Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга

Авторы патента:

Айзенштадт Александра Андреевна (RU)

Котелевская Елена Александровна (RU)

C12N5/00 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Владельцы патента RU 2517112:

Общество с ограниченной ответственностью г. Санкт-Петербург "Покровский банк стволовых клеток" (RU)

Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а также медицины. Предложен способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга. Благодаря высокой однородности и эффективности выделения стволовых клеток способ может быть использован в трансфузиологии.

Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, относится к области медицины - трансфузиологии и к разделам биотехнологии.

Одним из перспективных направлений в медицине является использование стволовых клеток для замещения в организме поврежденных и изношенных клеток и тканей. Стволовые клетки можно получить из разных частей организма, в частности гемопоэтические стволовые клетки получают из пуповинной и плацентарной крови, мезенхимные стволовые клетки (МСК) получают из костного мозга, жировой ткани, фибробластов. Перспектива использования мезенхимных стволовых клеток состоит в том, чтобы при их трансплантации в организм человека задействовать не только аутологичные клетки, но и клетки аллогенные, расширив таким образом их изготовление и применение. Выделив путем эксфузии небольшое количество костного мозга ~0,5-1 мл, а из него мезенхимные стволовые клетки посредством культивации, можно добиться получения их на несколько порядков больше.

В медицине известны способы культивирования МСК из костного мозга, так, в статье авторов Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А., Гуреев С.В., Остроумов Е.Н., Честухин В.В., Крашенников М.Е., Миронков Б.Л., Хубутия А.Ш. «Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для сократительной функции миокарда» «Российский кардиологический журнал» №5(43) 2003 г. стр.42-50, описан способ их получения. При получении трансплантационного материала осуществляют забор аутологичных клеток костного мозга путем пункции гребня подвздошной кости больного в количестве 150-300 мл. Путем определенных технологических действий получают клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных элементов, в количестве 350-1500×10⁶. Затем эти клетки ресуспендировали в ростовой среде Iskov”s (Gibco, Grand Island), с добавками. Суспензию клеток высевали для культивирования в чашки Петри диаметром 150 мм в концентрации 2,5-3,0×10⁶ кл/мл при 37°C в CO₂ инкубаторе - атмосфере с 5% CO₂ и 95% влажности на 2-е суток. В конце вторых суток в среду вносили 5-азацитидин до конечной концентрации 6 мкМ на 72 часа для направления дифференцировки стромальных МСК в кардиомиоцитоподобные и для ингибирования спонтанной дифференцировки их в по остеобластоидному направлению. Через 72 часа инкубации на 6-е сутки культивирования смешанная культура МСК использовалась для дальнейшего культивирования. Для этого культуральную среду полностью заменяли ростовой с добавлением к ней (инсулиноподобного фактора роста II, основного фактора роста фибробластов) тироксина и трийодтиронина. Среду заменяли через каждые три дня в течение 2-3 месяцев для наращивания значительной клеточной массы в зависимости от исходного пула стволовых клеток в аспирате больного. Затем пластик-адгезивные клетки снимались трипсином отмывались центрифугированием. Образовавшийся осадок ресуспендировали в растворе Хэнкса с добавками до конечной концентрации 10×10⁶ кл/мл и хранился на льду до введения больному не более 8 часов.

Недостатками такого способа культивирования являются: очень большой забор костного мозга (150-300 мл), за одну биопсию такое количество аутологичного костного мозга аспирировать травматично для пациента, при осуществлении нескольких эксфузий необходимо было указать, по какой порции костного мозга было взято, сколько раз проведена аспирация, с каким промежутком времени и как был восстановлен пациент, кроме того, в указанном способе отсутствует проверка костного мозга и полученных мезенхимных стволовых клеток на контаминацию, инфицирование, гистосовместимость, биологический посев, при проведении операций инфаркта миокарда (сердечной недостаточности, ишемии и т.д.) зачастую очень срочных, срок получения и культивирования - 3 месяца - очень длителен, данный способ является экспериментальным, пробным и осуществлен лабораторным путем, для более широкого применения способ не технологичен и занимает много времени.

