

(9) способ по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является хроническим дерматитом;

(10) способ по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является ревматизмом; и

(11) способ по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является остеоартритом.

Настоящее изобретение также относится к открытиям, описанным ниже. Толкование NR 10, антагонистов, моноклональных антител, рекомбинантных антител, воспалительных заболеваний и другого в способах такое же, как описано выше.

(1) применение антагониста NR 10 для получения агента для профилактики или лечения воспалительного заболевания;

(2) применение по п. (1), в котором антагонист NR 10 является антителом, связывающим NR 10;

(3) применение по п. (2), в котором антитело является моноклональным антителом;

(4) применение по п. (2), в котором антитело является моноклональным антителом, которое связывает NR 10 человека;

(5) применение по любому одному из пп. (2)-(4), в котором антитело является рекомбинантным антителом;

(6) применение по п. (5), в котором рекомбинантное антитело является химерным антителом, гуманизированным антителом или антителом человека;

(7) применение по любому одному из пп. (2)-(6), в котором фрагмент антитела, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, и/или продукт его модификации включены в качестве активного ингредиента;

(8) применение по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является атопическим дерматитом;

(9) применение по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является хроническим дерматитом;

(10) применение по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является ревматизмом; и

(11) применение по любому одному из пп. (1)-(7), в котором воспалительное заболевание является остеоартритом.

Все документы предшествующего уровня техники включены в это описание посредством ссылки.

Примеры

Ниже в этом описании настоящее изобретение будет более конкретно описано на примерах, но их не следует истолковывать, как ограничивающие настоящее изобретение.

[Пример 1] Создание клеточной линии Ba/F3, экспрессирующей NR 10 и OSMR

кДНК NR 10 человека (SEQ ID NO: 1 из WO 0075314) встраивали в экспрессионный вектор pCOS1 (Biochem Biophys Res Commun. 228, p838-45, 1996), чтобы получить pCosNR 10.3. кДНК рецептора онкостатина М (OSMR, номер доступа в базе данных GenBank - NM003999) получали с помощью ПЦР из плацентарной библиотеки человека, и затем аналогичным образом создавали экспрессионный вектор pCos1-hOSMR. 10 мкг каждого из векторов одновременно вводили электропорацией в клетки линии Ba/F3, полученной из мышиных IL-3-зависимых про-В-клеток (BioRad Gene Pulser; 960 мкФ и 0,33 кВ). После введения ДНК добавляли IL-31 человека, и культивировали клетки. Таким образом, получали клеточную линию, пролиферация которой зависит от IL-31. Аналогичным образом из клеток Ba/F3 получали клеточную линию, зависимую от мышиного IL-31, созданную для экспрессии мышиных генов NR 10 и OSMR.

Для обеих клеточных линий найденная величина ED50 составляла несколько нг/мл. Таким образом, были получены хорошо пролиферирующие линии. Зависимая от IL-31 человека клеточная линия не отвечала на мышиный IL-31, а добавление белка NR 10 человека (внеклеточного домена) подавляло роста. Зависимая от IL-31 мыши клеточная линия не отвечала на IL-31 человека, а добавление белка NR 10 мыши (внеклеточного домена) не подавляло роста.

[Пример 2] Получение белка NR 10 (внеклеточного домена)

Одиночный внеклеточный домен амплифицировали с помощью ПЦР на кДНК NR 10 в качестве матрицы, присоединяли последовательность FLAG-тага к С-концу и встраивали полученную конструкцию в экспрессионный вектор pCXND3 (WO 2005/005636) (pCXND3-NR 10-flag). 10 мг этого линеаризованного вектора вводили электропорацией в клетки линии яичников китайского хомячка DG44 (BioRad Gene PulserII; 25 мкФ и 1,5 кВ). Получали клеточную линию с высоким уровнем экспрессии. Получали очищенный образец из супернатанта масштабированной культуры клеточной линии на колонке с анти-FLAG антителом (SIGMA) и гель-фильтрацией, и использовали в экспериментах, описанных ниже. Аналогичным образом получали мышиный NR 10 (внеклеточный домен) с последовательностью FLAG-тага, присоединенной на С-конце.

