Штамм диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота для репродукции вирусов


 


Владельцы патента RU 2515915:

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (RU)

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии и касается штамма диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота. Охарактеризованный штамм выделен из легкого плода коровы и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) под №83. Штамм культивируется на среде Игла MEM и ГЛА 1:1 с 10% сыворотки плода крупного рогатого скота, свободен от вирусной, микоплазменной и бактериальной контаминации. Штамм может быть применен для накопления вирусов и достоверной диагностики вирусных инфекций.

 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии, в частности получению нового штамма клеток из легкого плода крупного рогатого скота «ЛПК», отвечающего требованиям биобезопасности и чувствительного к широкому спектру вирусов.

В клетках животного происхождения в процессе длительного культивирования происходят кариологические, культурально-морфологические изменения, которые могут приводить к изменению чувствительности их к вирусам. При этом возможна их контаминация латентными вирусами, микоплазмами и др. микроорганизмами, что создает угрозу для биобезопасности в производстве биопрепаратов, а также непредсказуемым результатам при проведении вирусологических исследований. В связи с этим получение новых клеточных штаммов, свободных от контаминантов и чувствительных к возбудителям вирусных болезней, является актуальным.

Известен штамм гетероплоидных клеток почки теленка Таурус-1, чувствительный к вирусам гриппа А, аденовирусам человека и крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Штамм представлен клетками эпителиоподобного типа, поддерживается на среде Игла MEM с 10% сыворотки крупного рогатого скота (1).

Известен также штамм культивируемых клеток легких плода коровы для культивирования вирусов (ЛЭК). Монослой формируется клетками эпителиоподобного типа в течение 3-4 сут. на среде Игла MEM с 10% сыворотки. Культура клеток ЛЭК обеспечивает репродукцию вирусов ИРТ, ПГ-3, PC крупного рогатого скота. Инфекционный титр этих возбудителей достигает на этой культуре 105-106ТЦД50/мл.

В процессе длительного культивирования штамм ЛЭК контаминировался вирусом ВД-БС и M.arginini (2). Прототип.

В задачу наших исследований входило получение нового, свободного от контаминации, чувствительного к вирусам крупного рогатого скота штамма клеток легкого плода коровы, применяемого для диагностики вирусных инфекций и накопления вирусного материала.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Клеточный пласт ЛПК на 3-4 сут. культивирования состоит из тесно прилегающих друг к другу полигональных клеток с четко выраженными границами. В популяции преобладают клетки фибробластоподобного типа. Ядра клеток крупные, овальной или округлой формы с одним или двумя ядрышками. Большинство ядер содержат мелкосетчатый хроматин. Цитоплазма гомогенная, в отдельных клетках встречаются вакуоли, расположенные, в основном, возле ядра. Некоторые клетки (1%) содержат по два ядра.

Кариологические признаки. Штамм ЛПК является диплоидным. Модальное число хромосом 58-60 (85%), интервал изменчивости 56-62.

Молекулярно-генетические признаки. В полимеразной цепной реакции (ПЦР) с видоспецифическими праймерами, комплементарными к участку генома, кодирующего субъединицу b цитохром оксидазы, подтверждено происхождение штамма от крупного рогатого скота. Штамм свободен от вирусов диареи - болезни слизистых оболочек, лейкоза крупного рогатого скота, микоплазм, что подтверждено методом ПЦР.

В цитологических препаратах и при бактериологическом исследовании не выявлено контаминации бактериями, грибами, простейшими.

Культуральные свойства. Штамм ЛПК поддерживают на среде, состоящей из ГЛА и Игла MEM 1: 1 с 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Культуру клеток выращивают при температуре 36,5-37°C. Кратность рассева 1: 2 - 1: 3. Срок формирования монослоя 3-4 сут.

Получение штамма. Предложенный штамм ЛПК получали следующим образом. Легкое плода коровы подвергали дезагрегации с использованием 0,125%-ного раствора трипсина в нескольких циклах. Диспергированные клетки объединяли, центрифугировали при 1000 об/мин, определяли жизнеспособность, ресуспендировали в ростовой среде (ГЛА в смеси с Игла MEM и 10% сыворотки плодов коров) и засевали в культуральные флаконы. На 5-е сутки после образования монослоя проводили субкультивирование с кратностью рассева 1:2-1:3. Последующие пассажи проводили через 3-4 суток на среде того же состава. Отделение клеток от стекла осуществляли смесью версена с трипсином в соотношении 9:1. Клетки криоконсервировали с использованием 10% ДМСО, 40% фетальной сыворотки и 50% питательной среды. Концентрация клеток составляла 3-4 млн клеток в 1 мл. Жизнеспособность после восстановления - 85-90%.

