Способ определения содержания лиганда в образце (варианты)

Настоящее изобретение относится к биологии и медицине, а именно к области биохимических анализов, и позволяет определять качественно или количественно наличие лиганда в образце. Сущность изобретения заключается в способе определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, в котором выбирают агент или носитель, имеющий блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, причем на изменение детектируемого сигнала, по которому определяют лиганд в образце, влияет пространственная или пространственно-электростатическая блокировка упомянутого блокируемого объекта. Технический результат при использовании изобретения состоит в повышении чувствительности метода к определяемому лиганду, сокращении времени проведения анализа, уменьшении количества требуемых реагентов для проведения анализа, повышении удобства проведения анализа, обеспечении возможности проведения анализа, в том числе в полевых условиях. 7 н. и 35 з.п. ф-лы, 10 пр., 7 ил.

 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к области биохимических анализов, и позволяет определять качественно или количественно наличие лиганда в образце.

Известен способ (Патент США 3,935,074, выдан 27 января 1976 г.), в котором используется молекулярный Реагент, имеющий два эпитопа, причем первый эпитоп схож с детектируемым лигандом, а второй эпитоп, детектирующий, отличается от лиганда. Эти два эпитопа должны быть расположены на Реагенте настолько близко друг к другу, что при связывании первого антитела с первым эпитопом стерически блокируется второй эпитоп так, что второе антитело, анти(детектирующий лиганд), не может связаться со вторым эпитопом. При этом количество связавшегося второго антитела будет коррелировать с количеством лиганда в образце. Определение количества связавшегося или несвязавшегося второго антитела дает информацию о количестве лиганда, находившегося в образце, по сравнению с образцами с известным содержанием лиганда.

Недостатки этого известного способа состоят в том, что:

1) Реагент, несущий на себе два эпитопа, заявлен как молекула. При этом, например, в случае использования данного метода в режиме гетерогенного иммуноанализа, в котором присутствует процесс разделения несвязавшихся антител от связавшихся, метод чрезвычайно трудоемок, время- и трудозатратен, а также сложен в исполнении. Для такого разделения могут быть использованы известные методы хроматографии или центрифугирования, что потребует дополнительного оборудования и, следовательно, ограничивают использование известного способа лабораторными условиями. Возможная иммобилизация данного Реагента на твердой фазе может вызывать частичную пространственную блокировку, например только первого эпитопа, за счет чего существенно снизится чувствительность способа, т.к. первое антитело не сможет вызывать пространственной блокировки второго эпитопа, и тот всегда будет либо заблокирован, либо, наоборот, всегда доступен для связывания, из-за чего появится побочный сигнал, снижающий чувствительность анализа.

2) На Реагенте иммобилизованы молекулы детектируемого в неизвестном образце лиганда, либо его аналога. При этом чувствительность метода невысока, т.к. для изменения детектируемого сигнала требуется концентрация лиганда в образце, достаточная для блокирования первых антител, т.е. превышающая концентрацию первых антител (точнее сайтов связывания на первых антителах), которые, в свою очередь, добавляют в избытке для возможности блокировки существенной часть лиганда на Реагенте в отсутствии лиганда в образце.

3) Для определения количества связанных или несвязанных лигандов на реагенте используется комбинация детектирующего лиганда на реагенте и детектанта. Причем детектирующий лиганд заявлен лишь как сайт для связывания второго антитела (анти-(детектирующий лиганд)) и не представляет собой метки, производящей сигнал (т.е. не может быть флуоресцентной или ферментной меткой). Это означает, что в данном известном способе сигнал производится детектантом, который определяет, сколько второго антитела связалось с детектирующим лигандом на реагенте, а сколько не связалось.

4) В качестве стерического блокиратора используется один «слой» рецептора (анти-лиганд), что может приводить к недостаточному стерическому блокированию и, следовательно, ухудшать динамический диапазон или чувствительность анализа.

Известен способ (Патент США 4,208,479, выдан 17 июня 1980 г.), в котором иммуноанализ проводится с использованием меченого рецептора и модифицирующего реагента, который способен модифицировать метку на рецепторе в случае рецептора, не связанного с лигандом или полилигандным аналогом. В случае же рецептора, связанного с лигандом, последний стерически блокирует подход модифицирующей молекулы к метке. При этом по изменению сигнала от метки можно определить количество л и ганда в анализируемом образце.

Недостатки этого известного способа состоят в том, что:

1) Для проведения анализа обязательно требуется добавление модифицирующего реагента, влияющего на сигнал, создаваемый меткой. Разграничение между рецепторами, связанными и не связанными с лигандом или полилигандным аналогом, осуществляется за счет влияния модифицирующей молекулой на способность метки производить сигнал. При этом способ ограничен в выборе меток, для которых существует подходящий модифицирующий агент, доступ которого к метке может быть стерически ограничен.

2) По определению, данному в описании данного изобретения, модифицирующая молекула взаимодействуете меткой таким образом, что сигнал, создаваемый меткой, уменьшается. При этом из-за стерических затруднений модифицируется только метка вне комплекса рецептор - лиганд (или рецептор - полилигандный аналог) таким образом, что наблюдаемый сигнал производится только немодифицированной меткой в комплексе и остаточным сигналом модифицированных меток вне комплекса. При этом в случае детекции моноэпитопного соединения в образце производимый сигнал будет тем меньше, чем больше этого соединения в образце (и чем меньше полилигандных аналогов маскирует метку от модификатора), что, как правило, приводит к ухудшению чувствительности способа.

3) В случае детекции в образце полиэпитопного лиганда или рецептора полиэпитопного лиганда стерически заблокировать метку от взаимодействия с модифицирующей молекулой должен сам лиганд или рецептор лиганда из образца, при этом в случае полиэпитопных, но небольших, лигандов (например, белков до 30 кДа) их возможности по стерической блокировки весьма ограничены.

4) Метка ковалентно конъюгирована непосредственно с рецептором. При этом, например, неудобно использовать в качестве метки фермент, способный деградировать упомянутый рецептор. Например, если рецептор - белок, то при использовании протеазы в качестве метки будет происходить протеолиз рецептора, как правило, обусловленный расщеплением меткой на одном рецепторе другого рецептора в растворе, что делает результаты такого анализа нестабильными.

Известен способ детекции аналита в образце (Патент США 4,193,983, выдан 18 марта 1980 г.), в котором детектируемый аналит является членом специфически связывающейся пары лиганда и антилиганда, и в котором используется метка, производящая детектируемый сигнал, величина которого зависит от близости упомянутого антилиганда к упомянутой метке из-за объема антилиганда или из-за вещества, конъюгированного с упомянутым антилигандом, которое взаимодействует с меткой. При этом процесс детекции аналита включает в себя, в том числе, смешение в водной среде: 1) образца, содержащего детектируемый аналит, 2) реагента, состоящего из лиганда (или его аналога) и метки, причем данный аналог лиганда способен связываться с упомятнутым антилигандом, и 3) антилиганда в случае, когда лиганд является аналитом или упомянутый антилиганд конъюгирован с упомянутым веществом, которое взаимодействует с меткой, причем реагент представляет собой отдельные коллоидные частицы, состоящие из большей части липофильных компонент и меньшей части метки и лиганда (или его аналога), причем упомянутая метка ковалентно связана по крайней мере с одним липофильным компонентом, а лиганд или аналог лиганда липофилен или сделан таковым за счет соединения с липофильным компонентом.

Недостатки этого известного способа состоят в том, что:

1) На Реагенте иммобилизованы молекулы детектируемого в неизвестном образце лиганда либо его аналога. При этом чувствительность метода невысока, т.к. для изменения детектируемого сигнала требуется концентрация лиганда в образце, способная конкурентно связаться с первыми антителами, а значит концентрация лиганда в образце должна превышать концентрацию первых антител (точнее сайтов связывания на первых антителах), которые добавляют в избытке для возможности блокировки существенной части лиганда на Реагенте в отсутствии лиганда в образце.

2) Реагент состоит из большей части липофильных компонент и меньшей части метки и лиганда (или его аналога) и представляет из себя коллоидные частицы, которые по определению, данному в описании данного способа, относятся к классу ассоциированных коллоидов, являющихся термодинамически стабильными системами, в которых диспергированная фаза состоит из агрегатов молекул или ионов сравнительно малых размеров. Кроме того, указано, что упомянутая метка ковалентно связана по крайнейп мере с одним липофильным компонентом, а лиганд или аналог лиганда липофилен или сделан таковым за счет соединения с липофильным компонентом, причем и метка, и лиганд связаны с частицей нековалентно, а именно за счет липофильной группы. При этом из известного уровня техники известно, что в такой системе помимо меток и лигандов, связанных с частицей, могут присутствовать индивидуальные свободные молекулы метки и лиганда (меченных или не меченных липофильным компонентом), не ассоциированные с частицами (по крайней мере, в случае использования амфифильных компонент). Значит, такие индивидуальные метки будут производить паразитный сигнал, а индивидуальные лиганды конкурировать за связывание с антилигандом, что будет ухудшать параметры анализа, например, чувствительность.

3) Т.к. метка и молекулы лиганда связаны с реагентом и друг с другом нековалентно, а за счет лишь липофильного взаимодействия, то при связывании первых антител с молекулами лиганда на реагенте, метки в составе того же реагента могут мигрировать по поверхности реагента и выходить из под пространственной блокировки первых антител, что будет приводить к невысокой чувствительности способа.

Таким образом, требуемый технический результат состоит в повышении чувствительности метода к определяемому лиганду, сокращении времени проведения анализа, уменьшении количества требуемых реагентов для проведения анализа, повышении удобства проведения анализа, обеспечении возможности проведения анализа, в том числе в полевых условиях.

Для достижения указанного технического результата предложен способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

А) выбор, по крайней мере, одного носителя, представляющего собой нано- или микрочастицу или поверхность твердой фазы и несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с рецептором к определяемому лиганду на носителе, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

В) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого носителя,

iii) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы выбран не определяемый лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания носителей друг с другом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от носителя или схожего с носителем аналога.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого носителя или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал. Кроме того, способ, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым носителем упомянутых молекул или частиц.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющий, по крайней мере, молекулу, идентичную или аналогичную упомянутому лиганду, и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

причем, упомянутая молекула и упомянутый блокируемый объект упомянутого агента косвенно связаны друг с другом, в том числе посредством связей в упомянутом агенте, преимущественно, по крайней мере, одним из взаимодействий: ковалентным, электростатическим, посредством водородных связей и пр., не включающим в себя липофильное взаимодействие,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутой молекулой на упомянутом агенте, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой молекулой на упомянутом агенте пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, состоящего из липофильных и/или амфифильных компонент, несущих на себе по крайней мере, молекулу, идентичную или аналогичную упомянутому лиганду, и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, являющейся нано- или микро-частицей надмолекулярной природы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутой молекулой упомянутого агента, причем упомянутое связывание зависит от присутствия лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой молекулой упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа полиэпитопного лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому полиэпитопному лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, состоящей из, по крайней мере, двух молекул полиэпитопного лиганда, или несущей на себе молекулы полиэпитопного лиганда, или способной связываться с рецептором к определяемому полиэпитопному лиганду в составе агента посредством других вспомогательных молекул в. зависимости от присутствия определяемого лиганда, причем такой, что при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду в составе упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый рецептор, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый полиэпитопный лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы,

Г) определение содержания определяемого полиэпитопного лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством, по крайней мере, одного связующего объекта, причем связывание упомянутого агента и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешивание:

i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

(iii) упомянутого связующего объекта, когда в качестве упомянутого связующего объекта не выбран определяемый лиганд,

iv) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:

i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу,

причем при связывании определяемого лиганда с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента, пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента, причем связывание упомянутого агента и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) смешивание:

i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутого агента,

iii) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу, зависящему от специфического связывания с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.) После упомянутого смешивания и пропускания полученной смеси по упомянутой дополнительной твердой фазе или инкубации в контакте с ней.

Кроме того, способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:

A) выбор поверхности твердой фазы, несущей, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,

Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутой поверхности твердой фазы, причем связывание упомянутой поверхности твердой фазы и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой поверхностью твердой фазы пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутой поверхности твердой фазы, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,

B) приведение в контакт, по крайней мере:

i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,

ii) упомянутой поверхности твердой фазы,

iii) жидкой среды, содержащей, по крайней мере, упомянутую блокирующую частицу, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,

Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

Кроме того, способ, в котором упомянутое блокирование упомянутого блокируемого объекта приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того, способ, в котором упомянутое блокирование упомянутого блокируемого объекта приводит к усилению (увеличению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания агентов друг с другом.