[Пример 3] Выделение scFv, имеющего нейтрализующую активность против NR 10 мыши, и получение BM095 в виде химеризованного IgG

Более конкретно, авторы изобретения попытались сузить количество подходящих клонов из фаговой библиотеки антител человека пэннингом с использованием биотинилированного мышиного белка NR 10 (внеклеточного домена). Секретируемые scFv очищали из клонов и добавляли к системе анализа роста клеток с IL-31-зависимыми клетками Ba/F3, описанными в примере 1. В результате был успешно получен клон BM095, который сильно подавлял рост клеток.

Для того чтобы сконструировать экспрессионный вектор, использовали ПЦР для соединения последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH) человека из BM095 с константной областью (после СН1) мышиного IgG2a, а последовательности вариабельной области легкой цепи (VL) человека из BM095 с константной областью λ-цепи мыши. Аминокислотная последовательность VH показана в SEQ ID NO: 1, а нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показана в SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность VL показана в SEQ ID NO: 3, а нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность, показана в SEQ ID NO: 4. Соответствующие линеаризованные экспрессионные векторы вводили одновременно в клеточную линию DG44, и затем отбирали клеточную линию, экспрессирующую высокий уровень химеризованного IgG. Очищенный образец получали из супернатанта масштабированной культуры клеточной линии хроматографией на колонке с белком А (rProtein A Sepharose Fast Flow, GE Amersham Biosciences) и на катион-обменной колонке (SP-TOYOPEARL 650M, TOSOH). Кроме того, на смоле ActiClean Etox (Sterogen) удаляли пирогены до понижения концентрации ниже предела обнаружения. Образец использовали в описанных ниже экспериментах на животных. Результат, полученный добавлением BM095 к описанной выше системе анализа, показан на фиг.1.

[Пример 4] Оценка эффективности лекарственного средства на модели атопического дерматита с использованием мышей NC/Nga

Модель дерматита получали многократным нанесением пикрилхлорида (PiCl) с недельными интервалами. Более конкретно, через 4 дня после сенсибилизации 5% раствором PiCl (150 мкл) области брюшины и подушечки лапы, индуцировали дерматит многократным нанесением 0,8% раствора PiCl (150 мкл) на спину и ушную раковину с недельными интервалами. За возникающими при этом симптомами наблюдали дважды в неделю за период времени с третьей по шестую неделю, и независимо оценивали пять параметров по шкале от 0 до 3 ((1) - зуд, (2) - покраснение и кровотечение, (3) - отек, (4) - рана и повреждение тканей и (5) - струп и сухость). Антитело вводили в количестве 10 мг/кг в перитонеальную полость за день перед сенсибилизацией и каждой индукцией, всего 6 раз (группа BM095), или за день перед каждой индукцией после третьей недели, всего три раза (группа V/B). В качестве положительного контроля мышам перорально вводили дексаметазон в количестве 1 мг/кг каждый день после третьей недели (группа DEX). В каждой группе было по 10 самцов мышей NC/Nga.

Как показано на фиг.2, значительный подавляющий эффект наблюдали в группе, которой вводили антитела, по сравнению с группой, которой вводили растворитель (носитель). В дополнение, как видно из фиг.2, в то время как в DEX-группе отмечалась значительная потеря веса, у группы, которой вводили антитела, не было потери веса. Это позволяет предположить, что антитело является весьма безопасным агентом.

