Способ получения лимфоцитов из тонкого кишечника мыши


 


Владельцы патента RU 2514653:

Мартынова Елена Владимировна (RU)

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к генной инженерии, и касается выделения жизнеспособных клеток из такого биологического материала, как стенка тонкого кишечника мыши. Получают жизнеспособные лимфоциты из стенок тонкого кишечника (lamina propria) мыши линии СВА при использовании биологического материала трех мышей. Исходный биологический материал - участок кишечника промывают фосфатно-буферным раствором и удаляют пейеровые бляшки. Измельчают его в присутствии фосфатно-солевого раствора, содержащего дитиотреитол при перемешивании при комнатной температуре. Промывают буферным раствором через нейлоновую сетку. Инкубируют материал в буферном растворе, содержащем бычий сывороточной альбумин при перемешивании в заданных условиях. Удаляют надосадочную жидкость. Промывают осадок фосфатно-солевым буфером. Инкубируют осадок биологического материала в клеточной среде RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку, HEPES и коллагеназу при перемешивании в заданных условиях, и фильтруют полученную суспензию. Отмывают суспензию от остатков коллагеназы и осаждают клетки лимфоцитов в клеточной среде RPMI-1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и HEPES с использованием центрифугирования в заданных условиях с последующим определением выхода жизнеспособных клеток с помощью камеры Горяева. Изобретение позволяет повысить выход жизнеспособных клеток из тонкого кишечника мыши. 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и конкретно касается генной инженерии, а именно выделения жизнеспособных клеток из такого биологического материала, как стенка тонкого кишечника.

Общеизвестно, что стенки кишечника вырабатывают основную массу белка типа, иммуноглобулина класса А, повышающего сопротивляемость организма, т.е. способствующего повышению иммунитета.

Клетки иммунной системы, на которые возложены ключевые функции по осуществлению приобретенного иммунитета, относятся к лимфоцитам, которые являются подтипом лейкоцитов. Большая часть лимфоцитов отвечает за специфический приобретенный иммунитет, так как могут распознавать инфекционные агенты внутри или вне клеток, в тканях или крови.

Основными типами лимфоцитов являются В-клетки и Т-клетки, которые происходят из плюрипотентных гемопоэтических стволовых клеток; у взрослого человека они образуются в костном мозге, а Т-лимфоциты дополнительно проходят часть этапов дифференцировки в тимусе. В-клетки отвечают за гуморальное звено приобретенного иммунитета, то есть вырабатывают антитела, в то время как Т-клетки представляют собой основу клеточного звена специфического иммунного ответа.

На этапе развития лимфоциты проходят отбор: остаются только значимые с точки зрения защиты организма, а также те, которые не несут угрозы собственным тканям организма. Параллельно с этим процессом лимфоциты разделяются на группы, способные выполнить ту или иную функцию защиты. Существуют разные виды лимфоцитов. В частности, по морфологическим признакам их разделяют на малые лимфоциты и большие гранулярные лимфоциты (БГЛ).

Как В-, так и Т-клетки несут на своей поверхности рецепторные молекулы, которые распознают специфические мишени. Рецепторы представляют собой как бы «зеркальный отпечаток» определенной части чужеродной молекулы, способный присоединиться к ней. При этом одна клетка может содержать рецепторы только для одного вида антигенов.

В-клетки составляют 5-15% циркулирующих лимфоцитов и характеризуются поверхностными иммуноглобулинами, встроенными в клеточную мембрану и выполняющими функцию специфического антигенного рецептора. Этот рецептор, специфичный лишь для определенного антигена, называется антителом. Антиген, связываясь с соответствующим антителом на поверхности В-клетки, индуцирует пролиферацию и дифференцировку В-клетки до плазматических клеток и клеток памяти, специфичность которых такая же, как и специфичность исходной В-клетки.

Плазматические клетки секретируют большое количество антител в виде растворимых молекул, распознающих исходный антиген. Секретируемые антитела имеют ту же специфичность, что и соответствующий B-клеточный рецептор.

Иммунологическая память - это способность иммунной системы отвечать более быстро и эффективно на антиген (патоген), с которым у организма был предварительный контакт.

Такая память обеспечивается предшествующими антигенспецифическими клонами как В-клеток, так и Т-клеток, которые функционально более активны в результате прошедшей первичной адаптации к определенному антигену.