Кроме того, способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от агента или схожего с агентом аналога.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы упомянутого агента выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого агента или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микро-частицу.

Кроме того, способ, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал. Кроме того, способ, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.

Кроме того, способ, в котором в качестве упомянутого блокируемого объекта выбирают фермент, а упомянутый детектируемый сигнал производится в результате работы данного фермента.

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя (или агента) в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, которое не приводит к специфическому связыванию двух носителей (или агентов).

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя (или агента) в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с другими молекулами или частицами или поверхностями твердой фазы, не включающими те, которые находятся на других носителях (или агентах), идентичных или подобных упомянутому (имеющие другие блокируемые объекты).

Кроме того способ, в котором для произведения упомянутого детектируемого сигнала упомянутый блокируемый объект взаимодействует, по крайней мере, с одним сигнальным объектом, причем упомянутый сигнальный объект выбирают отличный от носителя (или агента) и не аналогичный носителю (или агенту), и на создание упомянутого детектируемого сигнала существенно влияет количество взаимодействий «блокируемый объект-сигнальный объект», и не существенно влияет то, взаимодействует ли с каждым упомянутым сигнальным объектом несколько носителей (или агентов) или только один.

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал регистрируют без определения степени агрегации носителей (или агентов) друг с другом.

Кроме того способ, в котором возможная происходящая агрегация носителей (или агентов) друг с другом не влияет существенным образом на упомянутый детектируемый сигнал.

Кроме того способ, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится за счет прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем агрегация носителей (или агентов) не вносит существенного вклада в детектируемый сигнал.

Кроме того способ, в котором участие упомянутого блокируемого объекта в произведении упомянутого детектируемого сигнала заключается во взаимодействии с сигнальным объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от носителя (или агента) и не аналогичным носителю (или агенту), и на создание упомянутого детектируемого сигнала существенно влияет количество взаимодействий «блокируемый объект-сигнальный объект», но несущественно влияет то, взаимодействует ли с каждым сигнальным объектом несколько носителей (или агентов) или только один (когда в качестве сигнального объекта выбрана молекула или частица, а не поверхность твердой фазы).

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, являются, в том числе, возможность быстрой и легкой сепарации связанных молекул от несвязанных, повышение чувствительности метода за счет снятия ограничения на местоположение рецептора и аналога лиганда, возможность отказа от дополнительных сигнализирующих молекул (детектантов) или модификаторов метки на реагенте, например за счет использования в качестве реагента сложносоставной конструкции агента, представляющей собой нано- или микрочастицу с блокируемым объектом, специфически распознающим не лиганд, а третье вещество, и возможности считывать сигнал по взаимодействию пространственно или пространственно-электростатически заблокированного или не заблокированного блокируемого объекта агента с его естественным или синтетическим аналогом.

Кроме того, техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность использования активных детектирующих лигандов (блокируемого объекта), например ферментов, способных прямо или косвенно производить сигнал (в том числе в случае активации ферментом на реагенте зимогена, который затем начинает перерабатывать, например, неокрашенный субстрат в окрашенный).

Кроме того, возможность использования в качестве стерического блокиратора «многослойной блокирующей системы», в которой первая блокирующая частица, например, распознает эпитоп определяемого лиганда или рецептора к определяемому лиганду на агенте, а каждая последующая блокирующая частица распознает либо эпитоп определяемого лиганда или рецептора к определяемому лиганду на агенте, либо эпитоп или эпитопы на предыдущих блокирующих частицах.

Кроме того, возможность использования блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с рецептором к определяемому лиганду агента, причем в зависимости от присутствия определяемого лиганда, и такой, что при связывании блокирующей частицы с рецептором к определяемому лиганду агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того, возможность разграничения рецепторами на агенте, связанными и не связанными с лигандом или блокирующей частицей, без необходимости привлечения молекулы, модифицирующей сигнал блокируемого объекта.

Кроме того, возможность разграничения между рецепторами на агенте, связанными и не связанными с лигандом или блокирующей частицей, за счет способности модифицирующей молекулы модифицировать блокируемый объект на агенте таким образом, что сигнал, создаваемый блокируемым объектом, увеличивается. При этом из-за стерических затруднений модифицируется только блокируемый объект вне комплекса рецептор - лиганд (или рецептор - блокирующая частица) таким образом, что детектируемый сигнал производится только модифицированными метками вне комплекса и побочным сигналом немодифицированных меток в комплексе.

Кроме того, возможность использования низкоаффинных рецепторов к определяемому лиганду для получения высокой чувствительности метода.

Кроме того, возможность использования в качестве агента поверхности твердой фазы.

В рамках данного изобретения Лиганд-рецептор может быть любой парой специфически взаимодействующих молекул. В качестве примера, но не органичения, можно привести следующие пары: антиген-антитело, лектин-углевод, лектин-гликопротеин, стрептавидин-биотин, протеин А-иммуноглобулин, фермент-субстрат, фермент-активатор-зимоген и пр. При этом в приведенных парах лигандом или рецептором, в рамках данного описания, можно считать как первую часть, так и вторую, т.е. например, лиганд может быть антителом, а рецептор - антигеном к упомянутому антителу; лиганд может быть лектином, а рецептор к нему - соответствующим углеводом и т.п. В понятии лиганда для удобства описания подразумевается как сам лиганд, так и его аналоги, т.е. любые молекулы или молекулярные комплексы и частицы, часть которых гомологична лиганду, в том числе комплексы молекул. Так, например, понятие рецептор к определяемому лиганду включает в себя понятие рецептор к аналогу определяемого лиганда.

Кроме того, в одном воплощении метода, вместо лиганда может подразумеваться любое воздействие способное образовать или разрушить связь между блокирующей частицей и агентом (или носителем). Это может быть pH, повышенная температура, электромагнитное излучение и т.п. В этом случае понятие рецептор к определяемому лиганду следует понимать как комбинацию атомов, способных образовать связь под действием упомянутого воздействия или связь которой с блокирующей частицей может быть разрушена упомянутым воздействием. Так, под лигандом может в том числе пониматься молекулы и ионы, подобные этилендиаминтетраацетату, который способен, например, деметаллизировать металлозависимые рецепторы, например, многие лектины. При деметаллизировании таких рецепторов многие из них теряют способность связывать свой естественный лиганд.

Блокируемым объектом, участвующим прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, может быть любой атом, молекула или частица, пространственное или пространственно-электростатическое блокирование которой изменяет детектируемый сигнал.

Пространственная или электростатически-пространственная блокировка блокируемого объекта заключается в затрудненности блокируемого объекта взаимодействовать прямо или косвенно с определенными другими молекулами из-за стерических и/или электростатических факторов. Это значит, что из-за нахождения вблизи блокируемого объекта блокирующей частицы упомянутые молекулы не могут приблизиться к блокируемому объекту, за счет чего и происходит «блокировка». При этом невозможность приблизиться может быть обусловлена как объемом блокирующей частицы, так и ее сильным зарядом. Например, в случае одинакового знака заряда блокирующей частицы и упомянутых молекул, упомянутые молекулы будут отталкиваться от блокирующей частицы и не приблизятся к блокируемому объекту. В случае же разных знаков зарядов упомянутые молекулы могут притягиваться к блокирующей частице, за счет чего их взаимодействие с блокируемым объектом будет конкурировать с притяжением к блокирующим частицам, и, следовательно, будет наблюдаться «блокировка».

Кроме того, улучшение блокировки может быть достигнуто следующим способом. Если блокирующая частица имеет, в том числе, слабое сродство к блокируемому объекту, то по сравнению со случаем, когда такого сродства нет, может достигаться существенно более сильная блокировка при отсутствии определяемого лиганда и несущественно измененная остаточная блокировка в присутствии определяемого лиганда и упомянутых молекул, взаимодействующих с блокируемым объектом.

Поскольку все обратимые биохимические реакции взаимодействия подразумевают наличие как связанных, так и свободных молекул, то все использованные выше понятия, такие как «блокировка», «невозможность приближения» и т.п.используются в статистическом смысле, т.е., например, о блокировке можно говорить и в том случае, если не все блокируемые объекты «заблокированы», важно лишь то, что в случае блокировки «заблокированных рецепторов» больше, чем «незаблокированных».

Определяемым лигандом может быть любая частица, молекула, ион или атом. Определение лиганда в образце может быть использовано, например, для следующих целей: для проведения анализов крови, мочи, слюны, образцов еды, воды и других образцов на наличие тех или иных агентов. Такими агентами, например, могут быть маркеры заболеваний человека, токсические вещества, наркотики, пестициды и т.п.Определение данных агентов может быть использовано для диагностики состояния здоровья человека и животных, определения загрязнения воды и т.п.

Вышеперечисленные применения приведены лишь для иллюстрации, а не для ограничения изобретения.

В качестве носителя, несущего на себе определенные молекулы, могут быть использованы различные нано- и микрочастицы или поверхность твердой фазы. Это могут быть магнитные частицы, золотые частицы, флуоресцентные частицы, наноалмазы, нанофосфоры, полимерные частицы, белковые наночастицы, а также сложные конструкции, состоящие из различных нано- и микрочастиц, а также молекул. Носитель может нести на себе различные маркеры (помимо упомянутых блокируемых объектов) для регистрации носителя. Это могут быть ферментные, флуоресцентные, радиоактивные, магнитные, маркеры, а также маркеры, обладающие поверхностным плазмонным резонансом. Кроме того, могут быть использованы естественные или искусственные вещества, несущие на себе упомянутые определенные молекулы. Так, например, в случае, когда упомянутой определенной молекулой является углевод (например, глюкоза, манноза, сиаловая кислота и т.п.), в качестве упомянутого вещества может быть использован естественно существующий гликопротеин, несущий на себе данный углевод (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, фетуин и т.п.). В таком случае носитель может нести на себе упомянутое вещество, а не сами упомянутые молекулы.

В качестве поверхности твердой фазы может быть использована любая стандартная поверхность, используемая в лабораторной практике, например пластиковые планшеты для проведения иммуноферментного иммуноанализа или иммунохроматографические тест-полоски, или пластиковые пробирки.

Агент, имеющий определенные молекулы, может быть создан различными способами. В качестве примера можно привести следующие способы. Например, упомянутые определенные молекулы могут быть кросс-сшиты с помощью кросс-сшивающих агентов (например, гл юте рал ьде гида и т.п.) или с помощью иных химических способов. Кроме того, для кросс-сшивания данных молекул могут быть использованы биохимические способы, например сшивка посредством (стрепт)авидин-биотиновой или иной нековалентно взаимодействующей системы. Кроме того, в случае белков, они могут быть генно-инженерно полимеризованы в слитые белки.

Кроме того, агент может состоять в том числе из носителя, несущего на себе упомянутые определенные молекулы.

Чувствительность метода по определению содержания лиганда в образце может быть сдвинута в нужный концентрационный диапазон с помощью регулирования плотности рецепторов на агенте (или носителе), как правило, за счет вариации плотности рецепторов к определяемому лиганду (или плотности лиганда), однако вариация плотности блокируемых объектов для этой цели также возможна. Например, возможен такой вариант, приведенный здесь лишь для демонстрации, а не в качестве ограничения метода. Так, в случае повышенных требований к чувствительности метода (т.е. требования детекции наименьшего количества определяемого лиганда в образце), предпочтительнее использовать редкое расположение рецепторов к определяемому лиганду на агенте (или носителе), но так, чтобы блокирующие частицы могли заблокировать блокируемые объекты. Тогда при добавлении определяемого лиганда и ингибировании хотя бы одного (или малого их количества) рецептора к определяемому лиганду на агенте (или носителе) соответствующая блокирующая частица не могла присоединиться в этом месте к агенту (или носителю), за счет чего остались незаблокированными в этом месте агента (или носителя) блокируемые объекты, которые могли бы, например, связаться с комплементарным лигандом (или рецептором), иммобилизованным на иммунохроматографической тест-полоске. В случае же большой плотности рецепторов к определяемому лиганду (или лиганда) на агенте (или носителе) возможность не допустить связывания блокирующей частицы с определенным местом агента (или носителя) потребует большего количества лиганда в образце.

Кроме того, при использовании меток, маркирующих агент или носитель для ее детекции, например ферментных или флуоресцентных, вариация их плотности на агенте или носителе также может либо повышать, либо понижать чувствительность метода.

