Способ получения препарата антитела против il-18 или его антигенсвязывающей части (варианты)



Способ получения препарата антитела против il-18 или его антигенсвязывающей части (варианты)
Способ получения препарата антитела против il-18 или его антигенсвязывающей части (варианты)
Способ получения препарата антитела против il-18 или его антигенсвязывающей части (варианты)
Способ получения препарата антитела против il-18 или его антигенсвязывающей части (варианты)
Способ получения препарата антитела против il-18 или его антигенсвязывающей части (варианты)

 

C07K1/18 - Пептиды (пептиды в пищевых составах A23, например получение белковых композиций для пищевых составов A23J, препараты для медицинских целей A61K; пептиды, содержащие бета-лактамовые кольца, C07D; циклические дипептиды, не содержащие в молекуле любого другого пептидного звена, кроме образующего их кольцо, например пиперазин-2,5-дионы, C07D; алкалоиды спорыньи циклического пептидного типа C07D519/02; высокомолекулярные соединения, содержащие статистически распределенные аминокислотные единицы в молекулах, т.е. при получении предусматривается не специфическая, а случайная последовательность аминокислотных единиц, гомополиамиды и блоксополиамиды, полученные из аминокислот, C08G 69/00; высокомолекулярные продукты, полученные из протеинов, C08H 1/00; получение

Владельцы патента RU 2514657:

ЭББВИ ИНК, (US)

Группа изобретений относится к способам получения препарата антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части со сниженным содержанием белка клетки-хозяина (БКХ) из образца смеси, содержащей антитело против IL-18 или его антигенсвязывающую часть, и по меньшей мере один БКХ. Способ включает понижение рН от 3,0 до примерно 4,0 образца смеси, доведение рН от 4,5 до примерно 5,5 и проводимости до 9±0,5 мС/см, нанесение образца на катионообменную смолу, осуществление хроматографии гидрофобного взаимодействия и сбор образца. Вариант способа включает осуществление анионообменной хроматографии перед стадией катионообменной хроматографии. Также вариант способа включает фильтрование образца перед анионообменной хроматографией. Группа изобретений позволяет получить препарат антитела с повышенным выходом и чистотой. Выход составляет 96±4%, чистота 99,51±0,26%. 3 н. и 25 з.п. ф-лы, 2 ил., 9 табл., 2 пр.

 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/196751, поданной 20 октября 2008 г., включенной в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

Предпосылки создания изобретения

Интерлейкин-18 человека представляет собой идентифицированный цитокин, который синтезируется в виде биологически неактивного белка-предшественника, включающего 193 аминокислоты. Отщепление белка-предшественника, например, с помощью каспазы-1 или каспазы-4 высвобождает зрелый белок из 156 аминокислот, который проявляется биологическую активность, которая включает костимулирование пролиферации Т-клеток, усиление цитотоксичности NK клеток, запуск продуцирования IFN-γ Т-клетками и NK-клетками и потенцирование дифференциации Т-хелпера типа 1 (Th1). Кроме того, представляет собой эффективный индуктор провоспалительных медиаторов моноцитов человека, включая IL-8, фактор-α некроза опухоли (TNF-α) и простагландин Е2 (PGE2).

IL-18 играет потенциальную роль в иммунорегулировании или воспалении посредством усиления функциональной активности лиганда Fas на клетках Th1. IL-18 также экспрессируется в коре надпочечников и, таким образом, может представлять собой секретируемый нейроиммуномодулятор, играющий важную роль в настройке иммунной системы после стресса.

Клетки Th1, которые продуцируют провоспалительные цитокины, такие как IFN-γ, IL-2 и TNF-β, вовлечены в опосредование многих аутоиммунных заболеваний, включая рассеянный склероз (РС), ревматоидный артрит (РА), диабет типа 1 или инсулинозависимый (IDDM), воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) и псориаз. Таким образом, можно ожидать, что антагонизм ТН1 промотирующего цитокина, такого как IL-18, будет ингибировать развитие заболевания. В качестве антагониста можно использовать IL-18-специфические mAb.

In vivo IL-18 образуется за счет расщепления pro-IL-18, и его эндогенная активность, по-видимому, рассматривается в IFN-γ продуцировании в P. acnes и LPS-опосредованной смертности. Блокирование биологической активности IL-18 при заболеваниях человека является терапевтической стратегией при многих заболеваниях. Это можно осуществить с использованием растворимых рецепторов или блокирующих антител для связанного с клетками рецептора IL-18.

Цитокин-связывающие белки (растворимые рецепторы цитокинов) соответствуют межклеточным лиганд-связывающим доменам поверхностных цитокиновых рецепторов на поверхности соответствующих клеток. Они образуются или путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК, обычной для поверхностного клеточного рецептора, или путем протеолитического расщепления поверхностного клеточного рецептора. Такие растворимые рецепторы были описаны в прошлом, включая, наряду с прочим, растворимые рецепторы IL-6 и IFN-γ. Один цитокин-связывающий белок, называемый остеопротегерином (OPG, также известный как ингибирующий фактор остеокластов OCIF), член семейства TNFR/Fas, оказался первым примером растворимого рецептора, который существует только в качестве секретированного белка.

Было предположено, что IL-18 вовлечен в развитие патогенности при хронических воспалительных заболеваниях, включающих эндотоксиновый шок, гепатит и аутоиммунный диабет. Возможная роль IL-18 в развитии повреждения печени постулировалась на основании экспериментов, показавших повышенный уровень IL-18 в индуцированном липосахаридом остром повреждении печени на мышиной модели. Однако механизм мультифункционального фактора IL-18 в развитии повреждения печени до настоящее времени не выяснен.

Исследования последних лет показывают, что IL-18 играет провоспалительную роль в обобщенном метаболизме. Исследователи показали, что IL-18 продуцируется суставными хондроцитами и индуцирует провоспалительную и катаболическую ответные реакции. мРНК IL-18 стимулируется посредством IL-1β в хондроцитах. Хондроциты продуцируют предшественник IL-18 и, в ответ на стимуляцию за счет IL-1, продуцируют зрелую форму IL-18. Исследования эффекта IL-18 на хондроциты дополнительно показали, что он ингибирует индуцированную TGF-β пролиферацию и усиливает продуцирование окиси азота. IL-18 стимулировал экспрессию нескольких генов в нормальных суставных хондроцитах человека, включая индуцируемую окисью азота синтазу, индуцируемую циклооксигеназу, IL-6 и стромелизин. Экспрессию гена связывали с синтезом соответствующих белков. Обработка с использованием IL-18 нормального суставного хряща увеличивала высвобождение гликозаминогликанов. Эти данные выявили IL-18 в качестве цитокина, который регулирует ответные реакции хондроцитов и вносит свой вклад в разрушение хряща.

Было предположено, что IL-18 играет провоспалительную роль в ревматоидном артрите. Было показано, что уровни IL-18 значительно повышаются в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным артритом. Исследователи выявили мРНК IL-18 и белок в синовиальных тканях при ревматоидном артрите на значительно более высоких уровнях, чем при остеоартрите в качестве контроля. Также было показано, что комбинация IL-12 или IL-15 с IL-18 вызывает продуцирование IFN-γ в синовиальных тканях in vitro. Кроме того, введение IL-18 мышам, иммунизированным коллагеном в неполном адъюванте Фрейнда, облегчало развитие эрозионного воспалительного артрита, давая возможность предположить, что IL-18 может представлять собой провоспалительный фактор in vivo.

Была продемонстрирована роль IL-18 в развитии других аутоиммунных заболеваний. Соответственно, было показано, что экспрессия IL-18 существенно увеличивается в поджелудочной железе и селезенке у не страдающих ожирением диабетических мышей непосредственно перед началом заболевания. Кроме того, было показано, что введение IL-18 увеличивает клиническую тяжесть экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) у мышей, Th1-опосредованного аутоиммунного заболевания, которое представляет собой модель рассеянного склероза. Дополнительно было показано, что антисыворотка, нейтрализующая антикрысиный IL-18, предотвращает развитие ЕАЕ у самок крыс Lewis. Соответственно, IL-18 представляет собой желаемую мишень при разработке новых терапевтических средств для аутоиммунных заболеваний.

IL-18 представляет собой плейотропный интерлейкин, обладающий как усиливающими воспаление, так и ослабляющими его свойствами. С одной стороны, он усиливает продуцирование провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, промотируя тем самым воспаление. С другой стороны, он вызывает продуцирование NO, ингибитора каспазы-1, промотируя, тем самым, созревание IL-1β и IL-18 и, возможно, облегчая воспаление. Такая двойственная роль IL-18 поднимает вопросы, связанные с эффективностью ингибиторов IL-18 при лечении воспалительных заболеваний. Кроме того, из-за взаимодействия большого множества различных цитокинов и хемокинов, в регулировании воспаления нельзя ожидать, что благоприятное действие будет получено путем блокирования только одного из игроков в таком сложном сценарии.

Невзирая на все вышесказанное, нейтрализация антител IL-18 рассматривается как полезный фактор для облегчения аутоиммунных заболеваний и родственных симптомов. Соответственно, существует необходимость в данной области в антителе IL-18 с высокой аффинностью, таком как нейтрализующее моноклональное антитело интерлейкина IL-18 человека. Более того, важно, чтобы терапевтический режим, включающий антитела против IL-18, имел высокую чистоту. Настоящее изобретение адресовано данной необходимостью без использования колонки с белком А или эквивалентной стадии очистки на основе белка А.

Краткое изложение сущности изобретения

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к очищенным выделенным антителам и фрагментам антител, которые связываются с IL-18, а также к фармацевтическим композициям, содержащим такие антитела и фрагменты. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к выделенным антителам или их антигенсвязывающим частям, которые связываются с IL-18 человека. Выделенные антитела против IL-18 по настоящему изобретению можно использовать в клинических условиях, а также в научных исследованиях и разработках. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу против IL-18, включающему последовательности тяжелой и легкой цепи, идентифицированные в SEQ ID NO 1 и 2.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к способам очистки антител против IL-18 или их антигенсвязывающих частей, из матричных образцов, чтобы сделать их по существу не содержащими белков клетки-хозяина («БКХ»). В некоторых аспектах матричные образцы (или просто «образцы») включают клеточную линию, используемую для продуцирования антител против IL-18 по настоящему изобретению. В конкретных аспектах, образцы включают клеточную линию, используемую для продуцирования антител против IL-18 человека.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения матричный образец, включающий предполагаемое антитело против IL-18 или его антигенсвязывающую часть, подвергают регулированию рН. В некоторых аспектах рН доводят примерно до 3,5. Низкое значение рН, помимо прочего, промотирует сокращение и/или дезактивацию рН-чувствительных вирусов, которые могут присутствовать в образце. После подходящего промежутка времени рН доводят примерно до 5,0 и образец подвергают ионообменной хроматографии для получения элюата. В некоторых аспектах полученный при ионном обмене элюат собирают и дополнительно подвергают хроматографии гидрофобного взаимодействия для получения элюата. Элюат, полученный при хроматографии гидрофобного взаимодействия, затем может быть собран для дополнительной переработки или применения.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу очистки антител против IL-18, который включает первичную стадию выделения для, помимо прочего, удаления клеток и клеточного дебриса. В некоторых вариантах осуществления указанного выше способа первичная стадия выделения включает одну или несколько стадий центрифугирования или глубокого фильтрования. Например, но не в качестве ограничения, такие стадии центрифугирования можно осуществлять приблизительно от 7000×g до приблизительно 11000×g. Дополнительно некоторые варианты осуществления вышеуказанного способа будут включать стадию глубокого фильтрования, такую как делипидная стадия глубокого фильтрования.

В некоторых вариантах осуществления вышеуказанного способа стадия ионного обмена может представлять собой либо катионную, либо анионообменную хроматографию или их комбинацию. Данная стадия может включать множество стадий ионного обмена, как, например, стадия катионного обмена с последующей стадией анионного обмена или наоборот. В некоторых аспектах стадия ионного обмена включает двухстадийный процесс ионного обмена. Такие двухстадийные процессы могут быть осуществлены, например, не в качестве ограничения, путем проведения первоначально стадии катионного обмена с последующей второй стадией анионного обмена. Примером катионообменной колонки является колонка, стационарная фаза которой содержит анионные группы, такая как колонка CM Hyper DFTM. Такая хроматографическая стадия ионообменного захвата облегчает выделение антител против IL-18 из первичной смеси для выделения. Подходящая анионообменная колонка представляет собой колонку, стационарная фаза которой включает катионные группы. Примером такой колонки является колонка Q SepharoseTM. На одной или нескольких стадиях ионного обмена происходит дополнительное отделение антител против IL-18 за счет уменьшения примесей, таких как белки и ДНК клетки-хозяина, и, где это осуществимо, аффинного матричного белка. Такой метод анионного обмена представляет собой поток через хроматографический модуль, где антитела против IL-18 не взаимодействуют или не связываются с анионообменной смолой (или твердой фазой). Однако множество примесей действительно взаимодействует и связывается с анионообменной смолой.

В некоторых вариантах осуществления первую и вторую стадии ионного обмена проводят после первичного выделения. В некоторых таких вариантах осуществления образец для ионного обмена подвергают промежуточной стадии фильтрования, либо перед первой стадией ионного обмена, между двумя стадиями ионного обмена или после обоих стадий. В некоторых аспектах, стадия фильтрования включает захват методами ультрафильтрования/диафильтрования ("UF/DF"). Помимо прочих задач, такое фильтрование облегчает концентрирование и буферный обмен антител против IL-18 и их антигенсвязывающих частей.

Некоторые варианты осуществления данного изобретения относятся к способу, включающему проведение одной или нескольких стадий хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ). Подходящая колонка для ХГВ представляет собой колонку, стационарная фаза которой включает гидрофобные группы. Неограничивающим примером такой колонки является колонка Phenyl HP SepharoseTM. В некоторых обстоятельствах антитела против IL-18 будут образовывать агрегаты во время процесса выделения/очистки. Включение одной или нескольких стадий ХГВ облегчает уменьшение образования или исключает образование таких агрегатов. ХГВ также способствует удалению примесей. В некоторых вариантах осуществления на стадии ХГВ используется высокосолевой буфер для того, чтобы способствовать взаимодействию антител против IL-18 (или их агрегатов) с гидрофобной колонкой. Антитела против IL-18 затем могут быть элюированы с использованием более низкой концентрации соли.

В некоторых вариантах осуществления элюат, полученный при ХГВ, фильтруют с использованием фильтра для удаления вирусов, такого как, но без ограничений, фильтр Ultipor DV50TM (Pall Corporation, East Hills, N.Y.). В таких вариантах осуществления также можно использовать альтернативные фильтры, такие как фильтры ViresolveTM (Millipore, Billerica, Mass.); фильтры Zeta Plus VRTM (CUNO; Meriden, Conn.); фильтры PlanovaTM (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, I11).

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к одной или нескольким фармацевтическим композициям, содержащим выделенное антитело против IL-18 или его антигенсвязывающую часть и приемлемый носитель. В одном аспекте композиция дополнительно содержит одно или несколько антител или их антигенсвязывающих частей в дополнение к антителу против IL-18. В другом аспекте композиция дополнительно содержит один или несколько фармацевтических агентов.

Краткое описание фигур

Фиг.1. На фиг.1 представлен неограничивающий пример схемы очистки по настоящему изобретению.

Фиг.2. На фиг.2 показаны последовательности тяжелой и легкой цепи неограничивающего примера антитела против IL-18 (АВТ-325).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с IL-18 человека. В одном аспекте изобретение относится к выделенным антителам или их антигенсвязывающим частям, которые связываются с IL-18 человека. Выделенные антитела против IL-18 по настоящему изобретению можно использовать в клинических условиях, а также в научных исследованиях и разработках. Настоящее изобретение также относится к способам очистки антител против IL-18 или их антигенсвязывающих частей. Подходящие антитела против IL-18, которые могут быть очищены в соответствии с контекстом настоящего изобретения, описаны в заявках на патент США 09/780035 и 10/988360, включая антитело, которое впоследствии было идентифицировано как АВТ-325. Последовательности тяжелой и легкой цепей АВТ-325 представлены на фиг.2. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим описанные в настоящем изобретении антитела против IL-18 или их антигенсвязывающие части.

Для простоты, но не для ограничения, данное подробное описание разделено на следующие подразделы:

Определения;

Генерирование антител;

Продуцирование антител;

Очистка антител;

Способы анализа чистоты образца;

Дополнительные модификации;

Фармацевтические композиции; и

Применение антител.

Определения

Для более легкого понимания настоящего изобретения сначала будут определены некоторые термины.

Термин «антитело» включает молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, связанных между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь включает вариабельную область тяжелой цепи (сокращенно называемую в данном описании как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи (СН). Константная область тяжелой цепи включает три домена, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно называемой в данном описании LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи включает один домен, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, обозначаемые определяющими комплементарность областями (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более сохраняющимися, называемыми областями рамки считывания (FR). Каждая VH и VL состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, расположенных, начиная от аминного конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или часть антитела) включает фрагменты антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hIL-18). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться посредством фрагментов полного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают: (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, двухвалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одной «плеча» антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки), который состоит из домена VH, и (vi) выделенную, определяющую комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены, с использованием рекомбинантных методов, синтетическим линкером, который дает возможность получить их в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH располагаются парами с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином «антигенсвязывающая часть» антитела. Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела являются двухвалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы образовывались пары между двумя доменами одной и той же цепи, тем самым вынуждая домены располагаться парами с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123, полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки). Еще помимо этого антитело или его антигенсвязывающая часть могут представлять собой часть большей иммуноадгезионной молекулы, образованной за счет ковалентной или нековалентной ассоциации антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких иммуноадгезионных молекул включают применение стрептавидинового ядра для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки) и применение цистеинового остатка, маркерного пептида и С-концевого полигистидинового остатка для получения двухвалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) MoI. Immunol. 31:1047-1058, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки). Части антител, такие как фрагменты Fab и F(ab')2, могут быть получены из цельных антител с использованием общепринятых способов, таких как расщепление цельных антител с использованием папаина или пепсина, соответственно. Более того, антитела, части антител и иммуноадгезионные молекулы могут быть получены с помощью стандартных рекомбинантных технологий ДНК, как описано в данном описании. В одном аспекте антигенсвязывающие части представляют собой полные домены или пары полных доменов.

Выражение «интерлейкин 18 человека» (сокращенно приведенный в данном описании как hIL-18 или IL-18), как оно использовано в данном описании, относится к цитокину человека, который первоначально синтезируется в качестве биологически неактивного белка-предшественника, включающего 193 аминокислоты, а также к зрелому белку, продуцируемому, например, не в качестве ограничения, путем расщепления белка-предшественника, например, под действием каспазы-1 или каспазы-4, который проявляет биологическую активность, которая включает костимулирование пролиферации Т-клеток, усиление цитотоксичности NK клеток, запуск продуцирования IFN-γ Т-клетками и NK-клетками и потенцирование дифференциации Т-хелпера типа 1 (Th1). Нуклеиновая кислота, кодирующая IL-18, доступна из GenBank с кодом доступа NM_001562, и последовательность полипептида доступна из GenBank с кодом доступа NP_001553. Подразумевается, что термин «IL-18 человека» включает рекомбинантный IL-18 человека (rh IL-18), который может быть получен стандартными методами рекомбинантной экспрессии.