Таким образом, тонкий кишечник является важным иммунологическим органом, в собственной пластике (lamina propria) которого содержится столько же лимфоидных клеток, сколько в селезенке. По массе иммунокомпетентных клеток кишечнику принадлежит ведущее место в иммунной системе слизистых покровов. Среди этих клеток идентифицированы Т-, В-клетки и плазматические клетки. В-лимфоциты синтезируют иммуноглобулины преимущественно класса А. Поскольку иммуноглобулин А обладает уникальными свойствами и около 90% данного белка содержится в слизистых покровах тонкого кишечника, для его изучения существует необходимость выделения лимфоидных клеток кишечника, синтезирующих данный иммуноглобулин. Вместе с этим, лимфоциты тонкого кишечника имеют ряд уникальных особенностей, изучение которых представляет интерес для фундаментальной иммунологии и медицины. Основная сложность получения лимфоцитов из lamina propria тонкого кишечника мыши состоит в том, что данные клетки имеют короткий срок жизни вне кишечника и плохо переносят различные типы обработки.

Известен способ дифференцирования Т- и В-лимфоцитов человека путем обработки их стимулятором розектообразования с эритроцитами барана или эритроцитами мыши и оценкой результатов реакции. (SU 787994, 1980 или SU787995, 1980).

Однако эти способы требуют дорогих и дефицитных реактивов для своего воспроизводства.

Известен способ получения лимфоцитов путем выделения из смеси Т- и В-лимфоцитов с помощью хроматографии на колонне с нитроном. (Векслер Х.М., Сочнев A.M., Попов О.В. Сравнительное излучение методов получения фракций лимфоцитов периферической крови, обогащенной Т- и B-лимфоклетками. В кн. «Новые иммунорегулирующие препараты и иммунологические методы». Рига, «Зинатне» 1978, с.39-44).

Недостатком данного способа является невозможность обеспечения чистоты целевого продукта, т.е. обеспечения высокого выхода Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Кроме того, все эти способы характеризуют общий уровень выделения различных лимфоцитов, но не из стенок тонкого кишечника, который обогащен лимфоидными клетками, и как указывалось выше является важным иммунологическим органом.

Из ЕР 0407092, 09.01.1991 известен способ производства лимфоцитов из тонкого кишечника слизистой эпителия млекопитающих животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, козы, свиньи, кролики, крысы и мыши, включающий; а) затирание тонкой кишки слизистой эпителия млекопитающих с образованием кашеобразного месива; б) удаление твердых веществ из месива, для отделения из тонкой кишки клеток слизистой оболочки, экстракцией; в) диализ экстракта и получение фракции.

В настоящее время существуют несколько методов получения лимфоидных клеток из стенок тонкого кишечника. В качестве биологического материала в различных источниках используются кишечная ткань человека, свиней, крыс и мышей. Но методы выделения мышиных лимфоцитов, как показал наш практический опыт, не дают, ожидаемого результата, и конечный выход клеток не совпадает с заявленным в методе.

В качестве прототипов нами в литературе были найдены следующие методики выделения кишечных лимфоцитов:

1. Lefrancois L., Lycke N. Current Protocols in Immunology. // 1996. - Unit 3.19.

2. Lyscom N., Brueto M.J. Intraepithelial, lamina propria and Peyer's patch lymphocytes of the rat small intestine: isolation and characterization in terms of immunoglobulin markers and receptors for monoclonal antibodies. // Immunology. - 1982. - Vol.45. - P.775-783.

3. Rothkötter H. J., Kirchhoff Т., Pabst R. Lymphoid and non-lymphoid cells in the epithelium and lamina propria of intestinal mucosa of pigs. // Gut. - 1998. - Vol.35. - P.1582-1589.

4. Lee Jae-Sung, Oka K. Improved isolation methods for mucosal leukocytes from small and large intestines in rats. // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2009. - Vol.73 (8). - P.1732-1740.

Для выделения лимфоцитов тонкого кишечника в указанных источниках применялись несколько основных этапов обработки биологического материала, приведенных ниже:

- извлечение тонкого кишечника, очистка от инородных масс и удаление пейеровых бляшек;

- продольное и поперечное измельчение кишечника;

- размягчение кишечных тканей с помощью различных реагентов;

- ферментативная обработка кишечных тканей (используется различные типы коллагеназы - фермента, разрушающего межтканные связи);

- непосредственное выделение клеток из собственной пластинки (lamina proprid) и устранение остатков кишечной ткани;

- получение клеточных суспензий.