Кроме того, при пространственном разнесении блокируемого объекта и рецептора к определяемому лиганду (или лиганда), особенно в случае, когда они ассоциированы с носителем или поверхностью твердой фазы, возрастает сложность пространственной блокировки блокируемого объекта. При этом в случае его блокировки непосредственно определяемым лигандом метод ограничен возможностью детекции крайне больших по размерам лигандов. Тем не менее, при использовании блокирующих частиц для блокировки блокируемого объекта можно заблокировать блокируемые объекты, существенно удаленные от рецепторов к определяемому лиганду (или лиганда), причем удаление может быть порядка размеров блокирующих частиц. Учитывая, что блокирующие частицы могут быть существенно больше, чем любые молекулярные рецепторы - вплоть до нескольких десятков микрон, данное изобретение никоим образом не ограничено размерами детектируемых лигандов или пространственным разнесением блокируемого объекта и рецептора к определяемому лиганду (или самого лиганда).

Как упомянуто в определении, блокируемый объект - это любой атом или любая молекула, или частица, присутствие или отсутствие которой, так или иначе, определяет произведение детектируемого сигнала. Так, например, блокируемый объект может быть любой детектируемой меткой - флуоресцентной (в том числе атомарной или ионной), радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом и т.п. Причем в случае флуоресцентной метки ее пространственная заблокированность может заключаться в невозможности тушителя флуоресценции подойти достаточно близко к флуорофору для его тушения или же, наоборот, блокируемый объект может быть тушителем флуоресценции, а его блокировка может заключаться в невозможности флуорофора подойти к тушителю. Кроме того, блокируемый объект может быть одним флуорофором (или рецептором, меченным таким флуорофором) из пары флуорофоров, между которыми возможен ферстеровский резонансный перенос энергии, при этом блокировка будет заключаться в невозможности компонентов этой пары сблизиться друг с другом. Кроме того, это может быть фермент, действие которого может быть детектировано. Например, это может быть фермент, в результате работы которого неокрашенный субстрат превращается в окрашенный продукт или нефлуоресцентный субстрат - во флуоресцирующий продукт.Это также может быть фермент, запускающий каскадную реакцию. Например, его субстратом является зимогенная форма другого фермента, который, будучи активированным, уже производит детектируемый сигнал в результате своей работы, и т.п.Кроме того, блокируемый объект может быть любым рецептором, способным связать другую молекулу или частицу, причем такую, что факт связывания с этой молекулой может быть зарегистрирован. Например, упомянутая молекула может быть одной из вышеупомянутых детектируемых меток. Например, в случае если метка, которую способен связать блокируемый объект - магнитная, то она может быть зарегистрирована с высокой чувствительностью методом детекции нелинейных магнитных материалов на комбинаторных частотах (P.I.Nikitin, P.М.Vetoshko, Т.I.Ksenevich, Sens. Lett. 5, 296, 2007; P.I.Nikitin, P.M.Vetoshko, and Т.I.Ksenevich, J. Magn. Magn. Mater. 311, 445, ?2007). Кроме того, например, эта молекула может быть иммобилизована на какой-либо поверхности твердой фазы или частице, (например на пластиковом планшете или иммунохроматографической тест-полоске). При этом детекция связывания упомянутой молекулы и блокируемого объекта происходит за счет метки, связанной с блокируемым объектом. В случае иммунохроматографической тест-полоски эта метка может быть, например, окрашенная полимерной частицей, магнитной или золотой частицей, в случае планшета -например, ферментная или флуоресцентная метка. Роль данной метки может выполнять, в том числе, сам упомянутый агент (или носитель) или упомянутые молекулы на агенте (или носителе), или молекулы в составе агента (или носителя).

Кроме того, блокируемый объект может представлять собой несколько разных по своей природе меток, например, из тех, что упомянуты выше. При этом комбинированный сигнал от разных меток может изменять параметры анализа, например, повышая чувствительность или расширяя динамический диапазон детектируемых концентраций. Приведенные примеры даны лишь для иллюстрации возможной природы блокируемого рецептора, а не для ограничения вариантов блокируемого рецептора.

Кроме того, за счет использования агента (или носителя) и блокирующих частиц (для пространственной или электростатической блокировки вместо лиганда или рецептора к нему), существенно больших, чем рецепторы, используемые в системе, а также за счет пространственной разнесенности рецептора к определяемому лиганду и блокируемого объекта на агенте (или носителе) в качестве блокируемых объектов возможно использовать, в том числе, ферменты способные деградировать рецепторы, посредством которых блокирующие частицы связываются с агентом (или носителем). Например, в методе (патент США 4,208,479, выдан 17 июня 1980 г.) В случае использования в качестве агента белковых рецепторов, меченных протеазами, особенно низкоспецифичными, агент может быть нестабильным из-за деградации упомянутых рецепторов и потери их функциональности по связыванию «блокирующего» лиганда. В случае использования носителя, несущего на себе упомянутый рецептор и протеазную метку, нет возможности протеазе деградировать рецептор на других носителях (или другие рецепторы, сорбированные на поверхности твердой фазы) из-за ограниченности диффузии, а также степеней свободы, т.е. возможности правильной пространственной ориентации рецептора относительно протеазы для его деградации. При этом протеаза может быть функциональной по отношению к малому молекулярному субстрату, обладающему быстрой диффузией и неограниченностью по всем степеням свободы. То же применимо и к другим ферментам - нуклеазам, гликозидазам и т.п.При этом, например, в одном из воплощений метода на носителе иммобилизованы конканавалин А, связывающий терминальные остатки маннозы и глюкозы, и энтеропептидаза. При этом блокирующей частицей может быть кросс-сшитая пероксидаза хрена, хорошо связываемая конканавалином А и вымещаемая из данной связи глюкозой. В качестве субстрата может быть трипсиноген (в том числе иммобилизованный на наночастицах). При этом в случае блокировки взаимодействия энтеропептидазы и трипсиногена за счет связывания носителя с блокирующей частицей (при низкой концентрации глюкозы) не происходит активации трипсиногена до трипсина. При повышении концентрации глюкозы происходит разблокировка энтеропептидазы, которая превращает трипсиноген в трипсин. При нахождении в смеси прокарбоксипептидазы Б происходит ее превращение трипсином из зимогенной формы в активный фермент карбоксипептидазу Б, которая совместно с трипсином способна из проинсулина сделать инсулин (W.Kemmler, J.D.Peterson, D.F.Steiner, Studies on the conversion ofproinsulin to insulin. I. Conversion in vitro with trypsin and carboxypeptidase B, J. Biol. Chem. 246 (1971) 6786-6791). Таким образом можно добиться, чтобы в качестве детектируемого сигнала происходила выработка инсулина из проинсулина при повышении концентрации глюкозы в среде.

Кроме того, упомянутый детектируемый сигнал может приводить к агрегации агентов (или носителей). Так, например, в случае, когда к агенту (или носителю) добавляют вещество, взаимодействующее с незаблокированными блокируемыми объектами таким образом, что с одной молекулой упомянутого вещества может одновременно связаться по крайней мере два блокируемых рецептора, принадлежащие различным агентам (или носителям), происходит агрегация агентов (или носителей), которую можно детектировать любыми стандартными и известными способами. Другой вариант реализуется следующим способом. Используют, по крайней мере, два агента (или носителя), причем блокируемый объект одного агента (или носителя) комплементарен блокируемому объекту второго агента (или носителя). При этом агрегацию частиц можно измерять любым известным способом: турбодиметрически, по изменению характеристик плазмонного резонанса в случае использования золотых наночастиц в качестве основы для одного или для обоих агентов (или носителей), по изменению ямр-сигнала в случае использования магнитных частиц в качестве основы для одного или для обоих агентов (или носителей) и другими способами.

Однако, такой вариант регистрации детектируемого сигнала (по агрегации каких-либо частиц), как правило, существенно менее чувствителен, чем другие методы, особенно твердофазные методы анализа, приведенные в данном описании, поэтому в одном из воплощении изобретения упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, который не приводит к связыванию двух носителей, т.е. не приводит к их агрегации. В другом воплощении метода, упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя за счет прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, который не находится на другом носителе, причем побочное взаимодействие двух носителей с одним упомянутым сигнальным объектом не вносит существенного вклада в детектируемый сигнал. Это значит, что в случае, например, связывания с блокируемым объектом (например анти-флуоресцеиновыми антителами) белка, меченного флуоресцеином, сигнал будет детектироваться с помощью регистрации флуоресценции флуоресцеина на носителе. При добавлении не слишком больших избытков упомянутого белка, меченного флуоресцеином, может происходить незначительная агрегация носителей друг с другом, связанная с тем, что упомянутый белок, меченный флуоресцеином, может связаться более, чем с одним носителем. При этом в данном воплощении изобретения, детектируемый сигнал будет определяться возможностью упомянутого белка, меченного флуоресцеином, связаться с носителем и произвести сигнал, например, после отмывания несвязавшихся с носителями молекул упомянутого белка, а не за счет агрегации носителей, хотя в данном случае возможна и несущественная агрегация носителей, приводящая к несущественному тушению флуоресценции. Так, например, в другом воплощении изобретения упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания носителей (или агентов) друг с другом. В другом воплощении изобретения упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя (или агента) в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от носителя или схожего с носителем аналога. Это значит, что указанное взаимодействие не подразумевает, что детектируемый сигнал определяется лишь агрегацией носителей или агентов друг с другом. Даже если агрегация и возникает, то детектируемый сигнал производится за счет другого феномена. Так, например, если блокируемый объект на носителе - поликлональное антитело против бычьего сывороточного альбумина (БСА), а сигнальный объект - бычий сывороточный альбумин, меченный флуоресцеином, то при разблокировании блокируемого объекта на носителе, он будет связывать меченный флуоресцеином БСА из раствора. При этом, т.к. блокируемый объект представляет из себя поликлональные антитела, то при малой концентрации меченного БСА, несколько носителей может связаться с одной молекулой меченного БСА, при этом может произойти частичная агрегация носителей. Однако в этом случае намного чувствительнее детектировать связавшийся с носителями флуоресцеин по его флуоресценции, нежели определять степень агрегации частиц. Кроме того, при добавлении существенного избытка меченного флуоресцеином БСА, специфическое связывание носителей посредством БСА не будет происходить, и следовательно, уменьшится степень агрегации носителей. В то же время флуоресцентный сигнал, будет все также пропорционален количеству разблокированных блокируемых объектов, а не степени агрегации носителей. Необходимо заметить, что неспецифическая агрегация носителей может происходить и происходит практически в любом случае - при наличии определяемого лиганда и в его отсутствии, поэтому не существует методов анализа, на которые не влияет агрегация тех или иных объектов, участвующих в анализе. Кроме того, в вышеприведенном случае специфическая агрегация носителей за счет присоединения нескольких носителей к одной молекуле БСА может изменять флуоресцентный сигнал за счет, например, тушения флуоресценции. Однако если агрегация незначительна и БСА был добавлен в достаточном количестве, тушение флуоресценции будет лишь незначительно влиять на сигнал. В упомянутых случаях сигнальный объект, производящий детектируемый сигнал, может быть детектируемой меткой (флуоресцентной, магнитной, обладающей поверхностным плазмонным резонансом), прямо производящей детектируемый сигнал, кроме того он может быть, например, ферментной меткой - производящей флуоресцирующие молекулы из не флуоресцирующих и т.п. При этом детектируемый сигнал должен производиться именно сигнальным объектом, а не быть обусловленным взаимодействием с носителем. Кроме того, в тех случаях, когда сигнальный объект изменяет сигнал, производимый блокируемым объектом, сигнальный объект может быть, например, тушителем флуоресценции блокируемого объекта или ингибитором ферментного блокируемого объекта. При этом детектируемый сигнал должен производиться именно блокируемым объектом, а не носителем (в отличие от случая определения агрегации носителей), а требование к сигнальному объекту быть отличным от носителя или схожего с носителем аналога означает, что изменение сигнала может быть достигнуто лишь за счет взаимодействия сигнального объекта с блокируемым объектом безотносительно взаимодействия носителей друг с другом. Кроме того, схожий с носителем аналог подразумевает аналог устроенный подобно носителю, но имеющий другие связывающие рецепторы (или рецептор к определяемому лиганду или молекулы лиганда или аналога), другие блокируемые объекты или другие соответствующие им блокирующие частицы. Все вышесказанное про носители верно и также и для агентов, используемых для анализа. Кроме того, в другом воплощении метода, когда блокируемый объект связывается с поверхностью твердой фазы, носитель (или агенты) могут сами производить сигнал за счет того, что они могут быть зарегистрированы (в случае если они, например, являются окрашенными латексными частицами или золотыми, магнитными частицами, или с ними ассоциированы иные метки, например, ферментные), при этом специфическое связывание носителей (или агентов) с твердой фазой не является как таковой их агрегацией. Хотя с единой твердой фазой и соединяется большое количество частиц, такое взаимодействие следует отнести к специфическому связыванию носителей или агентов с не аналогичными им объектами, нежели к агрегации агентов друг с другом друг с другом в смысле агрегации аналогичных друг другу веществ. В другом воплощении метода, упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя (или агента) в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с другими молекулами или частицами или поверхностями твердой фазы, не включающими те, которые находятся на других носителях (или агентах), идентичных или подобных упомянутому носителю (или агенту) -имеющие другие блокируемые объекты.

