Моноклональные антитела, которые связываются с hgm-csf, и содержащие их композиции медицинского назначения

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены варианты выделенного моноклонального антитела, специфичного к hGM-CSF, где каждый вариант характеризуется тяжелой и легкой цепью. Каждый из вариантов характеризуется тем, что содержит по шесть соответствующих CDR. Описаны: фармацевтическая композиция, набор, представляющий собой лекарственное средство, основанные на использовании антитела. Раскрыты: кодирующая выделенная нуклеиновая кислота, экспрессионный вектор ее содержащий и клетка-хозяин, несущая вектор, используемые для получения антитела. Раскрыт способ получения антитела с использованием клетки. Предложенные изобретения могут найти применение для лечения заболевания или нарушения, связанного со сверхэкспрессией hGM-CSF. 7 н. и 18 з.п. ф-лы, 9 ил., 14 табл., 15 пр.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам, которые связываются с человеческим колониестимулирующим фактором гранулоцитов-макрофагов (обозначен также как «hGM-CSF») и нейтрализуют активность hGM-CSF, к композициям, которые содержат одно или несколько указанных моноклональных антител, и способам применения указанных моноклональных антител и композиций.

Предпосылки создания изобретения

Установлено, что колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) представляет собой гуморальный фактор, который ускоряет пролиферацию находящихся в костном мозге клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов и ускоряет формирование колоний гранулоцитов и макрофагов in vitro.

В настоящее время известно, что GM-CSF представляет собой стимулирующий фактор в широком разнообразии типов клеток. Он индуцирует дифференцировку и пролиферацию линий гранулоцитов-макрофагов клеток крови, усиливает функции антигенпрезентирующих клеток, поддерживает функции некоторых типов эпителиальных клеток и индуцирует функции альвеолярных макрофагов (например, повышает катаболизм сурфактанта, бактерицидную функцию и экспрессию Fc-рецептора) (The Cytokine Handbook, 4-ое изд., под ред. Thomson А. и др., изд-во Academic Press, 2003). Известно, что GM-CSF вызывает различные болезни, включая: 1) аллергические заболевания, такие как астма, атопия и полиноз, 2) отторжение трансплантата и реакцию «трансплантат-против-хозяина» (GVHD) и 3) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.

Например, для человеческого GM-CSF (hGM-CSF) характерна сверхэкспрессия в легких страдающих аллергией индивидуумов и в суставах страдающих ревматоидным артритом пациентов; сверхэкспрессия мРНК hGM-CSF обнаружена в коже страдающих аллергией индивидуумов. Описано также, что выживаемость моноцитов, представляющих собой индуцирующие воспаление клетки при атопическом дерматите, повышается в результате производства GM-CSF (Bratton D.L. и др., Granulocyte macrophage colonystimulating factor contributes to enhanced monocyte survival in chronic atopic dermatitis. J. Clin. Invest., 95, 1995, cc.211-218).

Кроме того, установлено, что GM-CSF стимулирует пролиферацию лейкозных клеток. Таким образом, считается, что GM-CSF является фактором, вызывающим лейкоз.

Существует необходимость в разработке путей лечения заболеваний и состояний, обусловленных человеческим GM-CSF. Одним из путей терапии указанных заболеваний и состояний является связывание hGM-CSF и ингибирование его биологической активности. Для этой цели можно применять, например, моноклональные антитела к hGM-CSF, которые обладают повышенной аффинностью и достаточной нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF, но не индуцируют иммунологическую реакцию.

Однако описанные к настоящему времени ингибирующие антитела к hGM-CSF не обладают достаточной нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. Кроме того, очень вероятно, что доступные в настоящее время моноклональные антитела к hGM-CSF могут индуцировать нежелательный иммунный ответ у реципиентов. Поликлональное антитело и моноклональное антитело, как правило, получают из экспериментальных животных, таких как мыши, кролики и козлы. Однако полученные таким путем антитела имеют последовательность, характерную для типа животных, используемых для их получения. Если их вводят людям, то иммунная система человека может распознавать антитела как чужеродные и это может приводить к человеческому гуморальному иммунному ответу на антитело животного происхождения (то есть такое антитело вызывает продуцирование собственных антител организма).

Кроме того, для лечения таких болезней необходимо длительное применение и в результате могут возникать проблемы, связанные с безопасностью, которые могут быть обусловлены небольшим количеством примесей вводимых лекарственных средств. Антитела с более высокой нейтрализующей активностью, чем доступные в настоящее время, могут быть более ценными в качестве терапевтических средств с позиций эффективности, безопасности и расходов на медицинское обслуживание.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится по меньшей мере частично к разработанным при создании изобретения конкретным моноклональным антителам к человеческому GM-CSF, которые отличаются их очень высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. При создании изобретения неожиданно было установлено, что нейтрализующая активность указанных антител выше, чем можно было бы ожидать на основе их аффинности к связыванию с hGM-CSF. Два из указанных моноклональных антител к hGM-CSF обозначены в настоящем описании как EV1018 и EV1019.

Одним из объектов изобретения являются антитела к hGM-CSF и их фрагменты, связывающие и нейтрализующие hGM-CSF.

Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 1. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит:

(а) тяжелую цепь, включающую консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, в которых:

(I) консенсусная V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и X₂ обозначает G или А,

(II) консенсусная V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, Х₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K, и

(III) консенсусная V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и

(б) легкую цепь, включающую консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность, в которых:

(I) консенсусная V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y,

(II) консенсусная V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и X₁₃ обозначает А или Р, и

(III) консенсусная V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO:319), в которой Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L;

и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с hGM-CSF.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело содержит:

(а) тяжелую цепь, включающую V_H-CDR1, V_H-CDR2 и V_H-CDR3, в которых:

(I) V_H-CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SYGMH (SEQ ID NO: 10) и SHAMH (SEQ ID NO: 333),

(II) V_H-CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) и VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334), и

(III) V_H-CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) и EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335); и

(б) легкую цепь, включающую V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, в которых:

(I) V_L-CDR1 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) и SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),

(II) V_L-CDR2 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и GKSPAS (SEQ ID NO: 331), и

(III) V_L-CDR3 имеет аминокислотную последовательность, выбранную из STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) и STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332), и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с hGM-CSF.

Например, связывание описанного выше антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с человеческим GM-CSF характеризуется значением K_D, составляющим менее 400 пМ, более предпочтительно значением K_D, составляющим менее 160 пМ.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC₅₀ для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее 100 пМ (например, менее 30 пМ, менее 20 пМ) при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при концентрации, соответствующей ED₈₀, согласно методу, представленному в настоящем описании.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать тяжелую цепь, представляющую собой цепь типа гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) или гамма 4 (γ₄). Тяжелую цепь можно выбирать из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 160-183 и 222-245.

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может содержать легкую цепь, представляющую собой легкую лямбда-цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая лямбда-цепь может содержать одну или обе из следующих аминокислотных замен: R100G и A153G, которые обозначены относительно последовательности дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения легкую цепь можно выбирать из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 34-37 и 202-221. Легкая цепь может представлять собой легкую лямбда-цепь или легкую каппа-цепь. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь типа гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) или гамма 4 (γ₄), а легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь. В любом из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь может содержать одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей: Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164 и L165A, относительно последовательности дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, которая несет одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей: Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A, а легкая цепь несет одну или обе следующие аминокислотные замены: R100G и A153G.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_H-CDR1, который имеет аминокислотную последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_H-CDR2, который имеет аминокислотную последовательность LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO:5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_H-CDR3, который имеет аминокислотную последовательность ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_L-CDR1, который имеет аминокислотную последовательность IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_L-CDR2, который имеет аминокислотную последовательность GRSPPS (SEQ ID NO: 8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331). Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать V_L-CDR3, который имеет аминокислотную последовательность STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, содержит 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, содержит 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 330-335.

В любом из вариантов осуществления изобретения антитело может включать тяжелую цепь, представляющую собой цепь типа гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) или гамма 4 (γ₄), и легкую цепь, представляющую собой каппа- или лямбда-цепь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, может включать дополнительно сигнальную последовательность, например, представленную в SEQ ID NO: 324, 325 и 326.

Под объем изобретения подпадают последовательности дикого типа, а также их варианты. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его фрагмент содержит тяжелую цепь, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 10, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 11-33, 38-80, и содержит также легкую цепь, последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 34, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 35-37. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь имеет последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 160, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 161-245, а легкая цепь имеет последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 202, или ее вариант, выбранный из SEQ ID NO: 203-221.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 152, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 153-158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 184, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 185-200 и 201.

В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152 и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 348, или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 349-362 и 363, и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 364 или SEQ ID NO: 365.

В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 348. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 364. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 365. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ).

В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF (hGM-CSF) и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, как представлено в настоящем описании, отличается тем, что содержит гипервариабельный участок (CDR), который имеет одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9 и SEQ ID NO: 330-335. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно в CDR заменять, изымать путем делеции, встраивать или добавлять одну или несколько аминокислот. Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, может отличаться тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию клеток линии TF-1 примерно на 50% при использовании в концентрации примерно 14 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF. В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию дендритных клеток периферической крови.

В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, обладает аффинностью к связыванию с hGM-CSF, для которой характерно значение K_D 4×10^-10 M или ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании, принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ). В некоторых вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой человеческое моноклональное антитело.

Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам и векторам, содержащих их. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. Одним из вариантов осуществления изобретения является вектор, содержащий ДНК, которая кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, представленное/представленный в настоящем описании.

Изобретение относится также к клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор, который содержит ДНК-вектор, предлагаемый в изобретении.

Изобретение относится также к набору, содержащему: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении; и (б) один или несколько контейнеров, содержащих антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Одним из вариантов осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении, предназначенный/предназначенное для применения в медицине.

В изобретении предложены композиции, содержащие антитело к hGM-CSF или его фрагмент, которое/который связывается и нейтрализует hGM-CSF. Указанная композиция может представлять собой фармацевтическую композицию (например, лекарственное средство), которая содержит антитело к hGM-CSF и/или его фрагмент (или их комбинацию) и фармацевтически приемлемый носитель. Под объем изобретения подпадает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, указанное/указанный выше в любом из вариантов осуществления изобретения.

Согласно другим вариантам осуществления изобретения композиция содержит более одного вида антител к GM-CSF, их фрагментов или комбинаций, которые все представлены в настоящем описании. Например, композиция может включать также второе выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, в результате композиция содержит более одного (несколько) вида/типа антител, их антигенсвязывающих фрагментов или их комбинаций, которые все связываются с GM-CSF. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно из нескольких антител, их антигенсвязывающих фрагментов или их комбинаций, связывающихся с hGM-CSF, представляет собой полипептид, выбранный из группы, включающей: SEQ ID NO: 10-80, 152-245, 320-323 и 348-365.

Изобретение относится также к композиции медицинского назначения, пригодной для применения с целью лечения заболевания, которое вызывается hGM-CSF, содержащей: моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в любом варианте осуществления изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель. Примерами болезней, вызываемых избыточным производством hGM-CSF, являются: а) аллергические заболевания, такие как астма, атония и полиноз (аллергический ринит; сенная лихорадка); б) отторжение трансплантата и реакция «трансплантат-против-хозяина» (GVHD), и в) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.

Указанные композиции или ветеринарная лекарственная композиция может содержать целый ряд видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических для одного конкретного антигена, и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция отличается тем, что входящие в ее состав несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков содержат два или большее количество типов антител или их антигенсвязывающих участков, можно выбирать из представленных ниже в подпунктах (а) и (б):

(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который содержит CDR, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,

(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), имеющее/имеющий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делении, встроена(ы) или присоединена(ы), и которое/который обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.

Такая композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция может ингибировать пролиферацию клеток линии TF-1 на 80% или более при применении каждой из них в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF.

Одним из объектов изобретения является также набор, содержащий любую из композиций, представленных в настоящем описании, и один или несколько контейнеров. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает также инструкцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор включает также этикетку, инструкцию или включает и этикетку, и инструкцию.

Изобретение относится также к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, или композиции, которая содержит указанное антитело или фрагмент. Любое представленное в настоящем описании антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент или композицию можно применять для производства или получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. В некоторых вариантах осуществления изобретения заболевание или нарушение выбирают из группы, включающей: хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз.

Для применения согласно указанным показаниям антитело или антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей максимальную переносимую дозу, где максимальная переносимая доза составляет примерно 500 мг на дозу.

Одним из объектов изобретения является применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции, представленных в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. Например, заболевание или нарушение может представлять собой хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз или рассеянный склероз. Указанное применение предусматривает введение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или содержащей его композиции, предлагаемых в изобретении, индивидууму, в дозе, не превышающей максимальную переносимую дозу, где максимальная переносимая доза составляет примерно 500 мг на дозу.

Изобретение относится также к способам лечения индивидуума, страдающего заболеванием или нарушением, которое ассоциировано с аномальной экспрессией hGM-CSF, с помощью антитела к hGM-CSF или его фрагмента. Способ заключается в том, что вводят индивидууму, у которого диагностировано или который имеет риск развития заболевания или нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией (например, сверхэкспрессией) hGM-CSF, композицию, которая содержит антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, нейтрализующее/нейтрализующий активность hGM-CSF in vivo, в количестве, достаточном для достижения по меньшей мере одного терапевтического действия на индивидуума.

Изобретение относится также к способу повышения опосредуемой антителом к hGM-CSF нейтрализующей активности в отношении hGM-CSF, отличающемуся тем, что вводят одновременно несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических в отношении одного и того же конкретного антигена. В некоторых вариантах осуществления изобретения два или большее количество антител или их антигенсвязывающих участков выбирают из указанных в подпунктах (а) и (б):

(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который содержит CDR, имеющий аминокислотную последовательность, которая представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,

(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), имеющее/имеющий аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или присоединена(ы), и которое/который обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.

Объектами изобретения являются способы повышения активности, отличающиеся тем, что два или несколько типов антител или их антигенсвязывающих участков ингибируют пролиферацию клеток линии TF-1 на 80% или более при использовании каждого из них в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферацию клеток линии TF-1 индуцируют с помощью hGM-CSF.

Изобретение относится также к эпитопу hGM-CSF, который распознается антителами и их антигенсвязывающими фрагментами, представленными в настоящем описании. Эпитоп hGM-CSF представляет собой полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 2 и 3, где эпитоп распознается антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, представленным в настоящем описании, и где полипептидные последовательности представляют собой прерывистый сегмент hGM-CSF (представленный в SEQ ID NO: 1). Эпитоп представляет собой прерывистый сегмент человеческого GM-CSF, в котором эпитоп содержит все или часть аминокислотных остатков 77-80 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и аминокислотные остатки 95-104 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1), и распознается моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, содержим 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9 или SEQ ID NO: 330-335.

Изобретение относится также к применению эпитопа, предлагаемого в изобретении. Изобретение относится также к способам скрининга и/или идентификации молекулы, специфически связывающейся с эпитопом, представленным в настоящем описании, который распознается антителами и антигенсвязывающими фрагментами, представленными в настоящем описании. Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются способы идентификации молекулы, которая связывается с эпитопом, представленным в настоящем описании, заключающиеся в том, что (I) осуществляют скрининг биологического образца или пептидной библиотеки с помощью зонда, который содержит эпитоп; (II) выделяют молекулу, которая специфически связывается с зондом; и (III) идентифицируют молекулу. Молекула, которая связывается с эпитопом, может представлять собой, например, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. Некоторыми вариантами осуществления изобретения является зонд, включающий также выявляемый маркер. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ заключается в том, что зонд является иммобилизованным.

Изобретение относится также к способам и процессам получения антител к hGM-CSF и их антигенсвязывающих фрагментов. Изобретение относится также к способам получения в клетке-хозяине моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, которое/который связывается с hGM-CSF, в которых антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает по меньшей мере консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность. Способ заключается в том, что осуществляют стадии, на которых:

(I) получают клетку-хозяина, которая содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую по меньшей мере консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность, где:

(а) консенсусная V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А,

(б) консенсусная V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K, и

(в) консенсусная V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G,

(г) консенсусная V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y,

(д) консенсусная V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и X₁₃ обозначает А или Р, и

(е) консенсусная V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L;

(II) экспрессируют ДНК в клетке-хозяине; и

(III) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК и производства антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одна ДНК кодирует тяжелую цепь или ее участок и легкую цепь или ее участок, где тяжелую цепь или ее участок выбирают из группы, включающей: SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 152-183, 222-245, 348-362 и 363, и легкую цепь или ее участок выбирают из группы, включающей: SEQ ID NO: 34-37, 184-221, 364 и 365.

Указанный выше процесс может включать также выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Указанный выше процесс может включать также получение композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

Изобретение относится также к векторам, содержащим ДНК, которая кодирует по меньшей мере участок антител или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании. Под объем изобретения подпадает также клетки-хозяева, экспрессирующие вектор.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор содержит ДНК, кодирующую V_H-CDR1, V_H-CDR2 и а V_H-CDR3, где:

V_H-CDR1 представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333),

V_H-CDR2 представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) и

V_H-CDR3 представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор содержит ДНК, кодирующую V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, где

V_L-CDR1 представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),

V_L-CDR2 представляет собой GRSPPSG (SEQ ID NO: 8) или GKSPASG (SEQ ID NO: 331) и

V_L-CDR3 представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная ДНК кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, при этом выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, такую как по меньшей мере одна последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9. В некоторых вариантах осуществления изобретения выделенная ДНК кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, при этом выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, такую как по меньшей мере одна последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335. Выделенная ДНК может обладать способностью гибридизоваться в строгих условиях с ДНК, описанной выше. Еще одним объектом изобретения являются векторы, включающие любую указанную ДНК, а также клетки-хозяева, которые экспрессируют рекомбинантный(ые) вектор(ы).

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - блок-схема выделения продуцирующих антитела клонов клеток;

на фиг.2 - схема анализа аффинности моноклональных антител к GM-CSF;

на фиг.3 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию дендритных клеток периферической крови в присутствии GM-CSF;

на фиг.4 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии дрожжевого hGM-CSF (лейкин);

на фиг.5 - результаты оценки ингибирующего действия моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech);

на фиг.6 - результаты оценки ингибирующего действия при совместном применении двух моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии дрожжевого hGM-CSF (лейкин);

на фиг.7 - результаты оценки ингибирующего действия при совместном применении двух моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию клеток линии TF-1 в присутствии hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech);

на фиг.8 - два графика, демонстрирующие ингибирование в зависимости от дозы в присутствии: человеческого GM-CSF (8А) и GM-CSF макака-резус (8Б);

на фиг.9А - столбиковая диаграмма, демонстрирующая активность миелопероксидазы (МРО), измеренную в дебрисе бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) из организма мышей, подвергнутых воздействию сигаретного дыма, -CS: мышей обрабатывали наполнителем (300 мкл наполнителя i.p. в день 1 и 3 без воздействия сигаретного дыма. +CS, изотип AT: мышей обрабатывали i.p. 300 мкл антитела соответствующего изотипа в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. +CS, антитело к GM-CSF: мышей обрабатывали i.p. 300 мкл антитела к GM-CSF в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. n=10 на группу, среднее значение ± СКО, *p<0,05, ***p<0,001;

на фиг.9Б - пара столбиковых диаграмм, демонстрирующих результаты оценки цитокинов в супернатантах БАЛЖ. Слева: результаты определения уровней МСР-1. Справа: результаты определения уровней MIP-1α. -CS: мышей обрабатывали наполнителем (300 мкл наполнителя i.p. в день 1 и 3) без воздействия сигаретного дыма. +CS, изотип AT: мышей обрабатывали 300 мкл антитела соответствующего изотипа i.p. в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. +CS, антитело к GM-CSF: мышей обрабатывали i.p. 300 мкл антитела к GM-CSF в день 1 и 3, подвергали воздействию сигаретного дыма. n=10 на группу, среднее значение ± СКО, *p<0,05, ***p<0,001.

Подробное описание изобретения

Как видно из настоящего описания, моноклональное антитело к hGM-CSF получали из антителопродуцирующих клеток, которые получали из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, получают из антителопродуцирующих клеток, которые получали из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой полностью человеческое моноклональное антитело. По этой причине для него характерен минимальный риск инициации иммуногенности, когда препарат антитела вводят в организм человека.

Задача, поставленная при создании изобретения, решается следующим образом. Настоящее изобретение относится к GM-CSF-связывающим моноклональным антителам и GM-CSF-связывающим их фрагментам, которые отличаются повышенной нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF, и композициям, включающим по меньшей мере один вид или тип указанных моноклональных антител или их фрагментов, а также способам лечения состояний или заболеваний, ассоциированных со сверхэкспрессией hGM-CSF (уровни hGM-CSF выше в организме индивидуума, страдающего состоянием, заболеванием или нарушением, чем у индивидуума, который не страдает указанным состоянием, заболеванием или нарушением).

Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, специфически связывается с hGM-CSF, аномальная экспрессия которого может вызывать различные заболевания, и снижает или элиминирует (нейтрализует) его биологическую активность. Моноклональное антитело к hGM-CSF обладает нейтрализующей активностью (в отношении hGM-CSF) более высокой по сравнению с активностью ранее описанных моноклональных антител к hGM-CSF. В частности, моноклональные антитела к hGM-CSF, предлагаемые в настоящем изобретении, представляют собой человеческие моноклональные антитела, не обладающие иммуногенностью и не индуцирующие иммунологическую реакцию.

Под понятием «специфически связывается» подразумевается высокая авидность и/или высокая аффинность связывания антитела со специфическим полипептидом, например, эпитопом белка, такого как человеческий белок GM-CSF. Связывание антитела с эпитопом в специфическом полипептиде предпочтительно является более сильным по сравнению со связыванием этого же антитела с любым другим эпитопом, прежде всего теми, которые могут присутствовать в молекулах в ассоциации с конкретным представляющим интерес полипептидом или в том же образце, что и конкретный представляющий интерес полипептид, например, связывание является более сильным с несущими эпитоп фрагментами белка, такого как GM-CSF, при этом в результате регулирования условий связывания антитело связывается практически исключительно с эпитопным сайтом или фрагментами требуемого белка, такого как несущий эпитоп фрагмент, подвергнутый обработке GM-CSF и не подвергнутый обработке родственными факторами этого же подсемейства. Выделенное антитело, предлагаемое в изобретении, предпочтительно обладает иммунореактивностью с конкретными видами и иммуноспецифичностью в отношении конкретных видов. Например, антитела, предлагаемые в изобретении, распознают человеческий GM-CSF, могут распознавать GM-CSF макака-резус и/или GM-CSF обезьян-игрунок (мармозетки), но, как правило, не связываются с его мышиной копией. Следует иметь в виду, что согласно этому объекту изобретения антитела и их антигенсвязывающие фрагменты распознают эпитоп антигена в его нативной конформации или в достаточно близкой к его нативной конформации, например, прерывистый сегмент антигена, находящийся в непосредственной близости в контексте всего антигена (например, hGM-CSF), что установлено при изучении структуры, образуя тем самым в совокупности эпитоп (например, «карман» на поверхности антигена), который распознается антителами, предлагаемыми в изобретении. Согласно этому объекту изобретения сами по себе антитела или их антигенсвязывающие фрагменты не дают перекрестную реакцию с белком, не представляющим собой GM-CSF, который содержит обе полипептидные последовательности, которые формируют описанный выше эпитоп. Должно быть очевидно, что в контексте связывания антитело-антиген «специфичность» связывания определяется природой взаимодействия. Таким образом, «антитело, которое связывается с GM-CSF» следует конструировать так, чтобы оно специфически связывалось с антигеном (т.е. GM-CSF).

В контексте настоящего описания понятие «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, в которой 4 полипептидных цепи, т.е. 2 тяжелых цепи и 2 легких цепи, соединены с помощью дисульфидного мостика. Моноклональные антитела можно создавать с помощью моноклональной или рекомбинантной технологии. В данной области известны указанные технологии. Понятия «антигенсвязывающий участок» и «антигенсвязывающий фрагмент» применяют взаимозаменяемо в контексте настоящего описания, и они означают любой укороченный вариант антитела, который предпочтительно характеризуется активностью связывания с конкретным антигеном (например, hGM-CSF). В частности, фрагмент, предлагаемый в изобретении, представляет собой фрагмент, который связывается с тем же самым эпитопом hGM-CSF, что и соответствующее моноклональное антитело. Фрагмент может представлять собой, например, Fab-фрагмент или любой другой фрагмент, обладающий указанными выше характеристиками. Кроме того, фрагменты антитела включают также одноцепочечное антитело (scFV), в которое включены вариабельная область антитела и гипервариабельный участок (CDR), биспецифическое антитело и мультиспецифическое антитело.