Недостатками метода [1] являются добавление в основной рабочий раствор для клеток больших количеств HEPES, а также длительная обработка биологического материала этилендиаминотетрауксусной кислотой (ЭДТА). ЭДТА нарушает внешний вид кишечных лимфоцитов, ведет к их деформации и быстрой гибели. Дополнительным фактором, существенно снижающим выход живых клеток, является длительная обработка коллагеназой (от 20 до 60 минут) в высокой концентрации (от 100 до 500 U/мл) при +37°С и механическом перемешивании. После часовой обработки кишечника в указанных условиях, фактически вся структура кишечной ткани разрушается, клетки выделяются в раствор, но процент живых при этом критически низкий (не более 20% живых). Таким образом, для этого метода необходимо дополнительное разделение живых и мертвых клеток в градиенте плотностей (Percoll) и использование большого количества биологического материала, что удлиняет время всего выделения лимфоцитов.

Недостаток метода, описанного в источнике [2], является применение в качестве рабочего буфера для клеток цитратного буфера. Лимфоидные клетки тонкого кишечника плохо переносят данный буфер и гибнут в процессе выделения.

Авторы источника [3] использовали в качестве биологического материала - кишечники свиней, поэтому время ферментативной обработки кишечника было не менее 12 часов, что невозможно при использовании мышиного материала. К тому же использование в процессе обработки кишечника ЭДТА, как описано выше, не позволяет получить жизнеспособные клетки из кишечника мыши.

К недостаткам метода из источника [4] можно отнести использование высокой концентрации коллагеназы, которую могут переносить крысиные кишечные лимфоциты, в отличие от мышиных клеток, а также применение ЭДТА в процессе обработки кишечника.

Данные способы получения подходят для выделения лимфоидных клеток крыс и свиней, тогда как мышиные клетки не выдерживают подобных длительных обработок и гибнут. Поскольку изучение свойств и характеристик клеточных популяций на мышиной модели является наиболее простым и экономичным, нами был разработан метод выделения кишечных лимфоидных клеток из мыши.

Таким образом, технической задачей является разработка более экономичного и эффективного способа выделения жизнеспособных лимфоцитов из стенок тонкого кишечника мыши, а также расширение ассортимента таких способов.

Поставленная техническая задача достигается заявочным способом получения (выделения) лимфоцитов из стенок тонкого кишечника мыши. Способ включает извлечение биологического материала - участка кишечника мыши (самки мышей линии СВА в возрасте 5-12 недель) от желудка до слепой кишки, промывание его фосфатно-буферным раствором, удаление пейеровых бляшек, измельчение извлеченного биологического материала в присутствии фосфатно-солевого буфера, содержащего дитиотреитол при перемешивании при комнатной температуре, последующее промывание биологического материала фосфатно-солевым буфером через нейлоновую сетку (размер ячеек 0,8 мм), выделение лимфоцитов путем последовательного инкубирования материала в растворе фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,2-0,3 мас.% бычьего сывороточного альбумина при перемешивании с использованием магнитной мешалки в термостате при +30-40°С в течение 10-15 минут, удаление надосадочной жидкости (супернатанта) с помощью нейлоновой сетки и промывание осадка фосфатно-солевым буфером. Далее осуществляется инкубирование биологического материала в виде образовавшегося осадка в культуральной среде RPMI-1640, содержащей 1-5 мас.% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,2-0,3 М HEPES и 20-40 U/мл коллагеназы, при перемешивании с использованием магнитной мешалки в термостате при +30-40°С в течение 10-13 мин, фильтрование полученной суспензии и отмывку суспензии от коллагеназы дважды с помощью клеточной среды RPMI-1640, содержащей 1-5 мас.% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,2-0,3 М HEPES центрифугированием при 1200-1500 об/мин при 0+4°С, определение выхода живых клеток с помощью камеры Горяева (4- сеточная, цельная). Число жизнеспособных клеток определяется с помощью клеточного красителя Трипанового Синего. Максимальный выход 15-20×106 жизнеспособных клеток в суспензии при использовании биологического материала от 3-х мышей, весом ≈16-18 г. Процентное содержание популяций клеток определяли методом проточной цитофлуориметрии (проточный цитометр Beckman Coulter EPICS XL), результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (Beckman Coulter).

Целевой продукт: Т-лимфоциты 50-70%, В-лимфоциты 10%, γ/δТ-лимфоциты 10%.

В качестве буферных растворов используют:

- Фосфатно-солевой буфер (Dulbecco's formula (modified), without magnesium and calcium Flow laboratories), приготовленный в деионизованной воде.

- Фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,2-0,3 мас.% бычьего сывороточного альбумина.

- Культуральная среда RPMI-1640 (Dako), содержащая 1-5 мас.% эмбриональной телячьей сыворотки (Панэко), 0,2-0,3 М HEPES (Servo).