В качестве блокирующей частицы, несущей на себе определенные молекулы, могут быть использованы, различные нано- и микрочастицы, а также молекулы. Это могут быть магнитные частицы, золотые частицы, флуоресцентные частицы, наноалмазы, нанофосфоры, полимерные частицы, белковые наночастицы, а также сложные конструкции, состоящие из различных нано- и микрочастиц, а также молекул.

Кроме того, блокирующая частица может быть создана путем кросс-сшивания рецептора или кросс-сшивания самого лиганда или его аналога, или кросс-сшивания молекулы-носителя, несущей на себе молекулу лиганда. Причем, например, в случае, когда лиганд - углевод, например, глюкоза или манноза, молекула-носитель может естественным образом нести на себе этот лиганд, например, в случае гликопротеина пероксидазы хрена. Кроме того, лиганд может быть иммобилизован на молекуле-носителе искусственным образом, например, с помощью химической конъюгации, так же как, например, принято для иммобилизации гаптенов на белке-носителе для иммунизации животных и наработке антител против данного гаптена. Кроме того, лиганд или рецептор могут быть конъюгированы с частицей, образованной кросс-сшиванием иной молекулы. Кросс-сшивание может быть произведено различными известными способами, такими как сшивка гомобифункциональные кросс-линкерами, например, гл юте рал ьде гидом, или гетеробифункциональными (Hermanson, G.T., Bioconjugate Techniques (Academic, London), 2nd Ed., 2008), или с помощью иных химических способов, кроме того, для кросс-сшивания данных молекул могут быть использованы биохимические способы -например, посредством (стрепт)авидин-биотиновой или иной нековалентно-взаимодействующей v системы. Кроме того, в случае белков, они могут быть генно-инженерно полимеризованы в слитые белки. Кроме того, на такой искусственной белковой частице могут быть образованы функциональные группы для удобной и быстрой конъюгации гаптенов, лигандов или рецепторов. Кроме того, удобство использования такой частицы состоит в том, что, подбирая концентрации кросс-сшиваемой молекулы и кросс-сшивающего агента, можно получать частицы разного размера для оптимизации свойств их стерической блокировки поверхности агента (или носителя). Дисперсию по размерам получаемых блокирующих частиц можно уменьшать, выделяя нужные по размеру фракции, используя гель-фильтрационное хроматографическое разделение кросс-сшитых молекул. При этом можно подбирать размер блокирующих частиц для оптимальной блокировки блокируемых объектов. Кроме того, используя разные фракции частиц, например, после гель-фильтрации кросс-сшитых молекул, можно стерически более полно блокировать блокируемые объекты: сначала добавлять к агенту (или носителю) фракции с большими частицами, а затем с меньшими.

Кроме того, за счет использования агента (или носителя) с плотной посадкой рецепторов к определяемому лиганду (или лиганда) и блокирующих частиц можно добиться, чтобы присоединение блокирующих частиц к агенту (или носителю) было одноточечным или многоточечным. Случай многоточечного связывания выгодно отличается тем, что возможно использовать низкоафинные рецепторы к определяемому лиганду или рецепторы, отличающиеся большой скоростью диссоциации комплекса с лигандом. При этом чувствительность метода и скорость получения результата может быть выше (чем в случае высокоафинных рецепторов) в случае добавлении определяемого лиганда к уже собранному комплексу агент (или носитель)-блокирующая частица. За счет быстрой скорости диссоциации пар рецептор-(эпитоп блокирующей частицы), будет более вероятно вытеснение блокирующей частицы из взаимодействия при добавлении более низких концентраций свободного детектируемого лиганда, тем не менее, за счет многоточечного связывания - связь агента (или носителя) и блокирующей частицы будет прочной в отсутствие свободного определяемого лиганда. Данный случай удобен для варианта иммуноанализа, когда время анализа и минимальное количество манипуляций для проведения анализа критично. При этом комплекс агента (или носителя) и блокирующих частиц может быть преподготовлен. При этом время, занимаемое на сборку агента (или носителя) и блокирующих частиц, не включается в значимое время анализа.

Надо заметить, что при упомянутом смешении (или приведении в контакт) блокирующие частицы могут взаимодействовать с агентом (или носителем) не только посредством взаимодействия через рецептор к определяемому лиганду (или через лиганд). Так, например, за счет использования второй связи между агентом (или носителем) и блокирующей частицей можно реализовать многократно обратимую блокировку блокируемого объекта на агенте (или носителе). Если упомянутая вторая связь (ковалентная или нековалентная) происходит с использованием длинного линкера, то блокирующие частицы при вытеснении их свободным определяемым лигандом в образце отсоединяются от рецепторов к определяемому лиганду агента (или носителя), и отходят на определенное длиной упомянутого линкера расстояние и происходит разблокировка блокируемого объекта для создания детектируемого сигнала. Когда же концентрация свободного определяемого лиганда в образце снижается, определяемый лиганд диссоциирует от рецептора к определяемому лиганду и с агентом (или носителем) теперь может опять соединиться блокирующая частица, за счет чего она опять приближается к блокируемому объекту и тем самым его блокирует, и сигнал не может быть произведен. Упомянутым линкером могут стать различные молекулы, тем не менее, предпочтительнее использовать гидрофильные полимеры (полиэтиленгликоль, декстран и т.п.), не препятствующие, а наоборот стимулирующие, удаление блокирующей частицы от агента (или носителя) пока они не связаны за счет рецепторов к определяемому лиганду агента (или носителя). Такой вариант обратимой блокировки также возможен в случае если на агенте (или ноистеле) расположен не рецептор к определяемому лиганду, а молекулы аналогичные лиганду или связующие рецепторы, с которыми прямо или косвенно соединяется блокирующая частица.

Способность блокирующих частиц связываться с агентом (или носителем) прямо или косвенно через рецептор к определяемому лиганду (или лиганда) агента (или носителя) подразумевает широкое разнообразие вариантов блокировки блокирующей частицей блокируемого объекта агента (или носителя). Так, например, блокирующая частица может связываться с рецептором к определяемому лиганду (или лигандом или связующим рецептором) агента (или носителя) не напрямую, а через набор взаимодействующих друг с другом молекул, так, например, в случае использования в качестве рецептора к определяемому лиганду мышиных антител, сначала может быть добавлен биотинилированный антиген (или биотинилированный аналог лиганда, к которому упомянутое антитело имеет меньшее сродство так чтобы определяемый лиганд из образца с легкостью вытеснял упомянутый биотинилированный аналог), а затем блокирующая частица, несущая на себе (стрепт)авидин. Это, например, может позволить использовать только один тип блокирующих частиц для детекции различных лигандов в образце (в случае мультиплексного анализа).

Кроме того, рецептор к определяемому лиганду может быть добавлен к агенту (или носителю) на шаге смешения, например, при этом могут смешивать несущий на себе рецептор 1 агент (или носитель) и дополнительную частицу 2, несущую на себе лиганд рецептора 1 и рецептор к определяемому лиганду.

Кроме того, может быть использована и многослойная блокировка, например, в вышеприведенном случае со стрептавидиновыми частицами могут быть добавлены вторые блокирующие частицы, несущие на себе крысиные анти-стрептавидиновые антитела, а следом могут быть добавлены третьи блокирующие частицы несущие на себе кроличьи анти-крысиные антитела и т.д. Понятно, что за счет использования такой многослойной блокировки степень блокирования может быть многократно усилена.

Изменение детектируемого сигнала зависит от связывания или не связывания блокирующей частицы с агентом (или носителем). При этом присутствие определяемого лиганда может влиять на образование или разрушение связи блокирующей частицы и агента (или носителя) разными способами. Так, например, связывание блокирующей частицы с рецептором к определяемому лиганду (или лигандом или связующим рецептором) агента (или носителя) может происходить несколькими способами. Например, в первом варианте упомянутая связь может осуществляться за счет распознавания упомянутым рецептором к определяемому лиганду молекул лиганда на блокирующей частице или молекул лиганда на молекуле, с которой связывается прямо или косвенно блокирующая частица. При этом в данном случае определяемый лиганд в образце конкурирует за связывание с упомянутым рецептором к определяемому лиганду, за счет чего количество связанных блокирующих частиц зависит от количества определяемого лиганда в образце. Кроме того, например, можно реализовать другой вариант.Связывание блокирующей частицы с рецептором к определяемому лиганду происходит за счет распознавания рецептором на блокирующей частицы рецептора к определяемому лиганду или за счет связывания блокирующей частицы прямо или косвенно с рецептором, распознающим рецептор к определяемому лиганду. При этом связывание упомянутого рецептора с рецептором к определяемому лиганду становится затрудненным или невозможным в случае связывания рецептора к определяемым лигандом с определяемым лигандом или его аналогом. Подобными способами может реализовываться связывание блокирующей частицы с молекулами лиганда агента (или носителя).

В одном из воплощений изобретения, неспецифическое связывание блокирующей частицы с агентом (или носителем) не ухудшает параметры анализа. Так, в известных методах, например, в иммуноферменТном твердофазном анализе, неспецифическое связывание с твердой фазой планшета ферментной метки, взаимодействующей с иммуносендвичем, приводит к повышению всех сигналов (для всех образцов), что ухудшает предел детекции метода. В предлагаемом изобретении, например, в воплощении, в котором блокируемый объект для произведения сигнала связывается с молекулой, иммобилизованной на твердой фазе (например, на иммунохроматографической тест-полоске в формате стандартного иммунохроматографического анализа), неспецифическое связывание блокирующей частицы с агентом (или носителем), наоборот, приводит к уменьшению сигнала, а не к его увеличению, что не приводит к ухудшению предела детекции. В одном из воплощений изобретения, неспецифическое связывание агентов (или носителей) с твердой фазой, опосредованное неспецифически связанной с агентом (или носителем) блокирующей частицей, как правило, не будет происходить, т.к. в основном с твердой фазой неспецифически будут связываться свободные блокирующие частицы, как правило, находящиеся в смеси в существенно большем количестве, чем количество агентов (или носителей). Кроме того, подобрав блокирующие частицы, обладающие минимальным неспецифическим связыванием с твердой фазой (но не обязательно с агентом или носителем), возможно свести вредные эффекты неспецифического связывания в системе к абсолютному минимуму. Для этого в одном из воплощений метода, выгодно использовать блокирующую частицу, созданную на основе сильно-гидрофильных незаряженных соединений, которые, как правило, обладают минимальным неспецифическим связыванием. Это могут быть частицы, покрытые молекулами полиэтиленгликоля, или созданные с содержанием большого количества углеводов - например, на основе декстрана или гликопротеинов. Кроме того, в приведенных примерах, неспецифическое связывание за счет рецепторов на блокирующей частице, специфически распознающих молекулы на агенте (или носителе), может не ухудшать предел детекции. Т.е. как было отмечено, такое неспецифическое связывание с агентом не повышает сигнал, и неспецифическое связывание свободных блокирующих частиц с твердой фазой, также не повышает сигнал. Таким образом, в одном из воплощений метода, можно практически полностью не зависеть от неспецифического связывания блокирующей частицы с агентом (или носителей), специфическая связь которых зависит от присутствия определяемого лиганда.

Кроме того, агент (или носитель) может быть легко многократно сепарирована от несвязавшихся или диссоцировавших от него молекул или других частиц. Так, например, используя в качестве носителя магнитную частицу можно легко удалить несвязавшиеся молекулы на любом шаге проведения анализа или создания носителя, с помощью широко используемой методики магнитной сепарации. За счет этого, например, если молекула, взаимодействующая с блокируемым объектом несет на себе метку (радиоактивную, ферментную, флуоресцентную или иную), то после магнитной сепарации несвязавшихся упомянутых молекул - полученный сигнал будет (с точностью до неспецифического связывания) обратнопропорционален степени заблокированное™ блокируемых объектов и пропорционален количеству определяемого лиганда в образце. Кроме магнитной сепарации, агент (или носитель) может быть легко сепарирован за счет своей высокой массы/плотности (центрифугированием или осаждением под силой тяжести, например, в случае золотой наночастицы или частицы из оксида кремния), электрофоретически за счет своего заряда, или иным способом.

