Способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения


 


Владельцы патента RU 2514828:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ") (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых" (ВлГУ) (RU)

Предложен экспрессный, безопасный и экономичный способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения. Определение проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт по QuEChERS делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора 300 мкл хлороформа в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции. Отбирают полученные экстракты в микрофлаконы, производят выпаривание растворителя и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана. В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором. Продолжительность определения микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к пищевой и перерабатывающей промышленности и может быть использовано при определении содержания микотоксинов в пищевых продуктах, зерновых культурах, комбикормах и мясе с целью оценки их безопасности.

Методик определения всех нормируемых микотоксинов из одной навески в настоящее время не предложено. Известны способы определения отдельных микотоксинов или отдельных классов.

Так, для определения зеараленона, Т-2, охратоксина А применяют тонкослойную хроматографию для каждого токсина отдельно (ГОСТ 28001-88. Методы определения микотоксинов Т-2, зеараленона и охратоксина А. Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма). Метод чрезвычайно сложный, длительный и позволяет полуколичественно определить указанные микотоксины каждого из отдельной навески.

Известен способ определения афлатоксинов (B1, B2, G1, G2) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием (ГОСТ Р 53162-2008. Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1, G2). Афлатоксины экстрагируют метанолом, экстракт очищают и концентрируют на иммуноаффинной колонке, элюируют метанолом, упаривают до малого объема и хроматографируют. Методика длительна, дорогостояща и требует применения большого количества растворителей.

Известен способ определения дезоксиниваленола (ГОСТ Р 51116-97. Комбикорма, зерно, продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиниваленола), основанный на извлечении микотоксина из пробы ацетонитрилом, очистке экстракта на двух последовательных колонках с углем, элюировании дезоксиниваленола ацетонитрилом, упаривании экстракта до малого объема и анализ методом жидкостной хроматографии с УФ-детектором. Однако предлагаемый способ длителен, трудоемок и не позволяют одновременно определить все микотоксины.

Известен способ определения патулина (Патент РФ №2056044, G01N 33/02. Способ количественного определения патулина в пищевых продуктах), основанный на извлечении патулина из пробы этилацетатом, очистке экстракта на адсорбенте, концентрировании экстракта и анализе методом жидкостной хроматографии. Методика длительна и требует применения большого количества растворителей.

Известен способ одновременного определения трихотоценовых микотоксинов и зеараленона в зерне методом газовой хромато-масс-спектрометрии (Toshitsuga Tanaka at al. Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography-mass spectrometry / J.Chromatogr. A. 2000. 882. P.23-28). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 10 г навески 100 мл ацетонитрила в течение 30 мин, удалении жира экстракцией 20 мл гексана, упаривании ацетонитрильного экстракта досуха, растворении сухого остатка в смеси метанола с хлороформом, очистки экстракта на колонке с флорисилом, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в 2 мл метанола, дериватизации тетраметилсиланом и затем хроматографировании. Способ длителен, трудоемок и дорогостоящ.

Известен способ одновременного определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона в зерне методом высокоэффективной хроматографии с флуориметрическим детектором (Gobel R., Lusky К. Simultaneous determination of aflatoxins, ochratoxin A and zearalenone in grains by new immunoaffinity column/liquit chromatography / Food Chemical Contaminants. 2004. V.87. № 2. P.411-418). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора ацетонитрила, очистки экстракта на иммуноаффинной колонке, извлечении из колонки микотоксинов 2 мл метанола, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в гексане, дериватизации трифторуксусной кислотой 15 мин, упаривании досуха, растворении остатка в метаноле и определении микотоксинов при разных длинах волн (афлатоксины - 360-440 нм, зеараленон - 276-466 нм и охратоксин А - 330-460 нм). Способ длителен и трудоемок, требует большого количества растворителей.

Наиболее близким к предлагаемому является способ одновременного определения афлатоксинов в зерновых продуктах (Campone L., Piccinelli A.L., Cetano R., Rastrelli L. Application of dispersive liquid-liquid microextraction for determination of aflatoxins B1, B2, G1, G2 in cereal products / J.Chromatogr. A.2011. 1248. P.7548-7554). Суть его заключается в извлечении микотоксинов из 25 г навески 100 мл раствора метанола, удалении жира экстракцией 6 мл гексана, очистки 1 мл экстракта с использованием дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции хлороформом (220 мкл), удалении хлороформа, растворении остатка в 0,1 мл метанола и определении афлатоксинов методом ФЭЖХ с флуориметрическим детектором. Коэффициент концентрирования микотоксинов составляет 2,0-2,5. Однако метод длителен, требует большого количества растворителей, мал коэффициент концентрирования и не дает возможности определения других микотоксинов из этого же экстракта. Продолжительность анализа только для афлатоксинов составляет 1,5-2 часа.