Термины «нумерация Кабата», «определения Кабата» и «мечение по Кабату» используются в данном описании взаимозаменяемо. Эти термины, которые известны в данной области, относятся к системе нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными) по сравнению с другими аминокислотными остатками в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела или его антигенсвязывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 и Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242, полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки). Для вариабельной области тяжелой цепи область гипервариабельности располагается в диапазоне положений аминокислот от 31 до 35 для CDR1, положений аминокислот от 50 до 65 для CDR2 и положений аминокислот от 95 до 102 для CDR3. Для вариабельной области легкой цепи область гипервариабельности располагается в диапазоне положений аминокислот от 24 до 34 для CDR1, положений аминокислот от 50 до 56 для CDR2 и положений аминокислот от 89 до 97 для CDR3.

Термин «антитело человека» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие зародышевой последовательности иммуноглобулина человека, как описано Kabat и др. (см., Kabat, et al. (1991) Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Антитела человека настоящего изобретения могут включать остатки аминокислот, которые не кодируются зародышевой последовательностью иммуноглобулина человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или путем соматической мутации in vivo), например, в областях CDR и, в частности, CDR3. Мутации могут быть введены с помощью «подхода селективного мутагенеза»). Антитело человека может содержать по меньшей мере одно положение, замененное остатком аминокислоты, например, увеличивающим активность остатком аминокислоты, который не кодируется зародышевой последовательностью иммуноглобулина человека. Антитело человека может содержать до двадцати положений, замененных аминокислотными остатками, которые не являются частью зародышевой последовательности иммуноглобулина человека. В других вариантах осуществления заменено до десяти, до пяти, до трех или до двух положений. В одном варианте осуществления данные замены находятся в областях CDR. Однако не предполагается, что термин «антитело человека», как он используется в данном описании, включает антитела, в которых области CDR, полученные от зародышевых линий других видов млекопитающих, таких как мышь, были привиты на последовательности рамки считывания человека.

Выражение «подход селективного мутагенеза» включает способ улучшения активности антитела путем выбора и индивидуального мутирования аминокислот области CDR по меньшей мере в одном подходящем положении для селективной мутации, гипермутации и/или контактном положении. «Селективно мутированное» антитело человека представляет собой антитело, которое включает мутацию в положении, выбранном с использованием селективного мутагенезного подхода. В другом аспекте подразумевается, что «подход селективного мутагенеза» относится к способу предпочтительного мутирования выбранных индивидуальных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (здесь и далее Н1, Н2 и Н3, соответственно) или в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи (здесь и далее L1, L2 и L3, соответственно) антитела. Остатки аминокислот могут быть выбраны из положений селективного мутагенеза, контактных положений или положений гипермутации. Индивидуальные аминокислоты выбирают на основании их положения в вариабельной области легкой или тяжелой цепи. Следует понимать, что положение гипермутации также может представлять собой контактное положение. В одном аспекте подход селективного мутагенеза представляет собой «направленный подход». Подразумевается, что выражение «направленный подход» включает способ мутирования выбранных аминокислотных остатков в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела направленным образом, например, «групповым направленным подходом» или «CDR направленным подходом». В «групповом направленном подходе» индивидуальные остатки аминокислот в определенных группах нацеливают для селективных мутаций, включающих группы I (включая L3 и H3), II (включая H2 и L1) и III (включая L2 и H1), где группы перечислены в порядке предпочтительности для нацеливания. В «CDR направленном подходе» индивидуальные остатки аминокислот в определенных CDR нацеливают для селективных мутаций в следующем порядке предпочтительности нацеливания: H3, L3, H2, L1, H1 и L2. Проводят мутацию выбранных аминокислотных остатков, например, по меньшей мере на два остатка других аминокислот и определяют воздействие мутации на активность антитела. Активность измеряют как изменение специфичности/аффинности связывания антитела и/или нейтрализации эффективности антитела. Следует понимать, что подход селективного мутагенеза можно использовать для оптимизации любого антитела, полученного из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с генами IgG зародышевой линии человека, антитела человека, выделенные из В-клеток человека. Подход селективного мутагенеза можно использовать для антител, которые не могут быть в дальнейшем оптимизированы с использованием технологии фагового дисплея. Следует понимать, что антитела из любого источника, включая фаговый дисплей, трансгенных животных с генами IgG зародышевой линии человека, антитела человека, выделенные из В-клеток человека, могут быть подвергнуты обратной мутации перед или после подхода селективного мутагенеза.

Выражение «рекомбинантное антитело человека» включает антитела человека, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными способами, как, например, антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным для генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки) или антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют с помощью других способов, включающих слайсинг последовательностей иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из зародышевой последовательности иммуноглобулина человека (см., Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или когда используют животных, трансгенных для последовательностей IgG человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, последовательности аминокислот областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой такие, которые, хотя и получены из или являются родственными зародышевым последовательностям VH и VL человека, могут не существовать в природе в рамках иммунной системы зародышевого антитела человека in vivo. Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела представляют собой результат подхода селективного мутагенеза или обратной мутации или обоих.

Выражение «выделенное антитело» относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих другую антигенную специфичность (например, выделенное антитело, которое специфически связывает hIL-18, по существу не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от hIL-18). Выделенное антитело, которое специфически связывает hIL-18, может связывать молекулы IL-18 других видов. Более того, выделенное антитело может по существу не содержать других клеточных веществ и/или химических соединений.

Выражение «нейтрализующее антитело» (или «антитело, которое нейтрализует активность hIL-18») включает антитело, чье связывание с hIL-18 приводит к ингибированию биологической активности hIL-18. Такое ингибирование биологической активности hIL-18 может быть оценено путем измерения одного или нескольких индикаторов биологической активности hIL-18, таких как вызывание продуцирования IFNγ Т-клетками или NK-клетками, или ингибирование связывания рецептора IL-18 в анализе связывания рецептора IL-18 человека. Данные индикаторы биологической активности hIL-18 могут быть оценены с использованием одного или нескольких стандартов в анализах in vitro или in vivo, известных в данной области.

Термин «активность» включает активности, такие как специфичность/аффинность связывания антитела в отношении антигена, например, антитела против hIL-18, которое связывается с антигеном IL-18, и/или нейтрализующая эффективность антитела, например, антитела против hIL-18, чье связывание с hIL-18 ингибирует биологическую активность hIL-18, например, ингибирование пролиферации бластов РНА или ингибирование связывания рецептора в анализе связывания рецептора IL-18 человека.

Выражение «поверхностный плазмонный резонанс» включает оптическое явление, которое дает возможность анализа в режиме реального времени биоспецифических взаимодействий путем обнаружения изменений в концентрациях белка в биосенсорной матрице, например, с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Швеция и Piscataway, NJ.). Дополнительные определения см. в публикациях Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19- 26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., el al. (1995) J. MoI. Recognit. 8:125-131; и Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277, полное описание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.

Термин «Koff», как он использован в данном описании, предназначен для обозначения константы скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Термин «Kd», как он использован в данном описании, предназначен для обозначения константы диссоциации взаимодействия определенного антитела-антигена.

Выражение «молекула нуклеиновой кислоты» включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но в одном аспекте относится к двухцепочечной ДНК.

Выражение «выделенная молекула нуклеиновой кислоты», как оно использовано в данном описании при определении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3), которые связывают hIL-18 (включая «выделенные антитела»), включает молекулу нуклеиновой кислоты, в которой последовательность нуклеотидов, кодирующая антитело или часть антитела, не содержит других последовательностей нуклеотидов, кодирующих антитела или части антител, которые связывают антигены, отличные от hIL-18, указанные другие последовательности могут по природе примыкать к нуклеиновой кислоте в геномной ДНК человека. Таким образом, например, выделенная молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, кодирующая область VH антитела против IL-18, не содержит других последовательностей, кодирующих другие области VH, которые связывают антигены, отличные от IL-18. Также подразумевается, что выражение «выделенная молекула нуклеиновой кислоты» включает последовательности, кодирующие бивалентные, биспецифические антитела, такие как диатела, в которых области VH и VL не содержат других последовательностей, отличающихся от последовательностей диатела.

Выражение «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») относится к клетке, в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии. Следует понимать, что подобные термины подразумеваются, как относящиеся не только к конкретной рассматриваемой клетке, но и к потомству таких клеток. Поскольку определенные модификации могут существовать в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо влияний окружающей среды, такое потомство может, в действительности, не быть идентичным исходной клетке, но оно все еще входит в объем термина «клетка-хозяин», как он использован в данном описании.

Термин «модифицированный», как он использован в данном описании, предназначен для обозначения изменений одной или нескольких аминокислот в антителах или их антигенсвязывающих частях. Изменение может быть вызвано путем добавления, замещения или удаления аминокислоты в одном или нескольких положениях. Изменение может быть осуществлено с использованием известных способов, таких как ПЦР мутагенез.

Термин «примерно», как он использован в данном описании, предназначен для обозначения диапазонов приблизительно на 10-20% больших или меньших, чем указанное значение. В некоторых обстоятельствах специалисту в данной области будет понятно, что вследствие природы приведенного значения термин «примерно» может означать больше или меньше, чем 10-20% отклонение от значения.

Выражение «уменьшение/дезактивация вирусов», как оно использовано в данном описании, предназначено для обозначения снижения числа вирусных частиц в конкретном образце («уменьшение»), а также снижения активности, например, но без ограничения, инфекционности или способности к репликации вирусных частиц в конкретном образце («дезактивация»). Такое снижение числа и/или активности вирусных частиц может составлять примерно от 1% до примерно 99%, предпочтительно примерно от 20% до примерно 99%, более предпочтительно примерно от 30% до примерно 99%, более предпочтительно примерно от 40% до примерно 99%, еще более предпочтительно примерно от 50% до примерно 99%, еще более предпочтительно примерно от 60% до примерно 99%, и еще более предпочтительно примерно от 70% до примерно 99%, еще более предпочтительно примерно от 80% до примерно 99% и еще более предпочтительно примерно от 90% до примерно 99%. В некоторых неограничивающих вариантах осуществления количество вирусов, если они присутствуют, в очищенном продукте антитела составляет менее чем ID50 (количество вируса, которое будет инфицировать 50% популяции-мишени) для данного вируса, предпочтительно по меньшей мере в 10 раз меньше, чем ID50 для данного вируса, более предпочтительно по меньшей мере в 100 раз меньше, чем ID50 для данного вируса, и еще более предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз меньше, чем ID50 для данного вируса.

Выражение «контактное положение» включает положение аминокислот в CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела, которое занимает аминокислота, которая контактирует с антигеном в одном из двадцати шести известных структур антитело-антиген. Если аминокислота CDR в любой из двадцати шести известных расшифрованных структур комплексов антитело-антиген контактирует с антигеном, то такая аминокислота может рассматриваться как занимающая контактное положение. Аминокислота, которая контактирует с антигенами, с более высокой вероятностью занимает контактное положение, чем находится в неконтактном положении. В одном аспекте контактное положение представляет собой положение в CDR, которое содержит аминокислоту, которая контактирует с антигеном больше, чем в 3 из 26 структур (>1,5%). В другом аспекте контактное положение представляет собой положение в CDR, которое содержит аминокислоту, которая контактирует с антигеном больше, чем в 8 из 25 структур (>32%).

2. Генерирование антитела

Термин «антитело», как он использован в данном разделе, относится к целому антителу или к его антигенсвязывающему фрагменту.

Антитела настоящего изобретения могут быть образованы множеством методов, включая иммунизацию животного представляющим интерес антигеном с последующими общепринятыми методологиями моноклональных антител, например, стандартными методами гибридизации соматических клеток Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495. Хотя способы гибридизации соматической клетки являются предпочтительными, в принципе, можно использовать другие методы продуцирования моноклонального антитела, например, вирусную или онкогенетическую трансформацию В лимфоцитов.

Одной из предпочтительных животных систем для получения гибридом является мышиная система. Продуцирование гибридомы представляет собой хорошо разработанный способ. Протоколы иммунизации и методы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области. Также известны партнеры для слияния (например, мышиные клетки миеломы) и методы слияния.

Антитело предпочтительно может представлять собой антитело человека, химерное или гуманизированное антитело. Химерные или гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены из представляющей интерес нечеловеческой гибридомы и сконструированы таким образом, чтобы они содержали немышиные (например, человеческие) иммуноглобулиновые последовательности, с использованием стандартных способов молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела мышиные вариабельные области могут быть связаны с константными областями человека с использованием способов, известных в данной области (см., например, патент США 4816567, Cabilly et al.). Для создания гуманизированного антитела мышиные области CDR могут быть вставлены в рамку считывания человека с использованием способов, известных в данной области (см., например, патент США 5225539, Winter, и патенты США 5530101; 5585089; 5693762 и 6180370, Queen et al.).

В одном неограничивающем варианте осуществления антитела согласно настоящему изобретению представляют собой моноклональные антитела человека. Такие моноклональные антитела человека, направленные против IL-18, могут быть образованы с использованием трансгенных или трансхромосомных мышей, несущих скорее части иммунной системы человека, чем мышиной системы. Данные трансгенные и трансхромосомные мыши включают мыши, указанные в данном описании как мыши HuMAb Mouse® (Medarex, Inc.), KM Mouse® (Medarex, Inc.) и XenoMouse® (Amgen).

Кроме того, альтернативные трансхромосомные животные системы, экспрессирующие гены иммуноглобулинов человека, доступны в данной области и могут использоваться для выработки антител против IL-18 настоящего изобретения. Например, можно использовать мышей, несущих как трансхромосомы тяжелой цепи человека, так и трансхромосомы легкой цепи человека, указанные как «мыши ТС»; такие мыши описаны Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Кроме того, в данной области были описаны коровы, несущие трансхромосомы тяжелой и легкой цепи человека (например, Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894 и заявка PCT No. WO 2002/092812), и могут использоваться для выработки антител против IL-18 настоящего изобретения.

Рекомбинантные антитела человека настоящего изобретения, включая антитела против IL-18 и их антигенсвязывающие части, или описанные в данном описании родственные антитела против IL-18 могут быть выделены путем скрининга библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител, например, библиотеки scFv фагового дисплея, полученной с использованием кДНК VL и VH, полученных из мРНК, полученных из лимфоцитов человека. Методики получения и скрининга таких библиотек известны в данной области. Помимо коммерчески доступных наборов для генерирования библиотек фагового дисплея (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, каталожный № 27-9400-01; и набор фагового дисплея Stratagene SurfZApTM, каталожный № 240612, полное описание которых включено в данное описание), примеры способов и реагентов, особенно подходящих для применения при генерировании и скрининге библиотек дисплея антител, можно найти, например, у Ladner et al., патент США No. 5223409; Kang et al., публикация PCT No. WO 92/18619; Dower et al., публикация PCT No. WO 91/17271; Winter et al., публикация PCT No. WO 92/20791; Markland et al., публикация PCT No. WO 92/15679; Breitling et al., публикация PCT No. WO 93/01288; McCafferty et al., публикация PCT No. WO 92/01047; Garrard et al., публикация PCT No. WO 92/09690; Fuchs et al., (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al., (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al., (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al., (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al., (1992) J MoI Biol 226:889-896; Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628; Gram et al., (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al., (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al., (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; и Barbas et al., (1991) PNAS 88:7978-7982; полное описание которых включено в данное изобретение.

Моноклональные антитела согласно настоящему изобретению также могут быть получены с использованием мышей SCID, в организме которых были воспроизведены иммунные клетки человека таким образом, что при иммунизации может быть генерирован антителогенез. Такие мыши описаны, например, в патентах США 5476996 и 5698767 Wilson et al.

В одном варианте осуществления способы настоящего изобретения включают антитела и части антител против IL-18, антитела и части антител, родственные антителам против IL-18, и антитела и части антител человека со свойствами эквивалентными антителам против IL-18, такие как связывающиеся с высокой аффинностью с hIL-18 с низкой кинетикой диссоциации и высокой нейтрализующей способностью. В одном аспекте изобретение относится к лечению с использованием выделенного антитела человека или его антигенсвязывающей части, которое диссоциирует от hIL-18 с Kd примерно 1×10-8М или меньше и константой скорости Koff 1×10-3 с-1 или меньше, обе из которых определены методом поверхностного плазмонного резонанса. В конкретных неограничивающих вариантах осуществления антитело против IL-18, очищенное согласно изобретению, конкурентно ингибирует связывание АВТ-325 с IL-18 в физиологических условиях.

Еще в одном варианте осуществления антитела против IL-18 или их фрагменты могут быть изменены, при этом константная область антитела модифицируется для уменьшения по меньшей мере одной опосредованной константной областью биологической эффекторной функции по сравнению с немодифицированным антителом. Для модификации антитела настоящего изобретения таким образом, чтобы оно проявляло пониженное связывание с рецептором Fc, сегмент иммуноглобулиновой константной области антитела может быть мутирован в определенных областях, необходимых для взаимодействий с рецептором Fc (FcR) (см., Canfield and Morrison (1991) J Exp. Med. 173:1483-1491; и Lund et al. (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662, полное содержание которых включено в данное описание). Уменьшение FcR-связывающей способности антитела может также уменьшать другие эффекторные функции, которые основаны на взаимодействиях с FcR, такие как опсонизация и фагоцитоз, и антиген-зависимая клеточная цитотоксичность.

3. Продуцирование антитела

Для экспрессирования антитела настоящего изобретения ДНК, кодирующие частичные или полные легкие и тяжелые цепи, вставляют в один или несколько векторов экспрессии, таких как гены, которые функционально связаны с транскрипционными и трансляционными контрольными последовательностями (см., например, патент США 6914128, полное содержание которого включено в данное описание посредством ссылки). В данном контексте термин «функционально связанный» предназначен для обозначения того, что ген антитела лигирован в вектор таким образом, что транскрипционные и трансляционные последовательности в векторе выполняют предназначенную им функцию регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и контрольные последовательности экспрессии выбирают таким образом, чтобы они были совместимыми с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, более конкретно, оба гена вставлены в один и тот же вектор экспрессии. Вставку генов антитела в вектор экспрессии проводят стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции фрагмента гена антитела и вектора или лигированием к срезанному концу, если сайт рестрикции не присутствует). Перед вставкой последовательностей антитела или относящихся к антителу легкой и тяжелой цепи, вектор экспрессии уже может содержать последовательности постоянной области антитела. Например, один из подходов для превращения антитела против IL-18 или связанными с антителом против IL-18 последовательностями VH и VL к генам полного антитела заключается в их инсерции в векторы экспрессии, уже кодирующие постоянные области тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, так что сегмент VH является функционально связанным с СН сегментом(ами) внутри вектора, и VL сегмент является функционально связанным с CL сегментом внутри вектора. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид будет связан в рамке считывания с аминным концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может представлять собой иммуноглобулиновый сигнальный пептид или гетерологичный сигнальный пептид (т.е. сигнальный пептид из неиммуноглобулинового белка).