В качестве прототипа известно техническое решение «Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток человека ex vivo», п. РФ №2323252 от 25.10.2006 г, дата публикации 27.04.2008 г., C12N 5/08, заключающееся в выделении из костного мозга ядросодержащих клеток и осуществлении культивирования в ростовой среде, выполненной в виде минерально-солевого раствора, содержащего аминокислоты, антибиотики, L-глютамина и эмбриональную телячью сыворотку, либо в виде среды RPMI-1640 (“Sigma”, USA), содержащей пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L - глютамин 2 мМ, 15% эмбриональной телячьей сыворотки, до получения заданного количества мезенхимальных стволовых клеток, в процессе каждого из которых высевают выделенные клетки в культуральные сосуды, в которых в ростовой среде увеличивают популяцию мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Извлечение последних осуществляют 0,03-0,1%-ным раствором трипсина. В процессе каждого цикла культивирования регулярно определяют pH ростовой среды и заменяют ростовой средой, pH которой от 6,0 до 8,0. Перед и после обработки мезенхимальные стволовые клетки отмывают в изотоническом растворе от следов ростовой среды и трипсина.

Недостатками вышеуказанного способа культивирования являются: при достижении монослоя популяции МСК наблюдается увеличение адгезии к культуральному сосуду и количество межклеточных контактов, что затрудняет процесс переноса клеток на новый культуральный сосуд. Также при достижении монослоя популяции МСК возникает явление контактного торможения, что отрицательно сказывается на пролиферативном потенциале клеток. Ростовые среды, используемые в способе, недостаточно эффективны и современны для получения МСК, что ведет к возможной потере МСК и не обеспечивает однородную популяцию, отсутствие определения иммунофенотипирования для получения сведений об ядросодержащих клетках, и в какой степени осуществлена однородность популяции МСК.

Техническим результатом предложенного решения является повышение эффективности выделения стволовых клеток посредством повышения однородности с использованием новой ростовой среды с добавлением к ней заменителя сыворотки, с определением популяции мезенхимных стволовых клеток, повышая экономичность и технологичность процесса выделения МСК из костного мозга.

Этот результат достигается тем, что в способе культивирования мезенхимных стволовых клеток, заключающемся в осуществлении увеличения мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, в соответствующих флаконах в процессе культивирования их в ростовой среде не менее двух циклов с увеличивающим по площади дном до получения их до заданного количества в среде углекислого газа при температуре 37°C с промежуточным воздействием на полученные клетки раствором трипсина, при этом флакон с фракцией мезенхимных стволовых клеток в ростовой среде, выполненной в виде раствора, содержащего 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Media с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, устанавливают в CO₂-инкубатор с экспозицией на 3 суток с прикреплением к пластику культурального флакона мезенхимных стволовых клеток, после двукратной промывки в ламинарном боксе содержимого флакона теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся клеток, добавляют во флаконы ростовую среду и вновь вносят флакон с клетками и ростовой средой в CO₂-инкубатор, последующее культивирование-субкультивирование проводят с периодом не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой культуральной среды не чаще чем раз в три дня, в ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду и двукратно промыв клетки раствором трипсина с ЭДТА, добавляют к клеткам 0,2-0,5 мл последний раствор с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3 минут, при этом взяв каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, считают их количество в камере Горяева, подсчитывая количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей, затем разливают суспензию из предыдущего флакона, стряхивая клетки от подложки и отмывая оставшиеся клетки ростовой средой, в новый флакон, содержащий 10 мл ростовой среды с увеличенной площадью дна - 75 см², и рассеивают клетки во флаконе в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна, и вновь для их роста устанавливают флаконы с ростовой средой и с клетками в CO₂-инкубатор, после получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации, осуществив анализ на бактериальный посев и иммунофенотипирование с использованием проточного цитометра на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток и фиксированием результатов выделения мезенхимных стволовых клеток в паспорт на образец мезенхимных стволовых клеток.