Цель изобретения - сокращение продолжительности анализа, увеличение воспроизводимости и надежности результатов анализа, сокращение расхода органических растворителей и обеспечение безопасности оператора.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения микотоксинов, включающему отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS, Anastassiades M., Stajnbaher D., Schenck F.J. // J. AOAC Int. 2003. V.86. №2. P.412), центрифугирование и определение хроматографическими методами. В предлагаемом способе экстракцию проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, охратоксина А и зеараленона) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13- и 15-ацетилдезоксиниваленол, патулин, зеараленон, охратоксин А) методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.

Пример определения микотоксинов. В пробирку вместимостью 50 мл помещают 2,000 г измельченного продукта (зерно, комбикорм, мясо), добавляют 10 мл ацетонитрила и 10 мл воды, энергично встряхивают 5 мин, высыпают смесь солей (4 г сульфата магния, 1 г хлорида натрия, 1 г цитрата натрия одноводного и 0,5 г цитрата натрия 1,5-водного), закрывают и энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Отбирают 8 мл полученного экстракта в пробирку вместимостью 15 мл, содержащую 0,9 г сульфата магния, по 0,2 г сорбентов Bondesil PSA и С18, энергично встряхивают 1-2 мин, затем центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин.

В три пробирки отбирают по 2 мл полученного экстракта. В первую вносят 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, во вторую - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, в третью - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси каждую отдельно впрыскивают с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в конических центрифужных пробирках, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне и центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстрактов в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана.

В первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), охратоксин А и зеараленон методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Условия хроматографирования: колонка «Kromasil С18», 150 мм, подвижная фаза ацетонитрил/вода (30/70), объем пробы 10 мкл, длина волны возбуждения 340 нм, детектирования 450 нм для афлатоксинов, 330-460 нм для охратоксина А и 276-460 для зеараленона.

Во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпетол, 13-ацетилдезоксиниваленол, 15-ацетилдезоксиниваленол), зеараленон, патулин, охратоксин А методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов. Условия хроматографирования: капиллярная колонка «OPTIMA® - 5 - Accent» (Macherey - Nagel, Германия, 30 м), температура термостата колонки 120°С, температура испарителя 200°С, детектора 300°С. Температура термостата колонки 120-310°С (скорость нагрева 15 град./мин), газ-носитель - азот, объем вводимой пробы 1 мкл без деления потока.

В третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектированием. Условия хроматографирования: колонка хроматографическая «XTerra RP18», 150 мм, подвижная фаза - ацетонитрил/вода (градиент 4-80% ацетонитрила), скорость подачи подвижной фазы 1 мл/мин, объем вводимой пробы 10 мкл, детектирование при аналитических длинах волн 236 и 270 нм.

Основные метрологические характеристики определения микотоксинов в оптимальных условиях по данной методике при введенных добавках стандартов микотоксинов в зерно, мясо и комбикорма на трех уровнях концентраций указаны в таблице.

Продолжительность определения для указанных в таблице микотоксинов составляет 1,5-2 часа при одновременной работе на 3-х хроматографах. Для пробоподготовки требуется 10,1 мл ацетонитрила, 0,9 мл хлороформа и 0,05 мл гексана. Коэффициент концентрирования примерно в 3 раза выше по сравнению с прототипом, что приводит к более чувствительному определению указанных микотоксинов. Использование разных вариантов хроматографии для определения патулина, зеараленона, охратоксина А приводит к получению более надежных результатов анализа.