В контексте настоящего описания понятие «биоактивность» является синонимом понятия «биологическая активность». Так, «биоактивность hGM-CSF» представляет собой биологическую функцию hGM-CSF, которую определяют или измеряют in vivo или с помощью клеточного анализа, например, представленного в настоящем описании. Более конкретно, биоактивность hGM-CSF можно оценивать с помощью анализа клеточной пролиферации. Применяют соответствующие клеточные линии, для которых известно, что они реагируют на GM-CSF. Как правило, в качестве системы человеческих клеток при осуществлении анализа пролиферации применяют линию клеток человеческого эритролейкоза TF-1. TF-1 представляет собой линию клеток, для создания которой использовали клетки страдающего эритролейкозом пациента. Анализ основан на ингибировании стимулированной GM-CSF пролиферации клеток TF-1 и хорошо известен в данной области. Можно применять также другие линии клеток. Обычный специалист в данной области может адаптировать соответствующий анализ в зависимости от применяемых систем или условий.

Анализы пролиферации TF-1 осуществляют в присутствии взятых в различных концентрациях человеческого GM-CSF дикого типа или рекомбинантного (обозначен как rhGM-CSF). На основе этих данных можно получать кривые дозовой зависимости. Концентрацию GM-CSF, необходимую для получения биологического ответа в виде пролиферации TF-1-клеток, составляющего 80% от максимального, в контексте настоящего описания обозначают как ED₈₀ или ED80. Таким образом, ED80 обозначает «дозу, эффективность которой составляет 80%» от максимального ответа. Аналогично этому, концентрацию GM-CSF, необходимую для получения ответа, составляющего половину от максимального, в биологическом анализе обозначают как ED₅₀ или ED50. Как правило, значение ED50 для GM-CSF составляет 0,02-1 нг/мл при оценке с помощью анализа клеточной пролиферации с использованием зависящей от человеческого GM-CSF клеточной линии TF-1.

Указанная или любые другие аналогичные системы анализа можно применять для идентификации или определения активности ингибитора или антагониста hGM-CSF. Например, можно применять систему для анализа пролиферации для оценки нейтрализующей способности антитела в отношении hGM-CSF. Другие примеры анализов, предназначенных для оценки биологической функции GM-CSF, включают анализ секреции IL-8 и анализ индукции поверхностного CD11b/Mac1.

Понятия «нейтрализация», «нейтрализует», «нейтрализующий» и т.п. относятся к ингибированию биологической активности биоактивного фактора, такого как hGM-CSF. Таким образом, антитело к hGM-CSF, обладающее нейтрализующей способностью или нейтрализующей активностью, означает антитело, которое обладает способностью связываться и оказывать антагонистическое действие или противодействовать биологической активности hGM-CSF в биологической системе, например, пролиферативной активности hGM-CSF в биологической системе, такой как TF-1-клетки, существенно ингибируя или элиминируя тем самым биологическую активность hGM-CSF.

Такие понятия как «ингибирующее действие» «способность ингибировать» и «ингибирование» означает подавление на 5-100% биоактивности или видов биоактивности, обусловленных антигеном-мишенью, вне зависимости от его происхождения. Для терапевтических целей в идеальном случае ингибирование биоактивности hGM-CSF должно находиться на уровне 50-100%.

В целом, значение IC₅₀ является мерой эффективности соединения в отношении ингибирования биологической или биохимической функции. Количественная мера означает количество конкретного лекарственного средства или другого агента (ингибитора), необходимое для ингибирования наполовину конкретного биологического процесса (или компонента процесса, т.е. фермента, клетки, клеточного рецептора или микроорганизма). Другими словами оно означает концентрацию, при использовании которой ингибирование составляет половину от максимального (50%) (IC) для указанной субстанции (50% IC или IC₅₀). Эту величину обычно применяют в качестве меры антагонистической активности лекарственного средства в фармакологическом исследовании. Согласно руководству, принятому Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и лекарственных средств Соединенных Штатов, величина IC₅₀ обозначает концентрацию лекарственного средства, которая необходима для 50%-ного ингибирования in vitro.

Таким образом, значение IC₅₀ нейтрализующего антитела к hGM-CSF можно определять, строя кривую дозовой зависимости и оценивая воздействие различных концентраций нейтрализующего антитела на снижение пролиферативной активности hGM-CSF. Значения IC₅₀ можно рассчитывать для конкретного антагониста, определяя концентрацию, необходимую для ингибирования наполовину от максимального биологического ответа агониста.

Согласно различным вариантам осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются значением IC₅₀, составляющим менее 20, менее 25, менее 30, менее 40, менее 50, менее 60, менее 70, менее 80, менее 90 или менее 100 пМ, в каждом случае при определении на основе анализа пролиферации TF-1 при ED₈₀ (концентрация, соответствующая ED₈₀). В конкретных вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент характеризуются значением IC50, составляющим менее 20, менее 25, менее 30 или менее 40 пМ, при определении на основе анализа пролиферации TF-1 при ED₈₀.

Моноклональные антитела к hGM-CSF, представленные в настоящем описании, включают иммуноглобулиновые молекулы, содержащие 2 тяжелые цепи и 2 легкие цепи. Каждая из тяжелых цепей включает вариабельную область тяжелой цепи (можно применять сокращение «HCVR» или «V_H») и константную область тяжелой цепи (константная область тяжелой цепи содержит 3 домена, которые сокращенно обозначают как «СН1», «СН2» и «СН3»). Каждая из легких цепей включает вариабельную область легкой цепи (можно применять сокращение «LCVR» или «V_L») и константную область легкой цепи (константная область тяжелой цепи содержит 1 домен, который сокращенно обозначают как «C_L»). HCVR и LCVR наиболее важны для специфичности связывания антитела.

Аминокислотная последовательность вариабельной области ответственна в основном за взаимодействие между антителом и антигеном. Поэтому, когда конструируют экспрессионный вектор, который содержит последовательность вариабельной области, выведенную из встречающегося в естественных условиях антитела, в каркасной последовательности, выведенной из другого антитела с другим свойством, образовавшийся вектор может экспрессировать рекомбинантное антитело, которое имитирует свойство встречающегося в естественных условиях антитела. Таким образом, не является необходимым получать полную последовательность конкретного антитела, когда создают интактное рекомбинантное антитело, обладающее способностью к связыванию, аналогичной способности исходного антитела. Иногда для достижения этой цели может оказаться достаточным создавать частичную последовательность тяжелой цепи и легкой цепи, которая перекрывает вариабельную область.

Антитело взаимодействует с антигеном-мишенью главным образом через аминокислотные остатки LCVR и HCVR. Поэтому аминокислотные последовательности вариабельных областей характеризуются большим разнообразием среди антител, чем последовательности, расположенные вне вариабельной области. HCVR и LCVR подразделяют также на основе относительно стабильного «каркасного участка (FR)» и «гипервариабельного участка (CDR)». Каждая HCVR и LCVR состоит из 3 CDR и 4 FR соответственно. Они расположены в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4, в направлении от аминоконца к карбоксиконцу.

В данной области известны методы определения или предсказания аминокислотных остатков, которые соответствуют каждому из структурных доменов антитела, включая гипервариабельные участки, например, CDR. К таким общепринятым методам относятся в частности методы Chothia, AbM и Kabat.

Как правило, аффинность к связыванию антитела составляет по меньшей мере примерно 1×10^-7 М, а связывание с высокой аффинностью с определенным антигеном превышает по меньшей мере в 2 раза связывание с неспецифическими антигенами (например, БСА, казеин).

Понятие «высокая аффинность» касательно определенных антител типа IgG означает, что аффинность к связыванию антитела составляет по меньшей мере примерно 1×10^-7 M, предпочтительно по меньшей мере примерно 1×10^-8 M, более предпочтительно по меньшей мере примерно 1×10^-9 М и наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 1×10^-10 М.

Понятие «высокая аффинность» изменяется в зависимости от изотипов антител. Например, считается, что антитело изотипа IgM обладает высокой аффинностью», когда аффинность к связыванию составляет по меньшей мере least 1×10^-7 M.

Антитела, предлагаемые в изобретении

Согласно настоящему описанию изобретение относится к моноклональным антителам к человеческому GM-CSF (анти-hGM-CSF) и их фрагментам, которые обладают более высоким нейтрализующим действием в отношении hGM-CSF, чем известные моноклональные антитела (доступные в настоящее время моноклональные антитела) к hGM-CSF. Можно применять или использовать для введения моноклональные антитела к hGM-CSF или их фрагменты одного типа или вида.

В альтернативном варианте можно применять или вводить совместно более одного типа или вида моноклональных антител к hGM-CSF. При создании изобретения было установлено, что, когда используют совместно более одного вида или типа моноклональных антител к GM-CSF, то они проявляют более высокое нейтрализующее действие (например, более высокую ингибирующую рост клеток активность). Кроме того, один или несколько типов или видов моноклональных антител к hGM-CSF или их фрагментов можно применять или использовать для введения в сочетании с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, которые не представляют собой антитела, такими как малая молекула, агент для РНКi или пептид.

Одним из объектов изобретения являются выделенные моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые распознают и специфически связываются с hGM-CSF. Изобретение относится к выделенным моноклональным антителам к hGM-CSF и их антигенсвязывающих фрагментам, которые связываются с hGM-CSF (моноклональные антитела к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с hGM-CSF), и обладают нейтрализующим действием или нейтрализующей активностью в отношении биологической активности hGM-CSF. Одним из вариантов осуществления изобретения являются выделенные моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с hGM-CSF и обладают нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF-активности, где моноклональное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент распознают следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF (SEQ ID NO: 1). Выделенные моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с hGM-CSF, где моноклональное антитело и его антигенсвязывающий фрагмент распознают следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, обладают нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF и пригодны для лечения и предупреждения заболевания, состояний и нарушений, ассоциированных со сверхэкспрессией hGM-CSF. Конкретным вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает следующий прерывистый эпитоп hGM-CSF, представленный в (SEQ ID NO: 1), который соответствует аминокислотам: ELYK (SEQ ID NO: 2) в положении 77-80 в hGM-CSF и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в положении 95-104 в hGM-CSF. Представленные в настоящем описании выделенные моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты специфически связываются с hGM-CSF. Они не дают перекрестную реакцию с белком, представляющим собой белок, который отличен от GM-CSF.

Более конкретно в настоящем описании представлены моноклональные антитела, которые специфически связываются с hGM-CSF и обладают способность нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF. Четыре таких антитела, представленных в настоящем описании, обозначены как EV1018, EV1019, EV1003 и EV1007, данные о которых обобщены в таблицах 1 и 2 и в примерах. Так, EV1018, EV1019, EV1003 и EV1007 связываются с hGM-CSF и обладают способностью нейтрализовать усиливающие рост клеток действия hGM-CSF. Как будет описано более подробно ниже, антитела EV1018 и EV1019 распознают один и тот же или практически полностью перекрывающий эпитоп в белке hGM-CSF.

Кроме того, изобретение относится к моноклональному антителу к hGM-CSF или его антигенсвязывающему участку, которое/который отличается тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы) в гипервариабельный участок (CDR).

Следующим объектом изобретения является выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающаяся тем, что выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.

Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF (hGM-CSF) и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF (hGM-CSF), отличающиеся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит гипервариабельный участок (CDR), который имеет по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающиеся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит гипервариабельный участок (CDR), который имеет по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.

Согласно настоящему изобретению моноклональное антитело к hGM-CSF, которое содержит гипервариабельный участок (CDR), имеющий одну или несколько аминокислотную(ых) последовательность(ей), выбранную(ых) из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9, и моноклональное антитело к hGM-CSF которое содержит гипервариабельный участок (CDR), имеющий одну или несколько аминокислотную(ых) последовательность(ей), выбранную(ых) из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335, рассматриваются как различные виды моноклональных антител к hGM-CSF.

Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, в котором одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делении, встроена(ы) или добавлена(ы) в гипервариабельные участки (CDR), подпадает под объем настоящего изобретения, если оно/он специфически связывается с hGM-CSF и нейтрализует его биологическую активность.

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:

(а) CDR1 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7,

(б) CDR2 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и

(в) CDR3 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

Аналогично этому настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:

(г) CDR1 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 330,

(д) CDR2 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 331, и

(е) CDR3 легкой цепи (L-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 332.

Под объем изобретения подпадает также следующее моноклональное антитело к hGM-CSF или антигенсвязывающий участок, если оно/он связывается специфически с hGM-CSF и нейтрализует его биологическую активность: моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, в котором описанный выше гипервариабельный участок (CDR) легкой цепи модифицирован путем делеции, замены, инсерции или добавления одной или нескольких аминокислот.

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:

(а) CDR1 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4,

(б) CDR2 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и

(в) CDR3 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

Аналогично этому настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его антигенсвязывающему участку, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок содержит CDR, выбранный из группы, включающей:

(а) CDR1 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333,

(б) CDR2 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334, и

(в) CDR3 тяжелой цепи (Н-цепь), который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 335.

Под объем изобретения подпадает также следующее моноклональное антитело к hGM-CSF или антигенсвязывающий участок, если оно/он связывается специфически с hGM-CSF и нейтрализует его биологическую активность: моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, в котором описанный выше гипервариабельный участок (CDR) легкой цепи модифицирован путем делеции, замены, инсерции или добавления одной или нескольких аминокислот.

Эпитоп GM-CSF

Еще одним объектом изобретения является эпитоп hGM-CSF, представляющий собой прерывистый сегмент человеческого GM-CSF, где эпитоп содержит аминокислотные остатки 77-80 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и аминокислотные остатки 95-104 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1), и описывается полипептидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, и распознается моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим 6 различных CDR, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 4-9 или SEQ ID NO: 330-335.

Как более подробно описано в примерах, эпитоп hGM-CSF, распознаваемый моноклональными антителами EV1018 и EV1019, был идентифицирован с помощью метода эпитопного картирования. Установлено, что и EV1018, и EV1019 распознают один и тот же (или практически перекрывающий его) сайт антигена hGM-CSF, которому соответствуют аминокислотные остатки 77-80 и 95-104, находящие в GenBank под регистрационным номером: NP_000749. Изучение структуры позволило установить, что хотя два сегмента являются несмежными в первичной последовательности, два сегмента полипептида расположены близко друг к другу при укладке полипептида, формируя вместе конформационный эпитоп. В соответствии с данными о том, что оба антитела EV1018 и EV1019 распознают один и тот же или практически перекрывающий эпитоп, анализ последовательностей CDR EV1018 и EV1019 продемонстрировал, что они являются практически подобными. Сравнение пептидных последовательностей CDR этих двух антител, позволило получить следующие консенсусные последовательности (например, формулы), представляющие собой перекрывающиеся (например, общие) остатки, которые содержатся в каждом из CDR:

для V_H-CDR1: FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), где X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А;

для V_H-CDR2: X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), где X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K;

для V_H-CDR3: EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), где X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G;

для V_L-CDR1: X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), где X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y;

для V_L-CDR2: GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), где Х₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает А или Р; и

для V_L-CDR3: STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), где Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L.

В каждой из консенсусных формул аминокислотные остатки, содержащиеся в соответствующем CDR, представлены в общепринятом однобуквенном формате. Представлены идентичные остатки, содержащиеся как в EV1018, так и BEV1019.

Таким образом, следующим вариантом осуществления является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающийся фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF и обладает нейтрализующей способностью или активностью в отношении hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, (II) консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K; и (III) консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y; (II) консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает А или Р;, и (III) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой X₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L; и где антитело или его фрагмент распознает ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF. В конкретном варианте осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент связывается со следующим прерывистым эпитопом: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF (SEQ ID NO: 1).

Следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, где антитело или его фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, (II) консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, Х₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K; и (III) консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y; (II) консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает A или P; и (III) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой X₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L; и где связывание антитела или его фрагмента с hGM-CSF характеризуется значением K_D, которое не превышает 400 пМ, в другом варианте осуществления изобретения составляет менее 160 пМ, при этом значение K_D определяют согласно методикам, описанным в примере 11.

В другом варианте осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент отличается тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует пролиферацию дендритных клеток периферической крови. Таким образом, следующим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь или ее часть и легкую цепь или ее часть. Тяжелая цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи может содержать V_H-CDR1, V_H-CDR2 и V_H-CDR3. В некоторых вариантах осуществления изобретения консенсусная последовательность представлена формулой FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, которая содержит V_H-CDR1. Аналогично этому формула X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K, представляет собой консенсусную последовательность которая содержит V_H-CDR2; и формула EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G, представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит V_H-CDR3. Легкая цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи может содержать V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3. В указанном варианте осуществления изобретения формула X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y, представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит V_L-CDR1; формула GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и X₁₃ обозначает А или Р, представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит V_L-CDR2; и формула STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), представляет собой консенсусную последовательность, которая содержит V_L-CDR3.

В любом из вариантов осуществления изобретения антитело или его фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF. В конкретных вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC₅₀ для антитела или фрагмента в анализе ингибирования пролиферации составляет менее чем 20, менее чем 30, менее чем 40, менее чем 50, менее чем 60, менее чем 70, менее чем 80, менее чем 90 или менее чем 100 пМ, в каждом случае при определении с помощью анализа пролиферации TF-1 при ED₈₀, согласно методу, описанному в примере 12. В конкретном варианте осуществления изобретения значение IC50 для моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, предлагаемого в изобретении, составляет менее чем 40 или менее чем 30 пМ, при определении с помощью анализа пролиферации TF-1 при ED₈₀. В конкретном варианте осуществления изобретения значение IC₅₀ для моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, предлагаемого в изобретении, составляет менее чем 25 или менее чем 20 пМ, при определении с помощью анализа пролиферации TF-1 при ED₈₀. Согласно еще одному варианту осуществления моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в изобретении, отличается тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент ингибирует пролиферацию TF-1-клеток примерно на 50% при использовании в концентрации примерно 14 пМ, когда пролиферация TF-1-клеток индуцируется hGM-CSF.

Как продемонстрировано более подробно в примерах, и EV1018, и EV1019 обладают эффективностью в отношении нейтрализации биологической активности hGM-CSF. Поскольку эти антитела распознают практически одинаковый конформационный эпитоп, как указано выше, то можно применять эпитоп для скрининга дополнительных молекул, которые распознают эпитоп, таких как моноклональные антитела или их фрагменты. Таким образом, изобретение относится также к способам скрининга, при которых применяют эпитоп hGM-CSF, который определен полипептидными последовательностями, представленным в SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 и который распознается антителами EV1018, EV1019 или их вариантами. Указанный способ заключается в том, что (I) осуществляют скрининг биологического образца или пептидной библиотеки с использованием зонда, который содержит эпитоп; (II) выделяют молекулу, которая специфически связывается с зондом; и (III) идентифицируют молекулу. В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию, на которой получают молекулу. В некоторых вариантах осуществления изобретения молекула, идентифицированная с помощью способа, представляет собой моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых случаях зонд может содержать также выявляемый маркер, представляющий собой (но, не ограничиваясь только ими) метку, краситель, аффинную метку и т.д. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения зонд может быть иммобилизованным для целей, например, скрининга связывающих молекул. Методы скрининга в целом являются доступными и хорошо известными специалистам в данной области.

В любом из указанных вариантов осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой любой подтип иммуноглобулинов, такой как класс IgG, например, IgG₁, IgG₂ и IgG₄. Таким образом, в любом из указанных вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь может представлять собой, например, цепь гамма-класса, такую как гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) или гамма 4 (γ₄). В любом из указанных вариантов осуществления изобретения тяжелую цепь можно выбирать (аминокислотные остатки тяжелой цепи выбирать из) группы, включающей полипептиды, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 152-245 и 348-363. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно применять часть тяжелой цепи, включая вариабельные области тяжелой цепи. Примеры вариабельных областей тяжелой цепи представлены (но, не ограничиваясь только ими) в настоящем описании в SEQ ID NO: 152-159 и 348-363.

В моноклональных антителах к hGM-CSF и их антигенсвязывающих фрагментах легкая цепь может представлять собой легкую лямбда-цепь или ее часть или легкую каппа-цепь или ее часть. В конкретных вариантах осуществления изобретения легкая лямбда-цепь содержит одну или обе указанные аминокислотные замены: R100G и A153G (содержит замену R100G, замену A153G или и замену R100G, и замену A153G). Следует отметить, что замены в аминокислотной последовательности цепей антитела представлены в настоящем описании со ссылкой на соответствующую аминокислотную референс-последовательность, при этом обозначение положения 100 и 153 в любой легкой цепи или ее фрагменте согласно изобретению должно определяться путем сравнения с SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 34, как аминокислотные положения, соответствующие аминокислотным положениям в SEQ ID NO: 35, в которых аминокислота R заменена на G и аминокислота А замена на G соответственно, если сравнивать с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 34. Например, в вышеописанном случае, в котором легкая лямбда-цепь может содержать одну или обе аминокислотные замены, аминокислотой референс-последовательностью является последовательность легкой цепи EV1018 (EV1018-wt-исходная; SEQ ID NO: 34). R100G означает, что R (аргинин) в положении 100 в легкой цепи EV1018 заменен на G (глицин); A153G означает, что А (аланин) в положении 153 в легкой цепи EV1018 заменен на G (глицин).

В конкретных вариантах осуществления изобретения легкую цепь выбирают из группы, включающей полипептиды, которые представлены (аминокислотные остатки которых представлены в) SEQ ID NO: 34-37 и 184-221 и 364-365. Примеры вариабельных областей легких цепей в контексте настоящего описания представлены в SEQ ID NO: 184-201 и 364-365.

Легкая цепь может нести одну или комбинацию, включающую две или большее количество этих аминокислотных замен, а также другие замены, которые не существенно влияют на способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с hGM-CSF и нейтрализовать его активность. В одном из вариантов осуществления изобретения легкая цепь содержит аминокислотную замену либо в одном, либо в обоих положениях, таких как положение 100 и положение 153, в результате чего гликозилирование не возможно в одном из них или в обоих положениях.

Тяжелая цепь моноклонального антитела к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающего фрагмента может содержать одну или несколько аминокислотных замен, таких как Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A. Следует отметить, что замены в аминокислотной последовательности цепей антитела представлены в настоящем описании путем сравнения с соответствующей аминокислотной референс-последовательностью, и к определению положений следует применять такие же принципы, которые описаны выше применительно к заменам R100G и A153G. Например, в вышеописанном случае, в котором тяжелая цепь может содержать одну или несколько указанных выше аминокислотных замен, аминокислотная референс-последовательность представляет собой последовательность тяжелой цепи EV1018 (EV1018; SEQ ID NO: 10). Например, Т97А означает, что Т (треонин) в положении 97 в тяжелой цепи EV1018 заменен на А (аланин); L164A означает, что L (лейцин) в положении 164 в тяжелой цепи EV1018 заменен на А (аланин).

Тяжелая цепь может нести одну или комбинацию, включающую две или большее количество этих аминокислотных замен, а также другие замены, которые не существенно влияют на способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента связываться с hGM-CSF и нейтрализовать его активность.

Ниже изложены дополнительные детали, касающиеся вариантов осуществления настоящего изобретения:

В одном из вариантов осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько или одну или комбинацию аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A. В другом варианте осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A, и при этом легкая цепь содержит одну или обе следующие аминокислотные замены: R100G и A153G.

Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых V_H-CDR1 содержит аминокислотные остатки SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333).

Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых V_H-CDR2 содержит аминокислотные остатки LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334).

Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых V_H-CDR3 содержит аминокислотные остатки ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

Ниже представлены другие варианты осуществления настоящего изобретения:

моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых V_L-CDR1 содержит аминокислотные остатки IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330);

моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых V_L-CDR2 содержит аминокислотные остатки GRSPPS (SEQ ID NO: 8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331); и

моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, в которых V_L-CDR3 содержит аминокислотные остатки STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

Следующими вариантами осуществления настоящего изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF, которое связывается с hGM-CSF, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с hGM-CSF, дополнительное содержащие сигнальную последовательность.

Сигнальная последовательность может представлять собой любую из множества сигнальных последовательностей, известных специалистам в данной области, таких как сигнальная последовательность, которая пригодна для обеспечения или повышения экспрессии и/или транспорта кодируемого продукта из клетки, в которой он продуцируется, включая (но, не ограничиваясь только ими) сигнальную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 324, 325 и 326.