Помимо генов цепи антитела, рекомбинантный вектор экспрессии настоящего изобретения может содержать одну или несколько регулирующих последовательностей, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетку-хозяина. Подразумевается, что термин «регулирующая последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие контрольные элементы экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регулирующие последовательности описаны, например, Goeddel; в Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), все указания которой включены в данное описание посредством ссылки. Специалистам в данной области будет понятно, что конструирование вектора экспрессии, включая выбор регулирующих последовательностей, может зависеть от таких факторов как выбор клетки-хозяина, предназначенной для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Подходящие регулирующие последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такой как промотор/энхансер CMV), вируса Simian 40 (SV40) (такой как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Дополнительно описание вирусных регулирующих элементов и их последовательностей см., например, в патенте США 5168062, Stinski, патенте США 4510245, Bell et al., и патенте США 4968615, Schaffher et al., полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки.

В дополнение к генам цепей антител и регуляторных последовательностей, рекомбинантный вектор экспрессии настоящего изобретения может содержать одну или несколько дополнительных последовательностей, таких как последовательность, которая регулирует репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, начало репликации) и/или селектируемый маркерный ген. Селектируемый маркерный ген облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США 4399216, 4634665 и 5179017, все Axel et al., полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки). Например, обычно селектируемый маркерный ген придает устойчивость в отношении лекарственных средств, таких как G418, гидромицин или метотрексат, клетке-хозяину, в которую был введен вектор. Подходящие селектируемые маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr- клетках-хозяевах с селекцией/амплификацией по метотрексату) и ген neo (для селекции по G418).

Антитело или часть антитела настоящего изобретения могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетку-хозяина. Для рекомбинантной экспрессии антитела, клетку-хозяина трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи антитела, так что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и секретируются в среду, в которой культивируют клетку-хозяина, из которой антитела могут быть выделены. Стандартные методологии рекомбинантной ДНК используют для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, введения данных генов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения данных векторов в клетки-хозяева, такие как описано в справочнике Sambrook, Fritsch и Maniatis (ред.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989), Ausubel et al. (ред.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и патентах США 4816397 и 6914128, полное содержание которых включено в данное описание.

Для экспрессии легкой и тяжелой цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующие тяжелую и легкие цепи, трансфицируют в клетку-хозяина с помощью стандартных методов. Различные формы термина «трансфекция» предназначены для охвата широкого множества методов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорация, кальций-фосфатное осаждение, DEAE-декстрановая трансфекция и тому подобное. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела настоящего изобретения либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках, таких как клетки-хозяева млекопитающих, является подходящей, поскольку такие эукариотические клетки и, в частности, клетки млекопитающих, с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, будут собирать и секретировать правильно сложенное и иммунологически активное антитело. Сообщалось, что прокариотическая экспрессия генов антител является неэффективной для продуцирования с высокими выходами активного антитела (Boss and Wood (1985) Immunology Today 6:12-13, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки).

Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторы, описанные в данном описании, являются прокариоты, дрожжи или описанные выше клетки высших эукариотов. Подходящие прокариоты для данной цели включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы, например кишечные бактерии, такие как Escherichia, например E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans и Shigella, а также Bacilli, такие как B. subtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41P, описанные в DD 266710, опубликованном 12 апреля 1989), Pseudomonas, такие как P. Aeruginosa и Streptomyces. Одним из подходящих клонируемых хозяев E. coli является E. coli 294 (ATCC 31,446), хотя другие штаммы, такие как E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) и E. coli W3110 (ATCC 27,325), являются подходящими. Данные примеры являются иллюстративными, но не ограничивающими.

В дополнение к прокариотам, эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих полипептид. Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи, наиболее общепринято используются в ряде низших эукариотических хозяев-микроорганизмов. Однако ряд других родов, видов и штаммов доступен в настоящее время и может использоваться, таких как Schizosaccharomyces pombe; хозяева Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. Thermotolerans и K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis; и мицелиальные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus хозяева, такие как A. nidulans и A. niger.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированных антител получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают растительные клетки и клетки насекомых. Были выявлены многочисленные бакуловирусные штаммы и варианты и соответствующие рекомендуемые клетки-хозяева насекомых от таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Публично доступно множество вирусных штаммов для трансфекции, например, вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы можно использовать в качестве вирусов согласно настоящему изобретению, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Растительные клеточные культуры хлопка, кукурузы, картофеля, сои, петунии, помидоров и табака также можно использовать в качестве хозяев.

Подходящие клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител настоящего изобретения включают клетки яичников китайского хомяка (клетки СНО) (включая dhfr-CHO клетки, описанные Urlaub и Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220, используемые вместе с DHFR-селектируемым маркером, например, как описано в публикации Kaufman and Sharp (1982) MoI. Biol. 159:601-621, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Когда векторы рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антитела вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение промежутка времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Другие примеры полезных клеток-хозяев млекопитающих представляют собой линию CV1 обезьяньей почки, трансформированную с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линию эмбрионной почки человека (293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки детенышей хомяка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомяка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); клетки мыши Сертоли TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки шейной карциномы человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы буффало (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4 и линия гепатомы человека (Hep G2), полное описание которых включено в данное изобретение посредством ссылки.

Клетки-хозяева трансформируют с помощью описанных выше векторов экспрессии или клонирования для продуцирования антитела и культивируют в обычной питательной среде, модифицированной подходящим образом для индуцирования промоторов, селекции трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемую последовательность.

Клетки-хозяева, используемые для продуцирования антитела, можно культивировать в разных средах. Коммерчески доступные среды, такие как Ham's F10TM (Sigma), минимальная незаменимая средаTM ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по Дульбекко среда ИглаTM ((DMEM), Sigma) являются подходящими для культивирования клеток-хозяев. Кроме того, любую среду, описанную Ham et al., в Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. в Biochem. 102:255 (1980), в патентах США 4767704; 4657866; 4927762; 4560655 или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или патенте США No. Re. 30985, полное содержание которых включено в данное описание посредством ссылки, можно использовать в качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любая такая среда может быть дополнена при необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеотидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамициновый препарат), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечной концентрации в микромолярном диапазоне) и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Также могут быть включены любые другие необходимые дополнительные добавки в подходящих концентрациях, которые известны специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное, представляют собой ранее используемые для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и будут очевидны для специалиста в данной области.

Клетки-хозяева также можно использовать для продуцирования частей цельных антител, таких как фрагменты Fab или молекулы scFv. Следует понимать, что вариации указанного выше способа входят в объем настоящего изобретения. Например, может оказаться желательным трансфицировать клетку-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе) антитела настоящего изобретения. Рекомбинантные технологии ДНК также можно использовать для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих обе или одну из легкой и тяжелой цепей, которые не нужны для связывания с IL-18, в частности hIL-18. Молекулы, экспрессированные из таких усеченных молекул ДНК, также входят в объем антител настоящего изобретения. Дополнительно, можно продуцировать бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь представляют собой антитело настоящего изобретения, а другая тяжелая и легкая цепь являются специфическими для антигена, отличного от IL-18, за счет сшивания антитела настоящего изобретения со вторым антителом с помощью стандартных методов химического сшивания.

В подходящей системе для рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части настоящего изобретения рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr-CHO посредством кальций фосфат-опосредованной трансфекции. В рекомбинантном векторе экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функицонально связаны с регулирующими элементами CVM-энхансер/AdMLP-промотор для управления высокими уровнями транскрипции генов. Рекомбинантный вектор экспрессии также содержит ген DGFR, который дает возможность селекции клеток СНО, которые были трансфицированы вектором, с использованием селекции/амплификации по метотрексату. Отобранные трансформанты клеток-хозяев культивируют для экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела, и полное антитело выделяют из культуральной среды. Стандартные методы молекулярной биологии используют для получения рекомбинантного вектора экспрессии трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды.

При использовании рекомбинантных технологий антитела могут образовываться внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретироваться в среду. В одном аспекте, если антитело продуцируется внутриклеточно, на первой стадии частицы дебриса, либо клетки-хозяева, либо лизированные клетки (например, полученные в результате гомогенизации) могут быть удалены, например, с помощью центрифугирования или ультрафильтрования. Когда антитело секретируется в среду, супернатант из таких экспрессионных систем может быть первоначально концентрирован с использованием коммерчески доступных фильтров для концентрирования белка, например, ультрафильтрационные комплексы Amicon или Millipore Pellicon.

Предшествующие способу настоящего изобретения методы очистки антител от клеточного дебриса в начальной стадии зависят от места экспрессии антитела. Некоторые антитела могут секретироваться непосредственно из клетки в окружающую среду роста; другие образуются внутриклеточно. Для антител последнего типа первая стадия способа очистки обычно включает: лизис клеток, который может быть осуществлен различными способами, включая механическое рассекание, осмотический шок или ферментативную обработку. Такие методы разрушения высвобождают полное содержимое клетки в гомогенат и дополнительно производят субклеточные фрагменты, которые трудно удаляются из-за небольшого размера. Их обычно удаляют дифференциальным центрифугированием или фильтрованием. Когда антитело секретируется, супернатанты из таких экспрессионных систем обычно первоначально концентрируют с использованием коммерчески доступных фильтров для концентрирования белка, например, ультрафильтрационные комплексы Amicon или Millipore Pellicon. Когда антитело секретируется в среду, рекомбинантные клетки-хозяева могут быть также отделены от клеточной культуральной среды, например, с помощью тангенциальной поточной фильтрации. Антитела могут быть дополнительно выделены из культуральной среды с использованием методов очистки антитела настоящего изобретения.

4. Очистка антитела

4.1. Общая очистка антитела

Изобретение относится к способу продуцирования очищенного (или содержащего сниженное количество БКХ) препарата антитела из смеси, содержащей антитело и по меньшей мере один БКХ. Способ очистки настоящего изобретения начинается на стадии отделения, когда антитело уже было получено с использованием описанных выше способов и общепринятых методов в данной области. Обычно, в данной области смеси антитело-БКХ подвергают захвату белком А (например, колонка с белком А) в качестве первоначальной стадии очистки, поскольку антитело связывается с белком А, тогда как БКХ протекает через колонку. Способы очистки по настоящему изобретению имеют то преимущество, что нет необходимости подвергать смесь, содержащую антитело и по меньшей мере один БКХ, захвату белком А (например, колонка с белком А) в качестве первоначальной стадии или в качестве любой стадии способа очистки. В таблице 1 суммирован один вариант схемы очистки. Предусматриваются вариации данной схемы, и они входят в объем настоящего изобретения.

Таблица 1
Стадии очистки и связанные с ними цели
Стадия очистки Цель
Первичное выделение Осветление матричных образцов
Катионообменная хроматография Захват антитела, белка клетки-хозяина и снижение связанных с ним примесей
Ультрафильтрование/диафильтрование Концентрирование и буферный обмен
Анионообменная хроматография Сокращение белков и ДНК клеток-хозяев
Хроматография на фенилсефарозе НР Уменьшение агрегатов антител и белков клеток-хозяев
Фильтрация вирусов Удаление больших вирусов, если они присутствуют
Конечное ультрафильтрование/диафильтрование Концентрирование и получение состава антитела

После получения осветленного раствора или смеси, содержащей антитело, отделение антитела от других белков, продуцируемых клеткой, таких как БКХ, проводят с использованием комбинации различных способов очистки, включая стадию(и) отделения с помощью ионного обмена и стадию(и) отделения за счет гидрофобных взаимодействий. На стадиях отделения смеси белков разделяют на основании их заряда, степени гидрофобности или размера. В одном аспекте изобретения разделение проводят с использованием хроматографии, включающей катионные, анионные и гидрофобные взаимодействия. Несколько разных хроматографических смол доступно для каждого из данных способов, дающих возможность приспособления схемы очистки для определенного белка. Сущность каждого из способов разделения заключается в том, что белки могут либо проходить по колонке с различной скоростью, достигая физического разделения, которое увеличивается по мере дополнительного прохождения вниз по колонке, или селективного удерживания на разделяющей среде при избирательном элюировании с помощью различных растворителей. В некоторых случаях антитело отделяют от примесей, когда такие примеси специфически удерживаются на колонке, а антитело не удерживается, т.е. антитело находится в вытекающем потоке жидкости.

Как отмечено выше, точное приспособление схемы очистки основано на обсуждении белка, предназначенного для очистки. В некоторых вариантах осуществления стадии отделения по настоящему изобретению используются для отделения антитела от одного или нескольких БКХ. Антитела, которые могут быть с успехом очищены с использованием описанных в данном описании способов, включают, но не ограничиваются ими, антитела IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM человека. В некоторых вариантах осуществления стратегия очистки согласно настоящему изобретению исключает применение аффинной в отношении белка А хроматографии. Такие варианты осуществления особенно полезны для очистки антител IgG3, поскольку известно, что антитела IgG3 связываются с белком А неэффективно. Другие факторы, которые дают возможность специфического приспособления схемы очистки включают, но не ограничиваются указанным: присутствие или отсутствие области Fc (например, в контексте полной длины антитела по сравнению с его Fab фрагментом); определенные зародышевые последовательности, используемые для генерирования представляющего интерес антитела; и состав аминокислот антитела (например, первичная последовательность антитела, а также общий заряд/гидрофобность молекулы). Антитела, разделяющие одну или несколько характеристик, могут быть очищены с использованием стратегий очистки, приспособленных для использования преимущества данной характеристики.

4.2. Первичное выделение

Первоначальные стадии способов очистки по настоящему изобретению включают первую фазу осветления и первичного выделения антитела против IL-18 из матричного образца. Дополнительно первичный способ выделения также может быть моментом дезактивации вирусов, которые могут присутствовать в матричном образце. Например, можно использовать любой один или несколько из множества способов дезактивации вирусов во время фазы первичного выделения способа очистки, включая термическую дезактивацию (пастеризация), дезактивацию с помощью рН, обработку растворителем/детергентом, УФ и γ-облучение и добавление некоторых химических дезактивирующих агентов, таких как β-пропиолактон или, например, фенантролин меди, как в патенте США 4535972, полное содержание которого включено в данное описание посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения матричный образец подвергают рН-вирусной дезактивации во время фазы первичного выделения.

Способы рН-вирусной дезактивации включают, но не ограничиваются указанным, инкубирование смеси в течение определенного промежутка времени при низком рН, последующую нейтрализацию рН и удаление частиц путем фильтрования. В некоторых вариантах осуществления смесь будут инкубировать при рН от 2 до 5, предпочтительно при рН от 3 до 4 и более предпочтительно при рН 3,5. рН смеси в образце может быть снижен с использованием любой подходящей кислоты, включая, но, не ограничиваясь указанным, лимонную кислоту, уксусную кислоту, каприловую кислоту или другие подходящие кислоты. Выбор уровня рН в большой степени зависит от профиля стабильности продукта антитела и буферных компонентов. Известно, что качество целевого антитела во время дезактивации вирусов при низком рН зависит от рН и продолжительности инкубирования при низком рН. В некоторых вариантах осуществления продолжительность инкубации при низком рН будет составлять от 0,5 часа до 2 часов, предпочтительно от 0,5 часа до 1,5 часов и более предпочтительно продолжительность инкубации будет составлять 1 час. Дезактивация вирусов зависит от тех же параметров помимо концентрации белка, которая может снижать дезактивацию при высоких концентрациях. Таким образом, можно подобрать правильные параметры концентрации белка, рН и продолжительности дезактивации для достижения желаемого уровня дезактивации вирусов.

В некоторых вариантах осуществления дезактивация вирусов может достигаться с использованием подходящих фильтров. Неограничивающим примером подходящего фильтра является фильтр Ultipor DV50TM от Pall Corporation. Хотя в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используется такая фильтрация во время фазы первичного выделения, в других вариантах осуществления она используется на других фазах способа очистки, включая предпоследнюю или конечную стадию очистки. В некоторых вариантах осуществления используют альтернативные фильтры для вирусной дезактивации, такие как, но, не ограничиваясь указанным, фильтры ViresolveTM (Millipore, Billerica, Mass.); фильтры Zeta Plus VRTM (CUNO; Meriden, Conn.); и фильтры PlanovaTM (Asahi Kasei Pharma, Planova Division, Buffalo Grove, 111).

В тех вариантах осуществления, где используется вирусная дезактивация, образец смеси может быть приспособлен, при необходимости, для следующих стадий очистки. Например, после вирусной дезактивации при низком рН, рН образца смеси обычно доводят до более нейтрального рН, например, примерно от 5,0 до примерно 8,5, перед продолжением способа очистки. Дополнительно, смесь может быть промыта под напором водой для инъекций (WFI) для получения желаемой проводимости.

В некоторых вариантах осуществления первичное выделение будет включать одну или несколько стадий центрифугирования для дополнительного осветления матричного образца, тем самым способствуя очистке антител против IL-18. Центрифугирование образца можно проводить, например, не в качестве ограничения, при от 7000g до приблизительно 12750g. В контексте крупномасштабной очистки такое центрифугирование можно проводить во встроенной линии при скорости потока, установленной для достижения, например, не в качестве ограничения, уровня мутности в 150 NTU (нефелогические единицы мутности) в полученном супернатанте. Такой супернатант затем может быть собран для дальнейшей очистки.

В некоторых вариантах осуществления первичное выделение будет включать применение одной или нескольких стадий глубокого фильтрования для дополнительного осветления матричного образца, тем самым способствуя очистке антител против IL-18. Фильтры для глубокого фильтрования содержат фильтрационную среду, имеющую номинальную плотность. Такая номинальная плотность дает возможность частицам большего размера улавливаться около поверхности фильтра, тогда как более мелкие частицы проникают в отверстия с большей площадью на поверхности фильтра, улавливаясь только в меньших отверстиях около центра фильтра. В некоторых вариантах осуществления стадия глубокого фильтрования может быть стадией глубокого фильтрования для удаления липидов. Хотя в некоторых вариантах осуществления стадии глубокого фильтрования используются только во время фазы первичного выделения, в других вариантах осуществления используются объемные фильтры, включая объемные фильтры для удаления липидов, во время одной или нескольких дополнительных фаз очистки. Неограничивающие примеры объемных фильтров, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают объемные фильтры модели CunoTM 30/60ZA (3M Corp.), и двухслойные фильтрующие картриджи 0,45/0,2 мкм SartoporeTM.

4.3. Ионообменная хроматография

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам получения препарата антител со сниженным содержанием БКХ из смеси, содержащей антитело и по меньшей мере один БКХ, путем проведения по меньшей мере одной стадии ионообменного разделения смеси таким образом, что получают элюат, содержащий антитело. Ионообменное разделение включает любой способ, с помощью которого два вещества разделяют на основании различия в их соответствующих ионных зарядах и в нем можно использовать либо катионообменный материал, либо анионообменный материал.