Порядок смешения агента (или носителя или приведения в контакт с поверхностью твердой фазы), образца и блокирующих частиц может сильно варьироваться в зависимости от требований анализа. Так, помимо одновременного смешивания (приведения в контакт) всех компонент, могут быть реализованы, например, следующие варианты. Например, в случае если агент (или носитель) несет на себе рецептор к определяемому лиганду, то сначала могут быть смешаны агент (или носитель) (или приведена в контакт поверхность твердой фазы) и образец - при этом произойдет ассоциация лиганда и рецепторов к нему на агенте (или носителе), затем к смеси могут быть добавлены блокирующие частицы, а затем может быть определен детектируемый сигнал от блокируемого объекта. Кроме того, можно сделать и по-другому: сначала смешать агент (или носителе или привести в контакт поверхность твердой фазы) и жидкую фазу, содержащую блокирующие частицы, причем это может быть сделано как непосредственно при проведении анализа, так и существенно заранее, а затем уже может быть добавлен образец, при этом за счет вытеснения свободным определяемым лигандом в образце блокирующих частиц из связи с рецептором к определяемому лиганду на агенте (или носителе) будет достигнуто разблокирование блокируемых объектов и необходимый сигнал может быть произведен и продетектирован.

Кроме того, если, например, агент (или носитель) несет на себе лиганд, а блокирующие частицы - рецептор к определяемому лиганду, то может быть реализован и такой случай. Блокирующие частицы смешивают или приводят в контакт сначала с лигандом, а уже потом добавляют смесь к агенту (или носителю). Варианты одновременного смешения (приведения в контакт) всех компонент, а также вариант со смешиванием (или приведением в контакт) сначала агента (или носителя) и блокирующих частиц, а затем добавления образца, тоже возможны.

Кроме того, перед добавлением каждого следующего компонента смеси, смесь можно инкубировать в различных условиях (температура, время, перемешивание и т.п.). Кроме того, можно добавлять определенные компоненты смеси одновременно.

Необходимо заметить, что приведенные варианты даны лишь для иллюстрации многообразия возможных вариантов процесса смешения, а не для ограничения.

В рамках данного изобретения можно также реализовать мультиплексную детекцию разных лигандов в образце, когда каждый лиганд детектируется независимо от остальных и сигнал, получаемый для каждого лиганда коррелирует с его содержанием в образце независимо от содержания там иных лигандов (при условии их не взаимодействия друг с другом и при условии использования высокоспецифических рецепторов в отношении каждого лиганда).

Проведение такого мультиплексного или мультипараметрического анализа может быть осуществлено, напрмер, таким способом. Для анализа используется набор агентов (или носителей), причем для каждого определяемого лиганда используется свой агент (или носитель) с рецептором, специфически распознающим данный лиганд, и блокируемый объект, который несет только данный агент (или носитель). Кроме того, используется набор (который может состоять и из 1 типа) блокирующих частиц, таких, что для любого определяемого лиганда в этом наборе существует блокирующая частица, несущая на себе либо этот лиганд, либо его аналог.При этом сигнал от разных блокируемых объектов каким-либо образом различается. Как иллюстративные варианты, могут быть предложены: пространственное разделение агентов (или носителей) на твердой фазе, несущей разные блокируемые объекты (например, на поверхности планшета, или на тест-полоске, или на ДНК-чипе), спектральное различение продуктов реакций, связанных с разными блокируемыми объектами или, например, спектральное различие в метках, связывающихся с различными блокируемыми объектами и т.п.При этом в качестве блокируемых объектов, например, удобно использовать олигонуклеотиды с разными для разных агентов (или носителей) последовательностями (так называемое штрих-кодирование агентов), или разные углеводы. При этом можно либо легко разделить различные агенты (или носители) на ДНК-чипе или чипе с иммобилизованными лектинами, либо использовать флуоресцентно меченные комплементарные молекулы. Кроме того, например, для лучшей детекции агентов (или носителей), связавшихся, с ДНК-чипом, можно использовать иммобилизованные на них дополнительные метки, например, флуоресцентные (в частности можно использовать флуоресцентные частицы в качестве основы агентов или носителей) или ферментные для амплификации детектируемого сигнала.

Детектируемый сигнал может быть любым сигналом, на создание, изменение или уничтожение которого может каким-либо образом повлиять упомянутый блокируемый объект, причем прямо или косвенно. В описании блокируемого объекта были приведены примеры, иллюстрирующие различные варианты блокируемого объекта и соответствующие им варианты детектируемых сигналов.

Помимо прочих вариантов произведения детектируемого сигнала можно привести, например следующий пример. Детектируемый сигнал от незаблокированного блокируемого объекта может быть произведен в результате взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с его лигандом, иммобилизованным на твердой фазе, например, на иммунохроматографической полоске или планшете иммуноферментного анализа, причем после упомянутого смешения в контакт агента (или носителя), образца и других реагентов, полученная смесь пропускается по тест-полоске (как в стандартном иммунохроматографическом анализе) или инкубируется в планшете. Далее сигнал, пропорциональный количеству задержавшихся на твердой фазе агентов (или носителей), т.е. взаимодействовавших с иммобилизованным лигандом, считывается любым известным способом - либо по оптическому сигналу (например, агента или носителя), либо по магнитному сигналу или же биохимически проявляется за счет рецепторов агента (или носителя).

В одном из воплощений изобретения выбирают носитель, представляющий собой нано- или микрочастицу или поверхность твердой фазы и несущий на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, а также используется блокирующая частица, способная связываться прямо или косвенно с рецептором к определяемому лиганду на носителе. При этом, например, блокирующая частица может связываться с рецептором к определяемому лиганду из-за того, что она состоит из молекул лиганда или его аналога или несет на себе лиганд или его аналог. При этом расположение рецептора к определяемому лиганду на носителе выгодно с той точки зрения, что при этом для недопущения блокировки блокируемых объектов блокирующими частицами надо заингибировать определяемым лигандом в образце сравнительно небольшое количество рецепторов к определяемому лиганду на носителе, в отличие от случая, когда на носителе находятся молекулы определяемого лиганда, а рецепторы к определяемому лиганду расположены на блокирующих частицах, т.к. в последнем случае самих блокирующих частиц и рецепторов к определяемому лиганду на них должно быть существенно больше, чем лиганда на носителе, поэтому чтобы заингибировать все рецепторы к определяемому лиганду надо еще больше определяемого лиганда в образце, следовательно, в первом случае чувствительность системы должна быть выше, чем во втором.

Кроме того, блокирующая частица может связываться с рецептором к определяемому лиганду различными косвенными путями - она может взаимодействовать с цепочкой молекул или частиц, одна из которых несет на себе или состоит из лиганда, или же блокирующая частица может нести на себе или состоять из рецептора к определяемому лиганду, тогда определяемый лиганд связывается с рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе, а затем со связанным лигандом связывается упомянутая блокирующая частица, несущая на себе рецептор, распознающий определяемый лиганд. Кроме того, в цепочке связей между носителем и блокирующей частицей могут участвовать различные другие молекулы, например, биотин-стрептавидин и т.п.

Кроме того, в одном из воплощений метода, используется носитель, несущий на себе рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект. Преимущества такого подхода заключаются, во-первых, в том, что носитель несет большое количество рецепторов к определяемому лиганду, а также блокируемых объектов, производящих сигнал.

Во-вторых, использование носителя, а не прямое соединение рецептора к определяемому лиганду с блокируемым объектом (меткой) позволяет пространственно разнести рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект и, хотя это существенно усложняет блокировку, тем не менее, может помочь иммобилизовать большее количество блокируемого объекта в активном состоянии. А именно, за счет того, что упомянутые рецепторы связаны не напрямую, упомянутые рецепторы не блокируют и не нарушают активности друг друга. Т.е., например, при конъюгации большого количества флуорофоров с антителом (т.е. если блокируемый объект или метка, флуорофор, напрямую конъюгирован с рецептором к определяемому лиганду, антителу) может происходить инсолюбилизация антитела за счет того, что большинство используемых флуорофоров плохо растворимы в воде. Кроме того, флуорофор обычно присоединяется химически, а потому хаотично, за счет чего часть флуорофора может присоединиться к распознающему участку антитела, что не позволит ему распознать лиганд, и кроме того, при большом количестве флуорофора на антителе возникает перекрестное тушение флуорофора.

В-третьих, упомянутое пространственное разнесение рецептора к определяемому лиганду и блокируемого объекта, а также использование блокирующих частиц (а не самих лигандов) для пространственной блокировки блокируемых объектов, позволяет использовать в качестве рецептора к определяемому лиганду и блокируемого объекта молекулы или вещества практически любого размера - вплоть до нескольких микрометров и более. Кроме того, за счет использования больших носителей, существенно превышающих размер упомянутых рецепторов, появляется возможность принципиально иной (по сравнению со случаем, если рецептор к определяемому лиганду напрямую связан с блокируемым объектом) пространственной или пространственно-блокировки блокируемых объектов, а именно слоистого типа, в том числе многослойного с использованием нескольких типов блокирующих частиц). При этом можно сделать практически независимой эффективность блокировки блокируемых объектов от их концентрации на носителе, т.е. эффективность будет блокировки зависеть лишь от количества рецепторов к определяемому лиганду на носителе. Так, в случае наличия минимально достаточного количества рецепторов к определяемому лиганду для образования «полного блокирующего слоя» все блокируемые объекты на носителе будут заблокированы. В случае же прямого соединения (например, конъюгации) рецептора к определяемому лиганду и блокируемого объекта эффективность блокировки существенно зависит от количественного соотношения этих рецепторов. Причем при большем количестве рецептора к определяемому лиганду - эффективность блокировки выше, но при это сигнал от блокируемого объекта ниже, что накладывает существенные ограничения на применимость метода.

В-четвертых, носитель позволяет использовать себя как твердую фазу, т.е. обеспечивает легкую сепарацию (например, если носитель - магнитная нано- или микрочастица) и другие преимущества использования нано- и микрочастиц в качестве твердой фазы иммуноанализа.

Кроме того, в одном из воплощений при использовании носителя, несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, пространственная или пространственно-электростатическая блокировка упомянутого блокируемого объекта, приводящая к изменению упомянутого детектируемого сигнала может происходить и без блокирующей частицы за счет самого лиганда, т.е. если сам лиганд, связавшись с рецептором к определяемому лиганду на носителе, может заблокировать блокируемый объект, то можно не добавлять блокирующие частицы. В этом случае, также возможно вышеупомянутая «слоистая» блокировка со всеми вышеперечисленными преимуществами.

В другом воплощении метода используется агент, имеющий, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, причем метод отличается тем, что упомянутый детектируемый сигнал должен производится в большей степени в случае не связывания блокирующей частицы и агента и производится в меньшей степени в случае связывания блокирующей частицы и агента. Так, например, в случае использования блокирующих частиц, несущих на себе или состоящих из молекул лиганда, анализ будет осуществляться в конкурентном режиме, т.е. лиганд в образце будет конкурировать за связывание с рецептором к определяемому лиганду агента. При этом при возрастании концентрации лиганда связывания блокирующей частицы и агента будет все меньше. Исходя из известных общих соображений, предел детекции метода будет существенно лучше, если детектируемый сигнал будет возрастать с возрастанием концентрации лиганда в образце, а не наоборот. Такой вариант реализуется в данном случае. При этом данный сигнал может быть произведен блокируемым объектом в случае, например, связывания какой либо метки, например, флуоресцентной или ферментной. При этом иммуноанализ может быть осуществлен как в гомогенном варианте, например, за счет ферстеровского переноса энергии между упомянутой меткой и флуорофором блокируемого объекта, либо в гетерогенном формате, в котором связавшаяся метка, например ферментная, детектируется после отмытия несвязавшихся с агентом меток. Кроме того, это может быть вариант с иммобилизованной, например, на иммунохроматографической тест-полоске или на пластиковом планшете, молекулой взаимодействующей с блокируемым объектом агента. При этом агент может быть окрашенной или нести на себе какие-либо другие проявляющие ее метки для проявления и детекции агента.

Кроме того, в одном из воплощений при использовании агента, состоящего, по крайней мере, из рецептора к определяемому лиганду и блокируемого объекта, участвующего прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, пространственная или пространственно-электростатическая блокировка упомянутого блокируемого объекта, приводящая к изменению упомянутого детектируемого сигнала может происходить и без блокирующей частицы за счет самого лиганда, т.е. если сам лиганд, связавшись с рецептором к определяемому лиганду агента, может заблокировать блокируемый объект, то можно не добавлять блокирующие частицы.