[Пример 5] Оценка эффективности лекарственного средства с использованием модели хронического дерматита, созданной многократным нанесением пикрилхлорида

Проводили сенсибилизацию шестинедельных самок мышей BALB/c, нанося на правое ухо 20 мкл 0,5% раствор пикрилхлорида (в смеси ацетона с оливковым маслом (объемное соотношение 1:4)). Индукцию проводили многократным нанесением на правое ухо 20 мкл 0,25% раствора пикрилхлорида (в смеси ацетона с оливковым маслом (объемное соотношение 1:4)) через день, начиная с восьмого дня после сенсибилизации. BM095 в количестве 10 мг/кг вводили в перитонеальную полость один раз в неделю, начиная с дня перед сенсибилизацией в группе для оценки профилактического эффекта BM095, или начиная с 20-го дня после начала индукции в группе для оценки терапевтического эффекта BM095. Опухание ушной раковины оценивали последовательным измерением толщины правого уха с использованием толщинометра с циферблатным индикатором.

В результате, как видно из фиг.4, значительный подавляющий эффект наблюдали в группе, которой вводили антитела. Было опубликовано, что экспрессия NR 10 человека повышена в утолщенном эпидермисе пациентов с атопическим дерматитом (непатентный документ 1). Для вышеописанной модели хронического дерматита проводили иммуногистохимическое окрашивание ушной раковины. Как и у людей, в утолщенном эпидермисе наблюдали повышение экспрессии мышиного NR 10 (фиг.5; ВМ095, константная область которого заменена на константную область IgG человека, получали в примере 3 и использовали в иммуногистохимическом окрашивании. Участки, окрашенные коричневым, являются местами экспрессии NR 10). Эти данные позволяют предположить, что NR 10 аналогичным образом вовлечен в воспалительные заболевания и у мышей, и у человека.

[Пример 6] Оценка эффективности лекарственного средства с использованием модели артрита (ревматизма), вызванного коллагеном

Получение модельных мышей и оценку эффективности лекарственного средства проводили по методике, описанной ниже.

140 мкл коллагенового геля, который получали смешиванием равного количества полного адъюванта H37Ra и 0,3% раствора коллагена типа II, полученного из бычьих суставов, вводили внутрикожно в основание хвоста 9-недельных самок мышей DBA/1JN (День 0; сенсибилизация). После трех недель полученный по такой же методике коллагеновый гель вводили внутрикожно в спину, для того чтобы индуцировать начало артрита (День 21; индукция). За два дня перед сенсибилизацией (День -2) 16 мышей разделяли на две группы по весу тела, каждая из которых включала 8 мышей, для того чтобы сформировать группу, которой вводят среду, и группу, которой вводят BM095. Используя в качестве среды ацетатный буфер с концентрацией 20 ммоль/л (рН 5,5) (200 ммоль/л NaCl), разведенный в 6 раз PBS, тестируемое вещество BM095 вводили внутривенно 8 мышам из группы, которой вводят BM095, в количестве 10 мг/кг веса тела за день перед сенсибилизацией (День -1). Тем временем в качестве контроля в день -1 вводили такой же объем среды на единицу веса тела 8 мышам в группе, которой вводят среду. Наблюдали за опуханием четырех конечностей и выставляли оценку (по шкале от 0 до 4 для каждой конечности: общая оценка 16), начиная с дня перед индукцией (День 20) через интервалы от 2 до 3 дней.

В результате было найдено, что оценка припухлости на четырех конечностях снизилась после 20-го дня в группе, которой вводили BM095, как видно на фиг.6. Это позволяет предположить, что BM095 подавляет начало артрита.

[Пример 7] Оценка эффективности лекарственного средства с использованием модели артрита (остеоартрита), вызванного коллагеназой

Получение модельных мышей и оценку эффективности лекарственного средства проводили по методике, описанной ниже.

Контрольную среду (20 ммоль/л ацетатный буфер (рН 5,5), разведенный в 6 раз PBS, 200 ммоль/л NaCl (n=5)), BM095 в количестве 2 мг/кг (n=5) и 20 мг/кг (n=6) вводили внутривенно (5 мл/кг) в хвостовую вену 8-недельных самцов мышей C57BL/6J Jcl (CLEA Japan Inc.). Затем под ингаляционной анестезией 3% изофлюраном (Am J Pathol 1989; 135(6):1001-14) мышам в полость правого коленного сустава вводили 6 мкл 1,5% раствора коллагеназы (тип II; Sigma), профильтрованной через 0,45 мкм фильтр (MILLIPORE).