- Культуральная среда RPMI-1640 (Macs), содержащая 1-5 мас.%эмбриональной телячьей сыворотки (Панэко), 0,2-0,3 М HEPES (Servo), collagenase, C1. Histolyticum (Gibco).

Ниже представлено более подробное описание технологии, лежащей в основе заявленного способа.

- Извлечение биологического материала (участок кишечника от желудка длиной приблизительно 20 см до слепой кишки). Для этого необходимо вскрыть брюшную полость, найти желудок. Необходимо следить, чтобы желудочный сок с пониженным показателем рН не попал в кишечник, поэтому кишечник необходимо аккуратно взять пинцетом на выходе из желудка, обрезать связку, а затем и кишку. Далее постепенно вытягивать кишечник, освобождая его от соединительной ткани тупой стороной ножниц во избежание нежелательных разрывов кишечной ткани. При достижении слепой кишки тонкий кишечник следует обрезать и поместить его в чашку Петри с фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) без содержания ионов кальция и магния, на льду. Преимуществом использования фосфатно-солевого буферного раствора является то, что он не влияет на жизнеспособность лимфоидных клеток. Недостатком использования буферного раствора, содержащего ионы кальция и магния, является агрегация выделяемых лимфоцитов и слизи в слизистых покровах в просвете кишечника, что отрицательно сказывается на жизнеспособности данных клеток. Недостатком использования нитратного буфера или физиологического раствора (см. выше) является плохая выживаемость кишечных клеток мыши в данных условиях.

- Промывка кишечника вышеуказанным раствором с помощью шприца для удаления химуса и других инородных масс. Промывание необходимо проводить холодным раствором на льду. Использование шприца (на 5-10 мл) с иглой облегчает и ускоряет данную процедуру.

- Удаление пейеровых бляшек с помощью хирургических глазных ножниц и пинцета. Данная процедура необходима для удаления клеток, не относящихся к лимфоцитам собственной пластинки (lamina propria). Поскольку бляшки хорошо просматриваются на темном фоне, удалять их удобнее, подложив под чашку Петри темный материал. Данную процедуру необходимо также проводить на льду в холодном ФСБ для сохранения высокого выхода клеток.

- Разрезание кишечника вдоль и поперек на куски длиной по 0,5-1,0 см с помощью хирургических ножниц.

- Помещение измельченного биологического материала в емкость с фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,1-0,2 мас.% дитиотреитола. Перемешивать емкость с биологическим материалом строго в течение 3-5 минут при комнатной температуре. Данная процедура необходима для удаления слизи с внутренней поверхности кишечника за счет действия дитиотреитола. Дитиотреитол отрицательно сказывается на стабильности живых лимфоцитов кишечника, поэтому концентрация 0,1-0,2 мас.% данного реагента является минимальной и достаточной для эффективного процесса удаления слизи в рабочий раствор (ФСБ). При использовании большей концентрации дитиотреитола ухудшается внешний вид клеток, а конечный выход клеток уменьшается, так как деформированные клетки гибнут в процессе выделения. Оптимальное время обработки - 3-5 минут, поскольку за меньший период дитиотреитол не связывается с поверхностью слизистых покровов, а более долгий период обработки с учетом необходимого для проведения реакции температурного режима (комнатная температура) отрицательно сказывается на жизнеспособности клеток.

- Тщательно отмыть биологический материал холодным рабочим раствором (ФСБ) от дитиотреитола с помощью нейлоновой сетки. Кусочки кишечника остаются на натянутой нейлоновой сетке, тогда как раствор, содержащий дитиотреитол, сливается в чашку Петри.

- Поместить кусочки кишечника в ФСБ, содержащий 0,2-0,3 мас.% бычьего сывороточного альбумина. Инкубировать в данном растворе биологический материал при перемешивании (магнитной мешалкой) при +30-40°С в течение 10-15 минут. Данная процедура необходима для отделения эпителия и ворсинок от собственной пластинки (lamina propria) кишечника. Время инкубации не должно быть короче 10 минут, так как не произойдет отделения эпителиального слоя клеток, и не должно превышать 15 минут, так как данная процедура отрицательно сказывается на выходе живых клеток. Присутствие магнитной мешалки необходимо для сокращения времени инкубации и для ускорения процесса отделения эпителия от собственной пластинки. Бычий сывороточный альбумин в концентрации 0,2-0,3 мас.% необходим для поддержания физиологических условий в процессе инкубации, предохраняя, таким образом, лимфоциты от грубого механического воздействия мешалки. Температурный режим должен быть близок к физиологическому режиму, т.е. от +30 до +40°С. В противном случае процесс отделения не проходит в полной мере, что отрицательно сказывается на количестве полученных клеток.