Применение катионообменного материала относительно анионообменного материала основано на общем заряде белка. Следовательно, в объем настоящего изобретения входит применение стадии анионного обмена перед применением стадии катионного обмена или стадии катионного обмена перед применением стадии анионного обмена. Кроме того, в объем настоящего изобретения входит применение только стадии катионного обмена, только стадии анионного обмена или любой серийной комбинации этих двух стадий.

При проведении разделения первоначальную смесь антитела можно привести в контакт с ионообменным материалом за счет использования любого из множества способов, например, с использованием порционного способа очистки или хроматографического способа.

Например, в порционном способе очистки ионообменный материал получают или уравновешивают в желаемом исходном буфере. При получении или уравновешивании получают суспензию ионообменного материала. Раствор антитела приводят в контакт с суспензией для адсорбции предназначенного для отделения антитела на ионообменном материале. Раствор, содержащий БКХ, которые не связываются с ионообменным материалом, отделяют от суспензии, например, оставляя суспензию отстаиваться и удаляя супернатант. Суспензию можно подвергнуть одной или более стадиям промывки. При желании, суспензию можно привести в контакт с раствором более высокой проводимости для десорбции БКХ, которые связались с ионообменным материалом. Для элюирования связанных полипептидов может быть повышена концентрация соли в буфере.

В качестве метода ионообменного отделения можно также использовать ионообменную хроматографию. В случае ионообменной хроматографии отделение молекул происходит на основании различия в общем заряде молекулы. Для очистки антитела, антитело, для того чтобы связываться, должно иметь заряд, противоположный заряду функциональной группы, присоединенной к ионообменному материалу, например смоле. Например, антитела, которые обычно имеют общий положительный заряд в буфере с рН, ниже своей pI (изоэлектрической точки), будут хорошо связываться с катионообменным материалом, который содержит отрицательно заряженные функциональные группы.

При ионообменной хроматографии заряженные участки на поверхности растворенного вещества привлекаются противоположным зарядом, присоединенным к хроматографической матрице, при условии низкой ионной силы окружающего буфера. Элюирование обычно проводят путем повышения ионной силы (т.е. проводимости) буфера для конкурирования с растворенным веществом за заряженные сайты на ионообменной матрице. Изменение рН и тем самым изменение заряда растворенного вещества представляют собой другой путь для осуществления элюирования растворенного вещества. Изменение проводимости или рН может быть постепенным (градиентное элюирование) или ступенчатым (ступенчатое элюирование).

Анионные или катионные заместители могут быть присоединены к матрицам для образования анионных или катионных носителей для хроматографии. Неограничивающие примеры анионообменных заместителей включают диаминоэтильную (DEAE), четвертичную аминоэтильную (QAE) и четвертичную аминную (Q) группы. Катионные заместители включают карбоксиметил (CM), сульфоэтил (SE), сульфопропил (SP), фосфат(P) и сульфонат (S). Целлюлозные ионообменные смолы, такие как DE23TM, DE32TM, DE52TM, CM-23TM, CM-32TM и CM-52TM, доступны от Whatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K., также известны ионообменники на основе SEPHADEX® и поперечно сшитые ионообменники. Например, DEAE-, QAE-, CM- и SP-SEPHADEX® и DEAE-, Q-, CM- и S-SEPHAROSE® и SEPHAROSE® ионообменники быстрого протекания доступны от Pharmacia AB. Кроме того, как DEAE, так и CM модифицированные сополимеры этиленгликоля-метакрилата, такие как TOYOPEARLTM DEAE-650S или M, и TOYOPEARLTM CM-650S или M доступны от Toso Haas Co., Philadelphia, Pa.

Смесь, содержащая антитело и примеси, например БКХ, загружают на ионообменную колонку, такую как катионообменная колонка. Например, не в качестве ограничения, смесь можно загрузить при нагрузке примерно 80 г белка/л смолы в зависимости от используемой колонки. Примером подходящей катионообменной колонки является колонка диаметром 80 см×23 см длиной, объем слоя которой составляет примерно 116 л. Смесь, загруженная на такую катионную колонку, впоследствии может быть промыта буфером (уравновешивающим буфером). Антитело затем элюируют с колонки и получают первый элюат.

Данная ионообменная стадия облегчает захват представляющего интерес антитела при снижении количества примесей, таких как БКХ. В некоторых аспектах ионообменная колонка представляет собой катионообменную колонку. Например, не в качестве ограничения, подходящая смола для такой катионообменной колонки представляет собой смолу CM HyperDF. Данные смолы доступны из коммерческих источников, таких как Pall Corporation. Такая процедура катионного обмена может быть проведена при комнатной или близкой к комнатной температуре.

4.4. Ультрафильтрование/диафильтрование

В некоторых вариантах настоящего изобретения используют стадии ультрафильтрования и/или диафильтрования для дополнительной очистки и концентрирования образца антитела против IL-18. Ультрафильтрование подробно описано в “Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications», L. Zeman и A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996); и в Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9). Предпочтительный процесс фильтрования представляет собой тангенциальное проточное фильтрование, как описано в каталоге Millipore, озаглавленном "Pharmaceutical Process Filtration Catalogue," стр. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96). Ультрафильтрование обычно обозначают как фильтрование с использованием фильтров с размером пор меньше чем 0,1 мкм. При использовании фильтров, имеющих такой мелкий размер пор, объем образца может снижаться во время проникновения образца в буфере через фильтр, тогда как антитела против IL-18 должны удерживаться.

Диафильтрование представляет собой способ использования ультрафильтров для удаления и обмена солей, сахаров, неводных растворителей, отделения свободных от связанных видов, удаления вещества с низкой молекулярной массой или быстрого обмена ионного или рН окружения. Такие растворенные микрочастицы удаляются наиболее эффективно при добавлении растворителя к раствору, подвергаемому ультрафильтрованию при скорости, равной скорости ультрафильтрования. Это вымывает микрочастицы из раствора при постоянном объеме, эффективно очищая остающееся антитело. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стадию диафильтрования используют для обмена различных буферов, используемых согласно настоящему изобретению, необязательно перед дополнительной хроматографией или другими стадиями очистки, а также для удаления примесей из препаратов антител.

4.5. Хроматография гидрофобного взаимодействия

Настоящее изобретение также относится к способам получения препаратов антител со сниженным содержанием БКХ из смеси, содержащей антитело и по меньшей мере один БКХ, дополнительно включающей стадию отделения за счет гидрофобного взаимодействия. Например, первый элюат, полученный из ионообменной колонки, может быть подвергнут взаимодействию с материалом для гидрофобного взаимодействия таким образом, что получают второй элюат, имеющий пониженный уровень БКХ. Стадии хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) (хроматография с гидрофобным взаимодействием), такой как описано в настоящем изобретении, обычно проводят для удаления агрегатов белков, таких как агрегаты антител, и связанных со способом примесей.

При проведении отделения образец смеси приводят в контакт с ХГВ материалом, например, с использованием способа порционной очистки или с использованием колонки. Перед ХГВ очисткой может оказаться желательным удаление любых агентов, вызывающих диссоциацию комплексов, или очень гидрофобных веществ, например, путем пропускания смеси через предварительную колонку.

Например, в случае порционной очистки, ХГВ материал получают или уравновешивают в желаемом исходном буфере. При получении или уравновешивании получают суспензию ХГВ материала. Раствор антитела приводят в контакт с суспензией для адсорбции предназначенного для отделения антитела на ХГВ материале. Раствор, включающий БКХ, которые не связываются с ХГВ материалом, отделяют от суспензии, например, оставляя суспензию отстаиваться и удаляя супернатант. Суспензию можно подвергнуть одной или более стадиям промывки. При желании суспензию можно привести в контакт с раствором более низкой проводимости для десорбции антител, которые связались с ХГВ материалом. Для элюирования связанных антител концентрация соли в буфере может быть понижена.

В то время как ионообменная хроматография основана на выделении антител на основании их зарядов, в хроматографии с гидрофобным взаимодействием используются гидрофобные свойства антител. Гидрофобные группы антитела взаимодействуют с гидрофобными группами колонки. Чем более гидрофобным является белок, тем сильнее он будет взаимодействовать с колонкой. Таким образом, на стадии ХГВ удаляют примеси, образующиеся из клетки-хозяина (например, ДНК и другие высокомолекулярные и низкомолекулярные виды родственных продуктов).

Гидрофобные взаимодействия являются наиболее сильными при высокой ионной силе раствора, соответственно, такой вид отделения обычно проводят после осаждения солей или проведения ионообменных методов. Адсорбции антитела на колонке ХГВ способствуют высокие концентрации солей, но действительные концентрации могут меняться в широком диапазоне в зависимости от природы антитела и конкретного выбранного ХГВ лиганда. Различные ионы могут быть расположены в так называемой солюфобной серии в зависимости от того, промотируют ли они гидрофобное взаимодействие (высаливающее действие) или разрушают структуру воды (хаотропное действие) и приводят к ослаблению гидрофобных взаимодействий. Катионы, расположены по мере повышения высаливающего действия Ba++; Ca++; Mg++; Li+; Cs+; Na+; K+; Rb+; NH4+, тогда как анионы могут быть расположены по мере повышения хаотропного действия в следующем порядке PO--; SO4--; CH3CO3-; Cl-; Br-; NO3-; ClO4-; I-; SCN-.

Как правило, сульфаты Na, K или NH4 эффективно промотируют взаимодействие лиганд-белок при ХГВ. Соли могут быть введены в составы таким образом, что влияние силы взаимодействия будет представлено следующим соотношением (NH4)2SO4>Na2SO4>NaCl>NH4Cl>NaBr>NaSCN. Как правило, используют концентрации соли, составляющие примерно от 0,75 до примерно 2М для сульфата аммония или примерно от 1 до 4М NaCl.

Колонки ХГВ обычно включают базовую матрицу (например, поперечно-сшитую агарозу или синтетический сополимерный материал), с которой связаны гидрофобные лиганды (например, алкильные или арильные группы). Подходящие колонки ХГВ включают агарозную смолу, замещенную фенильными группами (например, колонка Phenyl SepharoseTM). Многие колонки ХГВ коммерчески доступны. Примеры включают, но не ограничиваются указанным, колонку быстрого потока с фенилсефарозой (Phenyl SepharoseTM 6) с низким или высоким замещением (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Швеция); высокоэффективную колонку с фенилсефарозой (Phenyl SepharoseTM) (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Швеция); высокоэффективную колонку с октилсефарозой (Octyl SepharoseTM) (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Швеция); FractogelTM EMD-пропильную или FractogelTM EMD фенильную колонки (E. Merck, Germany); Macro-PrepTM метильный или Macro-PrepTM трет-бутильный носители (Bio-Rad, California); колонку WP HI-Propyl (C3)TM (J. T. Baker, New Jersey); и эфирную, фенильную или бутильную колонки ToyopearlTM (TosoHaas, PA).

4.6 Примеры стратегии очистки

В некоторых вариантах осуществления первичное выделение может протекать путем последовательного применения стадий понижения рН, центрифугирования и фильтрования для удаления клеток и клеточного дебриса (включая БКХ) из собранного продукта в биореакторе. Например, не в качестве ограничения, такое первичное выделение может быть осуществлено за счет первоначального удаления клеток-хозяев путем ценрифугирования (6900×g) и понижения рН с конечным осветлением путем центрифугирования (12750×g) и объемной фильтрацией. В некоторых вариантах осуществления культура, содержащая антитела и среду, может быть подвергнута дезактивации рН с использованием рН примерно от 3,5 до примерно 4,0 в течение приблизительно от 1 до 1,5 часов примерно при 20°С. Понижение рН можно облегчить с использованием известных кислотных препаратов, таких как лимонная кислота, например 3М лимонная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, муравьиная кислота и тому подобное. Такое понижение уменьшает/дезактивирует, если не исключает полностью, загрязнение рН чувствительными вирусами и осаждает часть загрязнений среды и клеток-хозяев. После такого понижения собранный продукт с подкисленным рН может быть доведен до рН примерно от 4,5 до примерно 5,5 с использованием основания, такого как гидроксид натрия, например, 3М гидроксид натрия, и выдержан при данном рН в течение примерно 16-24 часов примерно при 8°С. После 16-24 часового периода температуру можно поднять примерно до 20°С. Культуру с отрегулированным рН можно центрифугировать примерно при 12750×g. Полученный образец супернатанта затем можно пропустить через набор фильтров, включающий, например, один фильтр 3×12 дюймов, приспособленный для трех 12-дюймовых объемных фильтров CunoTM модели 60ZA с номинальным размером пор, колеблющимся примерно от 0,2 до примерно 0,8 мкм, и один фильтр 3×30 дюймов, приспособленный для трех гидрофобных фильтрующих картриджей 30 дюймов - 0,22 мкм. Другие подходящие фильтрующие системы являются коммерчески доступными и входят в объем настоящего изобретения. Следует отметить, что специалист в данной области может изменить указанные условия, при этом не выходя за объем настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления осветленный супернатант затем дополнительно очищают с использованием катионообменной колонки. В некоторых аспектах уравновешивающий буфер представляет собой буфер, имеющий рН примерно 5,0. Неограничивающий пример подходящего буфера представляет собой смесь примерно 20 мМ цитрат натрия/лимонная кислота с 65 мМ NaCl, pH 5,0. После уравновешивания на колонку загружают образец, полученный на указанной выше первичной стадии выделения. Колонку затем промывают уравновешивающим буфером. Затем колонку подвергают элюированию с использованием буфера, имеющего большую ионную силу по сравнению с уравновешивающим буфером. Например, подходящий элюирующий буфер может представлять собой смесь 20 мМ цитрат натрия/лимонная кислота, 300 мМ NaCl, pH 5,0. Антитела против IL-18 будут элюироваться, и этот процесс можно контролировать с использованием УФ спектрофотометра, установленного при ОП280нм. В конкретном примере элюат с колонки можно собирать, когда поглощение достигнет примерно 3 ОП280нм и продолжать приблизительно до 2 ОП280нм. Следует понимать, что специалист в данной области может варьировать условия, при этом не выходя за объем настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления элюат с катионообменной колонки затем фильтруют с использованием, например, фильтра, отсекающего при молекулярной массе 30 КДа. Подходящий фильтр для данной стадии фильтрования представляет собой, например, целлюлозную ультрафильтрующую мембранную кассету Millipore с отсечением по молекулярной массе 30 КДа (MWCO). Ультрафильтрование можно продолжать до тех пор, пока элюат не достигнет конечной целевой концентрации, например 30 мг/мл. Данный фильтрат затем можно подвергнуть диафильтрованию с использованием подходящего буфера. Примером подходящего буфера является 20 мМ фосфат натрия и 150 мМ хлорида натрия, рН примерно 7,0.

В некоторых вариантах осуществления элюат с указанной выше стадии фильтрования с захватом подвергают второму ионообменному разделению, такому как стадия анионообменной хроматографии. Альтернативно, элюат после катионного обмена может быть подвергнут стадии анионообменной хроматографии, где элюат после катионного обмена уравновешивают подходящим буфером. Такая стадия анионного обмена снижает количество связанных с процессом примесей, таких как нуклеиновые кислоты, подобно белкам клеток-хозяев и ДНК. Данная стадия ионообменной хроматографии представляет собой поточный метод хроматографии, где представляющие интерес антитела ни взаимодействуют, ни связываются с твердой фазой колонки, например, Q SepharoseTM. Однако в действительности многие примеси будут взаимодействовать и связываться с твердой фазой колонки. Анионный обмен может быть осуществлен примерно при 12°С.

Неограничивающим примером подходящей колонки для данной стадии является колонка, набитая анионообменной смолой, такая как колонка быстрого потока Q SepharoseTM от GE Healthcare, Piscatway, NJ. Колонка может быть уравновешена с использованием множества (например, примерно 5-7) объемов колонки подходящего буфера, такого как смесь троламин/хлорид натрия. Пример подходящих условий включает примерно 25 мМ троламин с примерно 40 мМ хлорида натрия при рН 8,0. Специалист в данной области снова может варьировать условия, при этом не выходя за объем настоящего изобретения. Образец, собранный с вышеописанной стадии УФ/ДФ (UF/DF), разводят двумя объемами 50 мМ троламина, рН 8 и загружают на анионообменную колонку. В альтернативных вариантах осуществления на колонку загружают элюат, собранный во время стадии катионного обмена после регулирования рН и проводимости. После загрузки на колонку, ее промывают уравновешивающим буфером. Вытекающий поток, содержащий антитела против IL-18, можно контролировать с использованием УФ спектрофотометра при ОП280нм. В некоторых примерах элюат собирают от верхней части в 0,4 ОП280нм до нижней части в 0,6 ОП280нм.

Настоящее изобретение также относится к способам получения препарата антитела IL-18 со сниженным содержанием БКХ из образца смеси, содержащей антитело и по меньшей мере один БКХ, дополнительно включающим стадию разделения за счет гидрофобного взаимодействия, где прошедший ионный обмен поток подвергают взаимодействию с гидрофобным материалом таким образом, что получают второй элюат с пониженным уровнем БКХ.

При проведении разделения образец смеси приводят в контакт с ХГВ материалом, например, с использованием порционного способа очистки или с использованием колонки. Перед проведением очистки ХГВ может оказаться желательным удаление любых хаотропных агентов или очень гидрофобных веществ. В качестве примера в случае порционной очистки, ХГВ материал получают или уравновешивают в желаемом уравновешивающем буфере. Получают суспензию ХГВ материала. Раствор антитела приводят в контакт с суспензией для адсорбции предназначенного для отделения антитела на ХГВ материале. Раствор, содержащий БКХ, которые не связываются с ХГВ материалом, отделяют от суспензии, например, оставляя суспензию отстаиваться и удаляя супернатант. Суспензию можно подвергнуть одной или нескольким стадиям промывки. При желании, суспензию можно привести в контакт с раствором более низкой проводимости для десорбции антител, которые связались с ХГВ материалом. Для элюирования связанных антител концентрация соли в буфере может быть понижена.

В некоторых вариантах осуществления изобретения образец, содержащий антитела против IL-18, будет дополнительно обработан с использованием стадии разделения за счет гидрофобного взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления стадии разделения за счет гидрофобного взаимодействия будет включать стадию хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ). Неограничивающим примером подходящей колонки для стадии ХГВ является колонка, набитая ХГВ-смолой, такая как Phenyl HP SepharoseTM от GE Healthcare Pharmacia, Piscatway, NJ. Поток, полученный на предшествующей стадии, содержащий представляющие интерес антитела, может быть разведен равным объемом 2,2М сульфата аммония, 40 мМ фосфатом натрия, рН 7,0. Затем он может быть подвергнут фильтрованию с использованием 2-слойного фильтра примерно 0,45/0,2 мкм SartoporeTM или эквивалентного фильтра. В некоторых вариантах осуществления способ хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) включает два или более циклов.