Во всех вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF может представлять собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или одноцепочечное антитело.

Связывающая активность антител

При создании изобретения неожиданно было установлено, и это является одним из объектов изобретения и описано ниже в примерах, что измеренная аффинность к связыванию антител с антигеном (hGM-CSF) не коррелирует линейно с их нейтрализующей способностью (например, способностью нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF). Эта результаты противоречат общепринятому положению о том, что более высокая аффинность соответствует более высокой нейтрализующей способности. Например, установлено, что антитело, представленное в настоящем описании, т.е. антитело, в котором используются представленные в настоящем описании CDR для распознавания эпитопа, представленного в настоящем описании, например EV1018, характеризуется более чем в 100 раз более высокой способностью к ингибированию при анализе с использованием TF-1-клеток по сравнению с известным в данной области антителом, представленным в таблице 7, в то время как аффинность к связыванию у него составляет менее 50% от аффинности к связыванию известного в данной области антитела. Это противоречит данным, представленным в WO 2006/122797, в которой продемонстрировано, что более высокая аффинность антитела сопровождается более высокой активностью в анализе с использованием TF-1-клеток.

Нейтрализующая активность антител

У мононуклеарных клеток периферической крови человека и опухолевых клеток линии TF-1 может происходить пролиферация в ответ на стимуляцию hGM-CSF. Нейтрализующую активность моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента подтверждают, оценивая ингибирующее действие на пролиферацию. Известно, что у моноцитов периферической крови человека и клеток линии TF-1 может иметь место пролиферация при их культивировании в присутствии hGM-CSF. Указанную пролиферацию можно ингибировать, добавляя моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающих фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, в культуральную систему, или путем первоначального взаимодействия hGM-CSF с моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, предлагаемым в настоящем изобретении, и последующего добавления смеси в культуральную систему. Например, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающих фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, может обладать нейтрализующей активностью в отношении TF-1-клеток, пролиферация которых индуцируется hGM-CSF, при этом уровень цитостатического действия составляет 40-60% (примерно 50%) по сравнению с применяемым в качестве отрицательно контроля вариантом (обработанным 31 пг/мл hIgG) при концентрации примерно 2 нг/мл (примерно 14 пМ).

Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, обладает нейтрализующей способностью в отношении hGM-CSF, превышающей способность известного моноклонального антитела к hGM-CSF. Поэтому их, вероятно, можно применять в качестве терапевтических агентов, используемых в меньших количествах или дозах, для лечения различных заболеваний, которые обусловлены hGM-CSF, таких как аллергический дерматит, аутоиммунные заболевания, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астма, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии типа ревматоидного артрита, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.

Терапевтические композиции, наборы и терапевтическое применение

Антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, обладают эффективностью, такой как способность нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, и поэтому их можно применять для лечения медицинского состояния (например, заболевания или нарушения), которое ассоциировано (например, вызывается) аномальной экспрессией hGM-CSF у индивидуума. Таким образом, указанное терапевтическое применение подпадает под объем настоящего изобретения.

Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются способы лечения заболеваний или состояний, которые указаны в настоящем описании, заключающиеся в том, что вводят пациенту антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, или композицию, представленную в настоящем описании.

В контексте настоящего описания понятие «заболевание или нарушение, ассоциированное со сверхэкспрессией hGM-CSF», как правило, относится к «заболеванию, вызываемому hGM-CSF». Под понятие подпадают любые заболевания, которые обусловливают патологию и является причиной ее ухудшения, когда у пациента присутствует GM-CSF. Под понятие подпадают также другие заболевания, которые обусловливают патофизиологическое состояние и вызывают его ухудшение. Ожидается, что ингибирование биологической активности GM-CSF может временно облегчать симптомы заболевания, ассоциированные с повышенным уровнем GM-CSF, и/или временно замедлять развитие заболевания.

Понятия «заболевание (болезнь)», «нарушение» и «состояние» в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо. Они включают (но, не ограничиваясь только ими): респираторные синдромы, обструктивные легочные заболевания различной этиологии, эмфизему легких различного происхождения, облитерирующие заболевания легких, интерстициальные легочные заболевания, интерстициальную болезнь легких, муковисцидоз, бронхит различной этиологии, бронхоэктаз, РДСВ (респираторный дистресс-синдром взрослых) и все формы отека легких; обструктивные легочные заболевания, выбранные из группы, включающей ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких), астму, бронхиальную астму, педиатрическую астму, серьезную астму, острый приступ астмы и хронический бронхит; эмфизему легких, обусловленную ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких) или дефицитом ингибитора α1-протеиазы; облитерирующие заболевания легких, выбранные из группы, включающей аллергический альвеолит, облитерирующие заболевания легких, инициируемые связанными с условиями труда токсическими субстанциями, таких как асбетоз или силикоз, и рестрикцию, вызываемую опухолями легких, такие как лимфангиоз (Lymphangiosis carcinomatosa), бронхоальвеолярная карцинома и лимфомы; пневмонию, вызываемую инфекциями, такими, например, как заражение вирусами, бактериями, грибами, простейшими, гельминтами или другими патогенами, пневмонит, вызываемый различными факторами, такими, например, как аспирация и недостаточность левого отдела сердца, индуцируемый радиацией пневмонит или фиброз, коллагеноз, такой, например, как красная волчанка, системная склеродермия или саркоидоз, грануломатозы, такие, например, как болезнь Бека, идиопатическая интерстициальная пневмония или идиопатический пневмосклероз (IPF); муковисцидоз, бронхит, вызываемый бактериальной или вирусной инфекцией, аллергический бронхит и токсический бронхит; бронхоэктаз; отек легких, например, токсический отек легких после аспирации или вдыхания токсических субстанций и инородных субстанций; ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера, гломерулонефрит и хронический атопический дерматит.

В контексте настоящего описания понятия «лечить», «обработка» и «лечение» означают в целом введение терапевтического средства индивидууму с целью получения всех или некоторых из следующих результатов: снижение или облегчение прогрессирования, серьезности и/или продолжительности заболевания, нарушения или состояния, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, или облегчение одного или нескольких их симптомов в результате введения одного или нескольких терапевтических средств (например, антител к GM-CSF).

В контексте настоящего описания понятие «терапевтически эффективное количество» означает количество терапевтического средства (например, антитела, которое иммуноспецифически связывается с человеческим GM-CSF), которое является достаточным для снижения серьезности нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, снижения продолжительности нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, облегчения одного или нескольких симптомов нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, предупреждение развития нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, обусловливание регресса нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF, или усиление или улучшение терапевтического(их) действия(ий) другой терапии в отношении нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией и/или активностью человеческого GM-CSF.

Количество вводимого моноклонального антитела к hGM-CSF, например, путем введения композиции, представленной в настоящем описании, может варьироваться в зависимости от таких условий, как состояние, заболевание или нарушение, подлежащее лечению, возраст, пол и состояние здоровья субъекта(индивидуума), получающего лечение, и серьезности и степени прогрессирования состояния, заболевания или нарушения, подлежащего лечению. Соответствующую дозу можно определять эмпирически, используя известные методы и с учетом потребностей индивидуума. Как правило, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг/дозу. Можно применять также более низкие дозы.

В других вариантах осуществления изобретения можно объединять любые антитела к GM-CSF и их фрагменты, указанные выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно объединять 2, 3, 4, 5 или большее количество указанных антител к GM-CSF, их фрагментов или комбинаций.

В некоторых вариантах осуществления изобретения любые описанные выше варианты можно объединять дополнительно с одним или несколькими ранее описанными антителами к GM-CSF, их фрагментами или комбинациями.

Следующим вариантом осуществления изобретения является терапевтическая композиция, содержащая (одно, по меньшей мере одно) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения терапевтическая композиция содержит одно или несколько моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые распознают следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, и фармацевтически приемлемый носитель. Терапевтические композиции могут содержать любое из моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, индивидуально (один вид или тип моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента в терапевтической композиции) или в сочетании, например в виде комбинаций двух или большего количества видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF; два или большее количество видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов; один или несколько видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF и один или несколько видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов; один или несколько видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF и два или большее количество видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов; два или большее количество видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF и один или несколько видов или типов их антигенсвязывающих фрагментов.

Специфическими вариантами осуществления изобретения являются терапевтические композиции, содержащие (одно или более одного) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, и фармацевтически приемлемый носитель, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее/содержащий (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, (II) консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K; и (III) консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO:316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y; (II) консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой X₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает А или Р;, и (III) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO:319), в которой X₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L; где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент распознает следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим два или большее количество моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, два или большее количество их антигенсвязывающих фрагментов, которые связываются с hGM-CSF, или их комбинацию и фармацевтически приемлемый носитель, где одно или несколько моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, или один или несколько их антигенсвязывающих фрагментов распознают прерывистый эпитоп ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является композиция, содержащая два или большее количество моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, два или большее количество их антигенсвязывающих фрагментов, или их комбинацию и фармацевтически приемлемый носитель, где одно или несколько антител или их антигенсвязывающих фрагментов содержит (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, (II) консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO:315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K; и (III) консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y; (II) консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой X₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает А или Р; и (III) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой X₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L; где моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент распознает следующие последовательности: ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.

Другим объектом изобретения является композиция, в которой по меньшей мере одно из двух или большего количества моноклональных антител к hGM-CSF, которые связываются с hGM-CSF, содержит полипептид, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 152-183, 34-37, 184-221, 222-245, 320-323 и 348-365. Композиции могут включать помимо одного или нескольких моноклональных антител к hGM-CSF, представленных в настоящем описании, другие ранее описанные моноклональные антитела к hGM-CSF (см., например, публикацию РСТ международной заявки на патент WO 2006/122797; публикацию РСТ международной заявки на патент WO 2007/092939; и публикацию РСТ международной заявки на патент WO 2006/11353).

Наборы

Антитела к hGM-CSF или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, а также композиция, содержащая такие антитела, может иметь форму набора, который подпадает под объем настоящего изобретения. Набор может иметь различные форматы и помимо лекарственного средства (терапевтическая композиция) может включать также упаковку и/или этикетку лекарственного средства или устройства, как правило, отвечающую предписанию лечащего врача. Набор, как правило, включает напечатанную инструкцию по применению. В некоторых вариантах осуществления изобретения приготовленная в виде препаративной формы композиция (например, лекарственное средство) находится в одном или нескольких контейнерах. В некоторых вариантах осуществления изобретения контейнер может представлять собой устройство, применяемое для дозирования лекарственного средства при введении. Например, лекарственное средство, предлагаемое в настоящем изобретении, может быть предварительно отмерено (например, разделено на аликвоты) в одноразовое дозирующее устройство и представлено в виде набора. В некоторых случаях контейнер представляет собой шприц. Шприц необязательно может быть предварительно заполнен. В некоторых случаях одноразовый контейнер является предварительно заполненным, предварительно запечатанным и может быть сменным.

В зависимости от путей введения и механизмов введения конкретного лекарственного средства набор может включать соответствующие компоненты.

Лекарственные средства

В контексте настоящего описания «носитель, пригодный для фармацевтического агента» включает любой или все физиологически совместимые растворы, дисперсионные среды, средства для нанесения покрытия, антимикробные средства или противогрибковые средства, агенты для регуляции осмотического давления и замедлители абсорбции. Например, носители, пригодные для фармацевтического агента, могут включать один или несколько типов агентов, таких как вода, солевой раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстроза, глицерин и этанол и их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включают в композиции агент для регуляции осмотического давления, такой как сахар, многоатомный спирт или хлорид натрия. Многоатомные спирты могут представлять собой маннит или сорбит. Кроме того, носитель, пригодный для фармацевтического агента, может включать небольшое количество вспомогательных субстанций, таких как увлажнитель, эмульгатор, консервант и забуферивающий агент. Вспомогательные субстанции могут повышать сохранность или эффективность композиций моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента.

Композиции медицинского назначения, пригодные для парентерального введения, могут включать моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении. Предпочтительно моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент применяют в виде инъецируемого раствора, содержащего антитело в количестве 0,1~250 мг/мл, когда применяют один вид моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента. С другой стороны, когда смешивают и применяют несколько видов антител, антитела предпочтительно применяют в виде инъецируемого раствора, содержащего антитела в количестве 0,001~10 мг/мл. Кроме того, несколько антител можно произвольно смешивать в любом соотношении.

Инъецируемый раствор в виде жидкой или лиофилизированной дозы может находиться во флаконе, ампуле из стекла типа «Флинт» или фармацевтического стекла желтого цвета или в предварительно заполненном шприце. В качестве забуферивающего агента можно применять L-гистидин при значении pH 15,0~7,0 (наиболее пригодным является значение pH 6,0). Наиболее предпочтительно применять L-гистидин в концентрации 5-10 мМ. Другие пригодные в качестве забуферивающих агенты могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. К забуферивающему агенту для элиминации токсичности раствора можно добавлять хлорид натрия в концентрации 0~300 мМ (в зависимости от лекарственной формы в виде жидкости, наиболее предпочтительно 150 мМ). Лиофилизированная лекарственная форма может включать криопротектант; главным образом сахарозу, в количестве 0~10% (наиболее предпочтительное количество может составлять 0,5~1,0%). Другими веществами, пригодными в качестве криопротектантов, могут являться трегалоза и лактоза. Лиофилизированная лекарственная форма может включать наполнитель, главным образом маннит в количестве 1~10% (наиболее предпочтительным может являться количество 2~4%). В качестве стабилизатора в лекарственных формах, как в виде жидкости, так и лиофилизата, можно применять главным образом L-метионин в концентрации 1~50 мМ (наиболее предпочтительной может являться концентрация 5~10 мМ). Другими приемлемыми наполнителями являются глицин и аргинин. Можно включать полисорбат 80 в качестве поверхностно-активного вещества в количестве 0~0,05% (наиболее предпочтительное количество может составлять 0,005~0,01%). К другим пригодным поверхностно-активным веществам относятся (но, не ограничиваясь только ими) полисорбат 20 и BRIJ.

Композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в виде различных лекарственных форм. Например, композиция может находиться в лекарственной форме в виде жидкости, полутвердого или твердого продукта. К ним относятся раствор (например, применяемый путем инъекции или трансфузии раствор), дисперсионная жидкость, суспензионная жидкость, таблетка, пилюля, порошок, липосома и суппозиторий. Предпочтительно вид лекарственной формы зависит, например, от пути введения и терапевтического назначения. Предпочтительно композиции, имеющие лекарственную форму в виде жидкости, можно применять путем инъекции и трансфузии жидкости. Композиции можно предпочтительно применять для парентерального введения (например, их можно применять для внутривенного введения, подкожного введения, абдоминального введения и внутривенного введения). В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело вводят путем внутривенной инфузии раствора или внутривенной инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело вводят путем внутримышечной инъекции или подкожной инъекции.

Композиции, предназначенные для терапевтического применения, как правило, получают и хранят в стерильных и стабильных условиях. Композиции могут иметь форму раствора, микроэмульсии, дисперсионной жидкости, липосомы или других структур, которые пригодны для включения лекарственного средства в высокой концентрации. Стерилизованный раствор, предназначенный для инъекции, приготавливают с помощью следующих процедур. Необходимое количество действующих веществ (в частности, моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента) смешивают в соответствующем растворителе. При необходимости одно или комбинацию вышеуказанных соединений смешивают в соответствующем растворителе вместе с действующими веществами, а затем стерилизуют фильтрацией, получая раствор. Как правило, основную дисперсионную среду и действующие вещества смешивают в стерилизованном наполнителе, включающем другие требуемые соединения из вышеуказанной среды. Когда стерилизованный лиофилизированный порошок применяют для получения стерилизованного инъецируемого раствора, то в качестве предпочтительных методов получения используют вакуумную сушку и сушку распылением. С помощью метода приготовления получают любые другие требуемые композиции из порошка действующего вещества и стерилизованного раствора, применяемого для фильтрации. Текучесть раствора на соответствующем уровне поддерживают следующими путями. Эти пути включают, например, нанесение материала для покрытия, такого как лецитин, сохранение частиц размера, требуемого для дисперсионной жидкости, и нанесение поверхностно-активного вещества. В композиции включают фармацевтические замедлители абсорбции, такие как моностеариновая кислота и желатин, в результате чего инъецируемые композиции могут абсорбироваться в организме человека в течение более длительного срока.

Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить с помощью различных методов, известных в данной области. Для различных терапий предпочтительно применяют такие пути/методы введения, как подкожная инъекция, внутривенная инъекция или трансфузия жидкости. Выбор путей/методов введения зависит от ожидаемых результатов. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что имплантат, чрескожный пластырь и система для введения лекарственного средства подпадают под понятие пути/методы введения. В одном из вариантов осуществления изобретения приготавливают также препарат антитела в сочетании с действующими веществами в виде лекарственной формы с контролируемым высвобождением, которая может контролировать высвобождение соединений. Биосовместимый полимер представляет собой биоразложимый полимер. Препарат может включать биосовместимый полимер, такой как этиленвинилацетат, полиангидрид, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортотиоэфиры и полилактат. Различные методы получения указанных лекарственных форм заявлены в патентах и хорошо известны специалистам в данной области.

В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент вводят орально в сочетании, например, с неактивным разбавителем или съедобным и абсорбируемым носителем. Соединения (и при необходимости другие ингредиенты) можно включать также в твердую или мягкую желатиновую капсулу, прессовать с получением таблетки или непосредственно смешивать в пище для индивидуума. При терапии, предусматривающей оральное введение, соединения можно смешивать с эксципиентом и применять в форме, предназначенной для приема внутрь, такой как таблетка, трансбуккальная таблетка, троше (пастилка), капсула, эликсир, суспензионная жидкость, сироп и облатка. Для введения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, путем, отличным от парентерального пути, необходимо наносить на соединение материалы, предупреждающие его инактивацию, и одновременно вводить соединения и указанные материалы.

Комбинированная терапия

Предусматривается также включение в композиции дополнительных действующих веществ, при этом дополнительные действующие вещества не представляют собой антитело к антигену, который не представляет собой GM-CSF. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, предписываются в сочетании с одним или несколькими видами других терапевтических средств, которые можно применять для лечения болезней, ассоциированных с повышенными уровнями GM-CSF, или вводят в сочетании с другими терапевтическими средствами одновременно, при этом другие терапевтические средства не представляют собой антитела к белку, отличному от GM-CSF. Например, моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, предписываются в сочетании с одним или несколькими другими антителами к GM-CSF. Преимуществом комбинированной терапии является то, что в этом случае терапевтические средства оказывают эффективное действие при их применении в малых количествах. Тем самым удается избежать токсичности или осложнений, которые могут быть связаны с терапевтическими средствами, характерных для различных монотерапий.

В контексте настоящего описания понятие «введение в одно и тоже время, одновременно» следует рассматривать в широком смысле. Например, когда два или большее количество видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов вводят пациенту, то каждое/каждый или некоторые из антител или их фрагментов может представлять собой индивидуальное лекарственное средство (композицию), но может и не являться индивидуальным лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуальное лекарственное средство (например, композиция) содержит все из различных видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые вводят индивидууму, в результате чего антитела или их антигенсвязывающие фрагменты одновременно присутствуют в организме пациента в виде смеси. Однако в некоторых вариантах осуществления изобретения два или большее количество лекарственных средств (например, композиций), которые содержат один или несколько видов антител или их антигенсвязывающих фрагментов, вводят индивидууму по отдельности. При введении «по отдельности» лекарственные средства можно вводить последовательно, например, одно после другого. Такое введение можно рассматривать как «одновременное», если действие первого лекарственного средства и действие вводимого(ых) позднее лекарственного(ых) средства(в) (второго, третьего) перекрываются во времени и в клетке/ткани-мишени в организме индивидуума, оказывая тем самым влияние на эффективность и повышая (например, синергетически) результат терапии.

В частности, когда применяют более одного вида моноклональных антител к hGM-CSF, предлагаемых в настоящем изобретении, то можно обеспечивать ингибирующую клеточный рост активность (нейтрализующая биологическая активность), существенно превышающую активность, полученную при использовании одного типа моноклональных антител в композиции медицинского назначения. Таким образом, можно применять требуемое терапевтическое средство в более низком количестве.

Таким образом, изобретение относится к способам повышения активности, отличающимся тем, что вводят одновременно два или большее количество видов моноклональных антитело к hGM-CSF или композиции медицинского назначения или ветеринарные лекарственные композиции, в состав которых входит два или большее количество видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, при этом два или большее количество видов антител выбирают из указанных ниже в подпунктах (а) и (б):

(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который имеет гипервариабельный участок (CDR), содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и является специфическим в отношении hGM-CSF,

(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, указанное/указанный в подпункте (а), которое/который имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот замена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы), и является специфическим в отношении hGM-CSF.

Аналогично этому, настоящее изобретение относится также к способу повышения активности, отличающемуся тем, что одновременно вводят несколько различных видов (далее в контексте настоящего описания обозначено как «множество (несколько) видов») моноклональных антител к hGM-CSF, предлагаемых в изобретении, или композиции медицинского назначения или ветеринарные лекарственные композиции, в состав которых входит несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF, предлагаемых в изобретении.

В любых вариантах осуществления изобретения композиция может содержать один вид или тип моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые обладают способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. В альтернативном варианте в любых вариантах осуществления изобретения композиция может содержать два или большее количество видов или типов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, которые обладают способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. Моноклональные антитела и/или и фрагменты, входящие в композицию, могут представлять собой помимо одного или несколько антител или их фрагментов, представленных в настоящем описании, ранее описанные моноклональные антитела к hGM-CSF и/или их фрагменты. Моноклональные антитела к hGM-CSF и их антигенсвязывающие фрагменты и терапевтические композиции, композиции медицинского назначения и фармацевтические композиции, которые содержат указанные антитела и/или их антигенсвязывающие фрагменты, можно применять для лечения или предупреждения заболеваний, нарушений или состояний, вызываемых hGM-CSF и/или ассоциированных с его сверхэкспрессией (относительно уровня экспрессии hGM-CSF в контроле, например, в организме индивидуума(ов), который(ые) не имеет(ют) заболевания, состояния или нарушения).

Считается, что композиции медицинского назначения, включающие носители, фармацевтически приемлемые для моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, должны обладать эффективностью в отношении заболеваний, вызываемых hGM-CSF. Приведенными в качестве иллюстрации примерами заболеваний, вызываемых избыточным производством hGM-CSF, являются

(а) аллергическое заболевание, такое как астма, атония и полиноз,

(б) отторжение трансплантата, реакция «трансплантат-против-хозяина» (GVHD) и

(в) аутоиммунное заболевание, такое как ревматоидный артрит.

Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом, можно предположить, что сверхэкспрессия GM-CSF по меньшей мере частично вызывает группу болезней или нарушений, которые перечислены в настоящем описании. Однако можно предположить также, что указанные клинические состояния могут вызываться также нарушением другого(их) родственного(ых) биологического(их) пути(ей), таких как позитивная (повышающая) регуляция соответствующего(их) рецептора(ов) или мутации в одном или нескольких эффекторных путях. Таким образом, понятие «заболевание или нарушение, ассоциированное со сверхэкспрессией hGM-CSF» должно включать такие состояния, которые приводят к результату, эквивалентному полученному при сверхэкспрессии hGM-CSF.

Производство/получение

Одним из вариантов осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, предназначенное/предназначенный для применения в медицине.

Вариантом осуществления изобретения является также применение моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, представленного в настоящем описании, для производства или получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF (уровнем GM-CSF), где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF. Указанные моноклональные антитела к hGM-CSF или их антигенсвязывающие фрагменты могут представлять собой любые варианты, представленные в настоящем описании.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, распознающего ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF, для производства или получения лекарственного средства.

Еще одним вариантом осуществления изобретения является применение моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов для производства или получения лекарственного средства, где антитело или его фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, (II) консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, Х₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K; и (III) консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y; (II) консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой X₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает А или Р; и (III) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой X₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L.

Следующим объектом изобретения являются выделенные антитела к hGM-CSF или антигенсвязывающие фрагменты указанных антител, которые можно применять для производства лекарственных средств. Эти лекарственные средства можно применять для лечения заболевания, состояния или нарушения, ассоциированного с аномальной экспрессией (например, сверхэкспрессией) hGM-CSF. Любое из моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, можно применять для производства лекарственного средства, предназначенного для указанной цели.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты распознают ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF.