- Удалить надосадочную жидкость (супернатант) с помощью нейлоновой сетки (фильтрование) и отмыть кусочки кишечника от остатков эпителиальных клеток с помощью ФСБ на льду.

- Поместить кусочки кишечника в клеточную среду RPMI-1640, содержащую 1-5% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,2-0,3 М HEPES и 20-40 U/мл коллагеназы. Инкубировать в данном растворе биологический материал при перемешивании (магнитной мешалкой) при +30-40°С в течение строго 10-13 минут. Использование клеточной среды RPMI-1640 обеспечивает высокий процент живых клеток, так как кишечные лимфоциты устойчивы в ней. Добавление в данную среду эмбриональной телячьей сыворотки улучшает свойства клеток, так как сыворотка «обволакивает» клетки и поддерживает их жизнеспособность. Опытным путем была определена оптимальная концентрация эмбриональной телячьей сыворотки в клеточной среде: от 1 до 5%. Добавление меньшего количества не сказывается положительно на свойствах кишечных лимфоцитов, тогда как концентрация более 5% экономически невыгодна. Присутствие HEPES в концентрации 0,2-0,3 М необходимо для поддержания физиологического значения рН в клеточной среде, что положительно влияет на живые клетки в данной среде. Коллагеназа является ферментом, расщепляющим межтканные связи в кишечной стенке, ферментативная обработка кишечника отрицательно влияет на жизнеспособность лимфоцитов. Поэтому концентрация коллагеназы должна минимально влиять на жизнеспособность клеток, но при этом должна успешно расщеплять волокна в биологическом материале. Опытным путем была подобрана оптимальная концентрация коллагеназы 20-40 U/мл. При большей концентрации, например 50 U/мл, процент живых клеток резко снижался. При меньшей концентрации (до 20 U/мл) не происходил процесс расщепления и собственно выделения клеток из кишечной ткани. Время инкубации определяли опытным путем. При инкубации менее 10 минут не происходило выделение кишечных клеток, тогда как при инкубации более 13 минут снижался процент выделенных живых клеток. Применение механического перемешивания с помощью магнитной мешалки и температурного режима инкубации мотивируется аналогично предыдущей процедуре инкубации.

- Фильтровать полученную суспензию через марлю и вату в пробирки на льду. Отмыть клеточную суспензию от коллагеназы дважды в RPMI-1640, содержащей 1-5 мас.% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,2-0,3 М HEPES, с помощью центрифугирования (1200-1500 оборотов в минуту) при температуре от 0 до +4°С. Двойное осаждение клеток необходимо для удаления остатков коллагеназы и посторонних элементов кишечной стенки из клеточной суспензии. При тройном осаждении процент живых клеток снижается, при этом после первого осаждения в клеточной суспензии содержатся клетки нелимфоцитарного происхождения (эпителиальные, мышечные и др. элементы). Оптимальная скорость осаждения лимфоцитов лежит в пределах от 1200 до 1500 оборотов в минуту. Скорость менее 1200 оборотов в минуту не приводит к осаждению лимфоцитов из раствора, тогда как скорость, превышающая 1500 оборотов в минуту, разрушает клеточные стенки лимфоцитов, тем самым снижая процент живых клеток на выходе. Температурный режим осаждения должен лежать в пределах от 0+4°С, так как при такой температуре клетки выживают дольше. Отрицательная температура приводит в разрушению клеточной мембраны, температура выше +4°С приводит к гибели клеток из-за их нестабильности в данном температурном режиме.

Подсчет выхода жизнеспособных клеток с помощью камеры Горяева (4-сеточная цельная). Число живых клеток определяли с помощью клеточного красителя Трипанового Синего. Процентное содержание популяций клеток определяли методом проточной цитофлуориметрии (проточный цитометр Beckman Coulter EPICS XL), результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (Beckman Coulter).

Целевой продукт: Т-лимфоциты 50-70%, В-лимфоциты 10%, γ/δТ-лимфоциты 10%.

Ниже приводится конкретный пример осуществления способа, иллюстрирующий его, но не ограничивающий объем притязаний.

Пример.