В другом воплощении метода, когда детектируемый лиганд полиэпитопен, используется агент, состоящий из рецептора к определяемому полиэпитопному лиганду и блокируемого объекта, участвующего прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, причем упомянутая блокирующая частица состоит из, по крайней мере, двух молекул полиэпитопного лиганда, или несет на себе молекулы полиэпитопного лиганда или способна связываться с рецептором к определяемому полиэпитопному лиганду в составе агента посредством определяемого лиганда. Причем, в данном случае упомянутый детектируемый сигнал может быть произведен как в меньшей, так и в большей степени в случае не связывания блокирующей частиц и агента и произведен в большей (или соответственно в меньшей) степени в случае связывания блокирующей частиц и агента. За счет использования блокирующей частицы, а не лишь определяемого полиэпитопного лиганда, появляется возможность пространственно или электростатически блокировать блокируемый объект, находящийся даже на большом расстоянии, в том числе превышающем размеры определяемого полиэпитопного лиганда и рецепторов к нему. За счет этого расширяется возможность детекции даже небольших полиэпитопных лигандов - так например, даже малые белки в 10 кДа могут обладать множеством эпитопов, при этом быть небольших размеров (2-5 нм). При этом блокирующая частица может быть в диаметре от нескольких нанометров до размеров более микрона. Кроме того, блокирующая частица, выполняющая блокирующую функцию, может соединяться с агентом посредством определяемого лиганда, при этом лиганд несет функцию связующего вещества между блокирующей частицей и агентом - в этом случае лиганд может не осуществлять никакой пространственной блокировки. Надо заметить, что в этом случае упомянутый детектируемый сигнал может производиться в большей степени в случае не связывания блокирующей частиц и агента и производиться в меньшей степени в случае связывания блокирующей частиц и агента или же наоборот - упомянутый детектируемый сигнал может производиться в меньшей степени в случае не связывания блокирующей частиц и агента и производиться в большей степени в случае связывания блокирующей частиц и агента.

В другом воплощении метода, выбирают агент, имеющий, по крайней мере, молекулу, идентичную или аналогичную упомянутому лиганду и блокируемый объект, участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, и кроме того выбирают, по крайней мере, одну блокирующую частицу, способную связываться прямо или косвенно с упомянутой молекулой агента, причем такую, что при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала. После смешения агента, образца и блокирующей частицы определяют содержание упомянутого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу, причем, упомянутая молекула и упомянутый блокируемый объект упомянутого агента косвенно связаны друг с другом, в том числе посредством связей в упомянутом агенте, преимущественно, по крайней мере, одним из взаимодействий: ковалентным, электростатическим, посредством водородных связей и пр., не включающем в себя липофильное взаимодействие. Кроме того, упомянутый носитель могут выбирать состоящим из веществ (молекул, кристаллов и т.п.), связанных друг с другом преимущественно, по крайней мере, одним из взаимодействий: ковалентным, электростатическим, посредством водородных связей и пр., не включающем в себя липофильное взаимодействие. В данном воплощении изобретения блокируемый объект и молекулы лиганда ассоциированы с общим агентом, и преимущества связанные с пространственным разделением блокируемого объекта и молекул лиганда подобны описанным выше преимуществам в воплощении метода, когда пространственно разделяют блокируемый объект и рецептор к определяемому лиганду. Преимущество же сильной связи между упомянутой молекулой и упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента, в том числе посредством связей в упомянутом агенте, определяемой преимущественно, по крайней мере, одним из взаимодействий: ковалентным, электростатическим, посредством водородных связей и пр., не включающем в себя липофильное взаимодействие, состоит в следующем.

Во-первых, упомянутая молекула и упомянутый объект упомянутого агента за счет преимущественной связи друг с другом посредством не липофильных взаимодействий существенно менее вероятно могут выходить из состава агента в окружающую среду в отличие от случая, когда взаимодействие между компонентами преимущественно определяется липофильными взаимодействиями, существенно более слабыми, чем электростатические, ковалентные или опосредуемые водородными связями. При этом также важно, что агенты могут содержать в себе и большие полимерные молекулы, с которыми конъюгированы упомянутая молекула и блокируемый объект, в отличие от метода (патент США 4,193,983, выдан 18 марта 1980 г.), в котором агенты состоят из липофильных компонент и представляют собой коллоидные частицы, которые относятся к классу ассоциированных коллоидов, являющиеся термодинамически стабильными системами, в которых диспергированная фаза состоит из агрегатов молекул или ионов сравнительно малых размеров. Так, например, агентом могут быть полистирольные частицы, созданные с помощью полимеров, т.е. больших молекул.

Во-вторых, за счет сильной связи упомянутой молекулы и упомянутого блокируемого объекта можно добиться улучшения такого важного параметра анализа как чувствительность. Так, хотя за счет сильной связи значительно сложнее равномерно распределить упомянутую молекулу и блокируемый объект по поверхности агента, тем не менее, чем более прочная связь между упомянутой молекулой и блокируемым объектом в составе агента, тем меньше вероятность выхода единичных молекул или блокируемых объектов из состава агента (как, например, происходит в случае, если агент представляет собой липосому), и, кроме того, тем стабильнее параметры упомянутой пространственной или пространственно-электростатической блокировки. Т. е. например, если связь между упомянутой молекулой и блокируемым объектом опосредуется только лишь липофильным взаимодействием (как в методе патента США 4,193,983, выдан 18 марта 1980 г.), то понятно, что термодинамически блокируемый объект и упомянутая молекула могут быть распределены по поверхности агента равномерно, однако с кинетической точки зрения при связывании анти-лиганда или блокирующей частицы с упомянутой молекулой агента, ничто не мешает блокируемому объекту отдалиться от упомянутой молекулы и выйти из стерической блокировки. Наличие более сильной связи между упомянутой молекулой и блокирующим агентом не позволит блокирующему объекту мигрировать по поверхности всего агента и выходить из пространственной блокировки. За счет этого, будет отсутствовать паразитный сигнал от свободных блокируемых объектов или тех блокируемых объектов, которые мигрировали по поверхности агента и вышли из под пространственной блокировки.

В другом воплощении изобретения, используют агент, состоящий из липофильных и/или амфифильных компонент, часть которых несет на себе, молекулу, идентичную или аналогичную упомянутому лиганду, и еще одна часть несет на себе - блокируемый объект, участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала. При этом для эффективной пространственной или электростатической блокировки используют, по крайней мере, одну блокирующую частицу, представляющую собой нано- или микро-частицу, молекулярной или надмолекулярной природы, способную связываться прямо или косвенно с упомянутыми молекулами лиганда на упомянутом носителе, причем такую, что при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутыми молекулами лиганда на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала. Причем, блокирующая частица может связываться с молекулами лиганда на носителе как было упомянуто выше, различными способами, например, посредством рецептора к определяемому лиганду (анти-лиганда) или через различные молекулы-посредники и т.д. При этом, как отмечалось выше, использование блокирующей частицы, несущей на себе анти-лиганд в качестве блокиратора, а не непосредственно анти-лиганда, существенно облегчает пространственную или электростатическую блокировку за счет дополнительного размера блокирующей частицы, которая может быть выбрана сколь угодно большой.

В другом воплощении метода, выбирают агент, несущий на себе или состоящий из одновременно связующего рецептора и блокируемого объекта, участвующего прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала. Кроме того, выбирают, по крайней мере, один связующий объект и, по крайней мере, одну блокирующую частицу, такие что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым агентом посредством связующего объекта через связующий рецептор агента, причем связывание агента и блокирующей частицы зависит от присутствия лиганда, причем таковых, что при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутыми связующими рецепторами к определяемому лиганду на упомянутой частице пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала.

Этот вариант изобретения может быть удобен за счет создания универсального агента, в котором два рецептора - связующий и блокируемый выбирают, например, из широко известных и удобных специфически взаимодействующих пар рецептор-лиганд (стрептавидин-биотин, протеин a - антитело, никель-нитрилотриуксусная кислота - гистидиновая метка, (анти-флуоресцеин)овое антитело - флуоресцеиновая метка и т.п.). При этом, например, агент может нести на себе стрептавидин (связующий рецептор) и (анти-флуоресцеин)овое антитело (блокируемый объект), связующий объект может быть биотинилированным рецептором к определяемому лиганду, а блокирующая частица нести на себе молекулы определяемого лиганда. При этом сигнал определяется, например, за счет пропускания смеси упомянутого агента, упомянутого связующего объект, образца, предположительно содержащего определяемый лиганд, упомянутой блокирующей частицы и других вспомогательных реагентов по иммунохроматографической полоске с иммобилизованным на ней флуоресцеин-меченным белком (например, бычьим сывороточным альбумином). Для детекции другого лиганда надо заменить лишь биотинилированный рецептор и блокирующую частицу. Кроме того, блокирующую частицу можно также сделать универсальной, если выбрать такую частицу, которая несет еще один универсальный рецептор - например (анти-динитрофенол)овое антитело, а в упомянутую смесь добавляют второй связующий объект, являющийся рецептором к лиганду (желательно, к другому эпитопу, чем первый связующий объект). При этом смешение, как указывалось выше, может происходить в любом порядке, так например, сначала могут быть смешаны образец и связующие объекты, а уже затем добавлены агент и блокирующая частица. При этом наличие несвязанного второго связующего объекта может не ухудшать чувствительности анализа - т.к. количество рецепторов на блокирующей частице может существенно превышать количество второго связующего объекта.

Зависимость связывания блокирующей частицы с агентом может быть реализована, например, за счет того, что в цепочке связей между упомянутым агентом и блокирующей частицей присутствует связь «рецептор к определяемому лиганду - определяемый лиганд».

В другом воплощении метода, выбирают поверхность твердой фазы, несущую на себе одновременно по крайней мере, два различных рецептора: связующий рецептор, с которым прямо или косвенно может связаться определяемый лиганд или рецептор к определяемому лиганду, и блокируемый объект, участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала. Затем приводят в контакт упомянутую поверхность, образец, предположительно содержащий определяемый лиганд. После этого определяют содержание упомянутого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу, который зависит от количества определяемого лиганда в образце.

Упомянутой поверхностью могут быть различные по своему исполнению объекты, например, стандартными пластиковыми планшетами для проведения иммуноферментного анализа или пластиковыми пробирками или иммунохроматографическими тест-полосками и т.п.

Зависимость детектируемого сигнала от количества определяемого лиганда в образце может реализовываться разными способами. Так, например, в случае если упомянутый связующий рецептор -рецептор к определяемому лиганду, то при связывании определяемого лиганда в образце с упомянутым связующим рецептором на упомянутой поверхности может пространственно или пространственно-электростатически блокироваться упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала.

Кроме того, на стадии приведения в контакт в качестве упомянутых других необходимых реагентов можно добавить в том числе блокирующие частицы, способные связываться с упомянутой поверхностью через связующий рецептор на ней, причем таковых, что на связывание упомянутых блокирующих частиц с упомянутым связующим рецептором на упомянутой поверхности влияет присутствие определяемого лиганда, кроме того таких, что при связывании упомянутых блокирующих частиц с упомянутой поверхностью пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала.

Зависимость связывания блокирующей частицы с поверхностью от присутствия лиганда может быть реализована как было описано выше. Так, например, в случае если упомянутая блокирующая частица несет на себе определяемый лиганд или состоит из молекул определяемого лиганда, а упомянутый связующий рецептор - рецептор к определяемому лиганду или в случае упомянутая блокирующая частица несет на себе рецептор к определяемому лиганду или состоит из молекул рецептора к определяемому лиганду, а упомянутый связующий рецептор - определяемый лиганд, то присутствие лиганда будет конкурировать со связыванием с рецептором к определяемому лиганду, а, следовательно, влиять на связывание блокирующей частицы с поверхностью.

Кроме того, упомянутая блокирующая частица может нести на себе рецептор к определяемому лиганду или состоять из молекул рецептора к определяемому лиганду, а упомянутый связующий рецептор может быть рецептором к определяемому лиганду, при этом связывание упомянутой блокирующей частицы с упомянутым связующим рецептором на упомянутый поверхности происходит посредством определяемого лиганда, например, таким образом: определяемый лиганд связывается с рецептором к определяемому лиганду на упомянутой поверхности, а затем со связанным лигандом связывается упомянутая блокирующая частица, несущая на себе рецептор, распознающий определяемый лиганд.