Пример 1. Культивирование вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ)

В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ИРТ в количестве 0,01-1 ТЦД50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа при температуре 37°C. Затем инокулум удаляли, а в культуру вносили поддерживающую среду, состоящую из ГЛА и Игла MEM 1:1. Инфицированную культуру инкубируют при температуре 37°C в течение 1-3 сут, ежедневно оценивая изменения в монослое. ЦПД проявлялось через 18-30 часов. Полное разрушение монослоя наблюдали через 30-72 часа в зависимости от заражающей дозы и штамма вируса. Уровень накопления вируса определяли по его инфекционному титру в стандартной культуре клеток почки теленка ПТ и параллельно в культуре клеток ЛПК. Максимальный титр вируса ИРТ, репродуцированного в культуре клеток ЛПК, составлял 106-106,75ТЦД50/мл. Культура клеток ЛПК проявляла чувствительность ко всем испытанным штаммам вируса (ТК-А(ВИЭВ)В2, ТНЛ, К-40).

Уровень репродукции вируса свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ЛПК.

Пример 2. Культивирование штамма ПТК 45/86 вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота (ПГ-3)

В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ПГ-3 в количестве 0,1-1 ТЦД50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа. Инокулум удаляли, в инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре 37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - формирование симпластов, удлинение клеток, образование пустот - наблюдали через 48 часов, максимальное ЦПД - через 72 часа после заражения. Инфекционный титр вируса достигал максимальных значений - 106-107 ТЦД50/мл по ЦПД или 106,3-107,5 по гемадсорбции эритроцитов морской свинки.

Уровень репродукции вируса ПГ-3 свидетельствовал о высокой чувствительности культуры клеток ЛПК к этому возбудителю.

Пример 3. Культивирование вируса диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС)

В культуру клеток ЛПК со сформированным монослоем вносили вирус ВД-БС (штаммы ВК-1B 1 №28 и Орегон) в количестве 0,1-0,5 ТЦД50/мл. Адсорбцию вируса проводили в течение 1 часа. Инокулум удаляли, в инфицированную культуру вносили поддерживающую среду и культивировали при температуре 37°C в течение 3-5 сут. Первые признаки ЦПД - образование отдельных участков округлых пикнотических клеток - наблюдали через 48 часов после заражения. Выраженное ЦПД (большинство клеток монослоя представлено мелкими пикнотическими клетками, которые быстро отслаивались от стекла) регистрировали через 72-96 часов после заражения. Инфекционный титр вируса достигал максимальных значений -105,5-106,0ТЦД50/мл.

Пример 4. Определение титра антител к вирусу ИРТ в сыворотке крови крупного рогатого скота в реакции нейтрализации

Уровень антител против вируса ИРТ в положительной и отрицательной сыворотке определяли в реакции нейтрализации. Для этого делали двукратные серийные разведения сыворотки, в которые добавляли по 100 ТЦД50/мл вируса. Суспезию клеток ЛПК с концентрацией 150-200 тыс. клеток/мл с 10% фетальной сыворотки разливали в лунки культуральных планшетов, содержавших смесь разведений сыворотки и 100 ТЦД50/лунку вируса. Учет реакции проводили через 48 часов культивирования в СО2 инкубаторе при температуре 37°C. Титр антител составлял 1:32 для положительной и 0 для отрицательной сыворотки, что соответствовало титру антител, выявляемому в других культурах клеток.

Культура клеток ЛПК, как видно из примера, пригодна для определения титра антител в реакции нейтрализации.

Пример 5. Выделение вируса ИРТ из назальных мазков больного крупного рогатого скота

В пробирки со сформированным монослоем клеток ЛПК (а также MDBK - контроль) вносили назальную слизь, разведенную культуральной средой Игла MEM 1:10. После адсорбции в течение 1 часа клетки трижды промывали и инкубировали со средой без сыворотки при температуре 37°C в течение 5 суток. ЦПД, характерное для вируса ИРТ, проявлялось уже в первом пассаже, в то время как в процессе трех слепых пассажей в культуре клеток MDBK присутствия вируса не выявили.

Культура ЛПК является пригодной для вирусовыделения.

Как видно из приведенных примеров, штамм является новым, свободным от контаминации вирусами, микоплазмами, бактериями, грибами, клетками других видов животных. Он представляет собой биобезопасный субстрат для культивирования вирусов, обеспечивающий высокий уровень их репродукции. Культура клеток штамма ЛПК пригодна для диагностики вирусных инфекций, в частности выделения вирусов из патологического материала и индикации противовирусных антител в реакции нейтрализации.

Штамм апробирован с положительным результатом в отделах клеточной биотехнологии и вирусологии ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии в 2011-2012 гг.

Штамм хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК (П) (СХЖ РАСХН) под №83.

Предложенный штамм клеток легкого плода коровы найдет применение в научно-исследовательских учреждениях, диагностических лабораториях, биологической промышленности.

Просим предложенный штамм, согласно документации, назвать «ЛПК».