Толщину правого и левого коленного суставов определяли штангенциркулем (Mitsutoyo CO.) непосредственно перед введением коллагеназы и на 3, 7 и 14 день после введения, для того чтобы вычислить разницу между правым и левым суставами. Разницу считали репрезентативной величиной опухоли правого коленного сустава. Для изменения этой разницы площадь под кривой (AUC) определяли на основе правила трапеции и считали индикатором эффективности лекарственного средства. Тест Стьюдента проводили для AUC контрольной группы (среда) и группы, которой вводили BM095, с использованием программного обеспечения для статистического анализа (SAS Institute Inc.) (разница считалась статистически значимой при p<0,05). В результате у группы, которой вводили BM095, AUC была значительно меньше при любой дозировке, чем у контрольной группы (среда), как видно на фиг.7. Этот результат демонстрирует, что BM095 подавляет артрит в модели остеоартрита.

[Пример 8] Получение нейтрализующего антитела против NR 10 человека

Мышей иммунизировали белком NR 10 человека (внеклеточным доменом) {описанным в примере 2}, и получали гибридомы общепринятыми способами. Проводили анализ культуральных супернатантов гибридом на наличие нейтрализующей активности с использованием зависимой от IL-31 человека клеточной линии (клетки hNR 10/hOSMR/BaF3), описанной в примере 1. Было получено много клонов, проявляющих сильную NR 10-нейтрализующую активность (фиг.8).

[Пример 9] Получение химерного антитела человека

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи NA633, которое проявляет наиболее сильную активность среди нейтрализующих антител, показана в SEQ ID NO: 16, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи показана в SEQ ID NO: 17. В дополнение, аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи NA633 показаны в SEQ ID NO: 18, 19 и 20, соответственно; и аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи показаны в SEQ ID NO: 21, 22 и 23, соответственно.

Кроме того, получали традиционным способом химерное антитело, включающее в себя вышеописанную мышиную вариабельную область и константную область человека (тяжелая цепь IgG1-типа; легкая цепь κ-типа), и определяли нейтрализующую активность. Как показано на фиг.9, химерное антитело NA633 проявляло сильную нейтрализующую активность при низких концентрациях.

[Пример 10] Выделение NR 10 яванского макака

Авторы стремились выделить ген NR 10 яванского макака, поскольку полагали, что перекрестное узнавание и нейтрализующая активность в отношении NR 10 яванского макака важны при испытаниях на безопасность на доклинической стадии. Праймеры были разработаны на основе раскрытой информации о геноме резус-макака и т.п., и успешно амплифицировали ген NR 10 из органов яванского макака с помощью ПЦР. На фиг.10 показано выравнивание аминокислотных последовательностей NR 10 человека и выделенного NR 10 яванского макака. Аминокислотная последовательность NR 10 яванского макака показана в SEQ ID NO: 24. В результате введения гена NR 10 яванского макака вместе с геном OSMR в клетки Ba/F3, как описано в примере 1, была создана клеточная линия, пролиферация которой зависит от IL-31 человека. Нейтрализующую активность химерного антитела NA633, описанного в примере 9, тестировали с использованием этой клеточной линии. Результат продемонстрировал, что антитело также проявляет сильную нейтрализующую активность у яванского макака (фиг.11).