В некоторых вариантах осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, (II) консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V Х₄ обозначает Т или I, Х₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K; и (III) консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y; (II) консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает А или P; и (III) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L. В одном из вариантов осуществления изобретения связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с hGM-CSF характеризуется значением K_D, не превышающим 400 пМ, в другом варианте осуществления изобретения K_D не превышает примерно 160 пМ (как в случае EV1018 или EV1019), где значение K_D определяют согласно методам, описанным в примерах.

В других вариантах осуществления изобретения можно объединять любые антитела к GM-CSF и их фрагменты, перечисленные выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно объединять 2, 3, 4, 5 или большее количество указанных антител к GM-CSF, их фрагментов или комбинаций.

Получение антител и их фрагментов, ДНК и векторов

Ниже описано получение исходных антител, которые распознают прерывистый эпитоп, предлагаемый в изобретении; однако изобретение не ограничено каким-либо конкретным способом. Описанные отличительные признаки, касающиеся технологии, можно изменять без отклонения от сущности изобретения.

Моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, получали из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом, используя следующие стадии: выделение клона клеток для получения антитела скрининг антителопозитивных клеток из полученной библиотеки антителопродуцирующих клеток и очистка полученного антитела от супернатанта антителопозитивных клеток в помощью аффинной очистки.

1) Выделение клона клеток, продуцирующего полностью человеческие антитела к hGM-CSF

В-лимфоциты выделяют из крови пациента, страдающего идиопатическим альвеолярным протеинозом (IPAP) и имеющего высокий уровень моноклонального антитела к hGM-CSF в сыворотке крови. Затем, индуцируют пролиферацию В-лимфоцитов. Метод индукции пролиферации хорошо известен. Например, в методе трансформации (D. Kozbor и др.) для индукции пролиферации применяют индуцирующий рак фактор, «вирус Эпштейна-Барра» (далее обозначен как EBV). Более конкретно, В-лимфоциты заражают EBV и индуцируют их пролиферацию. Пролиферирующие клетки поддерживают для получения библиотеки антителопродуцирующих клеток.

2) Выделение моноклонального антитела из библиотеки антителопродуцирующих клеток

С помощью известного метода, общепринятого для получения моноклональных антител, выделяют моноклональную клетку из популяции клеток с индуцированной пролиферацией.

Из библиотеки антителопродуцирующих клеток выделяют лимфоцит с целью получения антитела, которое связывается с hGM-CSF. Более конкретно, популяцию клеток (клоны), продуцирующую антитело, которое связывается с hGM-CSF, отбирают с помощью метода лимитирующих разведении. Предпочтительно применять ELISA, для осуществления которого используют hGM-CSF и мышиное антитело к hIgG, меченое для выявления фракции, связывающейся с hGM-CSF. Популяцию клеток (клоны), продуцирующую только требуемое антитело, получают культивированием отобранных антителопозитивных клеток и их повторного скрининга. Стадии, предшествующие «выделению антителопродуцирующего клеточного клона», проиллюстрированы на блок-схеме, представленной на фиг.1.

3) Аффинная очистка с использованием белка А или белка G

Для очистки моноклонального антитела к hGM-CSF можно культивировать отобранную иммортализованную клетку в роллер-флаконе, 2-литровой вращающейся колбе или в других системах для культивирования. Супернатант фильтруют и концентрируют. Затем белок очищают аффинной хроматографией на белок А-сефарозе или белок G-сефарозе и т.д. (фирма Pharmacia Corp., шт. Нью-Джерси, Пискатавей). После замены забуферивающего раствора на ЗФР концентрацию белка измеряют путем определения ОП при 280 нм или предпочтительно с помощью нефелометрического анализа. Изотип антитела оценивают с помощью антигенспецифического метода в отношении изотипа антигена.

Полученное моноклональное антитело к hGM-CSF представляет собой полностью человеческое антитело, продуцируемое В-лимфоцитом, сенсибилизированным в организме человека, поэтому моноклональное антитело к hGM-CSF редко дает иммунореакцию против антитела. При клонировании антителопродуцирующей клетки В-лимфоцит заражают вирусом ЕВ и индуцируют их пролиферацию посредством активности вируса ЕВ. Таким образом, отличительным признаком изобретения является то, что антителопродуцирующую клетку клонируют с использованием активности вируса ЕВ. Метод, основанный на применении вируса ЕВ, обладает преимуществом при получении встречающегося в естественных условиях антитела в человеческом организме и при получении антитела, обладающего высокой аффинностью. Например, аффинность моноклонального антитела к hGM-CSF в 10-100 раз выше аффинности антитела, полученного с использованием искусственно иммунизированной мыши. Библиотека включает группу В-лимфоцитов, пролиферация которых стимулирована заражением вирусом ЕВ. Можно выделять специфический антителопродуцирующий клеточный клон из библиотеки и получать человеческое антитело.

Как отмечалось выше, описанные отличительные особенности можно заменять или преобразовывать согласно технологии, известной в данной области, без отклонения от сущности изобретения. Согласно изобретению нуклеиновая кислота, вектор и клетка-хозяин может экспрессировать рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий участок. Они также подпадают под объем настоящего изобретения.

Ниже в таблицах представлены варианты тяжелой цепи и варианты легкой цепи антитела EV1018 и варианты тяжелой цепи и варианты легкой цепи антитела EV1019. В таблицах представлены соответственно варианты тяжелой и легкой цепей EV1018 и варианты тяжелой и легкой цепей EV1019, и это позволяет идентифицировать все возможные комбинации тяжелой и легкой цепей и для EV1018, и для EV1019. Обычный специалист в данной области может получать все комбинации с помощью методов, известных в данной области, и информации, представленной в настоящем описании.

Следующим объектом изобретения является процесс (способ) получения моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента. Как правило, способ получения моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента заключается в том, что получают или продуцируют ДНК, которая состоит в основном из ДНК, кодирующей иммуноглобулин, который состоит из тяжелой цепи и легкой цепи, или Fab-фрагмент; встраивают полученную ДНК в реплицируемый экспрессионный вектор так, чтобы она была функционально связана с приемлемым промотором, получая вектор, который содержит ДНК, функционально связанную с приемлемым промотором; интродуцируют вектор в клетку-хозяина, получая клетку-хозяина, которая содержит вектор; культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК, и получают кодируемый(ые) пептид(ы) и моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. Полученное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент можно выделять из клетки-хозяина или культуры клетки-хозяина методами, известными в данной области.

Более конкретно, способ заключается в том, что получают по меньшей мере V_H-CDR1, V_H-CDR2 и V_H-CDR3 и V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3 в клетке-хозяине. Способ заключается в том, что интродуцируют в соответствующую клетку-хозяина ДНК, кодирующую V_H-CDR1, V_H-CDR2, V_H-CDR3, V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, поддерживают образовавшуюся клетку-хозяина (клетку-хозяина, содержащую ДНК, которая кодирует V_H-CDR1, V_H-CDR2, V_H-CDR3, V_L-CDR1, V_L-CDR2, V_L-CDR3) в условиях, пригодных для экспрессии ДНК (производство кодируемых пептидов), и конструируют/осуществляют сборку моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, получая тем самым моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент. В конкретных вариантах осуществления изобретения моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент включает (а) тяжелую цепь или в случае фрагмента антитела часть тяжелой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А, (II) консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K; и (III) консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и (б) легкую цепь или в случае фрагмента антитела часть легкой цепи, которая содержит (I) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y; (II) консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO:318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и Х₁₃ обозначает А или P; и (III) консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой X₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L; и полученное моноклональное антитело к hGM-CSF или полученный его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF. ДНК, кодирующая V_H-CDR1, V_H-CDR2, V_H-CDR3, V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, может кодировать один или несколько компонентов (например, все компоненты V_H/V_L могут кодироваться одной ДНК, некоторые или все компоненты могут кодироваться различными ДНК).

Например, первая ДНК может кодировать полную тяжелую цепь, а вторая ДНК может кодировать полную легкую цепь. Полную тяжелую цепь можно выбирать из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 160-183; 222-245, 320 и 322, а полную легкую цепь можно выбирать из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 202-221, 321 и 323. В одном из вариантов осуществления изобретения полную тяжелую цепь выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80 и 160-183; 222-245, 320 и 322, полную легкую цепь выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 202-221, 321 и 323.

Способ может дополнительно предусматривать выделение моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента.

Объектом изобретения является также вектор, содержащий ДНК, которая кодирует V_H-CDR1 и/или V_H-CDR2, и/или V_H-CDR3. V_H-CDR1 имеет последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333), VH-CDR2 имеет последовательность LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) и V_H-CDR3 имеет последовательность ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

Объектом изобретения является также вектор, содержащий ДНК, которая кодирует V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, где V_L-CDR1 имеет последовательность IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330), V_L-CDR2 имеет последовательность GRSPPS (SEQ ID NO:8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331) и V_L-CDR3 имеет последовательность STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

Например, в процессе созревания белка отщепляют лидерные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи. Отщепленные лидерные последовательности не оказывают влияния на конечные свойства антитела. Для восполнения удаленной в результате делеции последовательности клонированную кДНК интегрируют с синтетическим олигонуклеотидом с помощью метода лигирования или ПЦР-амплификации. Понятия «лидерная последовательность» и «сигнальная последовательность» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо.

В альтернативном процессе синтезируют полную вариабельную область с парой коротких перекрывающихся олигонуклеотидов, а затем образовавшийся олигонуклеотид амплифицируют с помощью ПЦР-амплификации, в результате чего получают полный искусственный клон вариабельной области.

Другим объектом настоящего изобретения является выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, где выделенная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9. Настоящее изобретение относится также к выделенной ДНК, в которой нуклеотидная последовательность кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.

Когда выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающее/обладающий способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, под объем настоящего изобретения подпадает также следующая нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент:

выделенная ДНК, обладающая способностью гибридизоваться с описанной выше ДНК в строгих условиях.

Под объем настоящего изобретения подпадают также указанные ниже вектор и клетка-хозяин:

1) вектор, включающий выделенную ДНК,

2) клетка-хозяин, в которую интегрирован рекомбинантный экспрессионный вектор.

Кроме того, можно также получать специфическое антитело путем экспрессии диверсифицированного scFv- (одноцепочечный фрагмент вариабельной области) антитела, полученного в виде слитого с фагом белка с помощью искусственной перестановки генов V_H и V_L, используя разработанный в последние годы метод фагового дисплея, в котором применяют метод генной инженерии для экспрессии рекомбинантного антитела на поверхности фага.

Фрагмент антитела, предлагаемого в изобретении, можно получать с помощью любого метода, известного специалисту в данной области, например, путем рекомбинатной экспрессии фрагментов, которые кодируются укороченными формами ДНК, кодирующей антитело, или путем протеолитического расщепления аминокислотных цепей антитела, при этом специалист в данной области для решения вопроса о том, какой из фрагментов сохраняет антигенсвязывающую функцию или нейтрализующую активность, может применять стандартные биологические анализы, например, представленные в настоящем описании.

Конкретные антитела, предлагаемые в изобретении

Изобретение относится к самому антителу EV1018 и многочисленным вариациям (например, вариантам) антитела EV1018, сведения о которых обобщены в таблице А. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности тяжелой цепи дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности легкой цепи дикого типа EV1018. В некоторых вариантах осуществления изобретения и тяжелая цепь, и легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь исходного антитела (EV1018-wt-исходная) (SEQ ID NO: 34) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO:75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO:76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь EV1018-wt-BI (SEQ ID NO: 35) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь EV1018-wt-BI2 (SEQ ID NO: 36) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит легкую цепь EV1018-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 37) и один из следующих вариантов тяжелой цепи: EV1018 (SEQ ID NO: 10), EV1018-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 11), EV1018-T97A-IgG1KO (SEQ ID NO: 12), EV1018-T97V-IgG1KO (SEQ ID NO: 13), EV1018-N95D-IgG1KO (SEQ ID NO: 14), EV1018-N95E IgG1KO (SEQ ID NO: 15), EV1018-N95K IgG1KO (SEQ ID NO: 16), EV1018-N95Q IgG1KO (SEQ ID NO: 17), EV1018-N93Q-N95T IgG1KO (SEQ ID NO: 18), EV1018-wt IgG1-BI (SEQ ID NO: 19), EV1018-T97A IgG1-BI (SEQ ID NO: 20), EV1018-T97V IgG1-BI (SEQ ID NO: 21), EV1018-N95D IgG1-BI (SEQ ID NO: 22), EV1018-N95E IgG1-BI (SEQ ID NO: 23), EV1018-N95K IgG1-BI (SEQ ID NO: 24), EV1018-N95Q IgG1-BI (SEQ ID NO: 25), EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI (SEQ ID NO: 26), EV1018-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 27), EV1018-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 28), EV1018-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 29), EV1018-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 30), EV1018-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 31), EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 32), EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 33), EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 38), EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 39), EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 40), EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 41), EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 42), EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 43), EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 44), EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL (SEQ ID NO: 45), EV1018-wt IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 46), EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 47), EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 48), EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 49), EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 50), EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 51), EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 52), EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI (SEQ ID NO: 53), EV1018-IgG2 (SEQ ID NO: 54), EV1018-wt-IgG2 (SEQ ID NO: 55), EV1018-T97A-IgG2 (SEQ ID NO: 56), EV1018-T97V-IgG2 (SEQ ID NO: 57), EV1018-N95D-IgG2 (SEQ ID NO: 58), EV1018-N95E-IgG2 (SEQ ID NO: 59), EV1018-N95K-IgG2 (SEQ ID NO: 60), EV1018-N95Q-IgG2 (SEQ ID NO: 61), EV1018-N93Q-N95T-IgG2 (SEQ ID NO: 62), EV1018-IgG4 (SEQ ID NO: 63), EV1018-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 64), EV1018-T97A-IgG4 (SEQ ID NO: 65), EV1018-T97V-IgG4 (SEQ ID NO: 66), EV1018-N95D-IgG4 (SEQ ID NO: 67), EV1018-N95E-IgG4 (SEQ ID NO: 68), EV1018-N95K-IgG4 (SEQ ID NO: 69), EV1018-N95Q-IgG4 (SEQ ID NO: 70), EV1018-N93Q-N95T-IgG4 (SEQ ID NO: 71), EV1018-IgG4-SP (SEQ ID NO: 72), EV1018-wt-IgG4-SP (SEQ ID NO: 73), EV1018-T97A-IgG4-SP (SEQ ID NO: 74), EV1018-T97V-IgG4-SP (SEQ ID NO: 75), EV1018-N95D-IgG4-SP (SEQ ID NO: 76), EV1018-N95E-IgG4-SP (SEQ ID NO: 77), EV1018-N95K-IgG4-SP (SEQ ID NO: 78), EV1018-N95Q-IgG4-SP (SEQ ID NO: 79) и EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP (SEQ ID NO: 80).

Изобретение относится к самому антителу EV1019 и многочисленным вариациям антитела EV1018, сведения о которых обобщены в таблице Б. В некоторых вариантах осуществления изобретения тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности тяжелой цепи дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен относительно последовательности легкой цепи дикого типа EV1019. В некоторых вариантах осуществления изобретения и тяжелая цепь, и легкая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019 (SEQ ID NO: 160) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG1-BI (SEQ ID NO: 161) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG1KO (SEQ ID NO: 162) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G (SEQ ID NO: 163) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG1-BI (SEQ ID NO: 164) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO:212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG1KO (SEQ ID NO: 165) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S (SEQ ID NO: 166) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG1-BI (SEQ ID NO: 167) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG1KO (SEQ ID NO: 168) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A (SEQ ID NO: 169) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG1-BI (SEQ ID NO: 170) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG1KO (SEQ ID NO: 171) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q (SEQ ID NO: 172) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG1-BI (SEQ ID NO: 173) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG1KO (SEQ ID NO: 174) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T (SEQ ID NO: 175) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210),EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG1-BI (SEQ ID NO: 176) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG1KO (SEQ ID NO: 177) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M (SEQ ID NO: 178) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG1-BI (SEQ ID NO: 179) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205). EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG1KO (SEQ ID NO: 180) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L (SEQ ID NO: 181) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO:221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG1-BI (SEQ ID NO: 182) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG1KO (SEQ ID NO: 183) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-IgG2 (SEQ ID NO: 222) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG4 (SEQ ID NO: 223) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211). EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-wt-IgG4SP (SEQ ID NO: 224) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG2 (SEQ ID NO: 225) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG4 (SEQ ID NO: 226) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218). EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105G-IgG4SP (SEQ ID NO: 227) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG2 (SEQ ID NO: 228) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG4 (SEQ ID NO: 229) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105S-IgG4SP (SEQ ID NO: 230) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG2 (SEQ ID NO: 231) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG4 (SEQ ID NO: 232) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218). EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105A-IgG4SP (SEQ ID NO: 233) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG2 (SEQ ID NO: 234) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG4 (SEQ ID NO: 235) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105Q-IgG4SP (SEQ ID NO: 236) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG2 (SEQ ID NO: 237) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG4 (SEQ ID NO: 238) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105T-IgG4SP (SEQ ID NO: 239) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG2 (SEQ ID NO: 240) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG4 (SEQ ID NO: 241) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105M-IgG4SP (SEQ ID NO: 242) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG2 (SEQ ID NO: 243) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG4 (SEQ ID NO: 244) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь EV1019-C105L-IgG4SP (SEQ ID NO: 245) и легкую цепь, выбранную из группы, включающей: EV1019-wt-исходная (SEQ ID NO: 202), EV1019-wt-BI (SEQ ID NO: 203), EV1019-wt-BI2 (SEQ ID NO: 204), EV1019-wt-исходная-константная (SEQ ID NO: 205), EV1019-N25S (SEQ ID NO: 206), EV1019-N25S-BI2 (SEQ ID NO: 207), EV1019-N25G (SEQ ID NO: 208), EV1019-N25G-BI2 (SEQ ID NO: 209), EV1019-N25T (SEQ ID NO: 210), EV1019-N25T-BI2 (SEQ ID NO: 211), EV1019-N25R (SEQ ID NO: 212), EV1019-N25R-BI2 (SEQ ID NO: 213), EV1019-N25Q (SEQ ID NO: 214), EV1019-N25Q-BI2 (SEQ ID NO: 215), EV1019-S27N (SEQ ID NO: 216), EV1019-S27N-BI2 (SEQ ID NO: 217), EV1019-S27G (SEQ ID NO: 218), EV1019-S27G-BI2 (SEQ ID NO: 219), EV1019-S27A (SEQ ID NO: 220) и EV1019-S27A-BI2 (SEQ ID NO: 221).

Кроме того, вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи можно объединять с получением Fab-фрагмента, который связывается с антигеном. Указанную комбинацию, которая сохраняет такую же или эквивалентную аффинность к связыванию антигена, можно применять для получения различных версий антигенсвязывающего фрагмента, такого как одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). scFv представляет собой слияние вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, которые сцеплены друг с другом с помощью короткого (как правило, серинового, глицинового) линкера, и хорошо известны в данной области.

Таким образом, вариабельную область тяжелой цепи EV1018 можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1018. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи и/или легкой цепи может представлять собой вариант, который содержит одно или несколько изменений аминокислот по сравнению с последовательностью цепи дикого типа. Аналогично этому, вариабельную область тяжелой цепи EV1019 можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1019. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи и/или легкой цепи может представлять собой вариант, который содержит одно или несколько изменений аминокислот по сравнению с последовательностью цепи дикого типа.

В некоторых вариантах осуществления изобретения любую из 1018 вариабельных областей тяжелой цепи (например, дикого типа и ее варианты) можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1018-VL-wt-исходная (SEQ ID NO: 364) с получением антигенсвязывающего фрагмента которые связывается с hGM-CSF: EV1018-VH (SEQ ID NO: 348), EV1018-VH-wt (SEQ ID NO: 349), EV1018-VH-T97A (SEQ ID NO: 350), EV1018-VH-T97V (SEQ ID NO: 351), EV1018-VH-N95D (SEQ ID NO: 352), EV1018-VH-N95E (SEQ ID NO: 353), EV1018-VH-N95K (SEQ ID NO: 354), EV1018-VH-N95Q (SEQ ID NO: 355), EV1018-VH-N93Q-N95T (SEQ ID NO: 356), EV1018-VH-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 357), EV1018-VH-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 358), EV1018-VH-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 359), EV1018-VH-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 360), EV1018-VH-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 361), EV1018-VH-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 362) и EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 363).

В некоторых вариантах осуществления изобретения любую из 1018 вариабельных областей тяжелой цепи (например, дикого типа и ее варианты) можно объединять с вариабельной областью легкой цепи EV1018-VL-wt-BI (SEQ ID NO: 365) с получением антигенсвязывающего фрагмента которые связывается с hGM-CSF: EV1018-VH (SEQ ID NO: 348), EV1018-VH-wt (SEQ ID NO: 349), EV1018-VH-T97A (SEQ ID NO: 350), EV1018-VH-T97V (SEQ ID NO: 351), EV1018-VH-N95D (SEQ ID NO: 352), EV1018-VH-N95E (SEQ ID NO: 353), EV1018-VH-N95K (SEQ ID NO: 354), EV1018-VH-N95Q (SEQ ID NO: 355), EV1018-VH-N93Q-N95T (SEQ ID NO: 356), EV1018-VH-T97A IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 357), EV1018-VH-T97V IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 358), EV1018-VH-N95D IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 359), EV1018-VH-N95E IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 360), EV1018-VH-N95K IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 361), EV1018-VH-N95Q IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 362) и EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная (SEQ ID NO: 363).

Аналогично этому, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-wt (SEQ ID NO: 152) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105G (SEQ ID NO: 153) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105S (SEQ ID NO: 154) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-С105А (SEQ ID NO: 155) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-С105Т (SEQ ID NO: 156) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-С105М (SEQ ID NO: 157) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105Q (SEQ ID NO: 158) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий фрагмент EV1019 содержит вариабельную область тяжелой цепи EV1019-VH-C105L (SEQ ID NO: 159) и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, включающей: EV1019-VL-wt (SEQ ID NO: 184), EV1019-VL-BI (SEQ ID NO: 185), EV1019-VL-N25S (SEQ ID NO: 186), EV1019-VL-BI-N25S (SEQ ID NO: 187), EV1019-VL-N25G (SEQ ID NO: 188), EV1019-VL-BI-N25G (SEQ ID NO: 189), EV1019-VL-N25T (SEQ ID NO: 190), EV1019-VL-BI-N25T (SEQ ID NO: 191), EV1019-VL-N25R (SEQ ID NO: 192), EV1019-VL-BI-N25R (SEQ ID NO: 193), EV1019-VL-N25Q (SEQ ID NO: 194), EV1019-VL-BI-N25Q (SEQ ID NO: 195), EV1019-VL-S27N (SEQ ID NO: 196), EV1019-VL-BI-S27N (SEQ ID NO: 197), EV1019-VL-S27G (SEQ ID NO: 198), EV1019-VL-BI-S27G (SEQ ID NO: 199), EV1019-VL-S27A (SEQ ID NO: 200), EV1019-VL-BI-S27A (SEQ ID NO: 201).

Вариации, предлагаемые в изобретении

Настоящее изобретение относится к полноразмерным антителам к hGM-CSF и их антигенсвязывающим участкам или участкам антител к hGM-CSF, когда два или несколько их видов вводят одновременно. Таким образом, под объем изобретения подпадает также биспецифическое антитело и мультиспецифическое антитело, которое распознает hGM-CSF.

Вариации моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего участка представлены выше в настоящем описании, но описанные отличительные особенности можно заменять или преобразовывать согласно технологии, известной в данной области, без отклонения от сущности изобретения.

Так, под объем настоящего изобретения подпадают следующие антитела или их антигенсвязывающие участки:

(I) полноразмерное антитело и его антигенсвязывающий участок,

(II) участок антитела и

(III) рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, моноклональное антитело (включая химерное антитело и гуманизированное антитело) или его антигенсвязывающий участок, обладающее/обладающий способностью специфически связываться с hGM-CSF и нейтрализовать его биологическую активность, где рекомбинантное человеческое моноклональное антитело получают любым хорошо известным методом на основе аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4-9 и 330-335, SEQ ID NO: 364 и 365, и SEQ ID NO: 348-363, SEQ ID NO: 184-201 и SEQ ID NO: 152-159, которые представляют собой последовательности вариабельной области и CDR.

Когда применяют конкретное антитело или его антигенсвязывающий участок, полученное/полученный с помощью описанного выше способа, основой которого является по меньшей мере одна аминокислотная последовательность, выбранная из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9 или 330-335, которые представлены в настоящем описании, то такое антитело или его антигенсвязывающий участок также подпадает под объем настоящего изобретения.