Сущность изобретения как технического решения выражается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.

Существенными признаками решения, совпадающими с признаками прототипа, являются: А - осуществление увеличения мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, в соответствующих флаконах в процессе культивирования в ростовой среде не менее двух циклов с увеличивающим по площади дном до получения их до заданного количества в среде углекислого газа при температуре 37°C с промежуточным воздействием на полученные клетки раствором трипсина.

Существенными отличительными признаками изобретения являются: Б - флакон с фракцией мезенхимных стволовых клеток в ростовой среде, выполненной в виде раствора 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Media с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, устанавливают в CO₂-инкубатора с экспозицией на 3 суток с прикреплением к пластику культурального флакона мезенхимные стволовые клетки; В - после двукратной промывки в ламинарном боксе содержимого флакона теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся клеток, добавляют ростовую среду и вновь вносят флакон с клетками и ростовой средой в CO₂-инкубатор; Г - последующее культивирование-субкультивирование проводят с периодом не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой ростовой среды не чаще чем раз в три дня; Д - в ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду и двукратно промыв клетки раствором трипсина 0,05% (1х) с ЭДТА, добавляют к клеткам 0,2-0,5 мл последний раствор трипсина с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3-х минут; Е - взяв каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, считают их количество в камере Горяева, подсчитывая количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей; Ж - разливают суспензию из предыдущего флакона, стряхивая в нем клетки от подложки и отмывая оставшиеся клетки ростовой средой, в новый флакон, содержащий ростовую среду 10 мл с увеличенной площадью дна - 75 см², рассеивают клетки в флаконе в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна культурального флакона, и вновь для их роста устанавливают флакон с ростовой средой и с клетками в CO₂-инкубатор; И - после получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации, осуществив анализ на бактериальный посев и иммунофенотипирование с использованием проточного цитометра на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток и фиксированием результатов выделения мезенхимных стволовых клеток в паспорт на образец мезенхимных стволовых клеток.

Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, заключается в следующем. После выделения из костного мозга лейкоцитарного концентрата на фиколе, приготовления ростовой среды, в которой растут клетки, выполненной в виде раствора, содержащего 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Vedia с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, и центрифугирования выделяют чистые лейкоциты (ядросодержащие клетки). После соединения последних с чистой культуральной ростовой средой, центрифугирования и слива супернатанта, добавляют ростовую среду и переносят полученную суспензию с мезенхимальными стволовыми клетками на 1-2 флакона с площадью дна 25 см². Устанавливают флаконы с клетками в ростовой среде в CO₂-инкубатор IBBD 6220 (Thermo, Германия) с экспозицией на 3 суток для прикрепления за это время фракции мезенхимных стволовых клеток к пластику. Через 5 суток переносят флаконы из инкубатора в ламинарный бокс “GL-170 Biowizard GoldenLine (Kojair, Finland), промывают 2 раза содержимое флакона 2 мл теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся мезенхимных стволовых клеток. Добавляют новую ростовую среду и вновь устанавливают флакон с клетками в ростовой среде в CO₂-инкубатор. Последующее культивирование-субкультивирование проводят не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% со сменой ростовой среды не чаще чем раз в 3 дня. В ламинарном боксе, удалив из флакона кондиционную среду (отработанную) серологической пипеткой, двукратно по 2 мл промывают клетки раствором трипсина 0,05% (1х) в ЭДТА. Добавляют к промытым мезенхимным стволовым клеткам 0,2-0,5 мл раствора приготовленного трипсина с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3-х минут. Вносят в новые флаконы с площадью дна 25 см² по 5 мл ростовой среды, а во флаконы с площадью дна 75 см² по 10 мл ростовой среды. Аккуратно стучат по стенке флакона, открепляя (стряхивая) клетки от подложки. Смывают оставшиеся клетки 1,5-1,8 мл ростовой средой и снова пипетируют. Количество клеток в суспензии, т.е. в ростовой среде, считают в камере Горяева. Каплю суспензии, содержащей мезенхимные стволовые клетки, вносят в камеру Горяева и подсчитывают количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных областей. Считают клетки, касающиеся правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничивающих линий. Разливают полученную суспензию из предыдущего флакона в новый флакон с ростовой средой. Рассеивают клетки в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна культурального флакона. Затем вновь ставят флакон с мезенхимными стволовыми клетками в ростовой среде в CO₂-инкубатор, продезинфицировав рабочие наружные поверхности флакона 70% спиртом и освещением его УФ светом в течение 15 минут. После получения мезенхимных стволовых клеток в требуемом количестве до их выдачи проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации. Кондиционную среду выделяют в отдельный стерильный флакон, откуда переносят ее стерильным шприцем в сосуд для проверки на бактериальный посев. Кроме того, проводят иммунофенотипирование клеток, используя проточный цитометр FC500 (Becman Coulter, USA), на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимных стволовых клеток с использованием для подсчета камеры Горяева. Все результаты культивирования на образец мезенхимных стволовых клеток заносят в соответствующий паспорт.

