Способ выделения эндонуклеазы из яда кобры


 


Владельцы патента RU 2515924:

Общество с ограниченной ответственностью "ВИТАЛАНГ" (RU)

Изобретение относится к области биохимии и представляет собой способ выделения эндонуклеазы из яда кобры. Сначала проводят гель-фильтрацию раствора яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiana) на сверхмелком сефадексе G-75, затем хроматографию эндонуклеазы на SP-сефадексе C-25, диализ выделенного фермента с добавлением балластного белка, стерилизацию и лиофилизацию. При этом перед диализом добавляют БСА до конечной концентрации 1,0-2,0 мг/мл, а отдиализованную эндонуклеазу без концентрирования стерилизуют и лиофилизуют. Способ позволяет увеличить выход эндонуклеазы при выделении, а также устранить препятствие на пути ее использования для лечения бешенства коров. 2 пр.

 

Изобретение относится к области ветеринарии и фармацевтической промышленности, в частности к противовирусным средствам на основе эндонуклеаз, и может быть использовано при получении препарата для лечения бешенства коров, вызываемого РНК-содержащим вирусом Neuroryctes rabid, относящимся к группе миксовирусов рода Lyssavirus семейства Rhabdoviridae.

Эндонуклеазы из различных источников являются весьма перспективными противовирусными средствами. Так, панкреатическая эндорибонуклеаза крупного рогатого скота давно используется в медицине при лечении тяжелых форм клещевого энцефалита. Будучи введенной в кровь она настигает в ней и в клетках вирусную РНК и расщепляет ее. Однако оптимум действия панкреатической эндорибонуклеазы лежит в кислой среде и поэтому для того, чтобы она работала эффективно при рН крови и цитозоля клеток (7, 4) приходится вводить ее больному много. Отсюда реакция иммунной системы на чужеродный белок и связанные с этим осложнения. Иное дело содержащаяся в яде кобры относительно неспецифическая низкомолекулярная эндонуклеаза с оптимумом рН 7,8. Она легко проникает через биологические мембраны, обладает большой удельной активностью и действует поэтому в ничтожной концентрации.

Существующий способ выделения эндонуклеазы из яда кобры [1] предполагает добавление на его терминальной стадии альбумина из сыворотки крови человека [2]. Такой препарат идеален для медицины. Однако применение его в ветеринарии для лечения бешенства коров проблематично. Чужеродный белок, внесенный в большом количестве, может вызвать аллергию. Кроме того, использованное в этом способе на терминальной стадии концентрирование в токе воздуха приводит к неоправданным потерям выделяемого фермента.

Цель настоящего изобретения - получить из яда кобры препарат эндонуклеазы не содержащий другого чужеродного для коров белка, и повысить выход целевого фермента.

Поставленная цель достигается заменой на терминальной стадии выделения фермента альбумина из сыворотки крови человека на бычий сывороточный альбумин (БСА), а именно, в раствор эндонуклеазы перед диализом добавляют БСА до конечной концентрации 1,0-2,0 мг/мл, а отдиализованную эндонуклеазу без концентрирования лиофилизуют.

Пример осуществления предлагаемого способа

1. ТЕСТИРОВАНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

Эндонуклеазу тестировали по нарастанию оптической плотности раствора роlу(А) в процессе гидролиза (гиперхромный эффект). Для этого аликвоту раствора фермента инкубировали при 30°С в 3 мл раствора роlу (А) с концентрацией 2,36 ОЕ260 / мл в буфере А (0,05 М Трис-HCI, 5 мМ MgCI2, рН 7,8). Во времени (0-15 мин) регистрировали оптическую плотность реакционной смеси при 260 нм в термостатируемой прямоугольной кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см на спектрофотометре "Specord М 40". Контроль - 3 мл раствора роlу(А) с концентрацией 2,36 ОЕ260 / мл в буфере А. По начальному линейному участку полученной кинетической кривой рассчитывали скорость реакции. За единицу активности эндонуклеазы принимали такое количество фермента, которое в данных условиях вызывало нарастание оптической плотности при 260 нм со скоростью 1 ОЕ/мин.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

Выделение фермента проводили при 0-4°С. 3 г яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiand) растворяли в 40 мл буфера Б (0,05 М Трис-сукцинат, рН 5,6). В растворе яда определяли содержание белка, как описано в работе [1], и активность эндонуклеазы (аликвоты 2,5; 5 и 10 мкл, разбавленной в 30 раз буфером Б - пробы фермента).