Кроме того, помимо упомянутой блокирующей частицы при упомянутом приведении в контакт можно добавлять, по крайней мере, один связующий объект, такой что: блокирующая частица способна связываться с поверхностью посредством связующего объекта через связующий рецептор на поверхности, причем связывание поверхности и блокирующей частицы зависит от присутствия лиганда в образце.

Использование описанной пространственной или электростатической блокировки позволяет перевести стандартный конкурентный иммуноанализ для детекции низкомолекулярных соединений (например, иммуноферментный твердофазный анализ или иммунохроматографический анализ), в формат, в котором в отличие от существующих стандартных методов при возрастании концентрации детектируемого лиганда (аналита) детектируемый сигнал возрастает, что позволит улучшить чувствительность метода и улучшить предел детекции. При этом в одном из воплощений изобретения, проводят стандартный иммунохроматографический анализ, в котором вместо нано- или микро-частицы (золотой, латексной, магнитной и т.п.) используют агент или носитель (в том числе созданный на основе такой же нано- или микрочастицы), имеющий, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, причем блокируемый объект может быть пространственно или пространственно-электростатически заблокирован блокирующей частицей, связывающейся со связующим рецептором в зависимости от определяемого лиганда. При этом детекцию агентов на тест-линии тест-полоски проводят известными способами - оптически, в том числе по флуоресценции агентов, или по магнитному сигналу агентов, например, методом детекции нелинейных магнитных материалов на комбинаторных частотах.

Все вышеприведенные варианты проведения анализа могут быть скомбинированы друг с другом, а также дополнены различными известными способами для проведения анализа, наиболее подходящего для той или иной задачи.

Так, на фиг.1. показана реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор носителя, представляющего собой нано- или микрочастицу и несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор блокирующих частиц, несущих на себе аналоги определяемого лиганда, и при связывании которых с рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, упомянутого носителя, упомянутых блокирующих частиц, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой носителей.

Так, на фиг.2. показана реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор носителя, представляющего собой нано- или микрочастицу и несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор в качестве блокирующих частиц определяемого лиганда, при связывании которого с рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, и упомянутого носителя, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой носителей.

Так, на фиг.3. показана реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, состоящего из, по крайней мере, рецептора к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор блокирующих частиц, несущих на себе аналоги определяемого лиганда, и при связывании которых с рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, и упомянутых блокирующих частиц, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Так, на фиг.4. показана реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, состоящего из, по крайней мере, рецептора к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор в качестве блокирующих частиц определяемого лиганда, при связывании которого с рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Так, на фиг.5. показана реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством связующего объекта, причем связующий объект несет на себе эпитоп аналогичный определяемому лиганду и эпитоп, имеющий сродство к рецепторам на блокирующей частице, причем при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента. После смешивания образца, предположительно содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, упомянутого связующего объекта, упомянутой блокирующей частицы определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Так, на фиг.6. показана реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор, являющийся рецептором к определяемому лиганду, и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством связующего объекта, в качестве которого выбран сам определяемый лиганд, причем при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента. После смешивания образца, предположительно содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, упомянутой блокирующей частицы определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Так, на фиг.7. показана реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством связующего объекта, причем связующий объект несет на себе эпитоп аналогичный определяемому лиганду и эпитоп, имеющий сродство к связующему рецептору на агенте, причем при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента. После смешивания образца, предположительно содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, упомянутого связующего объекта, упомянутой блокирующей частицы определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Работа предлагаемого способа иллюстрируется чертежами фиг.1-3. Список фигур чертежей.

Фиг.1. Реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор носителя, представляющего собой нано- или микрочастицу и несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор блокирующих частиц, несущих на себе аналоги определяемого лиганда, и при связывании которых с рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, упомянутого носителя, упомянутых блокирующих частиц, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой носителей.

Фиг.2. Реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор носителя, представляющего собой нано- или микрочастицу и несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор в качестве блокирующих частиц определяемого лиганда, при связывании которого с рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, и упомянутого носителя, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой носителей.

Фиг.3. Реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, состоящего из, по крайней мере, рецептора к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор блокирующих частиц, несущих на себе аналоги определяемого лиганда, и при связывании которых с рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, и упомянутых блокирующих частиц, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Фиг.4. Реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, состоящего из, по крайней мере, рецептора к определяемому лиганду и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор в качестве блокирующих частиц определяемого лиганда, при связывании которого с рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект. После смешения упомянутого образца, содержащего или не содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Фиг.5. Реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством связующего объекта, причем связующий объект несет на себе эпитоп аналогичный определяемому лиганду и эпитоп, имеющий сродство к рецепторам на блокирующей частице, причем при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента. После смешивания образца, предположительно содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, упомянутого связующего объекта, упомянутой блокирующей частицы определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Фиг.6. Реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор, являющийся рецептором к определяемому лиганду, и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством связующего объекта, в качестве которого выбран сам определяемый лиганд, причем при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента. После смешивания образца, предположительно содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, упомянутой блокирующей частицы определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

Фиг.7. Реализация способа определения содержания одного лиганда в образце, включающего: а) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, способный связываться с дополнительным рецептором на твердой фазе, б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством связующего объекта, причем связующий объект несет на себе эпитоп, аналогичный определяемому лиганду, и эпитоп, имеющий сродство к связующему рецептору на агенте, причем при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента. После смешивания образца, предположительно содержащего определяемый лиганд, упомянутого агента, упомянутого связующего объекта, упомянутой блокирующей частицы определяют содержание определяемого лиганда в упомянутом образце по количеству связавшихся с упомянутой твердой фазой агентов.

ПРИМЕРЫ

Нижеприведенные примеры даны в качестве иллюстрации данного изобретения и не ограничивают его применения.

Пример 1) Создание Носителя, несущего на себе, рецептор к маннозе - Конканавалин А, и Блокируемый Объект - Протеин А.

1) 20 мг EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид) и 3 мг S-NHS (N-гидроксисульфосукцинимид) растворяют в 70 мкл 0.1 М MES-буфера рН 5.

2) К 8 мкл 10% суспензии 200-нм магнитных карбоксилированных частиц (МЧ) (Estapor, Франция) добавляют раствор EDC и S-NHS.

3) Инкубируют 20 минут. С помощью магнита, МЧ от буфера, буфер удаляют.

4) К МЧ добавляют 120 мкл раствора Конканавалина A (концентрация 0.8 г/л) и Протеина A (концентрация 0.8 г/л) в Боратном буфере рН 7.2.

5) Инкубируют 2 часа, периодически обрабатывая пробирку с МЧ в ультразвуковой бане.

6) Блокируют МЧ, добавляя 12 мкл 10% раствора бычьего сывороточного альбумина в дистиллированной воде и 12 мкл 10% раствора этаноламина рН 8.

7) Инкубируют 2 часа.

8) Отмывают МЧ 7 раз 100 мМ Трис-HCl буфером рН 7на магнитном сепараторе. Ресуспендируют в 400 мкл 100 мМ Трис-HCl буфера рН 7, содержащего 1 ммоль/литр CaCl2,1 ммоль/литр MnCl2.

Пример 2) Создание Блокирующих Частиц 1, способных связываться с Рецептором к Маннозе.

1) К 150 мкл 5% раствора Пероксидазы хрена в 0.1М Карбонатном буфере рН 9.5 добавляют 150 мкл 6% раствора глютеральдегида в дистиллированной воде.

2) Инкубируют, периодически перемешивая, в течение 12 часов.

3) Добавляют 10 мкл 5М раствора NaBH4 в дистиллированной воде.

4) Инкубируют, в течение 12 часов.

5) 100 мкл полученной смеси наносят на хроматографическую колонку с носителем Sephacryl 300 (GE Healthcare), объемом 10 мл, уравновешенную Трис-HCl буфером рН 7, 150 mM NaCl. Элюируют тем же буфером.

6) Собирают первые 3 фракции по 500 мкл начиная с мертвого объема.

Пример 3) Создание Блокирующих Частиц 2, способных связываться с Рецептором к Маннозе.

1) 0.86 g of FeCl2*4H2O и 2.36 g of FeCl3 6H2O растворяют в 40 мл прокипяченной воды. Температура воды при смешивании должна быть комнатной.

2) Добавляют 5 мл 30% NH4OH (концентрированный раствор аммиака, Химмед)

3) Нагревают до 80 градусов Цельсия, активно перемешивая. Инкубируют 2 часа.

4) Осаждают частицы магнитом. Декантируют.

6) Добавляют 15 мл 2М HNO3.

7) Инкубируют 15 минут.

8) Осаждают частицы магнитом. Декантируют. Добавляют 15 мл H2O, перемешивают.

9) Осаждают частицы магнитом. Декантируют. Добавляют 15 мл H2O, перемешивают.

10) Осаждают частицы магнитом. Декантируют. Добавляют 15 мл H2O, перемешивают.

12) Осаждают частицы магнитом. Частицы, оставшиеся в супернатанте собирают.

13) К 300 мг 70 кДа Декстрана добавляют 1 мл дистиллированной воды, перемешивают в течение часа, потом добавляют 10 мл собранных частиц. Перемешивают и инкубируют при 80 градусах Цельсия в течение 2 часов.

14) Пять раз отмывают частицы от несвязавшегося полимера с помощью центрифугирования.

15) Частицы ресуспендируют в дистиллированной воде в концентрации 10%.

Пример 4) Количественное определение содержания маннозы в образце.

1) На иммунохроматографическую тест-полоску наносят моноклональные IgG мыши, связывающиеся с Протеином A (Блокируемым Объектом Носителя). Ждут, пока полоска белка полностью высохнет - 20 минут.

2) К 1.5 мкл Носителя, синтезированного в примере 1, добавляют 5 мкл Рабочего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0.1% раствор Tween 20 в Tris-HCl буфере рН 7).

3) К полученной смеси добавляют 15 мкл исследуемого Образца, содержащего или не содержащего определяемую маннозу. Перемешивают.

4) Инкубируют в течение 20 минут.

5) К смеси добавляют 5 мкл Блокирующих Частиц 1, полученных во втором примере. Перемешивают.

6) Инкубируют в течение 20 минут.

7) В смесь помещают упомянутую тест-полоску. Ждут, пока пройдет миграция всего образца по полоске.

8) Сигнал на полоске детектируют, например, визуально.

Пример 5) Количественное определение содержания маннозы в образце со смещением предела детекции маннозы в область больших концентраций.

1) На иммунохроматографическую тест-полоску наносят моноклональные IgG мыши, связывающиеся с Протеином A (Блокируемым Объектом Носителя). Ждут, пока полоска белка полностью высохнет - 20 минут.

2) К 1.5 мкл Носителя, синтезированного в примере 1, добавляют 5 мкл Рабочего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0.1% раствор Tween 20 в Tris-HCl буфере рН 7).

3) К полученной смеси добавляют 3.5 мкл исследуемого Образца, содержащего или не содержащего определяемую маннозу. Перемешивают.

4) Инкубируют в течение 20 минут.

5) К смеси добавляют 10 мкл Блокирующих Частиц 1, полученных во втором примере. Перемешивают.

6) Инкубируют в течение 20 минут.

7) К смеси добавляют 7.5 мкл Рабочего Буфера. Перемешивают

8) В смесь помещают упомянутую тест-полоску. Ждут, пока пройдет миграция всего образца по полоске.

9) Сигнал на полоске детектируют, например, визуально.

Пример 6) Количественное определение содержания маннозы в образце с предварительным смешением Частицы и Блокирующей частицы 1.

1) На иммунохроматографическую тест-полоску наносят моноклональные IgG мыши, связывающиеся с Протеином А (Блокируемым Объектом Носителя). Ждут, пока полоска белка полностью высохнет - 20 минут.

2) К 1.5 мкл Носителя, синтезированного в примере 1, добавляют 5 мкл Рабочего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0.1% раствор Tween 20 в Tris-HCl буфере рН 7).

3) К смеси добавляют 2.5 мкл Блокирующих Частиц 1, полученных во втором примере. Перемешивают.

4) Инкубируют в течение 20 минут.

3) К полученной смеси добавляют 15 мкл исследуемого Образца, содержащего или не содержащего определяемую маннозу. Перемешивают.

6) Инкубируют в течение 20 минут.

7) В смесь помещают упомянутую тест-полоску. Ждут, пока пройдет миграция всего образца по полоске.

8) Сигнал на полоске детектируют, например, визуально.

Пример 7) Количественное определение содержания маннозы в образце с предварительным смешением Частицы и Блокирующей частицы и со смещением предела детекции маннозы в область больших концентраций.