Перечень вариантов антител

Ниже в таблицах представлены перечни пригодных цепей и фрагментов антител EV1018 и EV1019 соответственно.

Таблица А:
Перечень вариантов тяжелой цепи и легкой цепи и вариабельных областей антитела EV1018
Варианты тяжелой цепи EV1018	Варианты легкой цепи EV1018
EV1018	SEQ ID NO: 10	EV1018-wt-исходная	SEQ ID NO: 34
EV1018-wt-IgG1KO	SEQ ID NO: 11	EV1018-wt-BI	SEQ ID NO: 35

Варианты тяжелой цепи EV1018	Варианты легкой цепи EV1018
EV1018-T97A-IgG1KO	SEQ ID NO: 12	EV1018-wt-BI2 (G1)	SEQ ID NO: 36
EV1018-T97V-IgG1KO	SEQ ID NO: 13	EV1018-wt-исходная-константная	SEQ ID NO: 37
EV1018-N95D-IgG1KO	SEQ ID NO: 14	EV1018-VL-wt-исходная	SEQ ID NO: 364
EV1018-N95E IgG1KO	SEQ ID NO: 15	EV1018-VL-wt-BI	SEQ ID NO: 365
EV1018-N95K IgG1KO	SEQ ID NO: 16
EV1018-N95Q IgG1KO	SEQ ID NO: 17
EV1018-N93Q-N95T IgG1KO	SEQ ID NO: 18
EV1018-wt IgG1-BI	SEQ ID NO: 19
EV1018-T97A IgG1-BI	SEQ ID NO: 20
EV1018-T97V IgG1-BI	SEQ ID NO: 21
EV1018-N95D IgG1-BI	SEQ ID NO: 22
EV1018-N95E IgG1-BI	SEQ ID NO: 23
EV1018-N95K IgG1-BI	SEQ ID NO: 24
EV1018-N95Q IgG1-BI	SEQ ID NO: 25
EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI	SEQ ID NO: 26
EV1018-T97A IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 27
EV1018-T97V IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 28
EV1018-N95D IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 29
EV1018-N95E IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 30
EV1018-N95K IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 31
EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO:32
EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO:33
EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 38
EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 39
EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 40
EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 41
EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 42
EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 43

Варианты тяжелой цепи EV1018	Варианты легкой цепи EV1018
EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 44
EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 45
EV1018-wt IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 46
EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 47
EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 48
EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 49
EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 50
EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 51
EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 52
EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 53
EV1018-IgG2	SEQ ID NO: 54
EV1018-wt-IgG2	SEQ ID NO: 55
EV1018-T97A-IgG2	SEQ ID NO: 56
EV1018-T97V-IgG2	SEQ ID NO: 57
EV1018-N95D-IgG2	SEQ ID NO: 58
EV1018-N95E-IgG2	SEQ ID NO: 59
EV1018-N95K-IgG2	SEQ ID NO: 60
EV1018-N95Q-IgG2	SEQ ID NO: 61
EV1018-N93Q-N95T-IgG2	SEQ ID NO: 62
EV1018-IgG4	SEQ ID NO: 63
EV1018-wt-IgG4	SEQ ID NO: 64
EV1018-T97A-IgG4	SEQ ID NO: 65
EV1018-T97V-IgG4	SEQ ID NO:66
EV1018-N95D-IgG4	SEQ ID NO: 67
EV1018-N95E-IgG4	SEQ ID NO: 68
EV1018-N95K-IgG4	SEQ ID NO: 69
EV1018-N95Q-IgG4	SEQ ID NO: 70
EV1018-N93Q-N95T-IgG4	SEQ ID NO: 71

Варианты тяжелой цепи EV 1018	Варианты легкой цепи EV1018
EV1018-IgG4-SP	SEQ ID NO: 72
EV1018-wt-IgG4-SP	SEQ ID NO: 73
EV1018-T97A-IgG4-SP	SEQ ID NO: 74
EV1018-T97V-IgG4-SP	SEQ ID NO: 75
EV1018-N95D-IgG4-SP	SEQ ID NO: 76
EV1018-N95E-IgG4-SP	SEQ ID NO: 77
EV1018-N95K-IgG4-SP	SEQ ID NO: 78
EV1018-N95Q-IgG4-SP	SEQ ID NO: 79
EV1018-N93Q-N95T-IgG4-SP	SEQ ID NO: 80
EV1018	SEQ ID NO: 81
EV1018-wt-IgG1KO	SEQ ID NO: 82
EV1018-T97A-IgG1KO	SEQ ID NO: 83
EV1018-T97V-IgG1KO	SEQ ID NO: 84
EV1018-N95D-IgG1KO	SEQ ID NO: 85
EV1018-N95E IgG1KO	SEQ ID NO: 86
EV1018-N95K IgG1KO	SEQ ID NO: 87
EV1018-N95Q IgG1KO	SEQ ID NO: 88
EV1018-N93Q-N95T IgG1KO	SEQ ID NO: 89
EV1018-wt IgG1-BI	SEQ ID NO:90
EV1018-T97A IgG1-BI	SEQ ID NO: 91
EV1018-T97V IgG1-BI	SEQ ID NO: 92
EV1018-N95D IgG1-BI	SEQ ID NO: 93
EV1018-N95E IgG1-BI	SEQ ID NO:94
EV1018-N95K IgG1-BI	SEQ ID NO: 95
EV1018-N95Q IgG1-BI	SEQ ID NO: 96
EV1018-N93Q-N95T IgG1-BI	SEQ ID NO: 97
EV1018-T97A IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 98
EV1018-T97V IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 99

Варианты тяжелой цепи EV1018	Варианты легкой цепи EV1018
EV1018-N95D IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 100
EV1018-N95E IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 101
EV1018-N95K IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 102
EV1018-N95Q IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 103
EV1018-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 104
EV1018-wt-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 109
EV1018-T97A-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 110
EV1018-T97V-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 111
EV1018-N95D-IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 112
EV1018-N95E IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 113
EV1018-N95K IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 114
EV1018-N95Q IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 115
EV1018-N93Q-N95T IgG1-KO-QVQL	SEQ ID NO: 116
EV1018-wt IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 117
EV1018-T97A IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 118
EV1018-T97V IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 119
EV1018-N95D IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 120
EV1018-N95E IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 121
EV1018-N95K IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 122
EV1018-N95Q IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 123
EV1018-N93Q-N95T IgG1-QVQL-BI	SEQ ID NO: 124
EV1018-IgG2	SEQ ID NO: 125
EV1018-wt-IgG2	SEQ ID NO: 126
EV1018-T97A-IgG2	SEQ ID NO: 127
EV1018-T97V-IgG2	SEQ ID NO: 128
EV1018-N95D-IgG2	SEQ ID NO: 129
EV1018-N95E-IgG2	SEQ ID NO: 130
EV1018-N95K-IgG2	SEQ ID NO: 131

Варианты тяжелой цепи EV1018	Варианты легкой цепи EV1018
EV1018-N95Q-IgG2	SEQ ID NO: 132
EV1018-N93Q-N95T-IgG2	SEQ ID NO: 133
EV1018-IgG4	SEQ ID NO: 134
EV1018-wt-IgG4	SEQ ID NO: 135
EV1018-T97A-IgG4	SEQ ID NO: 136
EV1018-T97V-IgG4	SEQ ID NO: 137
EV1018-N95D-IgG4	SEQ ID NO: 138
EV1018-N95E-IgG4	SEQ ID NO: 139
EV1018-N95K-IgG4	SEQ ID NO: 140
EV1018-N95Q-IgG4	SEQ ID NO: 141
EV1018-N93Q-N95T-IgG4	SEQ ID NO: 142
EV1018-IgG4-SP	SEQ ID NO: 143
EV1018-wt-IgG4-SP	SEQ ID NO: 144
EV1018-T97A-IgG4-SP	SEQ ID NO: 145
EV1018-T97V-IgG4-SP	SEQ ID NO: 146
EV1018-N95D-IgG4-SP	SEQ ID NO: 147
EV1018-N95E-IgG4-SP	SEQ ID NO: 148
EV1018-N95K-IgG4-SP	SEQ ID NO: 149
EV1018-N95Q-IgG4-SP	SEQ ID NO: 150
EV1018-N93Q-N95T-IgG4-S	SEQ ID NO: 151
EV1018-VH	SEQ ID NO: 348
EV1018-VH-wt	SEQ ID NO: 349
EV1018-VH-T97A	SEQ ID NO: 350
EV1018-VH-T97V	SEQ ID NO: 351
EV1018-VH-N95D	SEQ ID NO: 352
EV1018-VH-N95E	SEQ ID NO: 353
EV1018-VH-N95K	SEQ ID NO: 354
EV1018-VH-N95Q	SEQ ID NO: 355

Варианты тяжелой цепи EV1018	Варианты легкой цепи EV1018
EV1018-VH-N93Q-N95T	SEQ ID NO: 356
EV1018-VH-T97A IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 357
EV1018-VH-T97V IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 358
EV1018-VH-N95D IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 359
EV1018-VH-N95E IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 360
EV1018-VH-N95K IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 361
EV1018-VH-N95Q IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 362
EV1018-VH-N93Q-N95T IgG1-исходная-константная	SEQ ID NO: 363
Таблица Б:
Перечень вариантов тяжелой цепи и легкой цепи и вариабельных областей антитела EV1019
Варианты тяжелой цепи EV1019	Варианты легкой цепи EV1019
EV1019-VH-wt	SEQ ID NO: 152	EV1019-VL-wt	SEQ ID NO: 184
EV1019-VH-C105G	SEQ ID NO: 153	EV1019-VL-BI	SEQ ID NO: 185
EV1019-VH-C105S	SEQ ID NO: 154	EV1019-VL-N25S	SEQ ID NO: 186
EV1019-VH-C105A	SEQ ID NO: 155	EV1019-VL-BI-N25S	SEQ ID NO: 187
EV1019-VH-C105T	SEQ ID NO: 156	EV1019-VL-N25G	SEQ ID NO: 188
EV1019-VH-C105M	SEQ ID NO: 157	EV1019-VL-BI-N25G	SEQ ID NO: 189
EV1019-VH-C105Q	SEQ ID NO: 158	EV1019-VL-N25T	SEQ ID NO: 190
EV1019-VH-C105L	SEQ ID NO: 159	EV1019-VL-BI-N25T	SEQ ID NO: 191
EV1019	SEQ ID NO: 160	EV1019-VL-N25R	SEQ ID NO: 192
EV1019-wt-IgG1-BI	SEQ ID NO: 161	EV1019-VL-BI-N25R	SEQ ID NO: 193
EV1019-wt-IgG1KO	SEQ ID NO: 162	EV1019-VL-N25Q	SEQ ID NO: 194
EV1019-C105G	SEQ ID NO: 163	EV1019-VL-BI-N25Q	SEQ ID NO: 195
EV1019-C105G-IgG1-BI	SEQ ID NO: 164	EV1019-VL-S27N	SEQ ID NO: 196
EV1019-C105G-IgG1KO	SEQ ID NO: 165	EV1019-VL-BI-S27N	SEQ ID NO: 197
EV1019-C105S	SEQ ID NO: 166	EV1019-VL-S27G	SEQ ID NO: 198
EV1019-C105S-IgG1-BI	SEQ ID NO: 167	EV1019-VL-BI-S27G	SEQ ID NO: 199
EV1019-C105S-IgG1KO	SEQ ID NO: 168	EV1019-VL-S27A	SEQ ID NO: 200

Варианты тяжелой цепи EV1019	Варианты легкой цепи EV1019
EV1019-C105A	SEQ ID NO: 169	EV1019-VL-BI-S27A	SEQ ID NO: 201
EV1019-C105A-IgG1-BI	SEQ ID NO: 170	EV1019-wt-исходная	SEQ ID NO: 202
EV1019-C105A-IgG1KO	SEQ ID NO: 171	EV1019-wt-BI	SEQ ID NO: 203
EV1019-C105Q	SEQ ID NO: 172	EV1019-wt-BI2	SEQ ID NO: 204
EV1019-C105Q-IgG1-BI	SEQ ID NO: 173	EV1019-wt-исходная-константная	SEQ ID NO: 205
EV1019-C105Q-IgG1KO	SEQ ID NO: 174	EV1019-N25S	SEQ ID NO: 206
EV1019-C105T	SEQ ID NO: 175	EV1019-N25S-BI2	SEQ ID NO: 207
EV1019-C105T-IgG1-BI	SEQ ID NO: 176	EV1019-N25G	SEQ ID NO: 208
EV1019-C105T-IgG1KO	SEQ ID NO: 177	EV1019-N25G-BI2	SEQ ID NO: 209
EV1019-C105M	SEQ ID NO: 178	EV1019-N25T	SEQ ID NO: 210
EV1019-C105M-IgG1-BI	SEQ ID NO: 179	EV1019-N25T-BI2	SEQ ID NO: 211
EV1019-C105M-IgG1KO	SEQ ID NO: 180	EV1019-N25R	SEQ ID NO: 212
EV1019-C105L	SEQ ID NO: 181	EV1019-N25R-BI2	SEQ ID NO: 213
EV1019-C105L-IgG1-BI	SEQ ID NO: 182	EV1019-N25Q	SEQ ID NO: 214
EV1019-C105L-IgG1KO	SEQ ID NO: 183	EV1019-N25Q-BI2	SEQ ID NO: 215
EV1019-IgG2	SEQ ID NO: 222	EV1019-S27N	SEQ ID NO: 216
EV1019-wt-IgG4	SEQ ID NO: 223	EV1019-S27N-BI2	SEQ ID NO: 217
EV1019-wt-IgG4SP	SEQ ID NO: 224	EV1019-S27G	SEQ ID NO: 218
EV1019-C105G-IgG2	SEQ ID NO: 225	EV1019-S27G-BI2	SEQ ID NO: 219
EV1019-C105G-IgG4	SEQ ID NO: 226	EV1019-S27A	SEQ ID NO: 220
EV1019-C105G-IgG4SP	SEQ ID NO: 227	EV1019-S27A-BI2	SEQ ID NO: 221
EV1019-C105S-IgG2	SEQ ID NO: 228	EV1019-wt-исходная	SEQ ID NO: 270
EV1019-C105S-IgG4	SEQ ID NO: 229	EV1019-wt-BI	SEQ ID NO: 271
EV1019-C105S-IgG4SP	SEQ ID NO: 230	EV1019-wt-BI2	SEQ ID NO: 272
EV1019-C105A-IgG2	SEQ ID NO: 231	EV1019-wt-исходная-константная	SEQ ID NO: 273
EV1019-C105A-IgG4	SEQ ID NO: 232	EV1019-N25S	SEQ ID NO: 274
EV1019-C105A-IgG4SP	SEQ ID NO: 233	EV1019-N25S-BI2	SEQ ID NO: 275
EV1019-C105Q-IgG2	SEQ ID NO: 234	EV1019-N25G	SEQ ID NO: 276

Варианты тяжелой цепи EV1019	Варианты легкой цепи EV1019
EV1019-C105Q-IgG4	SEQ ID NO: 235	EV1019-N25G-BI2	SEQ ID NO: 277
EV1019-C105Q-IgG4SP	SEQ ID NO: 236	EV1019-N25T	SEQ ID NO: 278
EV1019-C105T-IgG2	SEQ ID NO: 237	EV1019-N25T-BI2	SEQ ID NO: 279
EV1019-C105T-IgG4	SEQ ID NO: 238	EV1019-N25R	SEQ ID NO: 280
EV1019-C105T-IgG4SP	SEQ ID NO: 239	EV1019-N25R-BI2	SEQ ID NO: 281
EV1019-C105M-IgG2	SEQ ID NO: 240	EV1019-N25Q	SEQ ID NO: 282
EV1019-C105M-IgG4	SEQ ID NO: 241	EV1019-N25Q-BI2	SEQ ID NO: 283
EV1019-C105M-IgG4SP	SEQ ID NO: 242	EV1019-S27N	SEQ ID NO: 284
EV1019-C105L-IgG2	SEQ ID NO: 243	EV1019-S27N-BI2	SEQ ID NO: 285
EV1019-C105L-IgG4	SEQ ID NO: 244	EV1019-S27G	SEQ ID NO: 286
EV1019-C105L-IgG4SP	SEQ ID NO: 245	EV1019-S27G-BI2	SEQ ID NO: 287
EV1019	SEQ ID NO: 246	EV1019-S27A	SEQ ID NO: 288
EV1019-wt-IgG1-BI	SEQ ID NO: 247	EV1019-S27A-BI2	SEQ ID NO: 289
EV1019-wt-IgG1KO	SEQ ID NO: 248
EV1019-C105G	SEQ ID NO: 249
EV1019-C105G-IgG1-BI	SEQ ID NO: 250
EV1019-C105G-IgG1KO	SEQ ID NO: 251
EV1019-C105S	SEQ ID NO: 252
EV1019-C105S-IgG1-BI	SEQ ID NO: 253
EV1019-C105S-IgG1KO	SEQ ID NO: 254
EV1019-C105A	SEQ ID NO: 255
EV1019-C105A-IgG1-BI	SEQ ID NO: 256
EV1019-C105A-IgG1KO	SEQ ID NO: 257
EV1019-C105Q	SEQ ID NO: 258
EV1019-C105Q-IgG1-BI	SEQ ID NO: 259
EV1019-C105Q-IgG1KO	SEQ ID NO: 260
EV1019-C105T	SEQ ID NO: 261
EV1019-C105T-IgG1-BI	SEQ ID NO: 262

Варианты тяжелой цепи EV1019	Варианты легкой цепи EV1019
EV1019-C105T-IgG1KO	SEQ ID NO: 263
EV1019-C105M	SEQ ID NO: 264
EV1019-C105M-IgG1-BI	SEQ ID NO: 265
EV1019-C105M-IgG1KO	SEQ ID NO: 266
EV1019-C105L	SEQ ID NO: 267
EV1019-C105L-IgG1-BI	SEQ ID NO: 278
EV1019-C105L-IgG1KO	SEQ ID NO: 269
EV1019-IgG2	SEQ ID NO: 290
EV1019-wt-IgG4	SEQ ID NO: 291
EV1019-wt-IgG4SP	SEQ ID NO: 292
EV1019-C105G-IgG2	SEQ ID NO: 293
EV1019-C105G-IgG4	SEQ ID NO: 294
EV1019-C105G-IgG4SP	SEQ ID NO: 295
EV1019-C105S-IgG2	SEQ ID NO: 296
EV1019-C105S-IgG4	SEQ ID NO: 297
EV1019-C105S-IgG4SP	SEQ ID NO: 298
EV1019-C105A-IgG2	SEQ ID NO: 299
EV1019-C105A-IgG4	SEQ ID NO: 300
EV1019-C105A-IgG4SP	SEQ ID NO: 301
EV1019-C105Q-IgG2	SEQ ID NO: 302
EV1019-C105Q-IgG4	SEQ ID NO: 303
EV1019-C105Q-IgG4SP	SEQ ID NO: 304
EV1019-C105T-IgG2	SEQ ID NO: 305
EV1019-C105T-IgG4	SEQ ID NO: 306
EV1019-C105T-IgG4SP	SEQ ID NO: 307
EV1019-C105M-IgG2	SEQ ID NO: 308
EV1019-C105M-IgG4	SEQ ID NO: 309
EV1019-C105M-IgG4SP	SEQ ID NO: 310

Варианты тяжелой цепи EV1019	Варианты легкой цепи EV1019
EV1019-C105L-IgG2	SEQ ID NO: 311
EV1019-C105L-IgG4	SEQ ID NO: 312
EV1019-C105L-IgG4SP	SEQ ID NO: 313

Различные варианты осуществления настоящего изобретения

Ниже более подробно описаны варианты осуществления изобретения. Описание вариантов осуществления изобретения дано в той форме, в которой они были представлены при составлении формулы изобретения, поскольку, по-видимому, целесообразно проиллюстрировать в описании сущность изобретения, определяющую охраняемый объем, на который претендует данная заявка на патент.

Пункт 1. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент распознает ELYK (SEQ ID NO: 2) и TMMASHYKQH (SEQ ID NO: 3) в hGM-CSF (SEQ ID NO: 1).

Пункт 2. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, отличающееся/отличающийся тем, что антитело содержит:

(а) тяжелую цепь, включающую консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, в которых:

(I) консенсусная V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и Х₂ обозначает G или А,

(II) консенсусная V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, Х₅ обозначает Y или W, X₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K, и

(III) консенсусная V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G; и

(б) легкую цепь, включающую консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность, в которых:

(I) консенсусная V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y,

(II) консенсусная V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и X₁₃ обозначает А или Р, и

(III) консенсусная V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L. В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2 специфически связывается с hGM-CSF, что предпочтительно характеризуется значением K_D, составляющим менее 450 пМ.

Пункт 3. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, которое/который в дополнение к отличительным признакам, представленным в п.1 или 2, связывается с человеческим GM-CSF, что характеризуется значением K_D, составляющим менее 400 пМ.

Пункт 4. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.3, где значение K_D составляет менее 160 пМ.

Пункт 5. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC₅₀ для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее 100 пМ при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при ED₈₀.

Пункт 6. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где значение IC₅₀ составляет 40 или менее 30 или менее 25 пМ. Для других предпочтительных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, предлагаемых в изобретении, значения IC₅₀ составляют менее 20, менее 25, менее 30 или менее 40 пМ при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при ED₈₀.

Пункт 7. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.5, где значение IC₅₀ составляет менее 20 пМ.

Пункт 8. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-7, в котором тяжелая цепь выбрана из группы, включающей гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) и гамма 4 (γ₄).

Пункт 9. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-8, в котором тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 160-183, 222-244 и 245.

Пункт 10. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-9, в котором легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь.

Пункт 11. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.10, в котором легкая лямбда-цепь содержит по меньшей мере одну или обе следующие аминокислотные замены: R100G или A153G.

Пункт 12. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-11, в котором легкая цепь имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 202-220 и 221.

Пункт 13. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-9, в котором легкая цепь представляет собой легкую каппа-цепь.

Пункт 14. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-13, в котором тяжелая цепь выбрана из группы, включающей гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) и гамма 4 (γ₄), и в котором легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь.

Пункт 15. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-13, в котором тяжелая цепь содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, включающей Q3E, Т97А, T97V, N95D, N95E, N95K, N95Q, N93Q/N95T, K144R, L164A и L165A.

Пункт 16. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-15, в котором V_H-CDR1 содержит аминокислотную последовательность SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333).

Пункт 17. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-16, в котором V_H-CDR2 содержит аминокислотную последовательность LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334).

Пункт 18. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-17, в котором V_H-CDR3 содержит аминокислотную последовательность ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

Пункт 19. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-18, в котором V_L-CDR1 содержит аминокислотную последовательность IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330).

Пункт 20. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-19, в котором V_L-CDR2 содержит аминокислотную последовательность GRSPPS (SEQ ID NO: 8) или GKSPAS (SEQ ID NO: 331).

Пункт 21. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-20, в котором V_L-CDR3 содержит аминокислотные остатки STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

Пункт 22. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит 6 различных CDR, где последовательности 6 CDR представлены в SEQ ID NO: 4-9. В другом варианте осуществления изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22 специфически связывается с hGM-CSF, что предпочтительно характеризуется значением K_D, составляющим менее чем 450, предпочтительно 400 или 160 пМ.

Пункт 22А. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, в сочетании с выделенным моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом по п.п.2-22.

Пункт 23. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) и гамма 4 (γ₄), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую каппа-цепь.

Пункт 24. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.22, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) и гамма 4 (γ₄), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую лямбда-цепь.

Пункт 25. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который специфически связывается с hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит 6 различных CDR, где последовательности указанных 6 CDR представлены в SEQ ID NO: 330-335.

Пункт 26. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) и гамма 4 (γ₄), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую каппа-цепь.

Пункт 27. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.25, где антитело содержит (I) тяжелую цепь или ее фрагмент, выбранную/выбранный из группы, включающей гамма 1 (γ₁), гамма 2 (γ₂), гамма 3 (γ₃) и гамма 4 (γ₄), и (II) легкую цепь, представляющую собой легкую лямбда-цепь.

Пункт 28. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-27, дополнительно содержащее/содержащий сигнальную последовательность.

Пункт 29. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по 28, где сигнальная последовательность выбрана из группы, включающей: SEQ ID NO: 324, 325 и 326.

Пункт 30. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 34.

Пункт 31. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 35.

Пункт 32. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 36.

Пункт 33. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 10 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 11-33, 38-79 и 80, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 37.