В некоторых вариантах осуществления колонку ХГВ первоначально уравновешивают с использованием подходящего буфера. Примером подходящего буфера является 1,1М сульфат аммония, 20 мМ фосфат натрия, рН 7,0. Специалист в данной области может заменить уравновешивающий буфер, не отступая от объема настоящего изобретения, путем изменения концентраций буферных агентов и/или за счет замены на эквивалентные буферы. На колонку загружают разведенный образец после прохождения стадии анионного обмена и промывают несколько раз, например, три раза, уравновешивающим буфером.

Колонку элюируют с использованием подходящего элюирующего буфера. Подходящим примером такого буфера является 0,3М сульфат аммония, 9 мМ фосфат натрия при рН примерно 7,0. Представляющие интерес антитела можно обнаруживать и собирать с использованием обычного спектрофотометра от верхней части при 1 ОП280 нм до нижней части пика при 4 ОП280нм.

В некоторых вариантах осуществления элюат со стадии хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) подвергают фильтрованию для удаления вирусных частиц, включая цельные вирусы. Подходящим фильтром является фильтр Ultipor DV50TM от Pall Filtron, Northborough, MA. На данной стадии фильтрования также можно использовать другие вирусные фильтры, и они хорошо известны специалистам в данной области. В определенном аспекте элюат ХГВ пропускают через ряд предварительно смоченных фильтров, состоящий из 0,1 мкм фильтра и 10 дюймового нанофильтра при давлении примерно 34 фт/кв.дюйм. Необязательно после процесса фильтрации фильтр промывают с использованием, например, элюирующего буфера ХГВ для удаления каких-либо антител, оставшихся на фильтре. Фильтрат можно хранить в предварительно стерилизованном контейнере примерно при 12°С.

В следующих вариантах осуществления указанный выше фильтрат снова подвергают ультрафильтрованию/диафильтрованию. Стадия является важной, если конечным практическим этапом является применение антитела, например, в фармацевтическом препарате. Ультрафильтрование облегчает концентрирование антитела, а диафильтрование облегчает удаление ранее использованных буферных солей и замену их на определенный рецептурный буфер. Проводят непрерывное диафильтрование с использованием нескольких объемов, например, двух объемов или более рецептурного буфера. Примером подходящего рецептурного буфера является буфер из 5 мМ метионина, 2% маннита, 0,5% сахарозы, рН 5,9. После завершения диафильтрования антитело концентрируют. Для специалиста в данной области может оказаться желательным провести дополнительное фильтрование продукта антитела в данный момент с использованием способов, хорошо известных в данной области.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения будут включать дополнительные стадии очистки. Примерами дополнительных способов очистки, которые могут быть выполнены до, во время или после проведения ионообменной хроматографии, включают осаждение этанолом, изоэлектрическое фокусирование, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматографию на силикагеле, хроматографию на гепарин-сефарозеТМ, дополнительную анионообменную хроматографию и/или дополнительную катионообменную хроматографию, хроматофокусирование, SDS-PAGE, осаждение сульфатом аммония, хроматографию на гидроксиапатите, гельэлектрофорез, диализ и аффинную хроматографию (например, с использованием белка А, белка G, антитела, специфического субстрата, лиганда или антигена в качестве захватывающего реагента).

5. Способы анализа чистоты образца

Настоящее изобретение также относится к способам определения остаточных уровней концентрации белка клетки-хозяина (БКХ) в выделенной/очищенной композиции антитела. Как описано выше, БКХ желательно исключить из конечного целевого продукта вещества, т.е. антитела против IL-18. Иллюстративные БКХ включают белки, имеющие происхождение из источника продуцирования антитела. Невозможность идентифицировать и в существенной степени удалить БКХ из целевого антитела может привести к пониженной эффективности и/или неблагоприятным реакциям субъекта.

Как использовано в данном описании, термин «HCP ELISA» относится к анализу ELISA, в котором второе антитело, используемое в анализе, является специфическим в отношении БКХ, продуцируемым клетками, например, клетками СНО, используемыми для генерирования антитела, т.е. антитела против IL-18. Второе антитело может быть получено в соответствии с общепринятыми способами, известными специалистам в данной области. Например, второе антитело может быть получено с использованием БКХ, полученных в опытах с подложным продуцированием и очисткой, т.е. используют ту же самую клеточную линию, которая использована для получения представляющего интерес антитела, но клеточные линии не трансфицируют ДНК антитела. В иллюстративном варианте осуществления второе антитело продуцируют с использованием БКХ, аналогично тем, которые были экспрессированы в выбранной системе клеточной экспрессии, т.е. клеточной экспрессионной системе, использованной для продуцирования целевого антитела.

Обычно HCP ELISA включает прослаивание жидкого образца, включающего БКХ, между двумя слоями антител, т.е. первого антитела и второго антитела. Образец инкубируют в течение времени, за время которого БКХ удавливается первым антителом, например, но без ограничения, указанным козьим анти-СНО, которое аффинно очищено (Cygnus). Добавляют меченое второе антитело или смесь антител, специфических в отношении БКХ, продуцируемых из клеток, использованных для генерирования антитела, например, анти-СНО БКХ биотинилированное, и смешивают с БКХ в образце. В некоторых вариантах осуществления первое и второе антитела представляют собой поликлональные антитела. В некоторых аспектах первое и второе антитела представляют собой смеси поликлональных антител против БКХ, например, но, не ограничиваясь указанным, биотинилированную смесь козьих антител против белка клетки-хозяина 599/626/748. Количество БКХ, содержащегося в образце, определяют с использованием подходящего теста на основании метки во втором антителе.

Анализ HCP ELISA можно использовать для определения уровня БКХ в композиции антитела, такой как элюат или поток, получаемый в процессе способов, описанных выше в разделе III. Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей антитело, где композиция не содержит обнаруживаемого уровня БКХ, в соответствии с определением с помощью иммуносорбентного ферментативного анализа («ELISA») БКХ.

6. Дополнительные модификации

Антитела против IL-18 по настоящему изобретению могут быть модифицированы. В некоторых вариантах осуществления антитела против IL-18 или их антигенсвязывающие части модифицируют химически для обеспечения желаемого действия. Например, пэгилирование антител и фрагментов антител настоящего изобретения можно провести с помощью любой реакции пэгилирования, известной в данной области, как описано, например, в следующих ссылках: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0154316 и EP 0401384, каждая из которых включена посредством ссылки в настоящее описание во всей своей полноте. В одном аспекте пэгилирование проводят путем реакции ацилирования или реакции алкилирования с использованием реакционноспособной молекулы полиэтиленгликоля (или аналогичного реакционноспособного водорастворимого полимера). Подходящий водорастворимый полимер для пэгилирования антител и частей антител настоящего изобретения представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). Как использовано в данном описании, подразумевается, что термин «полиэтиленгликоль» охватывает любые формы ПЭГ, которые используются для получения производных других белков, такие как моно(C1-C10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль.

Способ получения пэгилированных антител и фрагментов антител настоящего изобретения обычно будет включать стадии (а) взаимодействия антитела или фрагмента антитела с полиэтиленгликолем, например, реакционноспособным сложным эфиром или альдегидным производным ПЭГ, в подходящих условиях, при этом антитело или фрагмент антитела присоединяется к одной или нескольким группам ПЭГ, и (b) получение продуктов реакции. Специалисту в данной области будет очевидно, как выбрать оптимальные реакционные условия или реакции ацилирования на основании известных параметров и желаемых результатов.

Пэгилированные антитела и фрагменты антител обычно можно использовать для лечения связанных с IL-18 нарушений настоящего изобретения путем введения описанных в данном описании антител и фрагментов антител против IL-18. Обычно пэгилированные антитела и фрагменты антител обладают увеличенным периодом полувыведения по сравнению с непэгилированными антителами и фрагментами антител. Пэгилированные антитела и фрагменты антител можно использовать сами по себе, совместно или в комбинации с другими фармацевтическими композициями.

Антитело или часть антитела настоящего изобретения могут быть дериватизированы или связаны с другой функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком). Соответственно, предполагается, что антитела и части антител настоящего изобретения включают описанные в данном описании производные или модифицированные другим образом формы антитело против IL-18 человека, включая иммуноадгезионные молекулы. Например, антитело или часть антитела настоящего изобретения могут быть функционально связаны (путем химического сшивания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или другим образом) с одним или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемым агентом, цитотоксическим агентом, фармацевтическим агентом и/или белком или пептидом, которые могут опосредовать ассоциацию антитела или части антитела с другой молекулой (такой как область ядра стрептавидина или полигистидиновая метка).

Один тип производного антитела получают путем сшивания двух или более антител (того же типа или различных типов, например, для создания биспецифических антител). Подходящие сшивающие агенты включают такие, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две очевидно реакционноспособные группы, отделенные подходящим спейсером (например, м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир), или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны от Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Полезные детектируемые агенты, которыми антитело или часть антитела настоящего изобретения могут быть дериватизированы, включают флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные детектируемые агенты включают флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и тому подобное. Антитело также может быть дериватизировано обнаруживаемыми ферментами, такими как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, оксидаза глюкозы и тому подобное. Когда антитело дериватизируют с использованием детектируемого фермента, его обнаружение осуществляют путем добавления дополнительных реагентов, которые использует фермент для продуцирования детектируемого реакционного продукта. Например, когда присутствует такой детектируемый агент, как пероксидаза хрена, добавление перекиси водорода и диаминобензидина приводит к окрашенному продукту реакции, который является детектируемым. Антитело также может быть дериватизировано с использованием биотина, и обнаруживаться посредством косвенных измерений авидинового или стрептавидинового связывания.

7. Фармацевтические композиции

Антитела и части антител настоящего изобретения могут быть введены в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Обычно фармацевтическая композиция содержит антитело или часть антитела настоящего изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Как использовано в данном описании, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают один или несколько из воды, физиологического раствора, забуференного фосфатом физиологического раствора, декстрозы, глицерина, этанола и подобного, а также их комбинации. Во многих случаях желательно включать в состав композиции изотонические агенты, например, сахара, полиатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают период хранения или эффективность антитела или части антитела.

Антитела и части антител настоящего изобретения могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Антитело или части антител могут быть получены в виде инъекционного раствора, содержащего, например, 0,1-250 мг/мл антитела. Инъекционный раствор может быть составлен или в виде жидкой, или в виде лиофилизованной дозированной формы, находящейся в бесцветном или желтого стекла пузырьке, ампуле или предварительно наполненном шприце. Буфер может представлять собой L-гистидин, приблизительно 1-50 мМ (оптимально 5-10 мМ) при рН от 5,0 до 7,0 (оптимально рН 6,0). Другие подходящие буферы включают, но не ограничиваются ими, сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Хлорид натрия можно использовать для модификации изотоничности раствора в концентрации 0-300 мМ (оптимально 150 мМ в жидкой дозированной форме). Криопротекторы могут быть включены в лиофилизованную дозированную форму, преимущественно 0-10% сахарозы (оптимально 0,5-1,0%). Другие подходящие криопротекторы включают трегалозу и лактозу. Наполнители могут быть включены в состав лиофилизованной дозированной формы, преимущественно 1-10% маннита (оптимально 2%). Стабилизаторы можно использовать как в жидкой, так и в лиофилизованной дозированных формах, преимущественно 1-50 мМ L-метионина (оптимально 5-10 мМ). Другие подходящие наполнители, включая глицин, аргинин, могут быть включены в виде 0-0,05% полисорбата-80 (оптимально 0,005-0,01%). Дополнительные поверхностно-активные вещества включают, но не ограничиваются ими, полисорбат 20 и поверхностно-активные вещества BRIJ.

В одном аспекте фармацевтическая композиция содержит антитело в дозировке примерно 0,01 мг/кг-10 мг/кг. В другом аспекте, дозировки антитела включают приблизительно 1 мг/кг, вводимые через неделю или приблизительно 0,3 мг/кг, вводимые ежедневно. Специалист в данной области сможет оценить правильные дозировки и режим введения субъекту.

Композиция настоящего изобретения может быть представлена в различных формах. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые дозированные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные растворы и растворы для вливаний), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Форма зависит, например, от предназначаемого пути введения и терапевтического использования. Композиции для местного введения находятся в форме инъекционного раствора или раствора для вливания, такие композиции подобны тем, которые используются для пассивной иммунизации людей другими антителами. Одним из способов введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В одном аспекте антитело вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. В другом аспекте антитело вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях получения и хранения. Композиция может быть составлена в форме раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или других организованных структур, подходящих для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем введения активного соединения (т.е. антитела или части антитела) в требуемом количестве в подходящий растворитель вместе с одним или с комбинацией перечисленных выше ингредиентов, как потребуется, с последующей стерилизацией фильтрованием. Обычно дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных лиофилизованных порошков для получения стерильных инъекционных растворов способы получения представляют собой вакуумную сушку и сушку распылением, что приводит к образованию порошка активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из их предварительно стерилизованного фильтрованием раствора. Подходящую текучесть раствора можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии или путем использования поверхностно-активных веществ. Продолжительную абсорбцию инъекционных композиций можно придать путем включения в композицию агента, который замедляет поглощение, например, моностеаратных солей и желатина.

Антитела и части антител по настоящему изобретению можно вводить с помощью множества способов, известных в данной области, одним путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или инфузия. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будут меняться в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах осуществления активные соединения могут быть получены вместе с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, как, например, препараты с контролируемым высвобождением, включая импланты, чрезкожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно использовать биоразрушаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортосложные эфиры и полимолочная кислота. Множество способов получения таких препаратов запатентовано или известно в общем виде специалистам в данной области. См, например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, полная доктрина которой включена в данное описание посредством ссылки.

В некоторых аспектах антитело или части антитела настоящего изобретения можно вводить перорально, например, вместе с инертным разбавителем или усваиваемым съедобным носителем. Соединение (и другие ингредиенты, при желании) также может быть заключено в оболочку твердой или мягкой желатиновой капсулы, быть спрессованным в таблетки или включено непосредственно в питание субъекта. Для перорального терапевтического введения соединения могут быть включены с эксципиентами и использованы в виде проглатываемых таблеток, буккальных таблеток, троше, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и подобного. Для введения соединения настоящего изобретения путем, отличным от парентерального введения, может потребоваться покрытие соединения оболочкой или совместное введение соединения вместе с веществом, необходимым для предотвращения его дезактивации.

В состав композиций также могут быть включены вспомогательные активные соединения. В некоторых аспектах антитело или часть антитела настоящего изобретения вводят совместно в составе рецептуры и/или совместно вводят вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, которые могут использоваться для лечения заболеваний, при которых нежелательна активность IL-18. Например, антитело или часть антитела против IL-18 человека (анти-hIL-18) настоящего изобретения может быть введено совместно в составе рецептуры и/или совместно вводиться вместе с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связываются с другими мишенями (например, антитела, которые связывают другие цитокины, или которые связываются с поверхностными клеточными молекулами). Кроме того, одно или несколько антител настоящего изобретения можно использовать в комбинации с двумя или более вышеуказанными терапевтическими агентами. При такой комбинированной терапии преимущество может заключаться в использовании более низких дозировок вводимых терапевтических агентов, тем самым, исключая возможную токсичность или осложнения, связанные с различными видами монотерапии. Специалисту в данной области будет понятно, что когда антитела настоящего изобретения используются в виде части комбинированной терапии, могут оказаться желательными более низкие дозировки антитела, чем когда антитело само по себе вводится субъекту (например, синергический терапевтический эффект может достигаться за счет использования комбинированной терапии, которая, в свою очередь, дает возможность достигать желаемого терапевтического эффекта при использовании более низкой дозы антитела).

Антитела настоящего изобретения или их антигенсвязывающие части могут использоваться сами по себе или в комбинации для лечения таких заболеваний. Следует понимать, что антитела настоящего изобретения или их антигенсвязывающие части могут использоваться сами по себе или в комбинации с дополнительным агентом, например, терапевтическим агентом, где указанный дополнительный агент выбирается квалифицированным специалистом для предназначенной цели. Например, дополнительный агент может представлять собой терапевтический агент, известный в данной области как используемый для лечения заболевания или состояния, подвергаемого лечению с помощью антитела по настоящему изобретению. Дополнительный агент также может представлять собой агент, который придает благоприятные свойства терапевтической композиции, например, агент, который придает композиции вязкость.

Дополнительно следует понимать, что комбинации, которые следует включать в настоящее изобретение, представляют собой комбинации, используемые для предназначенной цели. Агенты, которые указаны ниже, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения. Комбинации, которые являются частью настоящего изобретения, могут представлять собой антитела по настоящему изобретению и по меньшей мере один дополнительный агент, выбранный из приведенного ниже списка. Комбинация также может включать более одного дополнительного агента, например, два или три дополнительных агента, если комбинация является такой, что образуемая композиция может выполнять предназначенную ей функцию.

Некоторые комбинации представляют собой нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, также называемые как NSAID, которые включают лекарственные средства, такие как ибупрофен. Другие комбинации представляют собой кортикостероиды, включая преднизолон; хорошо известные побочные действия применения стероидов могут быть снижены или даже исключены путем сокращения дозы стероида, требуемой при лечении пациентов в комбинации с антителами против IL-18 настоящего изобретения. Неограничивающие примеры терапевтических агентов для лечения ревматоидного артрита вместе с которыми антитело или части антител настоящего изобретения могут быть объединены, включают следующее: цитокин-подавляющее противовоспалительное лекарственное средство(а) (CSAID); антитела или антагонисты других цитокинов человека или факторов роста, например, TNF, LT, IL-I, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-12, EMAP-II, GM-CSF, FGF и PDGF. Антитела настоящего изобретения или их антигенсвязывающие части могут быть объединены с антителами к клеточным поверхностным молекулам, такими как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90 или их лиганды, включая CD 154 (gp39 или CD40L).

Некоторые комбинации терапевтических агентов могут влиять в различных точках аутоиммунного и последующего воспалительного каскада; примеры включают антагонисты TNF, такие как химерные, гуманизированные или человеческие антитела TNF, D2E7, (заявка на патент США № 08/599226, поданная 9 февраля, 1996, полное содержание которой включено в данное описание посредством ссылки), cA2 (RemicadeTM), CDP 571, фрагменты антител против TNF (например, CDP870) и растворимые рецепторы TNF, p55 или p75, их производные, (p75TNFRIgG (EnbrelTM) или p55TNFRlgG (Lenercept), растворимый рецептор IL-13 (sIL-13), а также ингибиторы TNFα превращающего фермента (TACE); аналогично ингибиторы IL-1 (например, ингибиторы интерлейкин-1 превращающего фермента, такие как Vx740 или IL-IRA, и т.д.) могут быть эффективными по той же причине. Другие комбинации включают интерлейкин-11, анти-37 и р-селектиновый гликопротеиновый лиганд (PSGL). Некоторые другие комбинации включают других ключевых участников аутоиммунного ответа, которые могут действовать параллельно, зависимо или совместно с функцией IL-12. Было показано, что IL-12 и IL-18 имеют перекрывающиеся, но отдельные функции, и комбинация антагонистов для обоих может оказаться наиболее эффективной. Некоторые другие комбинации включают неисчерпываемые ингибиторы анти-CD-4. Другие комбинации включают антагонисты костимуляторного пути CD80 (B7.1) или CD86 (B7.2), включая антитела, растворимые рецепторы или антагонистические лиганды.