Использование изобретения «Способ культивирования мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга» по сравнению с прототипом повышает качество выделения мезенхимных стволовых клеток, на каждом пассаже выделения конфлюентность достигает 85-90%, используются современные реагенты в основном из Германии (Hy Clone, Gibco), позволяющие получить более качественную, экономичную и эффективную ростовую среду, позволяющую сократить время роста и получить более однородную популяцию мезенхимных стволовых клеток. В предлагаемом способе проводят иммунофенотипирование с использованием маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166, что повышает и эффективность конечного определения мезенхимных клеток и надежность и качество фиксации однородности при определении популяции мезенхимных стволовых клеток В предложенном способе выделения и культивирования мезенхимных стволовых клеток из костного мозга используется современное технологичное оборудование из США, Германии, Финляндии, Японии, и проводится выделение и культивирование стволовых клеток в производственном масштабе на предприятии ООО «Покровский банк стволовых клеток» с участием Медицинской Академии постдипломного образования в г. Санкт-Петербурге с фиксацией результатов выделения мезенхимальных стволовых клеток в паспорте на данный образец.

Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, заключающийся в осуществлении увеличения количества мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга, в соответствующих флаконах в процессе культивирования их в ростовой среде не менее двух циклов до получения заданного количества клеток в атмосфере с углекислым газом при температуре 37°C с промежуточным воздействием на полученные клетки раствором трипсина, отличающийся тем, что флаконы с фракцией мезенхимальных стволовых клеток в ростовой среде, выполненной в виде раствора, содержащего 45 мл культуральной среды Advanced Stem Cell Media с добавленными к ней 5 мл заменителя сыворотки Advanced Supplement for Stem Cells, 0,5 мл 100-кратного раствора глутамина, 1 мл или 0,5 мл раствора стрептомицина или гентамицина, устанавливают в CO₂-инкубатор с экспозицией на 3 суток, с прикреплением мезенхимальных стволовых клеток к пластику культурального флакона, после двукратной промывки в ламинарном боксе содержимого флакона теплым с температурой 36-38°C фосфатным солевым буфером с удалением неприкрепившихся клеток добавляют во флакон такую же ростовую среду и вновь вносят флакон с клетками и ростовой средой в CO₂-инкубатор, последующее культивирование-субкультивирование проводят с периодом не чаще чем раз в 5 дней при достижении конфлюентности не более 90% и со сменой ростовой среды не чаще чем раз в три дня, удалив из флакона кондиционную среду, и двукратно промыв клетки раствором трипсина 0,05% (1х) с ЭДТА, добавляют к клеткам 0,2-0,5 мл последний раствор трипсина с ЭДТА и выдерживают содержимое в течение 3 минут, при этом взяв каплю суспензии, содержащей мезенхимальные стволовые клетки, считают их количество в камере Горяева, затем разливают суспензию из предыдущего флакона, стряхивая в нем клетки от подложки и отмывая оставшиеся клетки ростовой средой, в новый флакон, содержащий ростовую среду 10 мл с увеличенной площадью дна - 75 см², и рассеивают клетки во флаконе в соотношении объемов 1 к 3-м или 1 к 4-м в зависимости от площади дна культурального флакона, и вновь для их роста устанавливают флаконы с ростовой средой и с клетками в CO₂-инкубатор, после получения мезенхимальных стволовых клеток в требуемом количестве, проверяют кондиционную среду с клетками на наличие или отсутствие бактериальной контаминации, осуществив анализ на бактериальный посев и иммунофенотипирование с использованием проточного цитометра на наличие маркеров CD90, CD105, CD34, CD45, CD166 с определением количества жизнеспособных мезенхимальных стволовых клеток и фиксированием результатов выделения мезенхимальных стволовых клеток в паспорт на образец мезенхимальных стволовых клеток.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии и касается штамма диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота. Охарактеризованный штамм выделен из легкого плода коровы и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.