Пункт 34. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит тяжелую цепь, имеющую конкретную последовательность тяжелой цепи, и легкую цепь, имеющую конкретную последовательность легкой цепи, где последовательность тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 160 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 161-244 и 245, и где последовательность легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 202 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 203-220 и 221.

Пункт 35. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, где аминокислотная область вариабельной области тяжелой цепи, представляет собой SEQ ID NO: 152 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 153-158 и 159, и вариабельную область легкой цепи, где аминокислотная область вариабельной области легкой цепи представляет собой SEQ ID NO: 184 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 185-200 и 201.

Пункт 36. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.35, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152.

Пункт 37. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.35, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 184.

Пункт 38. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.35, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 152, и где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 184.

Пункт 39. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.35-38, где антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ).

Пункт 40. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 348 или ее вариант, выбранный из группы, включающей SEQ ID NO: 349-362 и 363, и вариабельную область легкой цепи, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представляет собой SEQ ID NO: 364 или SEQ ID NO: 365.

Пункт 41. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 348.

Пункт 42. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 364.

Пункт 43. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.40, где аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 365.

Пункт 44. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.40-43, где антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ).

Пункт 45. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент по п.п.1-44.

Пункт 46. Другим вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая кислота по п.45, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

Пункт 47. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, содержащий ДНК по п.46.

Пункт 48. Другим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая вектор по п.47, где вектор представляет собой экспрессионный вектор.

Пункт 49. Другим вариантом осуществления изобретения является набор, который содержит: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-44; и (б) один или несколько контейнеров, содержащий(их) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Пункт 50. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-44, предназначенное/предназначенный для применения в медицине.

Пункт 51. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из п.п.1-44 и фармацевтически приемлемый носитель.

Пункт 52. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция по п.51, дополнительно содержащая второе выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое/который связывается с hGM-CSF, при этом композиция содержит несколько указанных антител, несколько их антигенсвязывающих фрагментов или по меньшей мере одно антитело и по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, каждое/каждый из которых связывается с hGM-CSF.

Пункт 53. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция по п.52, в которой по меньшей мере одно из антител или их антигенсвязывающих фрагментов представляет собой полипептид, который имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-80, 152-245, 320-323, 348-364 и 365.

Пункт 54. Другим вариантом осуществления изобретения является набор, который содержит: композицию по одному из п.п.51-53 и один или несколько контейнеров, содержащий(их) композицию.

Пункт 55. Другим вариантом осуществления изобретения является набор по п.49 или п.54, дополнительно содержащий инструкцию.

Пункт 56. Другим вариантом осуществления изобретения является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или композиция по одному из п.п.1-44 и 51-54, предназначенные для производства или приготовления лекарственного средства для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF, у индивидуума, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способность нейтрализовать активность hGM-CSF.

Пункт 57. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.56, где заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей: хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.

Пункт 58. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.56 или 57, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг.

Пункт 59. Другим вариантом осуществления изобретения является применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или композиции по одному из п.п.1-44 и 51-53 для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкпрессией hGM-CSF, у индивидуума, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с hGM-CSF и обладает способностью нейтрализовать активность hGM-CSF.

Пункт 60. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.59, где заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей: хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), астму, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.

Пункт 61. Другим вариантом осуществления изобретения является применение по п.59 или 60, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг.

Пункт 62. Другим вариантом осуществления изобретения является эпитоп hGM-CSF в полипептидах, последовательность которых представлена в SEQ ID NO: 2 и 3, где эпитоп распознается антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.22 или 25 и где полипептидные последовательности представляют собой прерывистый сегмент hGM-CSF (SEQ ID NO: 1).

Пункт 63. Другим вариантом осуществления изобретения является эпитоп, представляющий собой прерывистый сегмент человеческого GM-CSF, где эпитоп содержит аминокислотные остатки 77-80 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и аминокислотные остатки 95-104 человеческого GM-CSF (SEQ ID NO: 1) и распознается моноклональным антителом к hGM-CSF или его антигенсвязывающим фрагментом, содержащим 6 различных CDR, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 4-9 или SEQ ID NO: 330-335.

Пункт 64. Другим вариантом осуществления изобретения является способ получения в клетке-хозяине моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента, которое/который связывается с hGM-CSF, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность, заключающийся в том, что:

(I) получают клетку-хозяина, которая содержит по меньшей мере одну последовательность ДНК, кодирующую по меньшей мере консенсусную V_H-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR2-содержащую последовательность, консенсусную V_H-CDR3-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR1-содержащую последовательность, консенсусную V_L-CDR2-содержащую последовательность и консенсусную V_L-CDR3-содержащую последовательность, где:

(а) консенсусная V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой FTFSX₁X₂MH (SEQ ID NO: 314), в которой X₁ обозначает Y или Н и X₂ обозначает G или А,

(б) консенсусная V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой X₃X₄X₅HX_nGX_nX₆KX₇YADSVX₈G (SEQ ID NO: 315), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₃ обозначает L или V, Х₄ обозначает Т или I, X₅ обозначает Y или W, Х₆ обозначает R или K, Х₇ обозначает F или Y и X₈ обозначает R или K, и

(в) консенсусная V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой EX_nX₉GX₁₀X_nX_nDX_n (SEQ ID NO: 316), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, Х₉ обозначает М или V и Х₁₀ обозначает А или G,

(г) консенсусная V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой X_nGNX_nX_nNIGSX₁₁AVG (SEQ ID NO: 317), в которой X_n каждый независимо друг от друга обозначает любую встречающуюся в естественных условиях аминокислоту и Х₁₁ обозначает Н или Y,

(д) консенсусная V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GX₁₂SPX₁₃SG (SEQ ID NO: 318), в которой Х₁₂ обозначает R или K и X₁₃ обозначает А или Р, и

(е) консенсусная V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSX₁₄LSAVX₁₅ (SEQ ID NO: 319), в которой Х₁₄ обозначает R или S и X₁₅ обозначает V или L; и

(II) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК и производства антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Пункт 65. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.64, в котором по меньшей мере одна ДНК кодирует тяжелую цепь или ее часть и легкую цепь или ее часть, где тяжелая цепь или ее часть имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10-33, 38-80, 152-183, 222-245, 348-362 и 363, и где легкая цепь или ее часть имеет последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 34-37, 184-221, 364 и 365.

Пункт 66. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.64 или 65, дополнительной заключающийся в том, что выделяют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Пункт 67. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по одному из п.п.64-66, дополнительной заключающийся в том, что получают композицию, которая содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

Пункт 68. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует V_H-CDR1, V_H-CDR2 и V_H-CDR3, где:

V_H-CDR1 представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4) или SHAMH (SEQ ID NO: 333),

V_H-CDR2 представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5) или VIWHDGSKKYYADSVKG (SEQ ID NO: 334) и

V_H-CDR3 представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6) или EWVGGTCDS (SEQ ID NO: 335).

Пункт 69. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует V_L-CDR1, V_L-CDR2 и V_L-CDR3, где:

V_L-CDR1 представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7) или SGNSSNIGSYAVG (SEQ ID NO: 330),

V_L-CDR2 представляет собой GRSPPSG (SEQ ID NO: 8) или GKSPASG (SEQ ID NO: 331) и

V_L-CDR3 представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9) или STWDSRLSAVL (SEQ ID NO: 332).

Пункт 70. Другим вариантом осуществления изобретения является способ идентификации молекулы, которая связывается с эпитопом по п.62 или 63, заключающийся в том, что

(I) приводят к контакт биологический образец или пептидную библиотеку с зондом, который содержит эпитоп;

(II) выделяют молекулу, которая специфически связывается с зондом; и

(III) идентифицируют молекулу.

Пункт 71. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.70, дополнительно заключающийся в том, что

(IV) получают молекулу, указанную в подпункте (III).

Пункт 72. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по п.70 или 71, в котором молекула представляет собой моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент.

Пункт 73. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по одному из п.п.70-72, в котором зонд дополнительно содержит выявляемый маркер.

Пункт 74. Другим вариантом осуществления изобретения является способ по одному из п.п.70-73, в котором зонд является иммобилизованным.

Пункт 75. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF (hGM-CSF) и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF (hGM-CSF), отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет гипервариабельный участок (CDR), одна или несколько аминокислотных последовательностей которого выбраны из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.

Пункт 76. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет гипервариабельный участок (CDR), аминокислотные последовательности которого выбраны из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.

Пункт 77. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.75 или п.76, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы) в гипервариабельный участок (CDR).

Пункт 78. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.п.75-77, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию TF-1-клеток примерно на 50% при использовании в концентрации примерно 14 пМ, когда пролиферацию TF-1-клеток индуцируют hGM-CSF.

Пункт 79. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.78, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок ингибирует пролиферацию дендритных клеток периферической крови.

Пункт 80. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.78, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок имеет высокую аффинность к hGM-CSF, что характеризуется значением K_D, составляющим 4×10^-10 M или ниже.

Пункт 81. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.п.75-80, отличающееся/отличающийся тем, что антитело принадлежит к классу (подклассу) IgG₁(λ).

Пункт 82. Другим вариантом осуществления изобретения является моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.78, отличающееся/отличающийся тем, что моноклональное антитело к hGM-CSF представляет собой человеческое моноклональное антитело.

Пункт 83. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения, предназначенная для лечения заболевания, которое вызывается hGM-CSF, содержащая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок по п.п.75-82 и фармацевтически приемлемый носитель.

Пункт 84. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения по п.83, отличающая тем что заболевание, которое вызывается избыточным производством hGM-CSF, представляет собой любое заболевание, выбранное из группы, включающей:

(а) аллергические заболевания, такие как астма, атопия и полиноз,

(б) отторжение трансплантата, реакция «трансплантат-против-хозяина» (GVHD) и

(в) аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит.

Пункт 85. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), которая кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающаяся тем, что выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 4-9.

Пункт 86. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная ДНК, которая кодирует моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который обладает способностью связываться с hGM-CSF и нейтрализовать биологическую активность hGM-CSF, отличающаяся тем, что выделенная ДНК кодирует аминокислотную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 330-335.

Пункт 87. Другим вариантом осуществления изобретения является выделенная ДНК, которая обладает способностью гибридизоваться в строгих условиях с ДНК по п.85 или п.86.

Пункт 88. Другим вариантом осуществления изобретения является вектор, отличающийся тем, что в него встроена выделенная ДНК по одному из п.п.85-87.

Пункт 89. Другим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, отличающаяся тем, что в нее интродуцирован рекомбинантный экспрессионный вектор по п.88.

Пункт 90. Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения активности, отличающийся тем, что вводят одновременно несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических в отношении одного и того же конкретного антигена.

Пункт 91. Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения активности по п.90, отличающийся тем, что два или большее количество видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков содержат два или большее количество типов антител или их антигенсвязывающих участков, которые выбирают из указанных ниже в подпунктах (а) и (б):

(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который имеет гипервариабельный участок (CDR), аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,

(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), которое/который имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы), и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.

Пункт 92. Другим вариантом осуществления изобретения является способ повышения активности по п.91, отличающийся тем, что два или несколько типов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков ингибируют пролиферацию TF-1-клеток на 80% или более при использовании каждого в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферация TF-1-клеток индуцирована hGM-CSF.

Пункт 93. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция, содержащая: несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков, специфических в отношении одного и того же конкретного антигена, и фармацевтически приемлемый носитель.

Пункт 94. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция по п.93, отличающаяся тем, что несколько видов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков содержат два или большее количество типов антител или их антигенсвязывающих участков, которые выбирают из указанных ниже в подпунктах (а) и (б):

(а) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, которое/который имеет гипервариабельный участок (CDR), аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 4-9, SEQ ID NO: 330-335, SEQ ID NO: 336-341 или SEQ ID NO: 342-347, и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF,

(б) моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий участок, указанное/указанный в подпункте (а), которое/который имеет аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот заменена(ы), удалена(ы) в результате делеции, встроена(ы) или добавлена(ы), и обладает специфичностью в отношении hGM-CSF.

Пункт 95. Другим вариантом осуществления изобретения является композиция медицинского назначения или ветеринарная лекарственная композиция по п.94, отличающаяся тем, что несколько типов моноклональных антител к hGM-CSF или их антигенсвязывающих участков ингибируют пролиферацию TF-1-клеток на 80% или более при использовании каждого в концентрации примерно 55 пМ, когда пролиферация TF-1-клеток индуцирована hGM-CSF.

Ниже настоящее изобретение более подробно описано с помощью примеров, которые не ограничивают объем настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Выделение клеточных клонов, продуцирующих полностью человеческие антитела к hGM-CSF (hGM-CSF)

На фиг.1 приведена блок-схема выделения антителопродуцирующих клеточных клонов. В-лимфоциты выделяли из крови доноров, в сыворотке которых присутствовали высокие титры моноклонального антитела к GM-CSF, после чего их заражали EBV. Пролиферирующие клетки, инфицированные EBV, использовали в качестве библиотеки антителопродуцирующих клеток.

Клетки из библиотеки антителопродуцирующих клеток вносили в 96-луночные планшеты и культивировали в течение 3-4 недель. Супернатант культуры из каждой лунки подвергали скринингу в отношении присутствия моноклонального антитела к hGM-CSF. Скрининг осуществляли с помощью ELISA, используя 96-луночные планшеты, сенсибилизированные рекомбинантным hGM-CSF (rhGM-CSF). Клетки в лунках, позитивных в отношении производства антитела, высевали в новые 96-луночные планшеты и культивировали в течение 3-4 недель, а затем супернатант культуры из каждой лунки подвергали второму раунду скрининга в отношении присутствия моноклонального антитела к hGM-CSF. Клетки в лунках, позитивных в отношении производства антитела, культивировали в 96-луночных планшетах с использованием лимитирующих разведении культуры в течение 3-5 недель. Затем супернатант культуры из каждой лунки анализировали в отношении присутствия антитела и, наконец, получали антителопродуцирующие клеточные клоны из лунок, засеянных из расчета 1 клетка на лунку.

Пример 2. Идентификация изотипа и подкласса антител

При создании антитела идентифицировали изотип и подкласс антител, продуцируемых тремя антителопродуцирующими клеточными клонами EV1007, EV1018 и EV1019 (таблица 1). Идентификацию осуществляли с помощью ELISA, практически таким же методом, который применяли для скрининга производства антител в супернатантах культур с использованием супернатантов культур в качестве первого антитела и специфических для изотипа и подтипа антител в качестве второго антитела.

В таблице 1 представлены названия вновь полученных трех моноклональных антител к hGM-CSF и их подклассов и моноклонального антитела J158 4С (обозначенного далее в контексте настоящего описания как EV1003), которое описано в публикации международной заявки РСТ WO 07/049472.

Таблица 1
Антитело	Подкласс
EV1007	IgG1 λ
EV1018	IgG1 λ
EV1019	IgG1 λ
EV1003	IgG1 λ

Пример 3. Клонирование генов антител из антителопродуцирующих клеток

Гены антител клонировали из антителопродуцирующих клеток. Общую РНК экстрагировали из антителопродуцирующих клеток и ее кДНК синтезировали с помощью олиго-(дТ) праймера и обратной транскриптазы. С использованием кДНК в качестве матрицы амплифицировали гены, кодирующие синтетические антитела, с помощью ПЦР. Праймеры создавали на основе баз данных последовательностей ДНК генов антител так, чтобы 5′-конец содержал сайт инициации транскрипции, а 3′-конец содержал сайт терминации трансляции.

Пример 4. Определение аминокислотных последовательностей антител на основе нуклеотидных последовательностей

Клонировали кДНК генов антител [EV1007, EV1018 и EV1019, каждый включал гены тяжелой (Н) цепи и легкой (L) цепи] в плазмидных векторах и их нуклеотидные последовательности анализировали с помощью секвенатора (фирма ABI). Аминокислотные последовательности определяли на основе полученных нуклеотидых последовательностей. Для анализа гипервариабельных участков (CDR) антител (EV1007, EV1018, EV1019 и EV1003) использовали метод Кэбота. Последовательности CDR четырех антител представлены в SEQ ID NO: 4-9 и 330-347. В частности, последовательности CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1018 представлены в SEQ ID NO: 4-9 соответственно. CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1019 представлены в SEQ ID NO: 330-335 соответственно. CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1003 представлены в SEQ ID NO: 336-341 соответственно. CDR1 L-цепи, CDR2 L-цепи, CDR3 L-цепи, CDR1 Н-цепи, CDR2 Н-цепи и CDR3 Н-цепи EV1007 представлены в SEQ ID NO: 342-347 соответственно.

Пример 5. Подтверждение полученных генов антител, кодирующих моноклональные антитела к hGM-CSF

Гены, кодирующие три антитела (каждое состоящее из Н- и L-цепей), встраивали в экспрессионные векторы. Плазмидами, кодирующими гены L- и Н-цепи каждого антитела, кратковременно трансфектировали клетки линии 293Т, используя липофектамин и реагент Plus (фирма Invitrogen) и оценивали в отношении кратковременной экспрессии антител.

Через 2 дня после трансфекции собирали супернатанты клеточных культур, содержащие секретируемые антитела. Человеческий IgG и моноклональное антитело к GM-CSF в супернатантах культур выявляли с помощью ELISA для подтверждения кратковременной экспрессии человеческих антител и моноклональных антител к GM-CSF.

Пример 6. Создание стабильно трансфектированных СНО-клеток, экспрессирующих моноклональные антитела к hGM-CSF

Экспрессионными векторами, кодирующими моноклональные антитела к GM-CSF, трансфектировали СНО-K1-клетки согласно описанному выше методу. Через 2 дня после трансфекции клетки высевали в 96-луночный планшет и культивировали в селекционной среде, содержащей соответствующий маркер для селекции, в течение примерно 2 недель. Супернатант культуры каждой лунки подвергали скринингу в отношении моноклонального антитела к hGM-CSF с помощью ELISA. Одиночные клетки в лунках, позитивных в отношении экспрессии антитела, высевали в лунки 96-луночного планшета. Клоны одиночных клеток, выращенные в селективной среде, подвергали скринингу в отношении экспрессии моноклонального антитела к GM-CSF и получали клеточные клоны, стабильно экспрессирующие моноклональное антитело к GM-CSF.

Пример 7. Очистка антител

Клоны СНО-клеток, стабильно экспрессирующие моноклональные антитела к GM-CSF, культивировали в бессывороточной среде. После соответствующего периода экспрессии собирали супернатанты культуры и антитела выделяли с помощью аффинной хроматографии, используя колонку, предварительно заполненную HiTrap рекомбинантным белком A FF (фирма Amersham), согласно инструкции производителя. Подтверждали у очищенных антител способность связываться с hGM-CSF с помощью ELISA и подтверждали наличие у антитела Н-цепи с молекулярной массой примерно 50 кДа и L-цепи с молекулярной массой примерно 25 кДа с помощью ДСН-ПААГ.

Пример 8. Анализ аффинности моноклональных антител к GM-CSF

Для расчета констант аффинности, характеризующих связывание рекомбинантного hGM-CSF с моноклональными антителами к hGM-CSF, применяли метод резонанса поверхностного плазмона (SPR) с использованием Biacore System™ (фиг.2).

При осуществлении метода анализа взаимодействия между антителами и антигенами очищенные антитела иммобилизовывали на сенсорном чипе посредством взаимодействия с белком G, иммобилизованным на поверхности сенсорного чипа, а затем рекомбинантные антигены инъецировали в сенсорный чип. Применяли очищенные антитела и рекомбинантный hGM-CSF в качестве антигена.

Константы равновесия реакции диссоциации (K_D), характеризующие связывание рекомбинантного hGM-CSF, полученного из дрожжей (фирма Leukine Berlex) и из Е.coli (фирма Peprotech), с моноклональными антителами hGM-CSF, представлены в таблице 2.

Таблица 2
Антитело	Константы равновесия реакции диссоциации (KD (М))
Фирма Leukine	Фирма Peprotech
EV1007	1,2×10-9	9,3×10-10
EV1018	2,3×10-10	1,5×10-10
EV1019	3,6×10-10	1,5×10-10
EV1003	2,3×10-10	9,5×10-11

С помощью этого анализа установлено, что значения K_D для GM-CSF из дрожжей (фирма Leukine) составляло 1,2×10^-9 М для EV1007, 2,3×10^-10 M для EV1018 и 3,6×10^-10 M для EV1019. Значение K_D для моноклонального антитела EV1003, созданного ранее, составляло 2,3×10^-10 M.

Значение K_D для GM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech) составляло 9,3×10^-10 М для EV1007, 1,5×10^-10 М для EV1018, 1,5×10^-10 M для EV1019 и 9,5×10^-11 М для EV1003. Все четыре созданных моноклональных антитела к hGM-CSF связывались с рекомбинантными hGM-CSF с высокой аффинностью.

Пример 9. Ингибирующее воздействие моноклональных антител к GM-CSF на пролиферацию дендритных клеток периферической крови

5×10⁵ дендритных клеток (DC), в состав которых входили плазмацитоидные DC и миелоидные DC, получали из 7×10⁷ человеческих мононуклеарных клеток с помощью набора для выделения дендритных клеток из крови человека (Blood Dendritic Cell Isolation Kit II Human) (фирма Miltenyi Biotech).

Полученные DC суспендировали в среде RPMI 1640 (фирма Gibco), дополненной 10% FCS, rhGM-CSF (1 нг/мл, фирма Peprotech), TNF-α (10 нг/мл) и моноклональными антителами к GM-CSF (1 мкг/мл), высеянными в 96-луночные плоскодонные планшеты в концентрации 2×10⁴ клеток/лунку, и инкубировали в течение 10 дней.

Поликлональное антитело к GM-CSF (ПАт к GM-CSF, фирма R&D) (1 мкг/мл) и человеческое антитело к человеческому цитомегаловирусу (hIgG) (1 мкг/мл), которое получали при создании изобретения, применяли в качестве контролей. Результаты представлены на фиг.3.

Как видно из фиг.3, антитела EV1003, EV1018 и EV1019 ингибировали GM-CSF-зависимую пролиферацию DC. В отличие от этого при использовании EV1007 не обнаружено ингибирования. С другой стороны, ПАт к GM-CSF ингибировало GM-CSF-зависимую пролиферацию DC, а hIgG не обладало таким действием.

EV1003, EV1018 и EV1019 обладали способностью независимо блокировать GM-CSF-зависимую пролиферацию DC.

Пример 10. Оценка нейтрализующей способности моноклональных антител к GM-CSF с использованием TF-1-клеток

При создании изобретения оценивали нейтрализующую способность очищенных моноклональных антител к hGM-CSF (EV1007, EV1018 и EV1019) и антитела EV1003, которое было создано ранее, с использованием TF-1-клеток, пролиферация которых зависит от присутствия hGM-CSF, результаты представлены на фиг.4 и 5.

Очищенные антитела предварительно инкубировали с рекомбинантным hGM-CSF и смесь добавляли в культуру TF-1-клеток. После культивирования в течение 2 дней определяли статус пролиферации TF-1-клеток с помощью колориметрического анализа. Антитело, обладающее GM-CSF-нейтрализующей активностью, может блокировать активность добавленного рекомбинантного GM-CSF, что приводит к ингибированию GM-CSF-зависимого роста TF-1-клеток.

На фиг.4 и 5 продемонстрировано ингибирующее действие (нейтрализующая активность) антител на пролиферацию TF-1-клеток, стимулированную дрожжевым hGM-CSF (фирма Leukine) и hGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech) соответственно.

Ингибирующее действие каждого антитела исследовали независимо и ПАт к GM-CSF и hIgG использовали в качестве контролей, как описано в примере 9.

Для оценки антител осуществляли их четырехкратные серийные разведения с получением концентраций от 2 мкг/мл до 31 пг/мл. Во всех опытах в качестве конечной применяли концентрацию 0,5 нг/мл rhGM-CSF. После инкубации в течение 40 ч оценивали жизнеспособность TF-1-клеток по интенсивности цвета при А450/относительно А495 с помощью набора для подсчета клеток (Cell Counting Kit) (WST-1-анализ, фирма DOJIN).

На y-оси на фиг.4 и 5 жизнеспособность TF-1-клеток при использовании контрольного антитела hIgG в концентрации 31 пг/мл принимали за 100%, а жизнеспособность TF-1-клеток в отсутствии rhGM-CSF принимали за 0%. Тестируемые антитела перечислены под чертежами и их концентрации указаны справа на чертежах.