Таблица
Основные метрологические характеристики определения микотоксинов
Время удержи-вания, tR, мин Диапазон определяемых содержании, мг/кг Коэффициент концентрирования, К
Микотоксин Введено, мг/кг Степень извлечения, R, %
В1 24,2 0,00005-0,001 0,00005; 0,0005; 0,001 7,8-8,0 100-109
В2 10,3 0,00001-0,001 0,00005; 0,0005; 0,001 7,2-7,8 88-91
G1 20,6 0,00005-0,001 0,00005; 0,0005; 0,001 7,8-8,0 98-100
G2 8,2 0,00001-0,001 0,00005; 0,0005:0,001 7,6-7,8 86-98
Т-2 19,7 0,01-3 0,01; 1,0; 2,0 6,1-7,3 80-90
НТ-2 18,1 0,003-0,3 0,005;0,01;0,1 6,4-6,9 82-83
ДОН 14,2 0,01-2 0,01; 1,0:2,0 7,6-8,9 98-100
зон 18,7 0,01-2 0,01: 1,0; 2,0 6,8-7,5 87-94
3-АДОН 16,5 0,01-2 0,01:1,0:2,0 6,8-7,5 89-97
15-АДОН 15,7 0,01-2 0,005:0,01:0,1 6,1-7,7 87-88
Ниваленол 14,3 0,003-0,3 0,005:0,01:0,1 6,4-7,5 85-97
ДАС 16,7 0,01-2 0,01; 1,0:2,0 6,0-7,3 76-98
ОТА 11,4 0,002-0,2 0,005:0,01:0,1 6,5-7,7 87-96
Патулин 7,1 0,01-2 0,01; 1,0: 2,0 6,8-7,8 89-96
ДОН - дезоксиниваленол, ЗОН - зеараленон, 13, 15-АДОН - ацетилдезоксиниваленол, ДАС - диацетооксискирпенол, ОТА - охратоксин А

Способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения, включающий отбор пробы, экстракцию микотоксинов ацетонитрилом в присутствии высаливателей, очистку экстракта насыпными сорбентами (способ пробоподготовки по QuEChERS), центрифугирование и определение хроматографическими методами, отличающийся тем, что извлечение микотоксинов проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции с добавлением к первой части (для определения афлатоксинов, зеараленона и охратоксина А) 300 мкл хлороформа, содержащего 0,05% йода, ко второй (для определения трихотоценовых микотоксинов, патулина, зеараленона, охратоксина А) - 300 мкл хлороформа, содержащего 50 мкл трифторуксусного ангидрида, к третьей (для определения патулина и зеараленона) - 300 мкл хлороформа, затем полученные смеси впрыскивают каждую отдельно с помощью шприца в 5 мл воды, находящейся в центрифужной пробирке вместимостью 15 мл с коническим дном, выдерживают 30 с на ультразвуковой ванне, центрифугируют при 3000 об/мин 5 мин, отбирают нижние слои экстракта в микрофлаконы, производят отдувку растворителя азотом и остаток в первом и третьем микрофлаконах растворяют в 50 мкл ацетонитрила, во втором - в 50 мкл гексана, в первом микрофлаконе определяют афлатоксины (B1, B2, G1, G2), зеараленон и охратоксин А методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором, во втором - трихотоценовые микотоксины (дезоксиниваленол, ниваленол, НТ-2, Т-2, диацетооксискирпенол, 13-, 15-ацетилдезоксиниваленол), патулин, охратоксин А и зеараленон методом газожидкостной хроматографии с детектором по захвату электронов, в третьем - патулин и зеараленон методом ВЭЖХ с диодно-матричным детектором.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области экологии и предназначено для экологической проверки продуктов питания на предмет их химической безопасности для человеческого организма.

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения массовой доли амидированного пектина в мармеладе. Для этого готовят градуировочные растворы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу специфического отбора высокоаффинных молекул ДНК (ДНК-аптамеров) к рекомбинантному белку-мишени. Указанный способ включает синтез единой полипептидной цепи рекомбинантного белка, содержащего в своем составе фрагмент глютатион-S-трансферазы, целевой белок-мишень, пептидную последовательность, расщепляемую летальным фактором B.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно при получении водного раствора меда. Способ предусматривает нагрев дистиллированной воды до температуры кипения.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована для определения уровня токсикантов в воде, продуктах питания или физиологических жидкостях.

Настоящее изобретение относится к табачной промышленности. Предлагаемый способ предназначен для определения содержания хлора в табачном сырье и мешке курительных изделий.