1. Получение тонкого кишечника (все манипуляции проводить на льду) включает стадии:

1.1. Извлечение биологического материала (участок кишечника от желудка длиной приблизительно 20 см до слепой кишки). Для этого необходимо вскрыть брюшную полость, найти желудок. Необходимо следить, чтобы желудочный сок с пониженным показателем рН не попал в кишечник, поэтому кишечник необходимо аккуратно взять пинцетом на выходе из желудка, обрезать связку, а затем и кишку. Далее постепенно вытягивать кишечник, освобождая его от соединительной ткани тупой стороной ножниц во избежание нежелательных разрывов кишечной ткани. При достижении слепой кишки тонкий кишечник следует обрезать и поместить его в чашку Петри с фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) без содержания ионов кальция или магния.

1.2. Промывка кишечника вышеуказанным раствором с помощью шприца.

1.3. Удаление пейеровых бляшек.

1.4. Разрезание кишечника вдоль и поперек на куски длиной 0,5-1,0 см с помощью глазных ножниц.

1.5. Помещение измельченного биологического материала в фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,15% дитиотреитола, для удаления слизи. Перемешивание в течение 3 минут при комнатной температуре.

1.6. Тщательная промывка биологического материала фосфатно-солевым буфером через нейлоновую сетку.

2. Выделение лимфоцитов из стенки тонкого кишечника.

2.1. Помещение кусочков кишечника в фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,25% бычьего сывороточного альбумина. Инкубирование в данном растворе биологического материала при перемешивании (магнитной мешалкой) в термостате (+37°С) в течение 15 минут.

2.2. Удаление надосадочной жидкости с помощью нейлоновой сетки и промывка кусочков кишечника с помощью фосфатно-солевого буфера.

2.3. Помещение кусочков кишечника в клеточную среду RPMI-1640, содержащую 2 мас.% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,2 М HEPES и 25 U/мл коллагеназы. Инкубирование в данном растворе биологического материала при перемешивании (магнитной мешалкой) в термостате (+37°С) в течение 12-13 минут.

2.4. Фильтрование полученной суспензии через марлю и вату в пробирки на льду. Отмывка суспензии дважды с помощью RPMI-1640, содержащей 2 мас.% эмбриональную телячью сыворотку.

2.5. Подсчет выхода жизнеспособных клеток с помощью камеры Горяева.

Максимальный выход 15-20×106 жизнеспособных клеток в суспензии при использовании биологического материала от 3-х мышей.

Промышленная применимость.

Фундаментальные исследования в области иммунологии, медицины, прикладных наук (биотехнология, биохимия) с целью получения иммунологических материалов.

В исследовательском эксперименте часто используются мышиные модельные системы как наиболее простые и доступные в лабораторной практике.