Дрожжевой rhGM-CSF (фирма Leukine) в концентрации 0,5 нг/мл использовали для стимуляции пролиферации TF-1-клеток и полученные данные о нейтрализующей способности каждого моноклонального антитела к hGM-CSF представлены на фиг.4. В то время как для применяемого в качестве отрицательного контроля hIgG при высокой концентрации 2 мкг/мл обнаружено неспецифическое ингибирование клеточного роста, никакого ингибирующего действия не выявлено при его применении в концентрации ниже 2 мкг/мл. Для поликлонального антитела к hGM-CSF (ПАт к GM-CSF) обнаружена зависящая от концентраций антитела ингибирующая активность в отношении роста клеток при применении в концентрации 125 нг/мл или превышающей 125 нг/мл.

При оценке ряда очищенных моноклональных антител установлено, что EV1003 ингибировало рост TF1-клеток на уровне вплоть до 60% от положительного контроля при концентрации 31 нг/мл, и зависящее от концентрации ингибирование роста обнаружено при его применении в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл. Для EV1018 и EV1019 обнаружено примерно 50%-ное ингибирование при концентрациях 0,5 нг/мл или превышающей 0,5 нг/мл и 2 нг/мл или превышающей 2 нг/мл соответственно. Подтверждено, что EV1018 и EV1019 обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF. При применении EV1007 обнаружено заметное ингибирование клеточного роста при концентрациях 0,5 мкг/мл или превышающей 0,5 мкг/мл, что свидетельствует о его очень низкой нейтрализующей способности.

rhGM-CSF E.coli (фирма Peprotech) в концентрации 0,5 нг/мл применяли для стимуляции пролиферации TF-1-клеток и результаты, демонстрирующие нейтрализующую способность каждого моноклонального антитела к hGM-CSF, представлены на фиг.5. В этом анализе для hIgG, применяемого в качестве отрицательного контроля, обнаружено неспецифическое ингибирование клеточного роста в высокой концентрации 2 мкг/мл, и не обнаружено ингибирования при использовании в концентрации ниже 2 мкг/мл. Для поликлональных антител к hGM-CSF (ПАт к GM-CSF) обнаружена зависящая от концентрации антитела ингибирущая активность при применении в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл.

При оценке ряда очищенных моноклональных антител установлено, что EV1003 заметно ингибировало рост TF1-клеток в зависимости от концентрации при использовании в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл. Для EV1018 и EV1019 обнаружено примерно 50%-ное ингибирование при концентрациях 0,5 нг/мл или превышающих 0,5 нг/мл и 2 нг/мл или превышающих 2 нг/мл соответственно. Подтверждено, что EV1018 и EV1019 обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF.

При применении EV1007 обнаружено заметное ингибирование клеточного роста при концентрациях 0,5 мкг/мл или превышающих 0,5 мкг/мл, что свидетельствует о его очень низкой нейтрализующей способности по сравнению с EV1018 и EV1019.

Проводили оценку нейтрализующей активности комбинации двух антител (фиг.6 и 7). В таблице 3 представлены смесей, представляющих собой комбинации антител.

Таблица 3
Смесь - 1	EV1003+hIgG
Смесь - 2	EV1003+EV1007
Смесь - 3	EV1003+EV1018
Смесь - 4	EV1003+EV1019

Смесь - 5

EV1018+EV1019

Тестируемые растворы каждого антитела приготавливали путем серийного четырехкратного разведения с получением концентраций от 4 мкг/мл до 62 пг/мл, и два антитела в одной и той же концентрации смешивали (конечная концентрация представлена на фиг.6 и 7). Жизнеспособность TF-1-клеток оценивали по интенсивности цвета при А450/относительно А495 с помощью набора для подсчета клеток (Cell Counting Kit) (WST-1-анализ, фирма DOJIN).

На y-оси на фиг.6 и 7 жизнеспособность TF-1-клеток при использовании контрольного антитела hIgG в концентрации 31 пг/мл принимали за 100%, а жизнеспособность TF-1-клеток в отсутствии rhGM-CSF принимали за 0%, аналогично указанному на фиг.4 и 5. Результаты, полученные при оценке жизнеспособности TF1-клеток при применении контрольного антитела hIgG в концентрации 31 пг/мл, представлены на фиг.4 и 5, но не представлены на фиг.6 и 7. Комбинации смешиваемых антител представлены под чертежами и их концентрации указаны справа на чертежах.

Из изученных комбинаций ингибирующее действие смеси - 2: EV1003+1007, смеси - 3: EV1003+1018 и смеси - 4: EV1003+1019 резко повышалось по сравнению с индивидуальным применением каждого антитела. Например, как видно из фиг.6, смесь - 4: EV1003+1019 ингибировала рост TF1-клеток в меньшей на 10% степени, чем положительный контроль, при применении каждого антитела в концентрации 8 нг/мл (примерно 55 пМ).

Как видно из фиг.4, EV1003 при его индивидуальном применении в концентрации 8 нг/мл не ингибировало TF1-клеточную пролиферацию, EV1019 при его индивидуальном применении в концентрация 8 нг/мл вызывало лишь 50%-ное ингибирование. Эти результаты свидетельствуют о том, что комбинация двух антител обладает очень высокой нейтрализующей активностью.

В то время как ингибирующее действие EV1007 при его индивидуальном применении было очень низким, смесь - 2: EV1003+1007 ингибировала рост TF1-клеток в меньшей на 10% ниже степени, чем положительный контроль, при применении каждого антитела в концентрации 8 нг/мл (примерно 55 пМ), как видно из фиг.6 и 7.

Как показано на фиг.7, когда для стимуляции пролиферации TF-1-клеток применяли rhGM-CSF из Е.coli (фирма Peprotech), рост клеток практически полностью ингибировался смесью - 2: EV1003+1007, смесью - 3: EV1003+1018 и смесью - 4: EV1003+1019 при применении каждого антитела в концентрации 31 нг/мл или превышающей 31 нг/мл. Подтверждено, что при применении антител в виде комбинаций они обладали очень сильной нейтрализующей активностью.

С другой стороны, ингибирующее действие смеси - 5: EV1018+1019 повышалось в зависимости от концентрации по сравнению с индивидуальным применением антител, что продемонстрировано на фиг.4 и 5, однако уровень повышения оказалось ниже, чем при применении смесей - 2-4.

В случае смеси - 5: EV1018+1019, действие которой было не столь значительным, кривые дозовой зависимости (уровень нейтрализующего действия) для обоих антител при их индивидуальном применении оказались сходными.

Как видно из фиг.4 и 5, из четырех антител (EV1003, EV1007, EV1018 и EV1019) EV1003 характеризуется наиболее сильным ингибирующим действием при его индивидуальном применении в концентрации 2 мкг/мл, но даже при использовании в указанной высокой концентрации, примерно 20% клеток сохранялись. В противоположность этому, смесь - 2, смесь - 3 и смесь - 4 ингибировали клеточный рост практически полностью при применении в концентрации от 31 до 125 нг/мл. Это свидетельствует о том, что указанные три комбинации (смесь - 2, смесь - 3 и смесь - 4) обладают очень высокой нейтрализующей активностью.

Совместное применение моноклонального антитела к GM-CSF (EV1003) и антитела к CMV (hIgG) (смесь - 1), не привело к повышению ингибирующего действия антител по сравнению с их индивидуальным применением.

Из трех антител, полученных при создании настоящего изобретения, два антитела (EV1018 и EV1019) продемонстрировали очень высокую нейтрализующую активность при их индивидуальном применении и применении в виде комбинации. Из изученных комбинаций антител, перечисленных в таблице 3, некоторые комбинации обладали более высокой нейтрализующей активностью, превышающей аддитивное действие обоих антител.

Моноклональные антитела к GM-CSF, создание которых описано выше, и их антигенсвязывающие участки обладают способностью связываться с hGM-CSF, который является причинным фактором различных заболеваний, и инактивировать (нейтрализовать) биологическую активность hGM-CSF. Таким образом, антитела или их антигенсвязывающие участки обладают более высокой нейтрализующей активностью в отношении hGM-CSF, чем ранее созданные (доступные в настоящее время) моноклональные антитела к hGM-CSF. Антитела или их антигенсвязывающие участки не обладают иммуногенностью и не индуцируют иммунный ответ, поскольку они представляют собой человеческие моноклональные антитела.

Кроме того, одновременное применение в виде смесей моноклональных антител к GM-CSF или их антигенсвязывающих участков обусловливает очень высокое ингибирующее действие в отношении клеточного роста (т.е. нейтрализующая активность) по сравнению с их индивидуальным применением.

С учетом указанных свойств моноклональные антитела к hGM-CSF или их антигенсвязывающие участки, представленные в настоящем описании, могут обладать эффективностью в низких дозах в качестве профилактических или терапевтических средств в отношении заболеваний, которые ассоциированы с повышенным уровнем GM-CSF, включая (но, не ограничиваясь только ими) аллергические заболевания, такие как астма, ХОЗЛ, муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, атопия и полиноз, отторжение трансплантата, реакция «трансплантат-против-хозяина», артрит и родственные артропатии, псориаз, миелоидный лейкоз, рассеянный склероз, болезнь Альцгеймера и ревматоидный артрит.

Пример 11. Оценка аффинности моноклональных антител к GM-CSF с помощью Biacore-анализа в присутствии GM-CSF

Применяли Biacore-чипы, обработанные мышиным античеловеческим антителом (фирма GE Healthcare), для иммобилизации каждого антитела и давали связываться с растворимым поступающим в продажу очищенным GM-CSF (фирма Biomol). В этих экспериментах использовали hGM-CSF таким же образом, как представлено в описанных ниже биологических анализах. Аффинность к связыванию определяли с помощью программы Biacore, результаты обобщены в таблице 4.

Таблица 4
Антитело	ka	kd	KD
EV1003	1,05×106±0,01	2,15×10-4±0,01	203±2 пМ
EV1019	8,13×105±0,19	1,21×10-4±0,01	152±1 пМ
EV1018	1,11×106±0,03	1,44×10-4±0,37	112±6 пМ

EV1018 обладало более высокой аффинностью к связыванию, чем EV1019, и существенно более высокой аффинностью к связыванию, чем EV1003. Все варианты EV1018 обладали аффинностью к связыванию, равной аффинности EV1018 дикого типа.

Кросс-реактивность с GM-CSF из других видов (макак-резус, мышь, обезьяна-игрунка)

Последовательность GM-CSF макака-резус представлена в публичных базах данных (например, GenBank, регистрационный № NP_001028121) и ее применяли для создания экспрессируемого клона, такого как слитый белок Fc. Интродуцировали сайты, расщепляемые протеазами, что позволяет высвобождаться немеченому белку GM-CSF макака-резус. Образовавшийся белок обладал очень высокой биологической активностью (см. следующий раздел), и он распознавался всеми моноклональными антителами к GM-CSF (EV 1018, EV1019, EV1003) при анализе методом вестерн-блоттинга (данные не представлены). Осуществляли оценку с помощью Biacore-анализа (используя такую же схему, что и описанная выше в разделе 1.1), полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5.
Оценка связывания GM-CSF макака-резус и моноклональных антител к GM-CSF
Антитело	ka	kd	KD
EV1003	5,39×105±0,06	3,56×10-4±0,04	661±14 пМ
EV1019, партия 1	2,91×105±0,23	2,14×10-4±0,01	739±57 пМ
EV1019, партия 2	3,04×105±0,13	1,65×10-4±0,17	543±34 пМ
EV1018	5,56×105±0,52	2,11×10-4±0,06	381±16 пМ

Во всех вариантах кросс-реактивность с GM-CSF макака-резус оказалась очень высокой (все моноклональные антитела к GM-CSF распознавали белок GM-CSF макака-резус всего лишь примерно в 2-3 раза хуже, чем hGM-CSF). Таким образом, макак-резус является очень хорошей моделью примата кроме человека для создания описанных моноклональных антител к GM-CSF.

Осуществляли анализы с использованием мышиного GM-CSF (фирмы PeproTech и Biomol; например, GenBank, регистрационный № NP_034099) и полученные результаты обобщены в таблице 6.

Таблица 6.
Оценка связывания мышиного GM-CSF и моноклональных антител к GM-CSF
Антитело	ka	kd	KD
EV1003	Н/о	Н/о	Н/о
EV1019	1,1×105±0,1	6×10-3±2	62±27 нМ
EV1018	1,9×105±0,2	3,4×10-2±1,7	193±60 нМ

Во всех вариантах кросс-реактивность с мышиным GM-CSF оказалась очень низкой. Эти данные являются основой для экспериментов, целью которых является идентификация эпитопа hGM-CSF, с которым связываются моноклональные антитела к GM-CSF, в которых создавали белок GM-CSF, являющийся гибридом мышиного и человеческого GM-CSF.

Создавали экспрессионный клон GM-CSF обезьяны-игрунки (например, GenBank, регистрационный № B0KWQ4, несущий метионин в положении 53 и пролин в положении 109) подобно созданию описанного выше экспрессионного клона GM-CSF макака-резус. Очищенный белок применяли для Biacore-анализов и полученные результаты обобщены в таблице 7.

Таблица 7.
Оценка связывания GM-CSF обезьяны-игрунки и моноклональных антител к GM-CSF
Антитело	ka	kd	KD
EV1003	Н/о	Н/о	Н/о
EV1019	2,1×105±0,1	2,14×10-4±0,01	1,4±0,1 нМ
EV1018	3,64×105±0,01	7,6×10-4±0,3	2,1±0,1 нМ

Кросс-реактивность с GM-CSF обезьяны-игрунки является значительной. Все моноклональные антитела к GM-CSF распознавали белок GM-CSF обезьяны-игрунки примерно в 18-19 раз хуже, чем hGM-CSF. Также как и в случае макака-резус обезьяны-игрунки являются очень хорошими животными-моделями для создания описанных моноклональных антител к GM-CSF.

Пример 12. Биологическая активность: нейтрализация биоактивности GM-CSF

Анализ пролиферации TF-1 (GM-CSF человека, макака-резус, обезьяна-игрунка)

Пролиферация человеческих TF-1-клеток зависит от факторов роста. Эта линия клеток рассматривается в данной области, как очень хорошая основа для изучения биологического действия факторов роста.

При создании изобретения применяли рекомбинантный GM-CSF (rGM-CSF) различных видов, такой как (I) рекомбинантный hGM-CSF (rhGM-CSF) из hGM-CSF, экспрессируемого в Е.coli (фирма Biomol, №2514), с помощью стандартных методов, хорошо известных в данной области, или (II) рекомбинантный GM-CSF макака-резус (rrGM-CSF) из GM-CSF макака-резус (например, GenBank, регистрационный №. NP_001028121), или (III) рекомбинантный GM-CSF обезьяны-игрунки (rmGM-CSF) из GM-CSF обезьяны-игрунки (например, GenBank, регистрационный №. B0KWQ4, несущий метионин в положении 53 и пролин в положении 109), оба экспрессировали в клетках линии HEK 293 с помощью стандартных методов, хорошо известных в данной области.

TF-1-клетки выращивали в среде для культуры клеток RPMI 1640 (каталожный №31870, фирма Gibco), 1× глутамакс 100× (каталожный №35050-038, фирма Gibco), 1 мМ пируват натрия, 100 мМ (каталожный №11360-039, фирма Gibco)), 10 мМ Hepes, 1M (каталожный №15690-056, фирма Gibco), 10% FCS (каталожный №10500-064, фирма Gibco), 2 нг/мл rGM-CSF, (каталожный №200-005b, фирма ReliaTech GmbH). Клетки отмывали трижды ЗФР и высевали в 96-луночные планшеты (каталожный №167008, фирма Nunc) в среду для анализа (среда для культуры клеток без rGM-CSF) в концентрации 1×10⁵ клеток/мл. Раствор антитела и раствор GM-CSF разводили средой для разведения (среда для культуры клеток без FCS и без rGM-CSF) и добавляли в объеме 10 мкл соответственно. Клетки инкубировали в течение 3 дней при 37°С и 5% CO₂ в увлажняющей камере. Оценивали жизнеспособность клеток, добавляя 20 мкл MTS, и оценивали оптическую плотность при 492 нм согласно прилагаемой к набору инструкции (CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, фирма Promega, каталожный № G3581). В качестве отрицательного контроля использовали TF-1-клетки, выращенные в среде для культуры клеток, не содержащей rGM-CSF. В качестве положительного контроля использовали TF-1-клетки, выращенные в среде для культуры клеток, содержащей rGM-CSF в концентрации, соответствующей ED₈₀.

До оценки нейтрализующей активности антител определяли значения ED80, характеризующие стимуляцию пролиферации, с использованием GM-CSF человека, макака-резус и обезьяны-игрунки (таблица 8). GM-CSF человека и макака-резус обладали способностью очень эффективно стимулировать пролиферацию TF-1 (ED_{80[человек]}: 1,5 нг/мл; ED_{80[макак-резус]}: 7 нг/мл), однако GM-CSF обезьяны-игрунки оказался весьма неэффективным стимулятором пролиферации TF-1. Таким образом, человеческую клеточную линию TF-1 можно применять для оценки нейтрализующей активности в отношении GM-CSF человека и макака-резус, однако она является непригодной для оценки GM-CSF, полученного из организма обезьян-игрунок.

Таблица 8.
Значения ED80 для GM-CSF человека, макака-резус и обезьяны-игрунки в анализе пролиферации TF-1
Вид	GM-CSF	ED80
Человек	rhGM-CSF (из Е.coli)	1,5 нг/мл
Макак-резус	rrGM-CSF (из HEK-клеток)	7 нг/мл
Игрунка	rmGM-CSF (из HEK-клеток)	1 мкг/мл

Значения IC₅₀ антител определяли при концентрациях, соответствующих ED₈₀.

На фиг.8А и 8Б на y-оси жизнеспособность TF-1-клеток в положительном контроле принимали за 100%, а жизнеспособность TF-1-клеток в отрицательном контроле принимали за 0%.

Применяли также антитело с известной нейтрализующей активностью, такое как поступающее в продажу крысиное антитело к hGM-CSF изотипа IgG2a (BVD2-23B6, фирма BD Pharmingen, №554501) (таблица 9). Для применяемого в качестве контроля изотипа крысиного IgG2a (R35-95, фирма BD, №554687) не обнаружено способности ингибировать пролиферацию клеток (данные не представлены).

Установлено, что EV1018 и EV1019 обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении человеческого рекомбинантного GM-CSF. Антитело EV1018 превышало по нейтрализующей активности BVD2-23В6.

Тяжелая цепь EV1018 в естественных условиях содержит сайт N-гликозилирования внутри каркасного участка 3. Например, в последовательности SEQ ID NO: 10 он соответствует остаткам 95-97. Далее создавали варианты тяжелой цепи EV1018 и оценивали их нейтрализующую активность. Как видно из таблицы 9, полученные результаты свидетельствуют о том, что биологическая активность EV1018 сохранялась после удаления N-связанного сайта гликозилирования в каркасном участке 3 тяжелой цепи. В таблице 9 представлены значения IC₅₀ для двух вариантов последовательностей без сайта гликозилирования (EV1018 вариант 1 и 2), обозначенных как N95K и Т97 соответственно, в сравнении с EV1018, имеющим тяжелую цепь дикого типа, содержащую сайт N-гликозилирования. Значение IC₅₀ для каждого очищенного IgG определяли с помощью TF-1-анализа, в целом, как описано выше. Результаты, полученные в экспериментах, проведенных с другими вариантами EV1018, сопоставимы с результатами, полученными с использованием EV1018.

Таблица 9.
Сравнение значений IC50 в анализе пролиферации TF-1-клеток. Результаты представлены в нг/мл и в пМ (принимая, что молекулярная масса антител составляет 150 кДа)
Антитело	IC50 в отношений UGM-CSF	IC50 в отношении GM-CSF макака-резус
EV1018	2,3 нг/мл	1,7 нг/мл
легкая цепь SEQ ID NO: 34	15 пМ	11 пМ
тяжелая цепь SEQ ID NO: 10
EV1019	5,7 нг/мл	2,8 нг/мл
легкая цепь SEQ ID NO: 202	38 пМ	19 пМ
тяжелая цепь SEQ ID NO: 160

EV1003	71,1 нг/мл	6,6 нг/мл
легкая цепь SEQ ID NO: 321	474 пМ	44 пМ
тяжелая цепь SEQ ID NO: 320
BVD2-23B6	5,3 нг/мл 35 пМ	38 нг/мл 253 пМ
EV1018 вариант 1	32 пМ
легкая цепь SEQ ID NO: 35
тяжелая цепь SEQ ID NO: 11
EV1018 вариант 2	33,3 пМ
легкая цепь SEQ ID NO: 35
тяжелая цепь SEQ ID NO: 16

В экспериментах с использованием рекомбинантного GM-CSF макака-резус установлено, что моноклональные антитела EV1018, EV1019 и EV1003 обладали существенно более высокой нейтрализующей активностью, чем крысиное антитело BVD2-23B6. Однако в обоих типах экспериментов EV1018 значительно превышало по активности все изученные антитела. Все варианты EV1018 обладали такой же нейтрализующей активностью, что и EV1018 дикого типа.

В серии экспериментов, результаты которых представлены в таблице 9, применение поступающего в продажу крысиного антитела к человеческому GM-CSF изотипа IgG2a BVD2-21C11 (фирма BD, №554503) оказалось невозможным, поскольку при применении rGM-CSF в концентрациях, соответствующих ED⁸⁰, т.е. в дозе 1,5 нг/мл, не были получены значимые результаты. Для изучения антитела 21С11 необходимы более низкие дозы rGM-CSF, представленные ниже в таблице 10.

Сравнение эффективности антител в различных лабораториях невозможно осуществлять только на основе сравнения значений IC₅₀, поскольку значения IC₅₀ в значительной степени зависят от условий проведения анализа, например, от количества используемого стимула. Более надежное сравнение можно проводить на основе сопоставления соотношений, например, значений IC₅₀, полученных в описанном выше анализе на TF-1-клетках, но с применением различных указанных доз rGM-CSF, между стандартным антителом и представляющим интерес антителом. Например, в WO 2006/122797 (таблица 8, сс.56 и 57) описано, что наиболее эффективное из указанных в этом документе антител в 35 раз превышает по активности поступающее в продажу крысиное антитело к человеческому GM-CSF, клон BVD2-21C11. Соотношение значений IC₅₀ между поступающим в продажу моноклональным антителом к человеческому GM-CSF, клон BVD2-21C11 и EV1018 составляет 413. Таким образом, по сравнению с поступающим в продажу стандартом нейтрализующая активность EV1018 примерно в 10 раз выше, что видно из данных, представленных в таблице 10. Это является неожиданным, поскольку как описано в WO 2006/122797 и является известным в данной области, нейтрализующая активность моноклонального антитела к GM-CSF значительно коррелирует с его аффинностью к связыванию с GM-CSF (WO 2006/122797, данные о повышенной аффинности к связыванию представлены в таблице 4 на с.50 коррелируют с повышенной нейтрализующей способностью, данные о которой представлены в таблицах 6 и 7 на сс.52-54).

Сравнивая аффинность к связыванию MOR04357 (WO 2006/122797, таблица 4, с.50: аффинность к связыванию составляет 7 пМ для MOR-04357-Fab) с аффинностью к связыванию EV1018, при создании изобретения установлено, что EV1018 связывается с GM-CSF примерно в 16 менее эффективно, чем MOR04357. Однако нейтрализующая активность EV1018 в 10 раз выше, чем у MOR04357, что свидетельствует о том, что нейтрализующая активность не обязательно коррелирует с аффинностью к связыванию с GM-CSF.

Таблица 10.
Относительные нейтрализующие активности, полученные в анализах на TF-1-клетках, EV1018 и известного из прототипа антитела Строки 1 и 2: данные из WO 2006/122797, таблица 8, сс.56 и 57, строки 3 и 4: данные, полученные при создании настоящего изобретения
		TF-1-анализ hGM-CSF (E.coli) [пМ]	Условия анализа, конечная концентрация GM-CSF	Соотношение: референс-антитело и представляющее интерес антитело
1	Референс-Ат BVD2-21C11	1668	0,25 нг/мл
2	MOR04357(IgG1)	48	0,25 нг/мл	35

3	Референс-Ат BVD2-21C11 (фирма BD, №554503)	8260	1,0 нг/мл
4	EV1018	20	1,0 нг/мл	413

Анализ секреции IL-8 на Ц937-клетках (GM-CSF человека и макака-резус)

IL-8 представляет собой провоспалительный цитокин. Он является имеющим решающее значение фактором при связанном с нейтрофилами воспалении и принимает участие в большинстве воспалительных реакций. Клетками-мишенями активности GM-CSF являются клетки миелоидной клеточной линии. Клеточная линия премоноцитов U937 представляет собой линию миелоидного происхождения и секретирует провоспалительный цитокин IL-8 после стимуляции GM-CSF.