Изобретение относится к технике определения качественных показателей кофейных напитков и может быть использовано в пищеконцентратной промышленности. Способ характеризуется тем, что используют анализатор запахов с методологией «электронный нос», в котором в качестве измерительного массива применяют 7 сенсоров на основе пьезокварцевых резонаторов объемно-акустических волн с базовой частотой колебаний 10,0 МГц и разнохарактерными пленочными сорбентами на электродах, пробы напитков термостатируют при комнатной температуре, отбирают среднюю пробу объемом 50 см3, отстаивают ее, помещают в герметичный стеклянный сосуд с полимерной мягкой мембраной, выдерживают при постоянной температуре 20±2°C в течение 30 минут, индивидуальным для каждой пробы шприцем отбирают 2 см3 равновесной газовой фазы и вводят в ячейку детектирования, фиксируют частоту колебаний пьезокварцевых резонаторов равномерно через 1 с в течение 120 с, формируют суммарный аналитический сигнал в виде «визуальных отпечатков» максимумов и с помощью программного обеспечения прибора сравнивают с эталонными «визуальными отпечатками», полученными при анализе кофейных напитков для четырех различных социальных групп, приготовленных в точном соответствии с рецептурами из сырья, обжаренного при точном соответствии технологических параметров заданным, устанавливая степень их сходства с каким-либо эталоном из базы данных по кофейным напиткам, составляет более 95%, то делают вывод о принадлежности исследуемого напитка к этой группе, если степень сходства составляет 90-95%, то исследуемый напиток изготовлен из сырья с отличающимися от эталона свойствами, если степень соответствия менее 90%, то напиток не принадлежит к выбранной группе и его сравнивают с эталоном для другой социальной группы; по максимальным сигналам отдельных сенсоров судят о соответствии содержания отдельных веществ в образце эталону: сигнал сенсора с покрытием полидиэтиленгликоль сукцинат (ПДЭГСк) характеризует содержание аминов, сигнал сенсора с покрытием полиэтиленгликоль фталат (ПЭГфт) характеризует содержание сложных эфиров, сигнал сенсора с покрытием полиэтиленгликоль (ПЭГ-2000) характеризует содержание спиртов; если сигналы этих сенсоров в анализируемой пробе соответствуют с погрешностью ±2 Гц их сигналам для стандартной пробы, то содержание спиртов, сложных эфиров, аминов можно считать идентичным эталону.

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к способу и устройству определения зрелости икры. Икру (W) погружают на загрузочный лоток (6), направляют свет от светового излучателя (11) на икру (W) и изображение, по меньшей мере, части икры (W) в состоянии облучения светом от светового излучателя (11) икры (W) снимают с помощью устройства для съемки изображений (12).

Изобретение относится к области пищевой промышленности и предназначено для контроля качества мармелада и желейных корпусов конфет. .

Изобретение относится к области пищевой промышленности и предназначено для определения массовой доли пектинов в мармеладе. .

Изобретение относится к области защиты окружающей среды. Предложен способ определения содержания в газообразной среде труднолетучих органических соединений, таких как полиароматические углеводороды, карбоновые кислоты, спирты, сложные эфиры, н-алканы-С15-30.

Изобретение относится к регуляторам малых расходов газов, применяемых в газовых хроматографах. Технический результат заключается в повышение абсолютной и относительной точности поддержания расхода газа и точности анализа на хроматографах.

Изобретение относится к области хроматографии. Готовят суспензию анионита в 20-25% водном растворе глицерина с последующим ее центрифугированием и декантированием до получения осадка анионита-основы с зернением 12-16 мкм.

Изобретение относится к газовой хроматографии, в частности к использованию модифицированных углеродных адсорбентов для анализа сложных смесей веществ в нефтяной, химической, газовой, медицинской, пищевой и других отраслях промышленности.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано при анализе органических и неорганических веществ методом тонкослойной хроматографии в различных научных и практических областях медицины, биологии, химии, пищевой и парфюмерной промышленности, охране окружающей среды и других отраслях народного хозяйства.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для диагностики патологий, связанных с заболеваниями коры надпочечников.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения химических соединений газохроматографическим методом, и может быть использовано в различных областях химии, фармации, медицины, контроле окружающей среды и технологических процессах в нефтегазовой, химической и пищевой промышленности и так далее.

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии. .

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения содержания свободных альдегидов в альдегидсодержащих смолах и полимерах. .
Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения 2,4-дихлорфенола в крови. Способ включает отбор пробы крови, экстракцию органическим экстрагентом из указанной пробы 2,4-дихлорфенола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, причем перед экстракцией пробу крови подкисляют раствором щавелевой кислоты до pH 2-3, при экстракции в качестве органического экстрагента используют толуол, далее к полученному экстракту добавляют бромирующий реагент и разбавленную водой серную кислоту в объемном соотношении вода : концентрированная серная кислота как 3:1 соответственно, проводят бромирование экстракта в течение 5 минут, после завершения которого избыток брома нейтрализуют раствором сернистокислого натрия, затем полученный бромированный экстракт центрифугируют для отделения толуола и проводят его ацетилирование трифторуксусным ангидридом в среде пиридина в течение 5 минут, при этом пробу крови, органический экстрагент - толуол, бромирующий реагент, трифторуксусный ангидрид и пиридин берут в следующем объемном соотношении 1:0,5:0,4:0,02:0,02 соответственно. Способ обеспечивает упрощение стадии пробоподготовки при одновременном повышении чувствительности. 4 з.п. ф-лы, 6 табл., 1 пр.
Наверх