Способ культивирования эксплантов атеросклеротических бляшек ex vivo // 2515371

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в кардиологии для исследования формирования и разрыва бляшек в контролируемых лабораторных условиях, наблюдения за жизнедеятельностью различных клеток в бляшке в заданных условиях и проведения сравнения ех vivo и in vivo.

Мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения // 2515063

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам липокалина слезной жидкости человека, и может быть использовано в медицине. Мутеин липокалина слезной жидкости человека (hTLc) имеет обнаруживаемую аффинность связывания с рецепторной тирозинкиназой Met (c-Met) человека, или ее доменом, или фрагментом c-Met человека.

Способ получения лимфоцитов из тонкого кишечника мыши // 2514653

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к генной инженерии, и касается выделения жизнеспособных клеток из такого биологического материала, как стенка тонкого кишечника мыши.

Способ количественного определения клеток-предшественников (cd34+) в кроветворной ткани // 2513511

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.

Способ лечения длительно незаживающей раны и/или раневой полости // 2512681

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения длительно незаживающей раны и/или раневой полости. Для этого проводят многократное нанесение на поверхность раны и/или раневой полости пациента композиции, включающей культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток человека, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток человека.

Применение композиции для культивирования биологических клеток // 2511426

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии и медицины. Предложено применение композиции для культивирования клеток.

Специфичные для пациента линии стволовых клеток, полученные из человеческих партеногенетических бластоцистов // 2511418

Изобретение относится к области биотехнологии. Описаны способы генерации HLA-гомозиготных партеногенетических линий стволовых клеток человека (hpSC-Hhom) как от HLA-гомозиготных, так и от HLA-гетерозиготных доноров.

Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281 // 2511417

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии и медицины. Предложен способ выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, экспрессирующих ZNF281, с культивированием в сосуде, содержащем фибронектин, и последующим получением стволовых клеток из культуры, а также среда для культивирования стволовых клеток, способ культивирования стволовых клеток, клеточное терапевтическое средство, и способ увеличения «стволовости» стволовых клеток, который характеризуется наличием сферической культуры или трехмерной культуры стволовых клеток.

Предшественник искусственной почки и способ его получения // 2511395

Изобретение относится к области медицины, тканевых технологий и биотехнологии. Предложен предшественник искусственной почки, содержащий не относящийся к человеку метанефрос млекопитающего, выделенный из живого организма, при этом метанефрос подвергался операциям замораживания и размораживания вне живого организма, и он содержит мезенхимные стволовые клетки млекопитающего, перенесенные из живого организма (за исключением мезенхимных стволовых клеток из человеческого эмбриона), и также предложен способ его получения.