2.1. Гель-фильтрация раствора яда кобры на сефадексе G-75. Колонку К 50/100 фирмы «Pharmacia» (Швеция), заполненную на 89 см сефадексом G-75 (сверхмелким), наслоенным на 1 см «подушку» из сефадекса G-75 с диаметром гранул 40-120 мкм, уравновешивали буфером Б, наносили на нее 41,2 мл раствора яда и элюировали буфером Б со скоростью 19,4 мл/ч. Фракции объемом 9,7 мл собирали на коллекторе, измеряли в них оптическую плотность при 280 нм и активность эндонуклеазы (аликвоты по 2 мкл, время реакции 5 мин).

Фракции 82-95, содержащие эндонуклеазу, объединяли (объем 135,8 мл) и определяли в них содержание белка и активность фермента (аликвоты 2,5;5 и 10 мкл разбавленной в 10 раз буфером Б пробы фермента).

Фракции 47-54 (первый пик), содержащие элюирующиеся совместно фосфодиэстеразу и 5' - нуклеотидазу, объединяли (объем 77,6 мл) и диализовали в течение 2 сут против 2 порций по 1 л буфера В (0,02 М Трис-HCl, рН 8,9), после чего концентрировали в течение 1 сут диализом против 250 мл 50% раствора глицерина в буфере В. Сконцентрированный препарат двухферментного биокатализатора (объем 16,6 мл) хранили при -20°С.

Хвостовые фракции, содержащие фосфолипазы, и небольшой последний пик токсинов замораживали и хранили при -20°С.

2.2. Хроматография эндонуклеазы на SP-сефадексе С-25. 135,8 мл раствора эндонуклеазы, полученного на стадии гель-фильтрации, наносили на колонку (1,4×33 см) с SP-сефадексом С-25, уравновешенную буфером Б. Колонку промывали 100 мл буфера Б и фермент элюировали далее линейным градиентом концентрации NaCl при возрастающем рН: смеситель - 350 мл буфера Б; резервуар - 350 мл 0,4 М NaCl в 0,05 М Трис, рН 10,16. Скорость элюции 24 мл/ч. Фракции объемом 8 мл собирали на коллекторе и измеряли в них оптическую плотность при 280 нм и активность эндонуклеазы (аликвоты по 2 мкл, время реакции 5 мин). Фракции 48-59, содержащие эндонуклеазу, объединяли (объем 96 мл) и определяли в них содержание белка и активность фермента (аликвоты 5, 10, и 20 мкл разбавленной в 10 раз буфером Б пробы фермента).

2.3. Диализ и лиофилизация эндонуклеазы. К 96 мл раствора эндонуклеазы, полученного на стадии хроматографии, добавляли 144 мг БСА, раствор переносили в целлофановый мешок и диализовали в течение 2 сут против 2 порций по 1 л буфера Г (0,02 М Трис-HCl, рН 7,8). В отдиализованном препарате фермента (объем 105 мл) определяли активность эндонуклеазы (аликвоты 5, 10, и 20 мкл, разбавленной в 10 раз буфером Г пробы фермента).

Отдиализованную эндонуклеазу, стабилизированную БСА, пропускали через стерилизующие мембраны и лиофилизовали порциями по 0,2 мл. Лиофилизованный препарат эндонуклеазы с БСА хранили в герметично закрытых резиновыми пробками и завальцованными алюминиевыми колпачками флаконах при 4-10°С без потери активности, по крайней мере, в течение 2 лет.

Способ обеспечивает увеличение выхода эндонуклеазы при выделении по сравнению с прототипом [1] на 25% за счет исключения достаточно жесткой стадии концентрирования в токе воздуха, а также устраняет препятствие на пути ее использования для лечения бешенства коров.

