Способ определения природных аминокислот в составе белков пищевых продуктов


 

G01N1/18 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2517628:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (RU)

Изобретение относится к области анализа биологической ценности объектов пищевого и медицинского назначения, в частности животного сырья и продукции на его основе, и может быть использовано в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, а также сельском хозяйстве. Изобретение направлено на ускорение процесса выделения аминокислот из пищевого продукта и повышение точности определения за счет сокращения потерь и применения высокочувствительного материала, что достигается применением способа, предусматривающего кислый гидролиз образца, фильтрацию и хроматографическое разделение гидролизата с последующей автоматической идентификацией и количественной оценкой содержания аминокислот на автоматическом анализаторе. Изобретение позволяет определить аминокислоты в составе белков пищевого продукта при их содержании порядка 0,1-3,5 г/100 г продукта (1,5-17 г/100 г белка) с применением последовательного элюирования аминокислот смесью буферных растворов и одновременным детектированием компонентов при двух длинах волн 440 и 570 нм. 2 табл.

 

Изобретение относится к области анализа биологической ценности объектов пищевого и медицинского назначения, в частности животного сырья и продукции на его основе, и может быть использовано в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, а также сельском хозяйстве.

Известны разные методы определения состава аминокислот в белках. Наиболее часто используют метод классической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который дает возможность осуществлять разделение и идентификацию большинства аминокислот в смеси, однако недостаточная специфичность метода не позволяет проводить полное дифференцирование всех 20-ти природных аминокислот, в частности не происходит полное разделение и соответствующая идентификация серина от валина, фенилаланина от пролина и некоторых др. пар аминокислот, имеющих близкую хроматографическую подвижность в условиях ВЭЖХ [Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Коллаген: получение, свойства и применение: монография. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007].

Известен также способ повышения точности определения последовательности аминокислотных остатков биополимеров по данным масс-спектрометрического анализа с использованием вычислительной системы [Патент RU №2408011 C2]. Метод отличается точностью, но является сложным по техническому осуществлению и требует применения дорогостоящего масс-спектрометрического детектирования.

Известен способ идентификации 11-16 аминокислот методом капиллярного электрофореза [Патент RU №2346931 C1], однако указанный способ не позволяет определять весь спектр природных аминокислот.

Наиболее близким к заявленному является способ разделения основных аминокислот, который заключается в том, что аминокислоты разделяют двумерной тонкослойной хроматографией и последовательным использованием двух новых хроматографических систем растворителей: изопропиловый спирт - ацетон - 24-25% раствор аммиака - вода в соотношении (19,0-27,0):(20,0-26,0):(3,0-6,5):(6,0-10,0) (по объему) и хлороформ - этанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении (23,0-27,0):(13,5-16,0):(1,3-3,5) (по объему). Для детектирования аминокислот используют нингидриновый реактив и дополнительно реактивы Эрлиха или Несслера [Заявка RU №94028253 A1, кл. G01N 30/02]. Способ является трудоемким и не позволяет осуществлять быструю идентификацию в автоматической режиме.

Технической задачей заявленного изобретения является ускорение процесса выделения аминокислот из пищевого продукта и повышение точности определения за счет сокращения потерь и применения высокочувствительного материала.

Поставленная задача решается в способе, предусматривающем кислый гидролиз образца, фильтрацию и хроматографическое разделение гидролизата с последующей автоматической идентификацией и количественной оценкой содержания аминокислот на автоматическом анализаторе.

Технический результат заключается в определении аминокислот в составе белков пищевого продукта при их содержании порядка 0,1-3,5 г/100 г продукта (1,5-17 г/100 г белка) с применением последовательного элюирования аминокислот смесью буферных растворов и одновременным детектированием компонентов при двух длинах волн 440 и 570 нм.

Заявляемый способ определения осуществляют по следующей методике.

Анализ содержания аминокислот выполняют на аминокислотном анализаторе, в который вводят гидролизат пищевого продукта. Для разделения аминокислот используют буферную систему компонентов A-F, состав буферных растворов указан в табл.1. pH буферных растворов предварительно устанавливают с помощью ортофосфорной кислоты и гидрооксида натрия, растворы перед введением в анализатор подвергают фильтрованию через фторопластовый фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Таблица 1
Состав буферных растворов
Наименование A B C D F
pH 3,3 3,6 4,5 11,0 11,0
Нормальность 0,10 0,10 0,10 0,25 0,3
Ацетат натрия, г 8,2 8,2 8,2 8,2 0
Метанол, мл 75 0 0 0 0
Муравьиная кислота, мл 3,0 3,0 2,0 1,2 0
Уксусная кислота, мл 15,0 20,0 1,5 5,0 0
Борная кислота, г 0 0 0 2,0 0
Этилендиаминтетраацетата динатриевая соль, г 0 0 0 0,5 0
Гидроксид натрия, г 0 0 0 6,0 12,0
Каприловая кислота, мкл 100 100 100 100 100
Вода деионизированная для ВЭЖХ, л до 1 до 1 до 1 до 1 до 1