Антитела, специфично связывающиеся с рецепторами эпидермального фактора роста // 2518239

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам, которые специфично связываются с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR), а также к ДНК, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи указанных антител, ДНК, которые кодируют вариабельные области легкой цепи указанных антител. Раскрыты вектора экспрессии, содержащие эти ДНК, и линии животных клеток для экспрессии вышеуказанных антител, содержащие эти векторы. Описаны композиции для лечения рака, связанного с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), содержащая эффективное количество указанных антител. Изобретения позволяет эффективно лечить рак, связанный с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR). 14 н. и 16 з.п. ф-лы, 12 ил., 12 пр., 3 табл.

Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой (варианты) // 2518289

Изобретение относится к области получения рекомбинантных белков и касается способов их получения. Представлены способы получения антител, включающие: культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; подпитку клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток, где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей. Представленными способами возможно получать, в частности, такие антитела, как анти-TNFα-антитело или анти-IL-12-антитело. Охарактеризованное решение позволяет получить повышенное количество антител и может быть использовано в фармацевтической промышленности. 3 н. и 25 з.п. ф-лы, 46 табл., 4 пр., 1 ил.

Биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, способ его получения (варианты) и применения // 2519326

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию. Предложены способы получения вышеуказанного биокомпозита и набор для его приготовления. Предложены также способ обеспечения заживления повреждения у млекопитающего и способ доставки нуклеиновой кислоты. Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную регенерацию тканей после повреждения у млекопитающего за счет использования трехкомпонентного биокомпозита, состоящего из носителя, по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты и клеток, обеспечивающих репаративную регенерацию. 7 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 пр.

Способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией // 2520091

Изобретение относится к иммунологии, медицине и биотехнологии. Предложен способ стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа против клеток рака молочной железы с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной ДНК-конструкцией. Полученные из периферической крови условно-здоровых доноров, трансфецированные полиэпитопной конструкцией, культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток. Способ позволяет повысить эффективность и экономичность получения цитотоксических лимфоцитов. 1 ил.

Рационально разработанные среды для культивирования клеток // 2520810

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения полипептида в культуре клеток млекопитающего (варианты) и среду для культивирования клеток млекопитающего. Предложенное изобретение может быть использовано для получения в больших количествах полипептида, представляющего интерес. Способ включает получение культуры клеток, содержащей клетки млекопитающего, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, представляющий интерес, и исходную среду для культивирования клеток, при этом объем исходной среды для культивирования клеток составляет примерно 60-99% объема желаемой среды для культивирования клеток. Добавляют питательную среду для культивирования в культуру клеток, при этом объем питательной среды для культивирования клеток составляет примерно 1-40% объема среды для культивирования клеток. Получаемая среда для культивирования клеток представляет собой среду для культивирования клеток, содержащую от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ лейцина, от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ лизина, от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ треонина, от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ пролина и от примерно 7 мМ до примерно 30 мМ валина. Поддерживают культуру клеток в условиях, которые позволяют экспрессировать полипептид, представляющий интерес. Предложенное изобретение позволяет получать полипептид, представляющий интерес, с более высоким выходом. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 15 ил., 16 табл., 7 пр.

Способ получения первичной культуры клеток почек новорожденных крольчат для репродукции вирусов // 2520868

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает эвтаназию крольчат путем обезглавливания, удаление лапок, хвостов, снятие шкурок, вскрытие брюшной полости на уровне поясничных позвонков, извлечение почек, снятие капсулы органа, измельчение на кусочки величиной 1-3 мм. В качестве доноров первичный культуры клеток используют новорожденных крольчат 1-2-дневного возраста. Кусочки ткани отмывают от остатков крови солевым раствором Хенкса, подвергают дезагрегации в 0,25%-ном растворе трипсина путем предварительной инкубации кусочков при 37°C в течение 30-40 минут, клетки осаждают центрифугированием при 1000-1500 об/мин в течение 10 минут, супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в ростовой среде, состоящей из среды Игла MEM, 0,5%-ного раствора лактальбумина (1:1) с рН 7,0-7,2 с 10% сыворотки крови взрослого крупного рогатого скота или плодов коров, доводят концентрацию клеток до 5-7·105 клеток/см3, затем добавляют антибиотик ципрофлоксацин по 100 Ед/мл. При этом определяют чувствительность первично-трипсинизированной культуры клеток почек новорожденных крольчат к респираторно-кишечным вирусам КРС, парвовирусам, герпесвирусам и парагриппу-3 путем установления титров вирусов в lg ТДЦ 50/мл. Способ позволяет повысить чувствительность к вирусам животных, улучшить биологическую активность культивируемых клеток и повысить выход вирусного материала. 3 табл., 3 пр.