1) На иммунохроматографическую тест-полоску наносят моноклональные IgG мыши, связывающиеся с Протеином A (Блокируемым Объектом Носителя). Ждут, пока полоска белка полностью высохнет - 20 минут.

2) К 1.5 мкл Носителя, синтезированного в примере 1, добавляют 5 мкл Рабочего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0.1% раствор Tween 20 в Tris-HCl буфере рН 7).

3) К смеси добавляют 5 мкл Блокирующих Частиц 1, полученных во втором примере. Перемешивают.

4) Инкубируют в течение 20 минут.

3) К полученной смеси добавляют 15 мкл исследуемого Образца, содержащего или не содержащего определяемую маннозу. Перемешивают.

6) Инкубируют в течение 20 минут.

7) В смесь помещают упомянутую тест-полоску. Ждут, пока пройдет миграция всего образца по полоске.

8) Сигнал на полоске детектируют, например, визуально.

Пример 8) Определение содержания маннозы в образце с блокировкой Блокирующими частицами 2.

1) На иммунохроматографическую тест-полоску наносят моноклональные IgG мыши, связывающиеся с Протеином A (Блокируемым Объектом Носителя). Ждут, пока полоска белка полностью высохнет - 20 минут.

2) К 1.5 мкл Носителя, синтезированного в примере 1, добавляют 5 мкл Рабочего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0.1% раствор Tween 20 в Tris-HCl буфере рН 7).

3) К полученной смеси добавляют 15 мкл исследуемого Образца, содержащего или не содержащего определяемую маннозу. Перемешивают.

4) Инкубируют в течение 20 минут.

3) К смеси добавляют 5 мкл 1% суспензии в Рабочем буфере Блокирующих Частиц 2, полученных в третьем примере. Перемешивают.

6) Инкубируют в течение 20 минут.

7) В смесь помещают упомянутую тест-полоску. Ждут, пока пройдет миграция всего образца по полоске.

8) Наличие или отсутствие полоски на тест-линии тест-полоски определяют визуально.

Пример 9) Определение содержания маннозы в образце с предварительным смешением Частиц и Блокирующих частиц 2.

1) На иммунохроматографическую тест-полоску наносят моноклональные IgG мыши, связывающиеся с Протеином А (Блокируемым Объектом Носителя). Ждут, пока полоска белка полностью высохнет - 20 минут.

2) К 1.5 мкл Носителя, синтезированного в примере 1, добавляют 5 мкл Рабочего буфера (1% раствор бычьего сывороточного альбумина, 0.1% раствор Tween 20 в Tris-HCl буфере рН 7).

3) К смеси добавляют 5 мкл 1% суспензии в Рабочем буфере Блокирующих Частиц 2, полученных в третьем примере. Перемешивают.

4) Инкубируют в течение 20 минут.

3) К полученной смеси добавляют 15 мкл исследуемого Образца, содержащего или не содержащего определяемую маннозу. Перемешивают.

6) Инкубируют в течение 20 минут.

7) В смесь помещают упомянутую тест-полоску. Ждут, пока пройдет миграция всего образца по полоске.

8) Наличие или отсутствие полоски на тест-линии тест-полоски определяют визуально.

Пример 10) Определение содержания маннозы в образце с помощью ферментного маркера.

1) К 3 мкл Носителя, синтезированного в примере 1, добавляют 5 мкл образца, содержащего маннозу (определяемый лиганд), галактозу (неспецифический лиганд для рецептора к определяемому лиганду), или раствор Tris-HCl буфера.

2) К смеси добавляют 3 мкл Рабочего буфера (0.1% раствор Tween 20 в Tris-HCl буфере рН 7). Перемешивают.

3) Инкубируют в течение 20 минут.

4) К смеси добавляют 2 мкл Блокирующих Частиц 1, полученных во втором примере. Перемешивают.

5) Инкубируют в течение 20 минут.

6) К смеси добавляют 3 мкл поликлональных кроличьих антител в концентрации 2 мкг/мл в Рабочем буфере. Перемешивают.

7) Инкубируют в течение 20 минут.

8) С помощью магнитного сепаратора промывают два раза 15 мкл Рабочего буфера.

9) К МЧ добавляют 15 мкл раствора в Рабочем буфере конъюгата анти-кроличьих антител и щелочной фосфатазы, в концентрации согласно рекомендации производителя. Перемешивают, обрабатывают в ультразвуковой бане в течение 5 секунд.

10) Инкубируют в течение 20 минут.

11) С помощью магнитного сепаратора промывают трижды согласно рекомендации производителя конъюгата анти-кроличьих антител и щелочной фосфатазы.

12) Добавляют 20 мкл субстрата для щелочной фосфатазы согласно рекомендации производителя.

13) Инкубируют 30 минут.

14) Визуально определяют цвет полученной смеси: в случае выраженно фиолетового, манноза присутствовала.

1. Способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:
A) выбор, по крайней мере, одного носителя, представляющего собой нано- или микрочастицу или поверхность твердой фазы и несущего на себе, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,
Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с рецептором к определяемому лиганду на носителе, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду на упомянутом носителе пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,
B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:
i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,
ii) упомянутого носителя,
iii) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы выбран не определяемый лиганд,
Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

2. Способ по п.1, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания носителей друг с другом.

3. Способ по п.1, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от носителя или схожего с носителем аналога.

4. Способ по п.1, в котором упомянутое блокирование упомянутого блокируемого объекта приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

5. Способ по п.1, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого носителя или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.

6. Способ по п.1, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.

7. Способ по п.5, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого носителя, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым носителем упомянутых молекул или частиц.

8. Способ по п.1, в котором в качестве упомянутого блокируемого объекта выбирают фермент, а упомянутый детектируемый сигнал производится в результате работы данного фермента.

9. Способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:
А) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,
Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала,
B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:
i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,
ii) упомянутого агента,
iii) упомянутой блокирующей частицы,
Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

10. Способ по п.9, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания агентов друг с другом.

11. Способ по п.9, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от агента или схожего с агентом аналога.

12. Способ по п.9, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого агента или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.

13. Способ по п.9, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.

14. Способ по п.13, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.

15. Способ по п.9, в котором в качестве упомянутого блокируемого объекта выбирают фермент, а упомянутый детектируемый сигнал производится в результате работы данного фермента.

16. Способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:
A) выбор агента, имеющий, по крайней мере, молекулу, идентичную или аналогичную упомянутому лиганду, и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала, причем упомянутая молекула и упомянутый блокируемый объект упомянутого агента косвенно связаны друг с другом, в том числе посредством связей в упомянутом агенте, преимущественно, по крайней мере, одним из взаимодействий: ковалентным, электростатическим, посредством водородных связей и пр., не включающим в себя липофильное взаимодействие,
Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, способной связываться прямо или косвенно с упомянутой молекулой на упомянутом агенте, причем упомянутое связывание зависит от присутствия определяемого лиганда, и при связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой молекулой на упомянутом агенте пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,
B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:
i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,
ii) упомянутого агента,
iii) упомянутой блокирующей частицы,
Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

17. Способ по п.16, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания агентов друг с другом.

18. Способ по п.16, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от агента или схожего с агентом аналога.

19. Способ по п.16, в котором упомянутое блокирование упомянутого блокируемого объекта приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

20. Способ по п.16, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого агента или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.

21. Способ по п.16, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.

22. Способ по п.21, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.

23. Способ по п.16, в котором в качестве упомянутого блокируемого объекта выбирают фермент, а упомянутый детектируемый сигнал производится в результате работы данного фермента.

24. Способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:
A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,
Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента посредством, по крайней мере, одного связующего объекта, причем связывание упомянутого агента и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента,
что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,
B) смешивание:
i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,
ii) упомянутого агента,
iii) упомянутого связующего объекта, когда в качестве упомянутого связующего объекта не выбран определяемый лиганд,
iv) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,
Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

25. Способ по п.24, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания агентов друг с другом.

26. Способ по п.24, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от агента или схожего с агентом аналога.

27. Способ по п.24, в котором упомянутое блокирование упомянутого блокируемого объекта приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

28. Способ по п.24, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого агента или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок),
полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.

29. Способ по п.24, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектцруемый сигнал.

30. Способ по п.29, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.

31. Способ по п.24, в котором в качестве упомянутого блокируемого объекта выбирают фермент, а упомянутый детектируемый сигнал производится в результате работы данного фермента.

32. Способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:
A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, рецептор к определяемому лиганду и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,
B) смешение, по крайней мере, следующих компонент:
i) упомянутого образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,
ii) упомянутого агента,
Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу,
причем при связывании определяемого лиганда с упомянутым рецептором к определяемому лиганду упомянутого агента, пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект, что приводит к подавлению (уменьшению), по крайней мере, частичному, упомянутого детектируемого сигнала.

33. Способ по п.32, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта с сигнальным объектом, причем указанное взаимодействие отлично от связывания агентов друг с другом.

34. Способ по п.32, в котором упомянутый детектируемый сигнал производится упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента в зависимости от прямого или косвенного взаимодействия упомянутого блокируемого объекта либо с поверхностью твердой фазы, либо с сигнальным объектом, производящим детектируемый сигнал или изменяющим детектируемый сигнал, производимый блокируемым объектом, причем сигнальный объект выбирают отличным от агента или схожего с агентом аналога.

35. Способ по п.32, в котором в качестве основы упомянутого агента выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.

36. Способ по п.32, в котором процесс произведения упомянутого детектируемого сигнала включает в себя специфическое связывание с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, являющейся меткой (флуоресцентной, люминесцентной, ферментной, радиоактивной, магнитной, обладающей поверхностным плазменным резонансом и т.п.), способной производить детектируемый сигнал.

37. Способ по п.32, в котором после связывания упомянутой молекулы или частицы с упомянутым блокируемым объектом упомянутого агента, основную часть несвязавшихся упомянутых молекул или частиц удаляют (сепарируют), и упомянутый детектируемый сигнал производится преимущественно за счет связавшихся с упомянутым агентом упомянутых молекул или частиц.

38. Способ по п.32, в котором в качестве упомянутого блокируемого объекта выбирают фермент, а упомянутый детектируемый сигнал производится в результате работы данного фермента.

39. Способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:
A) выбор агента, имеющего, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,
Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутого агента, причем связывание упомянутого агента и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутым агентом пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутого агента, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,
B) смешивание:
i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,
ii) упомянутого агента,
iii) упомянутой блокирующей частицы, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,
Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу, зависящему от связывания с упомянутым блокируемым объектом прямо или косвенно, по крайней мере, одной молекулы или частицы, иммобилизованной на дополнительной твердой фазе (иммунохроматографической тест-полоске, пластиковом планшете, и т.п.) после упомянутого смешивания и пропускания полученной смеси по упомянутой дополнительной твердой фазе или инкубации в контакте с ней.

40. Способ по п.39, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого агента или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.

41. Способ определения содержания молекул, по крайней мере, одного типа лиганда в образце, включающий, по крайней мере:
A) выбор поверхности твердой фазы, несущей, по крайней мере, связующий рецептор и блокируемый объект, не способный специфически взаимодействовать с определяемым лигандом и участвующий прямо или косвенно в произведении детектируемого сигнала,
Б) выбор, по крайней мере, одной блокирующей частицы, такой что: блокирующая частица способна связываться с упомянутым связующим рецептором упомянутой поверхности твердой фазы, причем связывание упомянутой поверхности твердой фазы и упомянутой блокирующей частицы зависит от присутствия определяемого лиганда, причем при упомянутом связывании упомянутой блокирующей частицы с упомянутой поверхностью твердой фазы пространственно или пространственно-электростатически блокируется упомянутый блокируемый объект упомянутой поверхности твердой фазы, что приводит к изменению упомянутого детектируемого сигнала,
B) приведение в контакт, по крайней мере:
i) образца, предположительно содержащего определяемый лиганд,
ii) упомянутой поверхности твердой фазы,
iii) жидкой среды, содержащей, по крайней мере, упомянутую блокирующую частицу, когда в качестве упомянутой блокирующей частицы не выбран определяемым лиганд,
Г) определение содержания определяемого лиганда в упомянутом образце по произведенному упомянутому детектируемому сигналу.

42. Способ по п.41, в котором в качестве основы, по крайней мере, одного из упомянутого агента или упомянутой блокирующей частицы выбирают магнитную, флуоресцентную, белковую (в том числе представляющую собой кросс-сшитый белок), полимерную (из полистирола, декстрана, полипептида и т.п.) или кристаллическую (золотую, серебряную, полупроводниковую и т.п.) нано- или микрочастицу.