[Контрольный пример 1] Эффективность лекарственного средства BM095 при вызванном декстрансульфатом натрия (DSS) колите

Для оценки эффекта BM095 (нейтрализующего антитела против NR 10 мыши) получали модель колита, вызванного DSS (J Immunol (2003) 171:5507-5513), опубликованную как патологическую модель воспалительного заболевания кишечника (IBD). Приготавливали 5% (вес/объем) раствор натриевой соли декстрансульфата (Wako Pure Chemical Industries) в воде, стерилизованной фильтрацией через 0,22 мкм фильтр (Millipore). Шестинедельным самцам мышей Balb/cAnN Crj (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN) позволяли свободно пить раствор из поильников в течение 7 дней. Животных взвешивали, и изменение веса тела в процентах от веса в первый день приема DSS использовали в качестве показателя эффективности лекарственного средства.

В этой модели нейтрализующее антитело BM095 против NR 10 мыши вводили внутривенно в дозировке 10 мг/кг за день до приема DSS и оценивали конечную потерю веса (n=10) для того, чтобы проверить, улучшается ли патологическое состояние при нейтрализации сигнала от IL-31. В качестве контрольной группы носителя использовали группу (группу носителя; n=10), в которой за день до приема DSS внутривенно вводили носитель (смесь ацетатного буфера [20 ммоль/л ацетата натрия и 20 ммоль/л хлорида натрия] и фосфатно-солевого буфера [PBS; GIBCO], которые смешивали в объемном соотношении 1:5). Кроме того, также исследовали динамику относительного изменения веса у мышей Balb/cAnN Crj того же пола и возраста (n=1), как и у группы, которая принимала DSS, для того чтобы знать динамику относительного изменения веса у мышей в норме.

Динамика веса показана на фиг.12. Прием DSS снижал относительное изменение веса в группе, получавшей носитель. Динамика относительного измерения веса в группе, получавшей ВМ095, была аналогична динамике группы, получавшей носитель. Однако на четвертый и пятый день после приема DSS в группе ВМ095 относительное изменение веса значительно снизилось по сравнению с группой носителя. Эти результаты показывают, что введение ВМ095 не оказывало никакого терапевтического эффекта на колит этой модели.

Было опубликовано, что экспрессия IL-31RA усилена в этой модели (WO 2004/003140). Описанные выше результаты эксперимента демонстрируют, что нейтрализующие эту молекулу антитела не оказывают никакого терапевтического эффекта на колит этой модели.

[Контрольный пример 2] Эффективность лекарственного средства BM095 в модели острого контактного дерматита, вызванного пикрилхлоридом

Для оценки эффекта нейтрализующего антитела ВМ095 против NR 10 мыши создавали модель дерматита, описанную как модель острого контактного дерматита (Clin Immunol (2003) 108: 257-262). Этот дерматит является результатом отложенной реакции гиперчувствительности вследствие сенсибилизации и индукции нанесением пикрилхлорида. 50 мкл 7% раствора пикрилхлорида (nacalai tesque, Inc.; в смеси этанол:ацетон = 3:1 (объемное соотношение)) наносили на кожу брюшины для сенсибилизации 8-недельных самок мышей Balb/cAnN Crj (CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN), а через 5 дней на кожу правой ушной раковины наносили 20 мкл 1% раствора пикрилхлорида (в смеси ацетон:оливковое масло 1:4 (объемное соотношение)) для того, чтобы вызвать контактный дерматит (индукция). В качестве контроля на кожу левой ушной раковины той же мыши наносили 20 мкл носителя (ацетон:оливковое масло = 1:4 (объемное соотношение)) для того, чтобы оценить эффект носителя на толщину ушной раковины (положительная группа; n=6). Толщину левой и правой ушной раковины измеряли с использованием толщинометра с циферблатным индикатором (OZAKI MFG.) непосредственно перед индукцией и через 24, 48 и 72 часа после индукции, и изменение толщины ушной раковины относительно толщины непосредственно перед индукцией использовали в качестве показателя эффективности лекарственного средства.

Для того чтобы оценить развитие патологического состояния, в качестве контрольной группы использовали группу (отрицательную группу; n=6), которой во время сенсибилизации на кожу брюшины наносили смесь этанола с ацетоном (3:1 (объемное соотношение)) без пикрилхлорида, а через 5 дней на кожу правой ушной раковины наносили 20 мкл 1% раствора пикрилхлорида, а на кожу левой ушной раковины наносили 20 мкл носителя (смеси ацетон:оливковое масло 1:4 (объемное соотношение)).