Источники информации

1. Патент РФ №1347448, Кл. C12N 5/06, 27.09.1985 г.

2. А.С. СССР №1306121, Кл. C12N 5/06, 22.12.1986 г.

Штамм диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота для репродукции вирусов, депонированный в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) под №83.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается вакцины против вирусной диареи, ротавирусной и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ742 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им.

Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ710 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа количественного определения фиксированного вируса бешенства штамма «Москва 3253». Способ предусматривает обеззараживание и выделение РНК из вируссодержащего материала, постановку реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме «реального времени» с использованием специфичных праймеров RV5-5'-GTTGGGCACTGAAACTGCTA-3', RV6-5'-GAATCTCCGGGTTCAAGAGT-3' и зонда RV7-5'-ROX-AATCCTCCTTGAACTCCATGCGACAGA-BHQ2.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и касается штаммов вируса гриппа. Представлен штамм вируса гриппа A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов научно-исследовательского института вирусологии им.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается набора, включающего олигодезоксирибонуклеотидные праймеры и флуоресцентно меченный зонд для идентификации ДНК аденовируса серотипов 3, 4, 7, 14, 21 методом гибридизационно-флуоресцентной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии. Штамм вируса ядерного полиэдроза хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn обладает высокой противовирусной активностью по отношению к хлопковой совке.
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается способа получения вакцины против парагриппа-3 крупного рогатого скота. Представленный способ включает приготовление вируссодержащего материала из штамма вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, инфицирование вируссодержащим материалом культуры перевиваемых клеток, культивирование вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, сбор вируссодержащей жидкости, инактивацию ее с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой форме, при этом инактивацию вируссодержащей жидкости проводят раствором оксидантов, полученным электролизом 10,0-20,0%-ного раствора хлорида натрия, причем электролиз ведут до достижения величин pH 7,0-8,0, концентрации оксидантов 0,7-0,9% и окислительно-восстановительного потенциала +1000±50 мВ и при расходе инактивирующего средства 4,5-5,0 см3 на 0,8-1,0 л вируссодержащей жидкости, причем инактивацию вируссодержащей жидкости проводят в одну стадию при содержании активного хлора Сах=250-500 мг/л в течение 60-70 мин и при температуре 37-38˚С при рН 7,2-7,4.
Изобретение относится к области медицинской вирусологии. Предложен вакцинный штамм вируса гриппа A/17/mallard/Нидерланды/00/95(H7N3), характеризующийся температурочувствительностью и высокой степенью холодоадаптированности.

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к штамму бактериофага. Штамм обладает литической активностью в отношении Staphylococcus aureus.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в кардиологии для исследования формирования и разрыва бляшек в контролируемых лабораторных условиях, наблюдения за жизнедеятельностью различных клеток в бляшке в заданных условиях и проведения сравнения ех vivo и in vivo.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам липокалина слезной жидкости человека, и может быть использовано в медицине. Мутеин липокалина слезной жидкости человека (hTLc) имеет обнаруживаемую аффинность связывания с рецепторной тирозинкиназой Met (c-Met) человека, или ее доменом, или фрагментом c-Met человека.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к генной инженерии, и касается выделения жизнеспособных клеток из такого биологического материала, как стенка тонкого кишечника мыши.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения длительно незаживающей раны и/или раневой полости. Для этого проводят многократное нанесение на поверхность раны и/или раневой полости пациента композиции, включающей культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток человека, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Предложено применение композиции для культивирования клеток.

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны способы генерации HLA-гомозиготных партеногенетических линий стволовых клеток человека (hpSC-Hhom) как от HLA-гомозиготных, так и от HLA-гетерозиготных доноров.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Предложен способ выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, с культивированием в сосуде, содержащем фибронектин, и последующим получением стволовых клеток из культуры, а также среда для культивирования стволовых клеток, способ культивирования стволовых клеток, клеточное терапевтическое средство, и способ увеличения «стволовости» стволовых клеток, который характеризуется наличием сферической культуры или трехмерной культуры стволовых клеток.
Изобретение относится к области медицины, тканевых технологий и биотехнологии. Предложен предшественник искусственной почки, содержащий не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего, выделенный из живого организма, при этом метанефрос подвергался операциям замораживания и размораживания вне живого организма, и он содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего, перенесенные из живого организма (за исключением мезенхимных стволовых клеток из человеческого эмбриона), и также предложен способ его получения.
Изобретение относится к области медицины и клеточных технологий. Предложен клеточный продукт, содержащий популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, характеризующихся фенотипом CD49f+/EpCAM+ и после обработки вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивирования в коллагеновом геле меняющих профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретающих способность синтезировать мочевину и альбумин.
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а также медицины. Предложен способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга. Благодаря высокой однородности и эффективности выделения стволовых клеток способ может быть использован в трансфузиологии.
Наверх