Антитела настоящего изобретения или их антигенсвязывающие части могут быть также объединены с такими агентами, как метотрексат, 6-МР, азатиоприн, сульфасалазин, мезалазин, олсалазин хлороквинин/гидроксихлороквин, пенцилламин, ауротиомалат (внутримышечно и перорально), азатиоприн, кохицин, кортикостероиды (перорально, ингаляция и местная инъекция), агонисты β-2 адренорецепторов (салбутамол, тербуталин, салметерал), ксантины (теофиллин, аминофиллин), хромогликат, недокромил, кетотифен, ипратропий и окситропий, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенолят мофетил, лефлуномид, NSAID, например, ибупрофен, кортикостероиды, такие как преднизолон, ингибиторы фосфодиэстеразы, агонисты аденозина, антитромботические агенты, ингибиторы комплемента, адренергические агенты, агенты, которые влияют на передачу сигнала посредством провоспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL-1 (например, ингибиторы IRAK, NIK, IKK, p38 или MAP киназы), ингибиторы IL-1β-превращающего фермента (например, Vx740), анти-P7s, лиганд p-селектингликопротеина (PSGL), ингибиторы TNFα превращающего фермента (ТАСЕ), ингибиторы Т-клеточной передачи сигнала, такие как ингибиторы киназ, ингибиторы металлопротеиназ, сульфасалазин, азатиоприн, 6-меркаптопурины, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, растворимые цитокиновые рецепторы и их производные (например, растворимые рецепторы TNF р55 или р75 и производные p75TNFRIgG (EnbrelTM) и p55TNFRIgG (Lenercept), sIL-1 RI, sIL-1RII, sIL-6R, растворимые рецепторы IL-13 (sIL-13) и противовоспалительные цитокины (например, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13 и TGFβ). Некоторые комбинации включают метотрексат или лефлуномид, а в случаях ревматоидного артрита средней или высокой тяжести, циклоспорин. Другими агентами, которые можно использовать в комбинации с антителами IL-18, являются ингибиторы СОХ-2. Ингибиторы СОХ-2 известны в данной области. Конкретные ингибиторы СОХ-2 описаны в WO 01/00229, полное содержание которого включено в данное описание посредством ссылки.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут включать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или части антитела настоящего изобретения. Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое является эффективным, при дозировках и в течение необходимого промежутка времени, для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может изменяться в соответствии с такими факторами, как болезненное состояние, возраст, пол и масса индивидуума, и способность антитела или части антитела вызывать желаемую ответную реакцию у индивидуума. Терапевтически эффективное количество представляет собой такое количество, для которого терапевтически благоприятные действия перевешивают любые токсические или неблагоприятные действия. Выражение «профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному, при дозировках и в течение необходимого промежутка времени, для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу используют у субъектов перед или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Терапевтически эффективное количество активного белка(ов) будет представлять собой функцию многих переменных, включая тип антитела против IL-18, аффинность антитела в отношении IL-18, любая остаточная цитотоксическая активность, проявляемая антителом, путь введения, клиническое состояние субъекта (включая желательность поддержания нетоксического уровня активности эндогенного IL-18).

«Терапевтически эффективное количество» является таким, что при введении ингибитор IL-18 приводит к ингибированию биологической активности IL-18. Вводимая дозировка, однократная или многократные дозы, для индивидуума будут изменяться в зависимости от множества факторов, включая фармакокинетические профили ингибитора IL-18, путь введения, состояние и характеристики субъекта (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, размеры), степень проявления симптомов, сопутствующее лечение, частоту лечения и желаемый эффект. Регулирование и манипулирование устанавливаемыми диапазонами дозировок входят в компетенцию специалистов в данной области, а также определяются с помощью in vitro и in vivo методов определения ингибирования IL-18 в организме субъекта.

Режимы дозировки можно регулировать для обеспечения желаемой ответной реакции (например, терапевтической или профилактической ответной реакции). Например, можно ввести один болюс, можно вводить несколько разделенных доз с течением времени или доза может быть пропорционально снижена или увеличена по показаниям острой необходимости в терапевтической ситуации. Особенно предпочтительным является создание рецептуры парентеральных композиций в виде единичной дозированной формы для легкости введения и единообразия дозировки. Термин «единичная дозированная форма», как он использован в данном описании, относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных дозировок для субъектов-млекопитающих, подвергаемых лечению; каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для оказания желаемого терапевтического действия, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация единичных дозированных форм настоящего изобретения диктуется и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, которого необходимо достичь, и (b) ограничений, присущих области составления в композицию такого активного соединения для лечения восприимчивости у индивидуумов.

Иллюстративный неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или части антитела настоящего изобретения составляет 0,01-20 мг/кг или 1-10 мг/кг, или 0,3-1 мг/кг. Следует отметить, что объем дозировки может изменяться от типа и тяжести состояния, предназначенного для лечения. Дополнительно следует понимать, что для любого конкретного субъекта, определенные режимы дозировки следует регулировать с течением времени в соответствии с индивидуальной необходимостью и профессиональным суждением человека, который проводит введение или контролирует введение композиций, и что указанные в данном описании диапазоны дозировки являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или практического применения композиции, заявленной в формуле изобретения.

8. Применение антител против IL-18

8.1. Общие применения

Благодаря своей способности связываться с IL-18, антитела против IL-18 или их части, согласно настоящему изобретению, можно использовать для обнаружения IL-18, в одном аспекте, hIL-18 (например, в пробной матрице, в одном аспекте, в биологическом образце, таком как сыворотка или плазма) с использованием обычного иммуноанализа, такого как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или иммуногистохимия ткани. Изобретение относится к способу обнаружения IL-18 в биологическом образце, включающему контактирование образца с антителом или частью антитела настоящего изобретения и обнаружение либо антитела (или части антитела), связанного с IL-18, или несвязанного антитела (или части антитела) для обнаружения, тем самым, IL-18 в образце. В антитело прямо или косвенно вводят метку с использованием детектируемого вещества для облегчения обнаружения связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и радиоактивные вещества. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, данзил хлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол; и примеры подходящих радиоактивных веществ включают 125I, 131I, 35S или 3Н. Обнаружение IL-18 в образце можно использовать в диагностическом контексте, например, при диагностике состояния, связанного с повышенным уровнем IL-18, и/или может оказаться полезным для идентификации субъекта, для которого может оказаться выигрышным лечение с использованием антитела против IL-18.

Альтернативно введению метки в антитело, можно проводить анализ IL-18 в образце с помощью конкурентного иммуноанализа с использованием, например, стандартов rhIL-18, меченных детектируемым веществом, и немеченого антитела против IL-18, такого как антитело против hIL-18. В таком анализе объединяют образец, меченые стандарты rhIL-18 и антитело против hIL-18 и определяют количество меченого стандарта rhIL-18, связанного с немеченым антителом. Количество hIL-18 в образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта rhIL-18, связанного с антителом против hIL-18.

Антитела и части антител настоящего изобретения способны нейтрализовать активность IL-18 in vitro и in vivo, в одном аспекте активность hIL-18. Соответственно, антитела и части антител настоящего изобретения можно использовать для ингибирования активности IL-18, например, в клеточной культуре, содержащей IL-18, в организме людей или в организме других млекопитающих, имеющих IL-18, с которым реагирует антитело настоящего изобретения (например, приматы, такие как павиан, яванская макака и макака-резус). В одном аспекте, изобретение относится к выделенному антителу человека или его антигенсвязывающей части, которая нейтрализует активность IL-18 человека и по меньшей мере одного дополнительного IL-18 примата, выбранного из группы, состоящей из IL-18 павиана, IL-18 мартышки, IL-18 шимпанзе, IL-18 яванской макаки и IL-18 макаки-резуса, но не нейтрализует активность IL-18 мыши. В одном аспекте IL-18 представляет собой IL-18 человека. Например, в клеточной культуре, содержащей или, как предполагается, содержащей hIL-18, может быть добавлено к культуральной среде антитело или часть антитела настоящего изобретения для ингибирования активности hIL-18 в культуре.

В другом аспекте изобретение относится к способу ингибирования активности IL-18 у субъекта, страдающего нарушением, при котором активность IL-18 наносит вред. Интерлейкин 18 играет решающую роль в патологии, связанной с множеством заболеваний, включающих иммунные и воспалительные элементы.

Как использовано в данном описании, выражение «нарушение, в котором активность IL-18 наносит вред», предназначено для обозначения заболеваний и других нарушений, при которых, как было показано, присутствие IL-18 в организме субъекта, страдающего от нарушения, является или предполагается, что является либо ответственным за патофизиологию нарушения или фактором, вносящим вклад в ухудшение течения нарушения. Соответственно, нарушение, при котором активность IL-18 наносит вред, представляет собой нарушение, при котором, как ожидается, ингибирование активности IL-18 будет облегчать симптомы и/или прогрессирование нарушения. Такие нарушения могут быть подтверждены, например, по повышению концентрации IL-18 в биологической жидкости субъекта, страдающего от нарушения (например, увеличение концентрации IL-18 в сыворотке крови, плазме крови, синовиальной жидкости и т.д. субъекта), которая может быть определена, например, с использованием антитела против IL-18, как описано выше. Имеются многочисленные примеры нарушений, при которых активность IL-18 наносит вред. В одном аспекте антитела или их антигенсвязывающие части можно использовать в терапии для лечения описанных в данном описании заболеваний или нарушений. В другом аспекте антитела или их антигенсвязывающие части можно использовать для получения лекарственного средства для лечения описанных в данном описании заболеваний или нарушений. Применение антител или частей антител настоящего изобретения при лечении нескольких неограничивающих конкретных нарушений обсуждается ниже.

Изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения заболеваний или состояний, при которых необходимо модулирование активности IL-18. Данные заболевания или состояния включают аутоиммунные заболевания, диабет типа I, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата, воспалительное заболевание кишечника, сепсис, рассеянный склероз, ишемические болезни сердца (включая инфаркт миокарда), ишемическое повреждение мозга, хронический гепатит, псориаз, хронический панкреатит, острый панкреатит и тому подобное.

Соответственно, антитела против IL-18 или их антигенсвязывающие части или векторы, экспрессирующие их in vivo, показаны для лечения аутоиммунных заболеваний, диабета типа I, ревматоидного артрита, отторжения трансплантатов, воспалительного заболевания кишечника, сепсиса, рассеянного склероза, ишемических болезней сердца, включая острые инфаркты миокарда, ишемического повреждение мозга, хронического гепатита, псориаза, хронического и острого панкреатита и аналогичных заболеваний, при которых происходит аномальная экспрессия IL-18, приводящая к избытку IL-18 или в случае осложнений вследствие экзогенно вводимого IL-18.

8.2. Применение при повреждении печени

Один аспект настоящего изобретения заключается в разработке новых средств лечения и/или профилактики повреждения печени. Было обнаружено, что ингибитор IL-18 является эффективным при профилактике или лечении поражений печени. Соответственно, изобретение также относится к применению ингибитора IL-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики повреждения печени. Более конкретно, изобретение относится к лечению и/или профилактике повреждений печени, вызванных алкогольным гепатитом, вирусным гепатитом, иммунным гепатитом, скоротечным гепатитом, циррозом печени или первичным желчным циррозом.

8.3. Применение при артрите

Согласно настоящему изобретению, также было обнаружено, что ингибитор IL-18 является эффективным при лечении артрита. Терапевтическое действие включает снижение тяжести заболевания, а также предотвращение распространения заболевания. Соответственно, изобретение относится к применению ингибитора IL-18 для лечения и/или профилактики артрита. Это открытие является неожиданным, поскольку, исходя из описанного выше состояния данной области, нельзя было сделать вывод, что блокада одного специфического фактора, вовлеченного в артрит, а именно интерлейкина IL-18, будет приводить к облегчению течения артрита или даже выздоровления артритного сустава, пораженного болезнью.

Термин «артрит» включает все различные типы артрита и артритных состояний, как острый, так и хронический артрит, как определено, например, на начальной странице Факультета ортопедии Вашингтонского Университета Артрита. Примерами артритных состояний являются анкилозный спондилит, боль в спине, синдром отложения солей в запястьях, синдром Элерса-Данлоса, подагра, ювенильный артрит, системная красная волчанка, миозит, остеопсатироз, остеопороз, полиартрит, полимиозит, псориатический артрит, синдром Рейтера, склеродерма, артрит с заболеванием кишечника, болезнь Бехчета, детский артрит, дегенеративное заболевание сустава, фибромиалгия, инфекционный артрит, болезнь Лайма, синдром Марфана, остеоартрит, остеонекроз, болезнь Паджета, ревматическая полимиалгия, псевдоподагра, рефлекторная симпатетическая дистрофия, ревматоидный артрит, ревматизм, синдром Шегрена, наследственный аденоматозный полипоз и тому подобное.

Ревматоидный артрит (РА) вызывает воспаление выстилки суставов (синовиальная мембрана, одноклеточный слой эпителия) и/или внутренних органов. Заболевание имеет тенденцию продолжаться в течение многих лет, обычно поражает многочисленные различные суставы тела и, в конечном счете, может вызвать поражение хряща, костей, сухожилий и связок. Суставы, которые могут быть поражены РА, представляют собой, например, суставы, расположенные на шее, в плечах, локтях, бедрах, запястьях, руках, коленях, лодыжках и ногах. Во многих случаях при РА суставы воспаляются симметричным образом.

РА распространен примерно у 1% населения Соединенных Штатов Америки, распределяясь между всеми этническими группами и возрастами. Он наблюдается по всему миру, и женщины превосходят численно мужчин в соотношении 3 к 1 среди тех, кто страдает РА.

Было обнаружено, что введение ингибитора IL-18 в значительной степени уменьшает эрозию хряща на мышиной модели артрита. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению ингибитора IL-18 при получении лекарственного средства для лечения и/или профилактики деструкции хрящей.

Примеры

1. Выделение и очистка антител IL-18

В данном примере приведена одна из схем очистки антител против IL-18 от белков клетки-хозяина (БКХ), а также от других примесей. График последовательности технологических операций, представляющий в общих чертах настоящий способ очистки, приведен на фиг.1.

1.1. Первичное выделение с осветлением с помощью подкисления

Первичное выделение с помощью центрифугирования используют для удаления клеток и клеточного дебриса из 3000 л собранной порции, полученной в биореакторе. Центрифугу запускают при 6900×g при скорости загрузки 30 л/мин, и осветленный супернатант собирают в предварительно простерилизованную собирающую емкость. Задача стадии подкисления до низкого рН заключается в дезактивации случайных вирусов и получении культурального супернатанта для последующей стадии катионной хроматографии с захватом. Осветленную центрифугированием порцию доводят до рН 3,5±0,1 с использованием 3М лимонной кислоты и выдерживают при данном рН в течение 1 часа при 20°С. Осветленную порцию затем доводят до рН 4,9±0,1 с использованием 3М NaOH и выдерживают 16-24 часа при 8°С. Порцию с отрегулированным рН доводят обратно до 20°С, затем осветляют центрифугированием при 12750×g при скорости загрузки 30 л/мин и супернатант собирают в 2000 л емкость. Перед катионообменной хроматографией осветленную собранную порцию пропускают через набор фильтров, включающий объемные фильтры с номинальным размером пор 0,2-0,8 мкм и 0,22 мкм гидрофильные фильтрующие картриджи. Результаты центрифугирования, обработки до низкого рН и повторного центрифугирования приведены в таблице 2. Выход на стадии составлял 69±6% (n=7).

Таблица 2
Лот BAF04G BAF05G BAF06G BAF07G BAF08G BAF01H BAF02H
Антитело в собранной порции (г) 2225 2568 2220 1929 2246 2151 2153
Антитело в осветленной собранной порции после рН обработки (г) 1423 1588 1575 1305 1480 1712 1598
Выход по стадии (%) 64 62 71 68 66 80 74

Катионообменная хроматография

Захват антител из осветленной собранной порции проводили с помощью катионообменной хроматографии. Кроме того, связанные с процессом примеси (например, белки клеток-хозяев, ДНК и другие связанные с процессом примеси) удаляли из технологического потока. Для данной операции использовали колонку диаметром 80 см и длиной 20 см (объем слоя 101 л). Колонку заполняли смолой FractogelTM (EMD Industries, Gibbstown, NJ) и измеряли асимметрию и высоту эквивалентных теоретических тарелок (ВЭТТ) для определения качества набивки колонки. Работу на данной колонке проводили при температуре окружающей среды.

Колонку уравновешивали с использованием буфера 20 мМ цитрат Na/лимонная кислота, 65 мМ NaCl, pH 5. Объемный фильтрат разводили водой для снижения проводимости до 9±0,5 мС/см и загружали с линейной скоростью 180 см/час. Максимальную нагрузку для данной стадии хроматографии устанавливали на 27 г белка на литр смолы. Колонку затем промывали до фоновой линии с использованием уравновешивающего буфера при линейной скорости 200 см/час. Продукт элюировали буфером 20 мМ цитрат Na/лимонная кислота, 300 мМ NaCl, pH 5, с линейной скоростью 125 см/час. Элюат с колонки собирали при росте поглощения выше ОП 3,0 (А280) и продолжали сбор элюата до снижения поглощения до ОП 2,0 в виде хвоста пика. Собранное вещество фильтровали через 0,8 мкм фильтр и затем через 0,2 мкм фильтр. Результаты катионообменной хроматографии приведены в таблице 3. Выход на данной стадии составлял 88±6% (n=7), и чистота по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляла 98,29±0,52% мономера (n=7).

Таблица 3
Катионообменная хроматография
Лот BAP03G BAP04G BAP05G BAP06G BAP01H BAP02H BAP03H
Собранный лот BAF04G BAF05G BAF06G BAF07G BAF08G BAF01H BAF02H
FractogelTM загруженное количество (г) 1399 1507 1536 1286 1434 1686 1538
Загрузка г белка/л смолы 13,9 15,0 15,3 12,8 14,3 16,8 15,3
FractogelTM количество элюата (г) 1218 1398 1494 1108 1193 1356 1321
Выход по стадии (%) 87 93 97 86 83 80 86

Ультрафильтрование/диафильтрование

Концентрирование элюата после FractogelTM проводили с использованием ультрафильтрационного мембранного картриджа из регенерированного ацетата целлюлозы с отсечением по молекулярной массе в 30 кДа (MWCO) (общая площадь 7 кв. метров). Ультрафильтрование элюата продолжали до конечной целевой концентрации в 30 г/л. Концентрат затем подвергали диафильтрованию с использованием 6 объемов 20 мМ натрийфосфатного буфера, 150 мМ NaCl, pH 7.