Источники информации

1. Комарова Н.И., Медяникова Л.В., Троцкий Н.Ф., Яцухина И.Я., Ямковой В.И. Выделение нуклеаз из яда среднеазиатской кобры Naja naja oxiana. II Биотехнология. 1992. №3. С.35-38.

2. Патент СССР №1721087.

Способ выделения эндонуклеазы из яда кобры, включающий гель-фильтрацию раствора яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiana) на сверхмелком сефадексе G-75, хроматографию эндонуклеазы на SP-сефадексе С-25, диализ выделенного фермента с добавлением балластного белка, стерилизацию и лиофилизацию, отличающийся тем, что, с целью снижения потерь эндонуклеазы на терминальной стадии выделения и адаптации получаемого препарата к лечению бешенства коров, в раствор фермента перед диализом добавляют бычий сывороточный альбумин до конечной концентрации 1,0-2,0 мг/мл, а отдиализованную эндонуклеазу без концентрирования стерилизуют и лиофилизуют.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения глоботриозы заключается в ферментативном переносе галактозного мономера от донора галактозила на лактозу, выполняющую роль акцептора.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Способ предусматривает использование рибонуклеазы бактериальной 7P для увеличения эффективности подавления размножения РНК- и ДНК-содержащих вирусов для лечения острых вирусных заболеваний млекопитающих и теплокровных животных.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 - продуцента фитазы. Рекомбинантный штамм получен путем трансформации штамма Yarrowia lipolytica Polf ATCC MYA-2613 и содержит ген фитазы PhyA Obesumbacterium proteus.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения гидролазы эфиров альфа-аминокислот путем биосинтеза рекомбинантными бактериями. Для осуществления способа сконструирован рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-11271 - продуцент гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, полученный путем трансформации штамма-реципиента Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 1, содержащей ген aehR гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, не модифицированный на 5′-конце последовательностью, кодирующей полигистидиновый «хвост», и находящийся под контролем промотора Т7, а также ген устойчивости к канамицину Kan.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам переработки шкур рыб для получения гиалуроновой кислоты и коллагена. Способ предусматривает следующее.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-11246 - продуцента гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915 и способа микробиологического синтеза такой гидролазы.
Проводят ферментацию питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом. Проводят ультрафильтрацию полученного фильтрата культуральной жидкости с активностью 4250±250 ИЕ/см3 через мембраны с отсечением 5 кДа.

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и касается штамма бактерий Planomicrobium koreense 78k. .

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм бактерии Microbacterium testaceum 17В, депонированный под ВКПМ В-10628 во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика, являющийся продуцентом сайт-специфической эндонуклеазы MteI.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Проводят дробление, просеивание лигноцеллюлозного материала и отбор гранул с размером частиц от 0,08-0,1 мм. В качестве лигноцеллюлозного материала используют солому, траву, щепу, кукурузные початки, жом и жмых. Смешивают полученные гранулы при массовом соотношении между гранулами и водой 1:(1-5) при температуре 70-90оС. Диспергируют их через коллоидную мельницу в течение 1-2 часа для получения суспензии с размером частиц 40-80 мкм. Проводят гомогенизацию полученной суспензии при давлении 50-100 атм и температуре 60-85оС в течение 1-2 часов. Получают взвесь с частицами размером 10-40 мкм. Осуществляют буферизацию полученной взвеси буферным раствором ацетата натрия и уксусной кислоты со значением рН=4,8-5,8. Добавляют смесь ферментов: целлюлазы в количестве 10-60 международных единиц на грамм лигноцеллюлозного материала, β-глюкозидазы в количестве 40-100 международных единиц на грамм лигноцеллюлозного материала и ксиланазы в количестве 60-120 международных единиц на грамм лигноцеллюлозного материала. Смесь ферментов вводят в реактор после охлаждения взвеси до температуры проведения энзимолизиса 40-55оС. Энзимолизис проводят в реакторе в течение 36-72 часов при скорости вращения реактора 80-160 оборотов в минуту. Определяют содержание сахара в гидролизате методом жидкостной хроматографии. Изобретение позволяет провести обработку лигноцеллюлозного материала при невысокой температуре 40-55оС. 6 з.п. ф-лы, 3 ил., 3 пр.