Способ получения лимфоцитов из тонкого кишечника мыши, включающий извлечение биологического материала - участка кишечника самок мышей линии СВА в возрасте 5-12 недель, от желудка до слепой кишки, промывание его фосфатно-буферным раствором, удаление пейеровых бляшек, измельчение биологического материала в присутствии фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,1-0,2 мас.% дитиотреитола при перемешивании при комнатной температуре, последующую промывку биологического материала фосфатно-солевым буферным раствором через нейлоновую сетку, собственное выделение лимфоцитов из стенки тонкого кишечника путем последовательного инкубирования материала в растворе фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,2-0,3 мас.% бычьего сывороточного альбумина при перемешивании магнитной мешалкой при +30-40°С в течение 10-15 минут, удаление надосадочной жидкости с помощью нейлоновой сетки, промывание осадка фосфатно-солевым буфером, последующее инкубирование осадка биологического материала фосфатно-буферным раствором, инкубирование биологического материала в клеточной среде RPMI-1640, содержащей 1-5 мас.% телячьей сыворотки, 0,2-0,3 М HEPES и 20-40 U/мл коллагеназы при перемешивании магнитной мешалкой при 30-40°С в течение 10-13 минут, фильтрование полученной суспензии, отмывку суспензии от коллагеназы и осаждение лимфоцитов дважды в клеточной среде RPMI-1640, содержащей 1-5 мас.% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,2-0,3 М HEPES, с использованием центрифугирования при 1200-1500 об/мин и при 0+4°С, и далее осуществляют определение выхода живых клеток с помощью камеры Горяева.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения длительно незаживающей раны и/или раневой полости. Для этого проводят многократное нанесение на поверхность раны и/или раневой полости пациента композиции, включающей культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток человека, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Предложено применение композиции для культивирования клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны способы генерации HLA-гомозиготных партеногенетических линий стволовых клеток человека (hpSC-Hhom) как от HLA-гомозиготных, так и от HLA-гетерозиготных доноров.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Предложен способ выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, с культивированием в сосуде, содержащем фибронектин, и последующим получением стволовых клеток из культуры, а также среда для культивирования стволовых клеток, способ культивирования стволовых клеток, клеточное терапевтическое средство, и способ увеличения «стволовости» стволовых клеток, который характеризуется наличием сферической культуры или трехмерной культуры стволовых клеток.
Изобретение относится к области медицины, тканевых технологий и биотехнологии. Предложен предшественник искусственной почки, содержащий не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего, выделенный из живого организма, при этом метанефрос подвергался операциям замораживания и размораживания вне живого организма, и он содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего, перенесенные из живого организма (за исключением мезенхимных стволовых клеток из человеческого эмбриона), и также предложен способ его получения.
Изобретение относится к области медицины и клеточных технологий. Предложен клеточный продукт, содержащий популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, характеризующихся фенотипом CD49f+/EpCAM+ и после обработки вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивирования в коллагеновом геле меняющих профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретающих способность синтезировать мочевину и альбумин.
Изобретение относится к области клеточной биологии и медицины. Предложен способ получения клеток для заместительной клеточной терапии печени, заключающийся в выделении из подчелюстной слюнной железы популяции стволовых клеток, экспрессирующей маркеры CD49f и EpCAM, инкубировании ее с вальпроевой кислотой и последующей трансдифференцировке в гепатоцитарном направлении в процессе культивирования.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения непрерывных клеточных линий живых клеток и их применений. Представленный способ включает облучение указанных живых клеток дозой УФ-света от около 20 мДж/см2 до около 300 мДж/см2 при длине волны между около 100 нм и около 400 нм в течение от около 30 сек до 5 мин и отбор клеток, способных к пролиферации после по меньшей мере 20 пассажей.
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложен способ in vitro генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам липокалина слезной жидкости человека, и может быть использовано в медицине. Мутеин липокалина слезной жидкости человека (hTLc) имеет обнаруживаемую аффинность связывания с рецепторной тирозинкиназой Met (c-Met) человека, или ее доменом, или фрагментом c-Met человека. Мутеин содержит от 6 до 18 аминокислотных замен относительно аминокислотной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека (SWISSPROT DATABANK ENTRY P31025; SEQ ID NO:36), которые выбраны из группы, состоящей из Arg 26→Thr, Val, Pro, Ser, Gly; Glu 27→Gln, Gly, Val, Ser; Phe 28→Met, Asp; Pro 29→Leu, Ile, Ala, Trp; Glu 30→Leu, Gly, Arg, Phe; Met 31→Ser; Asn 32→Leu, Arg, Val, Gln; Leu 33→Tyr, Val, Ile, Thr, Phe; Glu 34→Val, Arg, Ala; Leu 56→Asn; Ile 57→Gln; Ser 58→Ile, Val; Asp 80→Tyr; Lys 83→Ala; Glu 104→Asp; Leu 105→Thr; His 106→Trp и Lys 108→Gly. Также мутеин может дополнительно содержать следующие замены: Cys 61→Ser; Cys 101→Ser; Cys 153→Ser; Arg 111→Pro; Lys 114→Trp; Thr 37→Ser; Met 39→Ile, Leu; Asn 48→Ser; Lys 52→Thr, Met; Met 55→Leu; Lys 65→Arg, Leu; Ala 79→Leu, Ser; Ala 86→Thr; Ile 89→Ser, Gln, Thr, His; Thr 40→Cys; Glu 73→Cys; Arg 90→Cys; Asp 95→Cys; Lys 121→Cys; Asn 123→Cys и Glu 131→Cys. Изобретение позволяет эффективно лечить патологические расстройства, в которые вовлечен путь HGF/c-Met, а также проводить идентификацию c-Met человека в образце. 12 н. и 38 з.п.ф-лы, 16 ил., 9 табл., 25 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в кардиологии для исследования формирования и разрыва бляшек в контролируемых лабораторных условиях, наблюдения за жизнедеятельностью различных клеток в бляшке в заданных условиях и проведения сравнения ех vivo и in vivo. В способе культивирования эксплантов атеросклеротических бляшек ех vivo в качестве материала эксплантов используют участки сонных артерий, полученные при операциях по поводу стенозирующего атеросклероза сонных артерий, которые хранят в лаборатории в течение не более 2 часов после операции, после экстрагирования полученный материал отмывают в фосфатно-солевом буфере, после чего материал для культивирования нарезают на кольцевидные блоки толщиной 2-3 мм перпендикулярно просвету сосуда, затем 2 блока фиксируют в 2% параформальдегиде и заключают в парафин, а остальные блоки помещают в среду для культивирования. При этом ткань культивируют не менее 20-22 дней, каждые три дня образцы тканей фиксируют в 2% параформальдегиде, затем заключают в парафин, а в последний день культивирования оставшиеся образцы также фиксируют в 2% параформальдегиде, заключают в парафин и исследуют гистологически. Изобретение позволяет сохранить жизнеспособность эксплантов атеросклеротических бляшек при культивировании для дальнейшего изучения механизмов патогенеза атеросклероза. 1 пр.
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии и касается штамма диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота. Охарактеризованный штамм выделен из легкого плода коровы и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) под №83. Штамм культивируется на среде Игла MEM и ГЛА 1:1 с 10% сыворотки плода крупного рогатого скота, свободен от вирусной, микоплазменной и бактериальной контаминации. Штамм может быть применен для накопления вирусов и достоверной диагностики вирусных инфекций.
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а также медицины. Предложен способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга. Благодаря высокой однородности и эффективности выделения стволовых клеток способ может быть использован в трансфузиологии.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам, которые специфично связываются с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR), а также к ДНК, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи указанных антител, ДНК, которые кодируют вариабельные области легкой цепи указанных антител. Раскрыты вектора экспрессии, содержащие эти ДНК, и линии животных клеток для экспрессии вышеуказанных антител, содержащие эти векторы. Описаны композиции для лечения рака, связанного с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), содержащая эффективное количество указанных антител. Изобретения позволяет эффективно лечить рак, связанный с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR). 14 н. и 16 з.п. ф-лы, 12 ил., 12 пр., 3 табл.