Способ восстановления утраченного зуба и способ изготовления восстановительного материала // 2521195

Группа изобретений относится к медицине, а именно к стоматологии, и может быть использована для изготовления восстановительного материала, используемого для восстановления области утраченного зуба в полости рта. Для этого помещают на носитель первую клеточную массу, образованную клетками/клеткой из мезенхимальных либо эпителиальных клеток, и вторую клеточную массу, образованную другой клеткой/другими клетками из мезенхимальных либо эпителиальных клеток. При этом одну из мезенхимальных либо эпителиальных клеток получают из зубного зачатка и указанные клеточные массы располагают в тесном контакте друг с другом без смешивания. Выращивают указанные клеточные массы с формированием целого восстанавливаемого зуба или его зачатка. Затем определяют ориентацию целого восстанавливаемого зуба или его зачатка, сформированного выращиванием, что позволяет внедрить целый восстанавливаемый зуб или его зачаток в области утраченного зуба таким образом, чтобы коронковая часть зуба была направлена внутрь полости рта, при этом зубной зачаток или зуб используют в качестве восстановительного материала для получения эквивалента утраченного зуба в области утраченного зуба. Группа изобретений позволяет восстановить область утраченного зуба путем внедрения восстанавливаемого зубного зачатка или восстанавливаемого целого зуба, изготавливаемого указанным способом. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 пр.

Способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы // 2521506

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способам генерации антиген-специфических клеток с цитотоксической активностью против клеток рака молочной железы, и может быть использовано в медицине. Способ включает выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови пациента, разделение клеток на прилипающую и неприлипающую фракции, добавление к прилипающей фракции МНК ростовых факторов, нагрузку дендритных клеток антигенами опухолевого лизата in vitro, стимуляцию созревания дендритных клеток в течение последующих суток. При этом к полученным незрелым ДК добавляют лизат аутологичных опухолевых клеток в дозе 100 мкг/мл, а еще через 48 часов в течение последующих 24 часов вносят рчФНО-альфа в дозе 25 нг/мл. Затем проводят совместное культивирование зрелых активированных лизатом дендритных клеток и неприлипающей фракции МНК в соотношении 1:10 в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 в дозе 10 нг/мл и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 в дозе 100 нг/мл. Изобретение позволяет повысить уровень цитотоксической и интерферон-продуцирующей активности антиген-активированных дендритных клеток при сокращении сроков их культивирования. 4 табл.

Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток // 2522001

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток. Способ включает этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, в среде, содержащей достаточное количество ингибитора циклин-зависимой киназы, чтобы вызвать увеличение экспрессии MAFA. При этом в качестве ингибитора циклин-зависимой киназы используют этил-(6-гидрокси-4-фенилбензо[4,5]фуро[2,3-b])пиридин-карбоксилат. Изобретение может быть использовано в медицине. 2 з.п. ф-лы, 10 ил., 7 табл., 9 пр.

Средство для лечения ишемических поражений тканей и способ его применения // 2522778

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средству для лечения ишемических поражений тканей, представляющему собой смесь с соотношением 1÷0,5-3 из двух культур мезенхимальных стволовых клеток, одна из которых модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию фактора роста эндотелия сосудов, а другая модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию ангиопоэтина, а также способу лечения ишемических поражений тканей посредством обкалывания ишемезированной ткани, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет достичь эффективной васкуляризации и репарации ишемизированной ткани. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.