U937 (АТСС: CRL-1593.2) выращивали в среде для культуры клеток (RPMI 1640 (каталожный №31870, фирма Gibco), 1× глутамакс 100× (каталожный №35050-038, фирма Gibco), 10% FCS (каталожный №10500-064, фирма Gibco), 1% PenStrep (пенициллин/стрептомицин)). Высевали 100 мкл клеточной суспензиии, содержащей 1×10⁵ клеток/мл, и добавляли 10 мкл раствора антитела и 10 мкл раствора GM-CSF. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С и 5% CO₂ в увлажняющей камере. Уровни цитокина IL-8 определяли с помощью набора OptEIA Human IL-8 Elisa Set (фирма BD Bioscience, каталожный №555244).

В качестве отрицательного контроля использовали U937-клетки, выращенные в среде для культуры клеток без антител и без GM-CSF, а в качестве положительного контроля использовали U937-клетки, выращенные в среде для культуры клеток, содержащей rGM-CSF в концентрации, соответствующей ED80, без добавления раствора антитела. Определяли концентрацию, соответствующую ED80, для GM-CSF человека и макака-резус (таблица 9) и эту концентрацию использовали для определения значений IC₅₀ для различных моноклональных антител к GM-CSF (таблица 11).

Таблица 11.
Определение значений ED80, характеризующих секрецию IL-8 в U937-клетках
GM-CSF	ED80
Человеческий (из Е.coli,	1,2 нг/мл

фирма Biomol, №2514)
Макак-резус (из HEK-клеток, получено при создании изобретения)	5,0 нг/мл
Таблица 12.
Сравнение значений IC50 в анализе секреции IL-8 на U937-клетках. Результаты представлены в нг/мл и в пМ (принимая, что молекулярная масса антител составляет 150 кДа)
Антитело	IC50 в отношении hGM-CSF	IC50 в отношении GM-CSF макака-резус
EV1018	0,9 нг/мл 6 пМ	0,8 нг/мл 5,6 пМ
EV1019	4,7 нг/мл 31,3 пМ	2,4 нг/мл 16 пМ
EV1003	14,6 нг/мл 97,3 пМ	1,7 нг/мл 11,5 пМ
BVD2-23B6	3,5 нг/мл 23,3 пМ	45 нг/мл 300 пМ

При оценке с помощью этого клеточного анализа установлено, что все три антитела обладали очень высокой нейтрализующей активностью в отношении человеческого GM-CSF, а также GM-CSF макака-резус. EV1018 обладало более высокой нейтрализующей активностью, чем EV1019, и существенно более высокой нейтрализующей способностью, чем EV1003. Для всех вариантов EV1018 обнаружена нейтрализующая активность того же уровня, что и активность EV1018 дикого типа.

Пример 13. Индукция поверхностных молекул CD11b/Mac1.

Гранулоциты представляют собой подпопуляцию клеток миелоидной линии, и они представляют собой клетки-мишени биологической активности GM-CSF. Помимо других эффекторных функцией GM-CSF индуцирует адгезионную молекулу (маркер межклеточной адгезии) CD11b/Мас1 на поверхности гранулоцитов. Индукция CD11b/Mac1 на поверхности клеток миелоидной клеточной линии представляет собой имеющую решающее значение стадию в миграции клеток из периферической крови к воспаленной ткани. У пациентов, страдающих хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, таких как ХОЗЛ и астма, присутствуют повышенные количества гранулоцитов в мокроте и жидкости бронхоальвеолярного лаважа. Поэтому эффективность антител к GM-CSF оценивали путем определения опосредуемой GM-CSF индукции маркера адгезии CD11b/Mac1 на первичных человеческих гранулоцитах.

80 мкл периферической крови, взятой от здоровых доноров, со сниженной свертываемостью инкубировали в течение 15 мин при 37°C с моноклональными антителами к GM-CSF или применяемым в качестве контроля изотипа антителом (человеческий IgG, № I-2511; фирма Sigma-Aldrich) (положительный контроль), предварительно инкубированными в течение 20 мин с rhGM-CSF (конечная концентрация 30 пМ) (фирма Biomol, №2514). Для создания отрицательного контроля инкубировали кровь со сниженной свертываемостью в течение 15 мин при 37°C с применяемым в качестве контроля изотипа антителом, предварительно инкубированным с ЗФР, 0,1% БСА в течение 20 мин.

Для количественной оценки экспрессии CD11b/Мас1 применяли антитело к CD11b, меченное фикоэритином (фирма Pharmingen; каталожный №333142), согласно инструкциям поставщика. В целом, метод состоял в следующем: 20 мкл раствора антитела к CD11b добавляли к клеткам, инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Эритроциты (красные клетки крови) лизировали, добавляя 2 мл раствора для лизиса (фирма BD; каталожный №349202), и инкубировали в течение еще 10 мин при комнатной температуре в темноте. После двух стадий отмывки ЗФР, 0,1% БСА лейкоциты суспендировали в 500 мкл Cellfix (фирма BD; каталожный №340181). Для анализа применяли проточный цитометр LSRII и программу DIVA6.1.1 для анализа результатов, полученных с помощью FACS (оба фирмы BD). Выделяли гейт популяции клеток гранулоцитов на точечной диаграмме с использованием прямого и бокового светорассеяния и принимали за 100%. Использовали 30 пМ rhGM-CSF для стимуляции CD11b/Мас1 на поверхности гранулоцитов. Установлено, что применение EV1018 в концентрации 67 пМ достаточно для полной блокады индукции CD11b/Мас1 GM-CSF.

Эти результаты свидетельствуют о том, что EV1018 эффективно нейтрализует биологическую активность GM-CSF в контексте, очень важном для воспалительных процессов, включающих повышенные количества гранулоцитов, типа ХОЗЛ и астмы.

Пример 14. Легочное воспаление после воздействия сигаретного дыма на мышей линии C57BL/6J

Сигаретный дым является фактором, имеющим решающее значение для развития ХОЗЛ. Продолжительное воздействие сигаретного дыма на животных различных видов, например, на крыс и мышей, вызывает патофизиологически значимые анатомические повреждения, сопоставимые с заболеванием у человека (Fujita и Nakanishi 2007). Одним из важных проявлений ХОЗЛ является хронический бронхит, характеризующийся повышенным количеством нейтрофилов и макрофагов в легком. Для доказательства того, что GM-CSF играет имеющую решающее значение роль в индуцируемом курением притоке клеток в легкое, проводили исследование с применением моноклональных антител к GM-CSF на созданной на мышах модели долговременного воздействия сигаретного дыма.

Мышей (линия C57BL/6J, вес 18-23 г) подвергали воздействию сигаретного дыма в течение 4 дней. Мышей подвергали воздействию 6 сигарет в день 1 и 2, 8 сигарет в день 3 и 10 сигарет в день 4. Животных подвергали воздействию дыма от каждой сигареты в течение 16 мин, после чего их обрабатывали в течение 8 мин свежим воздухом. После каждой второй сигареты делали дополнительный перерыв на 24 мин, при этом проводили обработку свежим воздухом. Мыши, которых не подвергали воздействию сигаретного дыма, служили в качестве отрицательного контроля.

Животным вводили внутрибрюшинно (i.p.) крысиное антитело к мышиному GM-CSF изотипа IgG2a, 300 мкг (клон MPI-22E9, фирма eBioScienses, №16-7331) или антитело соответствующего изотипа, 300 мкг (крысиный IgG2a, фирма eBioSciences, №16-4321), или наполнитель, 300 мкл (ЗФР, 10 мМ NaCl) за 2 ч до начала протокола обработки сигаретным дымом в день 1 и в день 3. Через 18 ч после последней экспозиции животных умерщвляли и легкие промывали, используя 2×0,8 мл раствора Хэнкса с ЭДТК. Бронхоальвеолярную лаважную жидкость (БАЛЖ) разделяли центрифугированием на клеточный дебрис и супернатант. Определяли миелопероксидазную (МРО) активность в дебрисе в качестве параметра, характеризующего приток миелоидных клеток. По 500 мкл образцов лаважной жидкости центрифугировали при 485 × g, при 4°С в течение 10 мин. Дебрис ресуспендировали в 200 мкл 0,5-ного бромида гексадецилтриметиламмония (НТАВ). По 50 мкл суспензий переносили в 96-луночный титрационный микропланшет. В каждую лунку добавляли по 250 мкл раствора субстрата (50 мМ KH₂PO₄, 5 мМ Na₂HPO₄, 0,2 мг/мл дигидрохлорида о-дианизидина, 0,2 мкл/мл H₂O₂) для инициации ферментативной реакции. Определяли экстинкцию при длине волны 450 нм в течение 90 с. Миелопероксидазную (МРО) активность рассчитывали в течение стационарной стадии ферментативной реакции. Активность выражали в миллиединицах активности в мин (мAU/мин).

Цитокины МСР-1 и MIP-1 α определяли в супернатантах БАЛЖ путем многократного исследования аналита на проточном цитометре (тип LSR II, фирма Becton Dickinson). Анализ осуществляли согласно инструкциям фирмы Bender MedSystems (Flow Cytomix). В целом, метод состоял в следующем 25 мкл супернатанта БАЛЖ смешивали с 25 мкл 1 × буфера для анализа (набор Basic Kit BMS8440FF), 25 мкл смеси гранул (смесь МСР-1 и MIP-1a Simplex Kits, BMS86005FF, BMS86013FF) и 50 мкл смеси биотин-конъюгат (входит в наборы Simplex Kits) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре на шейкере для микропланшетов при 500 об/мин. После двукратной отмывки буфером для анализа гранулы повторно растворяли в 100 мкл буфера для анализа и добавляли 50 мкл раствора стрептавидин-РЕ (фосфатидилэтаноламин, входит в набор Basic Kit). Гранулы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере для микропланшетов при 500 об/мин. Гранулы отмывали дважды буфером для анализа. Гранулы повторно растворяли в 500 мкл буфера для анализа и анализировали с помощью проточной цитометрии, используя программу FlowCytomix Pro 2.2 фирмы Bender MedSystems. Для количественной оценки готовили серийные разведения стандарта (входит в состав наборов Simplex Kits) согласно инструкциям поставщика (фирма Bender MedSystems). Концентрации цитокинов определяли на основе стандартов.

После предварительной обработки мышей антителом к GM-CSF активность МРО снижалась примерно на 25% (фиг.9А). С этими результатами согласуются данные о том, что уровень цитокинов МСР-1 и MIP-1a снижался примерно на 18% и 23% соответственно (фиг.9Б).

Результаты, представленные на фиг.9А и фиг.9Б, демонстрируют, что GM-CSF играет решающую роль в индуцированном сигаретным дымом воспалении и что нейтрализация GM-CSF может существенно снижать клеточную инфильтрацию и уровень воспалительных цитокинов, которые индуцируются при продолжительным воздействии сигаретного дыма на мышей.

Пример 15. Картирование эпитопов hGM-CSF

Оценивали пептидные массивы, содержащие пептиды GM-CSF мыши, человека, макака-резус и обезьяны-игрунки, с целью идентификации конкретной(ых) линейной(ых) последовательности(ей) в GM-CSF в качестве эпитопа, распознаваемого рассматриваемыми антителами.

Оценивали следующие антитела: BIBH1 (неродственное гуманизированное антитело изотипа IgG1, распознающее FAP, в качестве отрицательного контроля (см. US 20030103968, озаглавленный «Use of FAP alpha specific antibody BIBH1 in the treatment of cancer» («Применение специфического в отношении FAP альфа антитела BIBH1 для лечения рака»)) (http://www.asco.org/ASCO/Abstracts+&+Virtual+Meeting/Abstracts?&vmview=abst_detail_view&confID=10&abstractID=1028), а также антитела EV1018, EV1019 и EV1003.

Результаты, полученные с использованием пептидных массивов, свидетельствуют о том, что не выявлено специфическое связывание, превышающее уровни, обнаруженные при использовании антитела, которое применяли в качестве отрицательного контроля, в то время как иммобилизованный GM-CSF и применяемый в качестве положительного контроля человеческий IgG давали сильный сигнал. Исходя из того, что распознавался правильно уложенный GM-CSF, но не распознавался ни один из выведенных из GM-CSF пептидов, при создании изобретения было высказано предположение о том, что тестируемые антитела к GM-CSF распознают нелинейный(ые) или специфический(ие) для конформации эпитоп(ы). Это противоречит данным, полученным для некоторых других описанных в литературе антител к GM-CSF (например, описанным в WO 2007/092939).

Применяли следующий метод:

Синтезировали на заказ массивы, которые были помещены на стеклянные слайды на фирме JPT (Берлин, Германия). Массивы блокировали с помощью ЗФР+1% БСА+0,1% Твин 20 в течение 3 ч при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Антитела разводили до концентрации 5 мкг/мл в буфере для зондирования (ЗФР, 5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ ДТТ, 0,05% Тритон Х-100, 5% глицерина, 1% БСА) и инкубировали с массивами при 4°С в течение 1-2 ч. Затем массивы отмывали трижды буфером для зондирования (каждый раз по 1 мин на льду) и затем инкубировали с меченным с помощью Су5 козьим античеловеческим IgG (0,5 мкг/мл) в течение 1 ч при 4°С. Их вновь промывали согласно описанному выше методу, сушили центрифугированием (800 × g) и сканировали с использованием сканера для микромассивов типа Perkin-Elmer Proscan, снабженным постоянным фотоумножителем (РМТ) с набором фильтров для Су5.

Осуществляли также эпитопное картирование путем замены ортологов. Поскольку тестируемые антитела распознают конформационный или прерывистый эпитоп, то соответствующий эпитоп можно определять только в контексте правильно уложенного GM-CSF. Как видно из результатов, полученных с помощью описанного выше Biacore-анализа, рассматриваемые антитела связываются лишь очень слабо, если связывание вообще имеет место, с мышиным GM-CSF. Поэтому при создании изобретения создавали химерные версии GM-CSF, в которых отобранные области человеческого GM-CSF заменяли соответствующей мышиной последовательностью. Поскольку человеческий и мышиный GM-CSF, вероятно, обладают сходными трехмерными структурами, но идентичными только на 73%, химерные белки должны сохранять правильную укладку GM-CSF, что отличает этот метод от сканирования аланином (замена на полиаланиновые участки), который может влиять на укладку белка. Химеры, в которых эпитоп или его часть заменены на мышиные последовательности, должны терять свою способность связываться с рассматриваемым антителом (или связываться в меньшей степени). Повторное картирование последовательностей на известной трехмерной структуре человеческого GM-CSF, позволяет реконструировать пространственную локализацию аминокислот, из которых состоит эпитоп. Аминокислоты, являющиеся консервативными для человеческого и мышиного GM-CSF, нельзя анализировать этим методом.

Были созданы 11 различных химер, в которых 7 линейных пептидных последовательностей были заменены индивидуально и в сочетании. В каждой химере аминокислоты мышиного GM-CSF обозначены жирным шрифтом. Предсказанные сайты N-связанного гликозилирования, которые являются разными в различных химерах, подчеркнуты. Каждую химеру экспрессировали в НЕК 293-клетках в виде кроличьего Fc-связанного белка, что позволяет осуществлять очистку и количественное определение по кроличьему Fc-фрагменту. Контрольный вестерн-блотттинг со слитыми белками, для которого использовали антитело к кроличьему Fc, продемонстрировал, что в гели внесено идентичное количество различных химерных белков GM-CSF. Сдвиг подвижности между различными химерами являлся результатом различий в гликозилировании между человеческим и мышиным GM-CSF.

Вестерн-блоттинг химер GM-CSF с использованием EV1003 позволил установить, что для химер 3, 6, 9 и 10 характерно небольшое связывание или отсутствие связывания. Химера 9 представляет собой комбинацию химер 3 и 6, а химера 10 представляет собой комбинацию химер 2 и 6. Таким образом, все химеры, содержащие мышиные аминокислоты в положениях, в которых они присутствуют в химерах 3 и 6 или в комбинациях, содержащих одну или обе эти области, перестают распознаваться EV1003. Таким образом, они представляют собой эпитоп EV1003. Пространственное картирование химер 3 и 6 на 3-мерной кристаллической структуре GM-CSF продемонстрировало, что эти химеры расположены по соседству друг с другом на поверхности молекулы GM-CSF, что очень хорошо согласуется с этими результатами. Указанная поверхность представляет собой прерывистый эпитоп, распознаваемый EV1003.

Вестерн-блоттинг химер GM-CSF с использованием EV1019 позволил установить, что для химер 4, 5 и 11 характерно слабое связывание, в то время как для химеры 8 продемонстрировано практически полное отсутствие связывания. Химера 11 представляет собой комбинацию химер 1 и 5, а химера 8 представляет собой комбинацию химер 4 и 5. Таким образом, все химеры, содержащие мышиные аминокислоты в положениях, в которых они присутствуют в химерах 4 и 5, характеризуются слабым связыванием с EV1019. Химера 8, которая содержит комбинацию мышиных аминокислот в положениях в которых они присутствуют в химерах 4 или 5, перестает распознаваться EV1019. Таким образом, комбинация химер 4 и 5 представляет собой эпитоп EV1019. Пространственное картирование химер 4 и 5 на 3-мерной кристаллической структуре GM-CSF продемонстрировало, что эти химеры расположены по соседству друг с другом на поверхности молекулы GM-CSF, что очень хорошо согласуется с этими результатами. Указанная поверхность представляет собой прерывистый эпитоп, распознаваемый EV1019. Поскольку обе области необходимы для высокоаффинного связывания EV1019, то прерывистый эпитоп должен состоять из аминокислот, которые представлены в вариантах 4 и 5, которые лежат в непосредственной близости друг к другу и находятся на одной или близкой поверхности (и поэтому затрагивают «выставленные» на поверхности аминокислотные остатки) GM-CSF. Эти аминокислоты представляют собой 60-63 (ELYK) и 78-87 (TMMASHYKQH) (SEQ ID NO:3) соответственно. Возможно участие в этом также аминокислоты 76 (Р). Маловероятно, что аминокислоты 68-69 (SL) в химере 4 играют важную роль в связывании эпитопа из-за большого расстояния от поверхности раздела между химерми 4 и 5, однако это нельзя полностью исключать.

Вестерн-блоттинг химер GM-CSF с использованием EV1018 позволил установить, что для химер 4, 5 и 11 характерно слабое связывание, в то время как для химеры 8 продемонстрировано практически полное отсутствие связывания. Химера 11 представляет собой комбинацию химер 1 и 5, а химера 8 представляет собой комбинацию химер 4 и 5. Таким образом, все химеры, содержащие мышиные аминокислоты в положениях, в которых они присутствуют в химерах 4 или 5, характеризуются слабым связыванием с EV1018. Химера 8, которая содержит комбинацию мышиных аминокислот в положениях, в которых они присутствуют в химерах 4 или 5, перестает распознаваться EV1018. Таким образом, комбинация химер 4 и 5 представляет собой эпитоп EV1018. Пространственное картирование химер 4 и 5 на 3-мерной кристаллической структуре GM-CSF продемонстрировало, что эти химеры расположены по соседству друг с другом на поверхности молекулы GM-CSF, что очень хорошо согласуется с этими результатами. Указанная поверхность представляет собой прерывистый эпитоп, распознаваемый EV1018. Поскольку обе области необходимы для высокоаффинного связывания EV1018, прерывистый эпитоп должен состоять из аминокислот, которые представлены в вариантах 4 и 5, которые лежат в непосредственной близости друг к другу и находятся на одной или близкой поверхности (и поэтому затрагивают «выставленные» на поверхности аминокислотные остатки) GM-CSF. Эти аминокислоты представляют собой «ELYK» и «TMMASHYKQH» соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что EV1018 и EV1019 распознают один и тот же прерывистый эпитоп молекулы GM-CSF, a EV1003 распознает эпитоп в молекуле GM-CSF, отличный от эпитопа, распознаваемого EV1018 и EV1019.

1. Выделенное моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат:
(а) тяжелую цепь, включающую V_H-CDR1-содержащую последовательность, V_H-CDR2-содержащую последовательность и VH-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой SYGMH (SEQ ID NO:4),
(II) V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5), и
(III) V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6); и
(б) легкую цепь, включающую V_L-CDR1-содержащую последовательность, V_L-CDR2-содержащую последовательность и V_L-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
(I) V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7),
(II) V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и
(III) V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9).

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с человеческим GM-CSF характеризуется значением K_D, составляющим менее 400 пМ.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует активность hGM-CSF, при этом значение IC₅₀ для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет менее 100 пМ при определении с помощью анализа пролиферации TF-1-клеток при концентрации, соответствующей ED₈₀.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1 или 2, тяжелая цепь которого выбрана из группы, включающей гамма 1 (γ1), гамма 2 (γ2), гамма 3 (γ3) и гамма 4 (γ4).

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где тяжелая цепь представляет собой гамма 1-цепь (γ1).

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где легкая цепь представляет собой легкую лямбда-цепь.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-6, где тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 51.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где тяжелая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51.

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-8, где легкая цепь имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по пп.1-6, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 348 или SEQ ID NO: 361, и где последовательность вариабельной области легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 365.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 361.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-6, где последовательность тяжелой цепи представлена в SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 51, и где последовательность легкой цепи представлена в SEQ ID NO: 36.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где последовательность тяжелой цепи антитела представлена в SEQ ID NO: 51.

14. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или нарушения, связанных со сверхэкспрессией hGM-CSF, содержащая терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по одному из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Фармацевтическая композиция по п.14, предназначенная для применения в качестве лекарственного средства.

16. Фармацевтическая композиция по п.14, предназначенная для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума.

17. Набор, представляющий собой лекарственное средство для лечения заболевания или нарушения, связанных со сверхэкспрессией hGM-CSF, который содержит: (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13 и (б) один или несколько контейнеров, содержащий(их) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

18. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело к hGM-CSF или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13.

19. Выделенная нуклеиновая кислота по п.16, где нуклеиновая кислота представляет собой ДНК.

20. Экспрессионный вектор, содержащий ДНК по п.19.

21. Клетка-хозяин для экспрессии моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-13, содержащая вектор по п.20, где вектор представляет собой экспрессионный вектор.

22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства.

23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по одному из пп.1-13, предназначенные для лечения заболевания или нарушения, ассоциированного со сверхэкспрессией hGM-CSF у индивидуума.

24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент вводят индивидууму в дозе, не превышающей 500 мг.

25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23 или 24, где заболевание или нарушение выбрано из группы, включающей хроническое обструктивное заболевание легких ХОЗЛ, астму, бронхиальную астму, педиатрическую астму, серьезную астму, острые приступы астмы и хронический бронхит; муковисцидоз, интерстициальное легочное заболевание, ринит, артрит и родственные артропатии, ревматоидный атрит, псориаз, миелоидный лейкоз и рассеянный склероз.

26. Способ получения моноклонального антитела к hGM-CSF или его антигенсвязывающего фрагмента по п.1, которое/который связывается с hGM-CSF, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере V_H-CDR1-содержащую последовательность, V_H-CDR2-содержащую последовательность, V_H-CDR3-содержащую последовательность, V_L-CDR1-содержащую последовательность, V_L-CDR2-содержащую последовательность и V_L-CDR3-содержащую последовательность, в клетке-хозяине, заключающийся в том, что:
(I) получают клетку-хозяина, содержащую по меньшей мере одну последовательность ДНК, которая кодирует по меньшей мере V_H-CDR1-содержащую последовательность, V_H-CDR2-содержащую последовательность, V_H-CDR3-содержащую последовательность, V_L-CDR1-содержащую последовательность, V_L-CDR2-содержащую последовательность и V_L-CDR3-содержащую последовательность, в которых:
V_H-CDR1-содержащая последовательность представляет собой SYGMH (SEQ ID NO: 4),
V_H-CDR2-содержащая последовательность представляет собой LTYHHGNRKFYADSVRG (SEQ ID NO: 5),
V_H-CDR3-содержащая последовательность представляет собой ESMGAINDN (SEQ ID NO: 6),
V_L-CDR1-содержащая последовательность представляет собой IGNNNNIGSHAVG (SEQ ID NO: 7).
V_L-CDR2-содержащая последовательность представляет собой GRSPPS (SEQ ID NO: 8) и
V_L-CDR3-содержащая последовательность представляет собой STWDSSLSAVV (SEQ ID NO: 9); и
(II) культивируют клетку-хозяина в условиях, пригодных для экспрессии ДНК, и получают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.