Изобретение относится к области получения рекомбинантных белков и касается способов их получения. Представлены способы получения антител, включающие: культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; подпитку клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток, где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей. Представленными способами возможно получать, в частности, такие антитела, как анти-TNFα-антитело или анти-IL-12-антитело. Охарактеризованное решение позволяет получить повышенное количество антител и может быть использовано в фармацевтической промышленности. 3 н. и 25 з.п. ф-лы, 46 табл., 4 пр., 1 ил.

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию. Предложены способы получения вышеуказанного биокомпозита и набор для его приготовления. Предложены также способ обеспечения заживления повреждения у млекопитающего и способ доставки нуклеиновой кислоты. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную регенерацию тканей после повреждения у млекопитающего за счет использования трехкомпонентного биокомпозита, состоящего из носителя, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты и клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Изобретение относится к иммунологии, медицине и биотехнологии. Предложен способ стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа против клеток рака молочной железы с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной ДНК-конструкцией. Полученные из периферической крови условно-здоровых доноров, трансфецированные полиэпитопной конструкцией, культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток. Способ позволяет повысить эффективность и экономичность получения цитотоксических лимфоцитов. 1 ил.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения полипептида в культуре клеток млекопитающего (варианты) и среду для культивирования клеток млекопитающего. Предложенное изобретение может быть использовано для получения в больших количествах полипептида, представляющего интерес. Способ включает получение культуры клеток, содержащей клетки млекопитающего, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, представляющий интерес, и исходную среду для культивирования клеток, при этом объем исходной среды для культивирования клеток составляет примерно 60-99% объема желаемой среды для культивирования клеток. Добавляют питательную среду для культивирования в культуру клеток, при этом объем питательной среды для культивирования клеток составляет примерно 1-40% объема среды для культивирования клеток. Получаемая среда для культивирования клеток представляет собой среду для культивирования клеток, содержащую от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ лейцина, от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ лизина, от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ треонина, от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ пролина и от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ валина. Поддерживают культуру клеток в условиях, которые позволяют экспрессировать полипептид, представляющий интерес. Предложенное изобретение позволяет получать полипептид, представляющий интерес, с более высоким выходом. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 15 ил., 16 табл., 7 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает эвтаназию крольчат путем обезглавливания, удаление лапок, хвостов, снятие шкурок, вскрытие брюшной полости на уровне поясничных позвонков, извлечение почек, снятие капсулы органа, измельчение на кусочки величиной 1-3 мм. В качестве доноров первичный культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста. Кусочки ткани отмывают от остатков крови солевым раствором Хенкса, подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°C в течение 30-40 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с рН 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7·105 клеток/см3, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл. При этом определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл. Способ позволяет повысить чувствительность к вирусам животных, улучшить биологическую активность культивируемых клеток и повысить выход вирусного материала. 3 табл., 3 пр.
Наверх