Изобретение относится к способу идентификации улучшенных вариантов белка. Способ включает тестирование множества вариантов белка с единичными заменами в первом тесте первого свойства и во втором тесте второго свойства. Свойству родительского белка присваивается значение 1,0 в каждом тесте. Благоприятное первое или второе свойство обладает значением, превышающим 1,0, и чрезмерно неблагоприятное первое или второе свойство обладает значением менее чем приблизительно 0,80. Указанный родительский белок представляет собой протеазу. Первым свойством является стабильность, вторым свойством является эффективность стирки. Осуществляют идентификацию замены, введение замены в белок для получения варианта белка с множественными заменами. При этом замена не взаимодействует в трехмерной структуре указанного родительского белка, и одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное 0, -1 или -2 по отношению к родительскому ферменту, и, по меньшей мере, одна из замен содержит изменение суммарного заряда, равное +1 или +2 по отношению к родительскому ферменту. Тестируют вариант белка с множественными заменами в первом и втором тесте и идентифицируют указанный вариант белка. Изобретение позволяет получить вариант белка с улучшенной стабильностью и эффективностью стирки. 13 з.п. ф-лы, 6 ил., 6 табл., 7 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения разжиженной биомассы, предусматривающий получение материала биомассы из сахарной свеклы и/или сахарного тростника, разжижение упомянутой биомассы ферментной смесью. Указанную ферментную смесь используют в количестве по меньшей мере 0,025% от биомассы. Ферментная смесь включает целлобиогидролазу, бета-глюкозидазу и полигалактуроназу и дополнительно один или несколько ферментнов с гемицеллюлазной активностью, выбранных из арабиназы, ксиланазы, пектинметилэстеразы, рамногалактуроназы и 1,3-/1,6-бета-D-глюканазы. Полученный в результате продукт содержит остаточного нерастворимого сухого вещества менее 2 масс.%. Разжиженная биомасса является стабильной при хранении и может быть использована для получения продуктов в результате сбраживания, таких как этанол, бутанол, ацетон, 1,3-пропандиол, пропанол, уксусная кислота, молочная кислота и пропионовая кислота. 4 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 пр.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-НСl 50 мМ, СаСl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С. Процесс ведут в несколько последовательных стадий раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в указанном растворителе при температуре в диапазоне 35-40°С с последующей экспозицией. Затем чувствительный слой биосенсора последовательно промывают додецилсульфатом, растворенным в том же буфере в концентрации 0,1%, а затем водой на каждой стадии. При этом процесс обработки проводят трижды. Изобретение позволяет сократить продолжительность процесса. 1 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм бактерий Serratia species является продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов птичьего гриппа A/chickenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2). Предложенный штамм депонирован в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1287. При использовании культуральной жидкости или экстракта клеток штамма для производства противовирусных препаратов нейтрализация вирусов гриппа A/chickenKurgan/05/2005 и A/Aichi/2/68 составляет 100%. 1 ил., 2 табл., 6 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот (AEH) из рекомбинантных бактерий Escherichia coli, несущих ген aehR из Xanthomonas rubrilineans. Для осуществления способа указанные рекомбинантные бактерии культивируют в подходящих условиях, затем разрушают клетки биомассы методом гомогенизации высокого давления для получения гомогената. После чего проводят иммобилизацию содержащейся в гомогенате гидролазы эфиров альфа-аминокислот путем формирования ферментных агрегатов под действием осадителя - сульфата аммония или полиэтиленгликоля - с последующей стадией сшивки этих агрегатов глутаровым альдегидом в присутствии водорастворимого производного аминополисахарида хитозана. Полученные гетерогенные биокатализаторы используют для ферментативного синтеза аминобета-лактамных антибиотиков, например цефалексина, цефпрозила, цефаклора, ампициллина, амоксициллина, путем ацилирования ключевых бета-лактамных соединений соответствующими производными эфира D-аминофенилуксусной кислоты. Настоящее изобретение позволяет получить гетерогенные биокатализаторы с повышенной синтетазной активностью. 4 н.п. ф-лы, 4 табл., 9 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена клетка мицелиального гриба Penicillium canescens со снятой катаболитной репрессией и арабинозной индукцией, продуцирующая ксиланазу и лакказу. Клетка трансформирована плазмидой, содержащей промотор гена bgaS, лидерный пептид bgaS, фрагмент ДНК, кодирующий ксиланазу, терминатор bgaS, ген β-лактамазы и репликон pMB1, и плазмидой, содержащей промотор гена bgaS, лидерный пептид bgaS, фрагмент ДНК, кодирующий лакказу, терминатор bgaS, ген β-лактамазы и репликон pMB1. Предложен также способ ферментного препарата ксиланазы и лакказы с использованием указанной клетки Penicillium canescens. Группа изобретений обеспечивает повышение выхода целевых ферментов. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 3 табл., 4 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен способ получения пропионилхолинэстеразы из животной ткани. Гомогенизируют ганглии головоногих моллюсков двукратной обработкой ультразвуком. Полученный гомогенат разводят дистиллированной водой, фильтруют смесь, центрифугируют, пропускают надосадочную жидкость через хроматографическую колонку, где в качестве сорбента используют конконавалин A-сефарозу (Con-A-сефароза), и сушат, причем перед сушкой пропионилхолинэстеразы в раствор фермента добавляют раствор полиэтиленгликоля. Раствор фермента сублимируют при температуре досушивания не более 30°C. Преимуществом изобретения является получение пропионилхолинэстеразы с оптимальной удельной активностью в промышленных масштабах. 1 з.п. ф-лы, 1 пр.