После вытекания продукта из системы УФ, ее промывали буфером для диафильтрования для выделения продукта, удерживаемого в системе. Концентрат и промывочные жидкости объединяли, получая диафильтрованные антитела против IL-18. Концентрированный элюат после FractogelTM SO3- сразу же фильтровали через 0,2 мкм фильтр в сборную емкость и выдерживали при 8°С до готовности возобновления обработки. Результаты концентрирования элюата с FractogelTM приведены в таблице 4. Выход на данной стадии составлял 88±7% (n=7), и чистота по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляла 97,67±0,59% мономера (n=7).

Таблица 4
Концентрирование элюата после Fractogel
Лот BAP03G BAP04G BAP05G BAP06G BAP01H BAP02H BAP03H
Элюат с FractogelTM, количество (г) 1218 1398 1494 1108 1193 1356 1321
Концентрация в концентрате (г/л) 24,63 21,59 16,13 20,13 21,02 21,37 19,73
Количество концентрата (г) 1007 1319 1131 1015 1097 1231 1186
Выход при концентрировании (%) 83 94 76 92 92 91 90
Чистота по экс. ВЭЖХ (% мономера) 97,61 98,27 96,97 98,25 96,77 97,97 97,84

1.4. Анионообменная хроматография

Анионообменная хроматография снижает количество связанных с процессом примесей, таких как ДНК, вирусы и эндотоксины. Для данного процесса использовали колонку диаметром 45 см и длиной 30 см (объем слоя 48 л). Колонку набивали смолой Q SepharoseTM FF (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и измеряли асимметрию и ВЭТТ для определения качества набивки колонки. Разбавленное вещество собирали в портативные емкости из нержавеющей стали и перемещали в комплексе помещений для очистки класса 10000, где работа проводилась при 12°С.

Данную операцию проводили при 12°С. Уравновешивание смолы проводили с использованием 35 мМ троламина, 40 мМ NaCl, pH 8. Максимальную загрузку белка на данной хроматографической стадии устанавливали как 60 граммов белка на литр смолы. Разведенный, профильтрованный, с дезактивированными вирусами материал обозначали как загрузку на колонку Q SepharoseTM FF. Связанные с процессом примеси адсорбировались на смоле, а антитела вытекали из колонки. Концентрат элюата после FractogelTM S разводили двумя объемами уравновешивающего загрузку для колонки Q SepharoseTM FF раствора (50 мМ троламина, рН 8) и загружали на колонку. Загрузку на колонку проводили при 150 см/час, и вытекающий из колонки поток собирали, когда А280 поднималось выше 0,4 ОП. Колонку затем промывали уравновешивающим буфером, и промывочные жидкости собирали до тех пор, пока А280 не возвращалось к ОП 0,6. Элюат с колонки и промывочные жидкости собирали для получения объединенного элюированного продукта. Результаты анионообменной хроматографии приведены в таблице 5. Выход на данной стадии составлял 92±4% (n=7), и чистота по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляла 99,04±0,51% мономера (n=7).

Таблица 5
Анионообменная хроматография
Лот BAP03G BAP04G BAP05G BAP06G BAP01H BAP02H BAP03H
Загруженное количество (г) 1007 1319 1131 1015 1097 1231 1186
Загрузка г белка/л смолы 21,0 27,5 23,6 21,1 22,9 25,6 24,7
Количество потока с колонки и промывочных жидкостей (г) 868 1249 1004 957 981 1175 1151
Выход стадии (%) 86 95 89 94 89 95 97
Чистота по экс. ВЭЖХ (% мономера) 99,23 99,3 97,93 99,32 99,01 99,08 99,39

1.5. Хроматография гидрофобного взаимодействия

Хроматография гидрофобного взаимодействия удаляет агрегаты антител и связанные с процессом примеси. Для данного процесса использовали колонку диаметром 45 см и длиной 15 см (объем слоя 24 л). Колонку набивали смолой фенилсефарозой Phenyl SepharoseTM НР (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и измеряли асимметрию и ВЭТТ для определения качества набивки колонки. Технологический узел также работал при 12°С в комплексе помещений для очистки класса 10000.

Данную операцию проводили при 12°С. Уравновешивание смолы проводили с использованием 20 мМ фосфата натрия, 1,1М сульфата аммония, рН 7. Максимальную загрузку белка на данной стадии устанавливали как 40 граммов белка на литр смолы. Загрузку колонки проводили при 75 см/час. Элюат с Q SepharoseTM FTW разводили равным объемом 40 мМ фосфата натрия, рН 7, 2,2М сульфат аммония, смешивали и фильтровали через фильтр 0,2 мкм. После загрузки колонку промывали 20 мМ фосфатом натрия, рН 7, 1,1М (NH4)2SO4. Продукт элюировали на стадии градиентного изменения концентрации соли с использованием 9 мМ фосфата натрия, рН 7, 0,3М сульфата аммония при линейной скорости 38 см/ч. Продукт собирали при повышении поглощения выше 1,0 ОП при А280 и продолжали до тех пор, пока поглощение не снижалось до 4,0 ОП в виде хвоста пика. Для обработки полной порции элюата после Q SepharoseTM FTW требовался один или два цикла. Результаты хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) приведены в таблице 6. Выход на данной стадии составлял 97±4% (n=7), и чистота по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляла 99,30±0,55% мономера (n=7).

Таблица 6
Гидрофобная хроматография
Лот BAP03G BAP04G BAP05G BAP06G BAP01H BAP02H BAP03H
Цикл А, загруженное количество (г) 922 665 986 933 960 587 575
Цикл В, загруженное количество (г) N/A 652 N/A N/A N/A 563 553
Общее загруженное количество (А+В) (г) 922 1317 986 933 960 1150 1128
Средняя загрузка г/л смолы N/A 27,2 N/A N/A N/A 23,5 23,0
Количество элюата (г) 907 1256 1034 887 927 1065 1101
Выход стадии (%) 98 95 105 95 97 93 98
Чистота по экс. ВЭЖХ (% мономера) 99,51 99,57 99,05 98,20 99,31 99,69 99,80

1.6. Вирусное фильтрование

На стадии нанофильтрования с использованием фильтра Ultipor DV50TM удаляли случайные вирусы диаметром ≥50 нм, которые могут присутствовать в элюате с колонки с фенилсефарозой Phenyl SepharoseTM НР. Данную операцию проводили при 12°С. Элюат с колонки Phenyl SepharoseTM НР фильтровали через 0,1 мкм фильтр и пропускали через предварительно увлажненный 10 дюймовый фильтр Ultipor DV50TM (Pall Filtron, Northborough, MA) при давлении 35 фт/кв.дюйм. Фильтр затем заливали элюирующим буфером для колонки Phenyl SepharoseTM НР для удаления антител против IL-18, оставшихся на фильтре. Фильтрат после Ultipor DV50TM хранили в подвижной емкости из нержавеющей стали при 10-14°С. Результаты нанофильтрования с использованием DV50TM приведены в таблице 7. Выход на данной стадии составлял 96±4% (n=7), и чистота по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляла 99,51±0,26% мономера (n=7).

Таблица 7
Нанофильтрование с использованием DV50
Лот BAP03G BAP04G BAP05G BAP06G BAP01H BAP02H BAP03H
Загруженное количество (г) 907 1256 1034 887 927 1065 1101
Количество фильтрата (г) 842 1115 1019 847 950 1055 1049
Выход стадии (%) 93 89 98 95 102 99 95
Чистота по экс. ВЭЖХ (% мономера) 99,52 99,46 98,97 99,61 99,58 99,68 99,75

1.7. Конечное ультрафильтрование/диафильтрование

На стадии УФ/ДФ получали концентрат антитела IL-18, удаляли сульфат аммония и диафильтровали антитело в буфер для получения препарата. Для данной стадии использовали ультрафильтрационный мембранный картридж (7 кв. метров) из регенерированной целлюлозы с отсечением по молекулярной массе в 30 кДа (MWCO). Данную стадию проводили при 12°С. Нанофильтрат после фильтра Ultipor DV50TM концентрировали примерно до 65 г белка/л. Затем проводили непрерывное диафильтрование с использованием не менее 8 объемов буфера для препарата. После вытекания продукта из системы УФ/ДФ ее промывали буфером для диафильтрования для выделения продукта, удерживающегося в системе. Концентрат и промывные жидкости объединяли для получения диафильтрованного антитела. Образец антитела затем пропускали через 0,2 мкм 10 дюймовый фильтр Millipak OpticapTM (0,7 кв.метра). Результаты операции: Выход на данной стадии составлял 96±4% (n=7), и чистота по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляла 99,51±0,26% мономера (n=7).

Таблица 8
Ультрафильтрование/диафильтрование
Лот BAP03G BAP04G BAP05G BAP06G BAP01H BAP02H BAP03H
Количество фильтрата после DV50TM (г) 842 1115 1019 847 950 1055 1049
УФ/ДФ концентрирование (г/л) 65 70 68 75 65 69 70
УФ/ДФ выделение (г) 800 1110 1008 858 916 1034 1013
Выход стадии (%) 95 100 99 101 96 98 97
Чистота по экс. ВЭЖХ (% мономера)а 99,61 99,58 99,07 99,62 99,5 99,65 99,81
А Результаты эксклюзионной ВЭЖХ основаны на анализе лекарственного вещества

1.8. Конечное фильтрование, бутылирование и замораживание

Препарат антитела затем фильтровали через 0,2 мкм фильтр в 2 л контейнеры из PETG и замораживали при -80°С (номинальная температура). Результаты операции ультрафильтрования/диафильтрования приведены в таблице 9. Выход на данной стадии составлял 96±4% (n=7).

Таблица 9
Конечное фильтрование, бутылирование и замораживание
Лот BAP03G BAP04G BAP05G BAP06G BAP01H BAP02H BAP03H
ДФ/ДФ количество (г/л) 797 1102 1004 852 912 1029 1009
Бутылированное количество (г) 764 1088 937 843 899 992 1005
Выход стадии (%) 96 99 93 99 99 96 100

2. Определение концентрации белка клетки-хозяина в композициях антител против IL-18

Данный способ описывает методологию тестирования с целью определения остаточной концентрации белка клетки-хозяина в образцах антитела против IL-18. Твердофазный иммуноферментативный анализ (ELISA) используют для белка клетки хозяина (антигены) между двумя слоями специфических антител. Его проводят путем блокирования неспецифических сайтов казеином. Белки клетки-хозяина затем инкубируют, в течение данного времени молекулы антигена захватываются первым антителом (покрывающее антитело). Затем добавляют второе антитело (биотинилированное антитело против белка клетки-хозяина), которое фиксируется с антигеном (белки клетки-хозяина). Добавляют нейтравидин-конъюгированный HRP, который связывается с биотинилированным антителом против белка клетки-хозяина. Это проводят путем добавления К-синего субстрата. Хромогенный субстрат гидролизуют фермент-связанным антителом, давая голубое окрашивание. Реакцию останавливают с помощью 2М Н3РО4, изменяя цвет на желтый. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству антигена, связанного в лунке.

Получение 50 мM бикарбоната натрия (буфер для нанесения покрытия), pH 9.4.

В химический стакан емкостью 1 л добавляют: 900 мл воды Milli-Q; 4,20±0,01 г бикарбоната натрия. Перемешивают до полного растворения. Доводят pH до 9,4 с использованием 1н NaOH. Переносят в мерную колбу на 1 л и доводят объем с использованием воды Milli-Q. Смешивают путем переворачивания до гомогенности. Фильтруют через 0,22 мкм стерильный фильтр. Хранят при номинальной температуре 4°C до 7 дней от даты приготовления раствора.

Получение 0,104M Na 2 HPO 4 *7H 2 O, 1,37M NaCl, 0,027M KCl, 0,0176M KH 2 PO 4 , pH=6.8-6.9 (10X PBS). Добавляют приблизительно 400 мл воды Milli-Q в стеклянный химический стакан. Добавляют 13,94±0,01 г Na2HPO4×7H2O. Добавляют 40,0±0,1 г NaCl. Добавляют 1,00±0,01 г KCl. Добавляют 1,20±0,01 г KH2PO4. Перемешивают до гомогенности. Переносят в мерную колбу объемом 500 мл. Доводят объем до 500 мл водой Milli-Q. Смешивают путем переворачивания. Фильтруют через 0,22 мкм стерильный фильтр. Хранят при комнатной температуре до 7 дней.

Получение 1X PBS+0,1% Тритон X-100, pH 7,40: (промывочный буфер для планшетов). В градуированном цилиндре емкостью 4 л смешивают 400 мл 10X PBS (стадия 5.2) с 3500 мл воды Milli-Q. Проверяют pH и доводят, при необходимости, до 7,40±0,05 с использованием 1н. HCl или 1н. NaOH. Доводят объем водой Milli-Q. Плотно закрывают цилиндр парафильмом и смешивают при переворачивании до гомогенности. Переносят в бутылку емкостью 4 л. Удаляют 4 мл 1X PBS и отбрасывают. Добавляют 4 мл triton X-100 к 3996 мл 1X PBS. Помещают на перемешивающую пластину и перемешивают по полного растворения. Фильтруют количество промывочного буфера для планшетов, необходимое для получения буфера разведения, через 0,22 мкм стерильный фильтр. Хранят при комнатной температуре до 7 дней.

Получение смеси покрывающего антитела. Козье антитело против СНО 599/626/748 (лот # G11201 @ 1,534 мг/мл), очищают аффинной хроматографией. ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные растворы хранят в пузырьках при номинальной температуре -80°С. Получают аликвоты. Берут одну аликвоту на планшет во время использования. Непосредственно перед применением: разводят смесь антитела, чтобы она имела конечную концентрацию 4 мкг/мл в холодном бикарбонате натрия следующим образом. Например, добавляют 31 мкл смеси покрывающего антитела к 11969 мкл холодного покрывающего буфера. Осторожно смешивают, путем переворачивания.

Получение смеси козьего антитела против белка клетки-хозяина. 599/626/748 (лот # G11201 @ 0,822 мг/мл). ПРИМЕЧАНИЕ: Исходные растворы хранят в пузырьках при номинальной температуре -80°С. Получают аликвоты. Берут одну аликвоту на планшет во время использования. Непосредственно перед применением: разводят смесь биотинилированного антитела, чтобы она имела конечную концентрацию 1 мкг/мл в казеине при 37°С±2°С следующим образом. Например, добавляют 14,6 мкл смеси биотинилированного антитела к 11985 мкл казеина при 37°С±2°С. Осторожно смешивают, путем переворачивания.

Получение нейтравидина-HRP. Проводят восстановление содержания влаги для новых лотов (2 мг/пузырек) до концентрации 1 мг/мл следующим образом: добавляют в пузырек 400 мкл воды Milli-Q, затем добавляют 1600 мкл 1X PBS до общего объема 2 мл. Осторожно встряхивают для смешивания. Хранят при номинальной температуре -20°С. Готовят аликвоты желаемого объема таким образом, что используют 1 аликвоту на планшет. Получают в полипропиленовой пробирке. Характеризуют новые лоты для определения рабочих концентраций. Дата истечения срока действия считается 6 месяцев со дня даты получения. Например, если рабочая концентрация была определена как равная 0,2 мкг/мл, то приготовление проводили следующим образом. Непосредственно перед применением: оттаивают аликвоту нейтравидина-HRP при комнатной температуре. Разводят раствор нейтравидина-HRP концентрацией 1 мг/мл до концентрации 0,1 мг/мл (100 мкг/мл) с использованием казеина при 37°С±2°С. Например: разведение Х10, добавляют 50 мкл нейтравидина к 450 мкл казеина. Осторожно встряхивают для смешивания. Дополнительно разводят раствор концентрации 100 мкг/мл до концентрации 0,2 мкг/мл с использованием казеина при 37°С±2°С. Например: разведение Х500, добавляют 24 мкл нейтравидина (100 мкг/мл) к 11976 мкл казеина. Осторожно встряхивают для смешивания.

Получение 5,72М фосфорной кислоты (стоп-раствор). Получают 2М раствор фосфорной кислоты из концентрированной фосфорной кислоты следующим образом. Из % фосфорной кислоты, указанного на этикетке, плотности (1,685 г/мл) и формульной массы (98 г/моль) рассчитывают объем концентрированной фосфорной кислоты, необходимый для получения 500 мл 2М фосфорной кислоты. Добавляют рассчитанный объем концентрированной фосфорной кислоты в колбу. Доводят до целевого объема с использованием воды Milli-Q и смешивают путем переворачивания до гомогенности. Хранят при температуре окружающей среды в течение до 6 месяцев от даты приготовления.

Получение буфера для разведения (казеин, разведенный Х100 в 1X PBS+0,1% Тритона Х100, рН 7,4). Разводят при 37°С±2°С казеин Х100 в стерилизованном фильтрованием через фильтр 0,22 мкм 1X PBS+0,1% Тритона Х100, рН 7,4 (см. выше). Например: добавляют 1 мл казеина при 37°С±2°С к 99 мл стерилизованного фильтрованием через фильтр 0,22 мкм 1X PBS+0,1% Тритона Х100, рН 7,4. Хорошо перемешивают. Готовят свежий раствор для каждого применения.

Получение стандартов. Стандарты белка клетки-хозяина (антигенные стандарты) (лот № G11203 @ 1,218 мг/мл): ПРИМЕЧАНИЕ: исходные растворы хранят при -80°С в 70 мкл аликвотах. Оттаивают аликвоту при комнатной температуре. Проводят серийное разведение в полипропиленовых пробирках с использованием буфера для разведения.

Получение образцов. В полипропиленовых пробирках разводят конечный объем образцов до концентрации 24 мг/мл с использованием буфера для разведения. Регистрируют концентрацию. ПРИМЕЧАНИЕ: Используют указанные ниже растворы для получения обогащенных образцов и для получения приведенных ниже растворов с концентраций 12 мг/мл. В полипропиленовых минипробирках дополнительно разводят растворы с концентрацией 24 мг/мл до концентрации 12 мг/мл с использованием буфера для разведения. Загружают в лунки планшета в трех повторах для каждого из растворов с концентрацией 12 мг/мл, всего 6 лунок.

Получение маркера. В полипропиленовой микропробирке получают маркировочный раствор белка клетки-хозяина с концентрацией 10 нг/мл из стандарта концентрацией 20 нг/мл, полученного выше, путем разведения 2× с использованием буфера для разведения. Загружают в три лунки планшета 10 нг/мл маркировочный раствор. Используют стандартный раствор концентраций 20 нг/мл со стадии 6.1 для маркированных образцов.

Получение маркированных образцов. В полипропиленовых микропробирках маркируют 300 мкл из каждого конечного объемного раствора с концентрацией 24 мг/мл с использованием 300 мкл маркирующего раствора с концентрацией 20 нг/мл (6.1). Загружают в трех повторах лунки для каждого маркированного образца раствора из расчета всего 6 лунок.

Получение контроля. Контрольный диапазон должен быть установлен для каждого нового исходного контрольного раствора перед использованием в обычном тестировании. Исходный контроль: получают 150 мкл аликвоты порции концентрата лекарственного вещества АВТ-874 и хранят замороженными при номинальной температуре -80°С в течение 3 лет.