Для того чтобы оценить эффект введения анти-NR 10 антител на патологическое состояние в модельной системе использовали группу (группу ВМ095; n=6), в которой острый контактный дерматит индуцировали таким же способом, как и в случае вышеописанной положительной группы, и затем вводили ВМ095 внутривенно в количестве 10 мг/кг за день до сенсибилизации и индукции, и группу (группу носителя; n=5), которой в то же время вводили носитель (ацетатный буфер [20 ммоль/л ацетата натрия и 20 ммоль/л хлорида натрия] и фосфатно-солевой буфер [PBS; GIBCO], которые смешивали в объемном соотношении 1:5).

На фиг.13 показано изменение толщины ушной раковины за 72 часа после индукции. Было найдено, что ушные раковины животных из положительной группы были значительно утолщены в каждой временной точке - 24, 48 и 72 часа после индукции по сравнению с отрицательной группой, что означает возникновение патологического состояния. Изменение толщины ушной раковины в группе ВМ095 было аналогичным изменению в группе носителя, и, таким образом, значительное подавление дерматита не было обнаружено.

Описанные выше результаты демонстрируют, что введение ВМ095 не оказывает никакого терапевтического эффекта на острый контактный дерматит, наблюдаемый в этой модели.

Промышленное применение

Настоящее изобретение относится к новым агентам для профилактики или лечения воспалительных заболеваний. Агенты для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, предоставленные настоящим изобретением, содержат в качестве активного ингредиента антагонист NR 10, более предпочтительно антитело, имеющее NR 10-нейтрализующую активность.

В последние годы много внимания уделяется антицитокиновой терапии на основе моноклональных антител. Однако при многих реальных патологических состояниях при блокировании единственного цитокина сложно получить терапевтический эффект вследствие активации компенсаторных биохимических путей. Более того, было трудно прогнозировать, при каком заболевании можно получить терапевтический эффект, блокируя определенный цитокин. При этих обстоятельствах авторы настоящего изобретения обнаружили, что NR 10-нейтрализующие антитела могут значительно подавлять симптомы у мышей-моделей с атопическим дерматитом, хроническим дерматитом, ревматизмом, остеоартритом или т.п.

Авторам настоящего изобретения также успешно удалось получить антитела, нейтрализующие NR 10 человека. Агенты для профилактики или лечения воспалительных заболеваний, которые содержат в качестве активного ингредиента антитела, нейтрализующие NR 10 человека, являются весьма полезными для клинического применения у людей.

1. Способ профилактики или лечения воспалительного заболевания, который включает стадии:
(a) получения антитела к NR 10, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, и отбора антитела, подавляющего рост IL-31-зависимой клеточной линии, и
(b) введения указанного антитела к NR 10, имеющего NR 10-нейтрализующую активность, пациенту с воспалительным заболеванием, где воспалительное заболевание представляет собой атопический дерматит, хронический дерматит, ревматизм или остеоартрит.

2. Способ по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело.

3. Способ по п.1, где антитело представляет собой моноклональное антитело, имеющее активность, нейтрализующую NR 10 человека.

4. Способ по п.1, где антитело представляет собой рекомбинантное антитело.

5. Способ по п.4, где рекомбинантное антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека.

6. Способ по п.1, где антитело содержит фрагмент и/или модифицированный фрагмент антитела с NR 10-нейтрализующей активностью.

7. Способ по любому из пп.1-6, где воспалительным заболеванием является атопический дерматит.

8. Способ по любому из пп.1-6, где воспалительным заболеванием является хронический дерматит.

9. Способ по любому из пп.1-6, где воспалительным заболеванием является ревматизм.

10. Способ по любому из пп.1-6, где воспалительным заболеванием является остеоартрит.