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и представляет собой рекомбинантную плазмиду pET40CmAP/CGL, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/CGL со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (СmАР) и галактозоспецифичного лектина мидии Crenomytilus grayanus (CGL). Плазмида включает NcoI/SalI - фрагмент плазмиды pET-40b(+) (Novagen) и фрагмент ДНК размером 2028 пар оснований, который является химерным геном, кодирующим структурные гены щелочной фосфатазы CmAP и галактозоспецифичного лектина CGL, соединенных между собой полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность линкера (G4S)3EL и сайта энтерокиназы D4K. Предложен также рекомбинантный штамм E. coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/CGL, трансформированный указанной плазмидой, - продуцент гибридного бифункционального белка CmAP/CGL, включающего аминокислотные последовательности рекомбинантной щелочной фосфатазы CmAP и галактозоспецифичного лектина CGL. Предложен способ получения гибридного бифункционального белка CmAP/CGL. Изобретение позволяет получать высокоочищенный препарат гибридного белка CmAP/CGL со свойствами рекомбинантной высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и галактозоспецифичного лектина CGL и может быть использован для выявления различий в гликозилировании онкофетальных антигенов. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены способ обработки лигноцеллюлозного материала, способ разжижения лигноцеллюлозного материала и система разжижения лигноцеллюлозного материала. Способ обработки включает проведение реакции парового разрыва лигноцеллюлозного материала с получением суспензии, добавление материала на основе щелочи к суспензии, добавление ферментного раствора к суспензии, перемешивание суспензии с добавлением ферментного раствора, проведение ферментативного гидролиза суспензии. Способ разжижения лигноцеллюлозного материала включает проведение реакции парового разрыва лигноцеллюлозного материала с получением суспензии, перемешивание суспензии с материалом на основе щелочи, впрыскивание ферментов ферментного раствора на суспензию, перемешивание суспензии с добавлением ферментного раствора. Система разжижения лигноцеллюлозного материала включает реактор парового разрыва, первый шнековый транспортер, второй шнековый транспортер, смеситель в жидкостном соединении с выходом из второго шнекового транспортера, верхнюю часть реактора для преобразования вязкости материала. Изобретения обеспечивают увеличение скорости процесса разжижения лигноцеллюлозного материала. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил.
Наверх