Получение рабочего контроля. Оттаивают аликвоту контроля при комнатной температуре. В полипропиленовых пробирках разводят контроль до концентрации 24 мг/мл с использованием буфера для разведения. В полипропиленовых минипробирках дополнительно разводят контрольный раствор с концентрацией 24 мг/мл до концентрации 12 мг/мл с использованием буфера для разведения. Получают одно разведение и загружают в 3 лунки планшета.

Методика анализа ELISA. Наполняют планшеты промывочным раствором из бутылки с буфером для промывки планшетов (ссылаясь на стадию 5.3, 1Х PBS+0,1% Тритон X-100). Подготавливают промывочное устройство для планшетов. Контролируют следующие параметры: параметры должны быть установлены: тип планшета: 1 для каждого цикла (всего 5 циклов): объем: 400 мкл; Время замачивания: 10 секунд; время аспирации (отсасывания жидкости): 4 секунды.

Методика анализа. Планшеты покрывают из расчета 100 мкл/лунка смесью козьего покрывающего антитела с концентрацией 4 мг/мл в холодном 50 мМ бикарбонате натрия. Постукивают по стороне планшеты до тех пор, пока покрывающий раствор не покроет равномерно дно лунок, закрывают укупоривающей лентой и инкубируют при номинальной температуре 4°С при встряхивании в планшетном шейкере (или эквиваленте) при скорости 3 в течение 18±1 час. После инкубирования в течение ночи удаляют планшет из холодильника и дают возможность уравновешивания до комнатной температуры. Отбрасывают покрывающий раствор. Промокают планшет бумажным полотенцем. Блокируют из расчета 300 мкл/лунка казеином 37°С±2°С, закрывают укупоривающей лентой и инкубируют при 37°С±2°С при встряхивании на лабораторном планшет-шейкере Lab-line Enciron (или эквиваленте) при 80±5 об/мин в течение 1 часа. Получают стандарт, образец, контроль, маркер и маркированные образцы во время проведения инкубирования при блокировании. Промывают планшеты 5 раз с использованием промывочного буфера. Промокают планшеты бумажными полотенцами. С использованием 8-канальной пипетки вносят 100 мкл/лунка стандартов, образцов, маркеров, маркированных образцов и контроля в трех повторах в лунки планшета. Пипеткой добавляют 100 мкл/лунка буфера разведения в пустые лунки планшета, чтобы они служили в качестве пустых лунок. Закрывают герметизирующей лентой и инкубируют при 37°С±2°С при встряхивании на планшет-шейкере Lab-line Envitron (или эквиваленте) при 80±5 об/мин в течение 1 часа. Заполняют шаблон для использования в качестве указателя при загрузке планшета.

Установка планшет-ридера. Устанавливают шаблон, вводящий концентрации для стандартов. Не следует вводить факторы разведения для образцов, контроля, маркера или маркированных образцов. Определяют лунки, содержащие разбавитель как пустые, для вычитания из всех лунок. Промывают планшеты 5 раз с использованием промывочного буфера. Промокают планшеты бумажными полотенцами. Добавляют 100 мкл/лунка биотинилированного козьего антитела. Закрывают герметизирующей лентой и инкубируют при 37°С±2°С при встряхивании на планшет-шейкере Lab-line Envitron (или эквиваленте) при 80±5 об/мин в течение 1 часа. Промывают планшеты 5 раз с использованием промывочного буфера. Промокают планшеты бумажными полотенцами. Добавляют 100 мкл/лунка раствора конъюгата нейтравидин-HRP. Закрывают герметизирующей лентой и инкубируют при 37°С±2°С при встряхивании на планшет-шейкере Lab-line Envitron (или эквиваленте) при 80±5 об/мин в течение 1 часа. Промывают планшеты 5 раз с использованием промывочного буфера. Промокают планшеты бумажными полотенцами. Добавляют 100 мкл/лунка холодного субстрата К-синий, покрывают герметизирующей лентой и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут (устанавливают таймер сразу после добавления субстрата в первый ряд), при встряхивании со скоростью 3 на лабораторном шейкере для микротитровальных планшетов (или эквиваленте). Останавливают реакцию путем добавления 100 мкл/лунка 2М фосфорной кислоты (стадия 5.7). Помещают планшеты на планшет-шейкер при скорости 3 на 3-5 минут. Считывают планшет при 450 нм.

Анализ данных и расчеты. ПРИМЕЧАНИЕ: Учитываются только образцы, маркеры, маркированные растворы и контроль с оптической плотностью, попадающей в предел практической количественной оценки (2,5 нг/мл стандарта) для стандартной кривой и отвечающие % CV или % критерия различия, указанным ниже. Если ОП образца попадает ниже ОП для стандарта 2,5 нг/мл, результат будет регистрироваться как меньше чем 2,5 нг/мл. Данное значение затем следует разделить на концентрацию разведенного образца (12 мг/мл), чтобы представить значение в нг/мг. Если образец имеет высокую концентрацию клетки-хозяина, вызванную немаркированным и/или маркированным образцом, и выше стандартной кривой, значение записывают как >100 нг/мл. Данное значение затем следует разделить на концентрацию разведенного образца (12 мг/мл), чтобы представить значение в нг/мг. Рассматривают значения образца как ноль для расчета регенерирования маркера, когда образец показывает значение ниже, чем для стандарта с концентрацией 2,5 нг/мл.

Стандартная кривая. Стандартные концентрации должны быть введены в протокол шаблона. Используют среднеквадратичную кривую. Коэффициент детерминации должен быть равен 0,99, и % CV между тремя лунками должен составлять 20%. Если данный критерий не соответствует: один стандарт (1 уровень, 3 лунки) может быть пропущен. Если пропущен стандарт 1,25 нг/мл, только образцы и маркированные образцы с оптической плотностью, попадающей в диапазон от 2,5 нг/мл до 100 нг/мл (оставшиеся точки стандартной кривой), являются приемлемыми. Дополнительно, для трех повторов каждого уровня стандарта, если одна лунка является явно загрязненной или показывает низкое связывание, она может быть пропущена. Если пропускают лунку из уровня стандарта, оставшиеся повторы должны иметь % различия 20%. % CV для наиболее низкого стандарта, который показывает значения ОП, близкие к фону (пустые) планшета, должен составлять 30%. Если одна лунка пропущена, % различия оставшихся повторов должен составлять 35%. Если пропущен наиболее низкий стандарт, только образцы и маркированные образцы с оптическими плотностями, попадающими в уровень оптической плотности оставшейся стандартной кривой, являются приемлемыми.

Образцы. % CV должен составлять 20% между лунками в трех повторах. Записывают % CV между лунками в трех повторах. Одна лунка из каждого разведенного образца может быть пропущена. Оставшиеся повторы должны иметь % различия 20%. Примечание: если ОП немаркированного образца составляет ниже ОП стандарта с концентрацией 2,5 нг/мл, критерий % различия не следует применять для немаркированных результатов. Ссылка на расчет выше. Рассчитывают фактическую концентрацию белка клетки-хозяина в нг/мг из среднего значения (нг/мл) следующим образом: Белок СНО клетки-хозяина (нг/мг)=среднее значение «результат немаркированного образца (нг/мл)»-концентрация разведенного образца (12 мг/мл).

Маркеры. % CV должен составлять 20% между лунками в трехкратном повторе. Записывают % CV. Одна лунка для каждого маркера может быть пропущена. Оставшиеся точки должны иметь % различия 20%. Ссылка на расчет выше. Приводят концентрацию клетки-хозяина в нг/мл. Данный результат будет использован в расчетах регенерирования маркера. Полученная концентрация для маркера (нг/мл) составляет ±20% от теоретической концентрации маркера. Регистрируют результат и указывают Калибр или Неудача. Если результат для маркера не укладывается в 20% от теоретического, анализ должен быть повторен. Средняя концентрация маркера (нг/мл)×100=10 нг/мл, должна составлять 100±20%.

Маркированные образцы. % CV должен составлять 20% между лунками в трех повторах. Записывают % CV между лунками в трех повторах. Одна лунка из каждого разведенного маркированного образца может быть пропущена. Оставшиеся повторы должны иметь % различия 20%. Ссылка на расчет выше. Записывают % различия между парами разведений. % различия между разведениями должен составлять 25%. Данные результаты будут использоваться для расчета регенерирования маркера. Рассчитывают % регенерирования маркера для каждого набора разведений с использованием следующей формулы: % регенерирования маркера=значение для маркированного образца-значение для немаркированного образца×100. ПРИМЕЧАНИЕ: (1) Если значение ОП для немаркированного образца составляет ниже ОП для стандарта с концентрацией 2,5 нг/мл, рассматривают значение как ноль в расчете % регенерирования маркера. % Регенерирования маркера должен составлять 100±50% (50-150%) для каждого разведения для каждого образца. Записывают результаты и параметры Калибр/Неудача.

Контроль. % CV должен составлять 20% между лунками в трех повторах. Записывают результат % CV. Одна лунка из каждого контроля может быть пропущена. Оставшиеся повторы должны иметь % различия 20%. Ссылка на расчет выше. Регистрируют концентрацию белка клетки-хозяина в контроле в нг/мг. Рассчитывают концентрацию белка клетки-хозяина в нг/мг следующим образом: Белок клетки-хозяина (нг/мг)=результат для белка клетки-хозяина в контроле в нг/мм.

В данном описании процитированы различные публикации, содержание которых включено в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.

1. Способ получения препарата антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части со сниженным содержанием белка клетки-хозяина (БКХ) из образца смеси, содержащей антитело против IL-18 или его антигенсвязывающую часть, и по меньшей мере один БКХ, где указанный образец смеси не подвергали воздействию белка А, и где указанный способ включает:
(a) понижение рН указанного образца смеси, получая, таким образом, первично выделенный образец, при этом указанное понижение рН составляет примерно от 3,0 до примерно 4,0;
(b) доведение рН указанного первично выделенного образца до диапазона примерно от 4,5 до примерно 5,5, и проводимости до 9±0,5 мС/см, а затем;
(с) нанесение указанного первично выделенного образца на катионообменную смолу и сбор образца после катионного обмена;
(d) нанесение указанного образца после катионного обмена на смолу для хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) и сбор образца после ХГВ, где указанный образец после ХГВ содержит указанный препарат антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части со сниженным содержанием БКХ.

2. Способ по п.1, где указанное понижение рН проводят путем смешивания подходящей кислоты с указанным образцом смеси, и где указанную подходящую кислоту выбирают из группы, состоящей из лимонной кислоты, уксусной кислоты, каприловой кислоты и фосфорной кислоты.

3. Способ по п.1, где указанный образец после катионного обмена вносят в анионообменную смолу и отбирают образец после анионного обмена до внесения в смолу для хроматографии гидрофобного взаимодействия.

4. Способ по п.1, где указанная катионообменная смола содержит замещенную матрицу, в которой заместители выбирают из группы, состоящей из карбоксиметила, сульфоэтила, сульфопропила, SO3-, фосфата и сульфоната.

5. Способ по п.4, где указанная катионообменная смола представляет собой фрактогель.

6. Способ по п.4, где указанный заместитель представляет собой SO3-.

7. Способ по п.3, где указанная анионообменная смола содержит замещенную матрицу, где заместители выбирают из группы, состоящей из диэтиламиноэтильной, четвертичной аминоэтильной и четвертичной аминной группы.

8. Способ по п.7, где указанный заместитель представляет собой четвертичный амин.

9. Способ по п.1, где указанный образец после катионного обмена включает первую стадию ионного обмена и вторую стадию ионного обмена.

10. Способ по п.3, дополнительно включающий промежуточную стадию, где указанная промежуточная стадия представляет собой стадию фильтрования после того как отбирают указанный образец после катионного обмена, и до того как указанный образец после катионного обмена вносят в смолу для анионного обмена.

11. Способ по п.10, где указанную стадию фильтрования осуществляют посредством ультрафильтрования/диафильтрования с захватом.

12. Способ по п.1, где указанная смола для ХГВ содержит замещенную матрицу, где заместители состоят из одной или нескольких гидрофобных групп.

13. Способ по п.12, где указанные заместители выбраны из группы, состоящей из алкильных, арильных групп и их комбинаций.

14. Способ по п.12, где указанные заместители выбраны из группы, состоящей из: фенильной, 3-октокси пропан-1,2-диольной, эфирной, пропильной, метильной и бутильной группы.

15. Способ по п.14, где указанная смола содержит агарозную матрицу, которая содержит фенильные заместители.

16. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию фильтрования, где указанный образец после ХГВ подвергают фильтрованию для удаления вирусных частиц и для облегчения буферного обмена.

17. Способ по п.1, где указанное антитело против IL-18 или его антигенсвязывающая часть представляет собой гуманизированное антитело, химерное антитело или многовалентное антитело.

18. Способ по п.17, указанное антитело против IL-18 или его антигенсвязывающая часть представляет собой гуманизированное антитело.

19. Способ по п.17, указанное антитело против IL-18 или его антигенсвязывающая часть представляет собой изолированное антитело человека, которое диссоциирует из IL-18 человека с Kd примерно 1,34×10-4М или менее и константой скорости Koff примерно 0,1 с-1 или менее, обе из которых определены методом поверхностного плазмонного резонанса.

20. Способ по п.1, где указанное антитело против IL-18 или его антигенсвязывающая часть нейтрализует IL-18 как in vivo, так и in vitro.

21. Способ по п.1, где указанный препарат по существу не содержит БКХ.

22. Способ получения препарата антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части с пониженным содержанием белка клетки-хозяина (БКХ) из образца смеси, содержащей антитело против IL-18 или его антигенсвязывающую часть и по меньшей мере один БКХ, где указанный образец смеси не подвергали воздействию белка А, и где указанный способ включает:
(a) понижение рН указанного образца смеси, получая, таким образом, первично выделенный образец, при этом указанное понижение pH составляет примерно от 3,0 до примерно 4,0;
(b) доведение рН указанного первично выделенного образца до диапазона примерно от 4,5 до примерно 5,5, и проводимости до 9±0,5 мС/см, а затем;
(с) нанесение указанного первично выделенного образца на катионообменную смолу и сбор образца после катионного обмена;
(d) нанесение указанного образца после катионного обмена на анионообменную смолу и сбор образца после анионного обмена; и
(е) нанесение указанного образца после ионного обмена на смолу для хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) и сбор образца после ХГВ, где указанный образец после ХГВ включает указанный препарат антитела со сниженным содержанием БКХ.

23. Способ получения препарата антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части с пониженным содержанием белка клетки-хозяина (БКХ) из образца смеси, содержащей антитело против IL-18 или его антигенсвязывающую часть и по меньшей мере один БКХ, где указанный образец смеси не подвергали воздействию белка А, и где указанный способ включает:
(a) понижение рН указанного образца смеси, получая, таким образом, первично выделенный образец, при этом указанное понижение pH составляет примерно от 3,0 до примерно 4,0;
(b) доведение рН указанного первично выделенного образца до диапазона примерно от 4,5 до примерно 5,5 и проводимости до 9±0,5 мС/см, а затем;
(с) нанесение указанного первично выделенного образца на катионообменную смолу и сбор образца после катионного обмена;
(d) фильтрование указанного образца после катионного обмена и сбор фильтрата;
(е) нанесение указанного фильтрата со стадии (d) на анионообменную смолу и сбор образца после анионного обмена; и
(f) нанесение указанного образца после ионного обмена на смолу для хроматографии гидрофобного взаимодействия (ХГВ) и сбор образца после ХГВ, где указанный образец после ХГВ включает указанный препарат антитела против IL-18 или его антигенсвязывающая часть со сниженным содержанием БКХ.

24. Способ по пп.1, 22 и 23, где указанный препарат антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части с пониженным содержанием БКХ содержит одно или несколько меченых антител против IL-18 или их антигенсвязывающих частей.

25. Способ по п.24, где указанная метка является радиоактивной.

26. Способ по п.25, где указанную радиоактивную метку выбирают из группы, состоящей из 125I, 131I, 35S и 3Н.

27. Способ по п.24, где указанная метка является нерадиоактивной.

28. Способ по пп.1, 22 и 23, где указанный препарат антитела против IL-18 или его антигенсвязывающей части с пониженным содержанием БКХ содержит одно или несколько пэгилированных антител против IL-18 или их антигенсвязывающих частей.



 

Похожие патенты:

Группа изобретений относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, конкретно к рекомбинантной плазмидной ДНК pG1-Rm7, обеспечивающей в клетках Escherichia coli синтез гибридного белка G1-Rm7, способного связывать фактор некроза опухолей и обладающего биолюминесцентной активностью люциферазы Renilla muelleri, где указанная плазмидная ДНК включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, и может быть использована в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Предложено моноклональное антитело и его антиген-связывающие части, которые специфически связывают C-концевую или центральную область фактора ингибирования миграции макрофагов (MIF).

Изобретение относится к области иммунологии. Представлены два антитела против IL-21 человека.
Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены вариабельные домены тяжелых (VH) и легких (VL) цепей мышиного антитела против фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) человека, а также антигенсвязывающий фрагмент Fab, которые селективно связываются с ФНО-α человека и нейтрализуют его.
Изобретение раскрывает полностью человеческие моноклональные антитела (IgG аутоантитела), которые связываются с человеческим IL-1α. Антитело содержит тяжелую цепь, ковалентно связанную с легкой цепью, для которых определены аминокислотные последовательности.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Описан иммуноген, для индукции иммунного ответа на IgE.

Изобретение относится к иммунологии. .

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ концентрирования забуференного водного раствора иммуноглобулина в тангенциальном потоке, где значения трансмембранного давления и величину поперечного потока выбирают в зависимости от текущей концентрации иммуноглобулина в растворе, а также способ получения иммуноглобулина с использованием способа концентрирования по изобретению.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Предложено моноклональное антитело, которое специфически связывает сульфатиды и сульфатированные протеогликаны, а также фармацевтическая композиция для лечения атеросклероза и набор реагентов для диагностики атеросклеротических повреждений, применение антитела для получения лекарственного средства для лечения атеросклероза и в качестве вакцины.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекуле нуклеиновой кислоты, которая является циклическим или линейным вектором, пригодным для экспрессии, по меньшей мере, одного целевого полипептида в клетках млекопитающих, включающая (а) по меньшей мере, одну экспрессирующую кассету (POI) для экспрессии целевого полипептида; (б) экспрессирующую кассету (MSM), включающую ген селективного маркера млекопитающих; (в) экспрессирующую кассету (MASM), включающую амплифицированный ген селективного маркера млекопитающих; причем экспрессирующая кассета (POI) фланкирована в направлении 5′ кассетой экспрессии (MASM), кассета экспрессии (MSM) локализована в направлении 3′ от кассеты экспрессии (POI) и в которой кассеты экспрессии (MASM), (POI) и (MSM) расположены в той же ориентации от 5′ к 3′.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения комплекса иммуноглобулинов IgG, IgM и IgA для внутривенного введения. .

Изобретение относится к способам очистки белков. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению гликопротеинов, и может быть использовано для крупномасштабного получения фактора свертывания крови IX в культуре клеток.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций.
Наверх