Принцип определения аминокислот заключается в следующем. 20 мкл анализируемой пробы помещают в пластиковый сосуд, который устанавливают в поворачивающийся штатив автоматического термостатированного инжектора. Закол пробы осуществляется в соответствии с программой после промывки и регенерации хроматографической колонки, имеющей температуру 47°C и заполненной ионообменником - катионитом с карбоксильными ионогенными группами в Na+-форме. Подача элюента осуществляется по капиллярным шлангам высокого давления с внутренним диаметром 0,2 мм. Разделение аминокислот осуществляется автоматически в соответствии с заданной программой (табл.2). После разделительной колонки раствор поступает в термостатированный реактор для проведения цветной реакции. Подача в реактор нингидринового раствора, содержащего: 15 г/л нингидрина, 0,55 г/л гидридантингидрата, 1% метилцеллозольва, 10% метанола в 0,1 M ацетатном буфере pH 4,8, позволяет при температуре реактора 125°C осуществлять цветную реакцию анализируемых и прошедших аминокислот с нингидрином. Далее окрашенный раствор с комплексом аминокислот с нингидрином подается насосом в УФ детектор. Регистрацию аминокислот, связанных в комплексе с нингидрином, осуществляют автоматически одновременно при 570 нм, пролин анализируют при 440 нм, т.к. это является максимальной абсорбцией для данных определяемых аминокислот.

Работа анализатора выполняется по программе, предусматривающей одновременное ступенчатое изменение вида буфера и температуры хроматографической колонки на каждой стадии. Стандартное время анализа от момента ввода пробы до завершения выхода последнего пика, соответствующего аргинину, составляет 50 минут при скорости подачи элюента 0,2 мл/мин.

Таблица 2
Программа анализа аминокислот (P в колонке 50 атм, поток 0,2 мл/мин)
1 2 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Время, мин 12,0 5,5 7,5 9,0 3,0 11,0 9,0 8,0 0,1 8,0 4,0 6,1 0,4
Ввод образца X
Нингидриновый буфер X X X X X X X X
Буфер A X X
Буфер B X
Буфер C X X
Буфер D X X X
Буфер F X X X X X
Температура колонки, °C 47 47 48 48 49 52 56 60 60 70 70 55 55

Используемый метод позволяет определять с точностью ±(5-10)% наличие всех природных аминокислот с минимальным уровнем их содержания в растворе (0,500±0,006) мкмоль/мл. Минимальный интервал надежного определения сигнала аминокислот, составляющий >200 мВ, получают для концентрации >0,3 мкг/мл взятого на анализ белка в пробе.

Пример. 0,1 г образца (пищевого продукта или белка неизвестного состава с содержанием белкового компонента более 20%) обрабатывают 6 M раствором HCl в количестве 1 мл при температуре 120°C в течение 24 ч в атмосфере Ar, полученный гидролизат смешивают с 5 мл буфера с pH 2,2, содержащим: цитрата натрия 9,8 г, концентрированной HCl 8,3 мл, тиодигликоля 1 мл и каприловой кислоты 50 мкл на литр, фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм и вводят в анализатор аминокислот.

По завершении автоматического анализа получают хроматограмму, содержание аминокислоты (X) в мкМ/мл (или в мг/мл, %, условных машинных единицах или мм по высоте или площади пиков в соответствии с заданной автоматической градуировкой обсчета хроматограмм) осуществляют автоматически по формуле: X=S1/S2·C, где S1 - площадь пика определяемой аминокислоты на аминограмме; S2 - площадь пика той же аминокислоты в стандартной смеси; C - концентрация аминокислоты в стандартной смеси, мкМ/мл. В качестве градуировки используют стандартный раствор, содержащий по 2,5 мкМоль/мл ASP, THR, GLU, PRO, GLY, ALA, CYS, VAL, MET, ILEY, LEY, TYR, PHE, HIS, LYS, TRP и ARG. Результаты определения рассчитывают до второго десятичного знака и округляют до первого десятичного знака после запятой.

Способ определения состава и содержания аминокислот в белках пищевых продуктов, включающий кислотный гидролиз образца, фильтрацию, хроматографическое разделение с последующей идентификацией и количественной оценкой аминокислот, отличающийся тем, что хроматографическое разделение с последующей идентификацией и количественной оценкой аминокислот в концентрации 0,5 мкмоль/мл в растворе смеси первоначально осуществляют в системе буферных растворов переменного состава с повышающейся нормальностью от 0,1 до 0,3 на хроматографической колонке с катионитом с карбоксильными ионогенными группами в Na+-форме в интервале повышающихся температур от 47 до 70°C, затем в буфере с нормальностью 0,1 в интервале понижающихся температур 70-55°C с одновременным детектированием разделенных на выходе аминокислот в виде цветного комплекса с нингидрином при двух длинах волн 440 и 570 нм в автоматическом режиме.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения массовой доли яблочного пюре в мармеладе или желейном корпусе конфет. Для этого проводят взвешивание образца мармелада или корпуса желейной конфеты.
Предложен экспрессный, безопасный и экономичный способ определения микотоксинов в продуктах животного и растительного происхождения. Определение проводят из 2 г пробы, очищенный экстракт по QuEChERS делят на три части по 2 мл и используют в качестве диспергатора 300 мкл хлороформа в дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции.

Изобретение относится к области экологии и предназначено для экологической проверки продуктов питания на предмет их химической безопасности для человеческого организма.

Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано для определения массовой доли амидированного пектина в мармеладе. Для этого готовят градуировочные растворы.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу специфического отбора высокоаффинных молекул ДНК (ДНК-аптамеров) к рекомбинантному белку-мишени. Указанный способ включает синтез единой полипептидной цепи рекомбинантного белка, содержащего в своем составе фрагмент глютатион-S-трансферазы, целевой белок-мишень, пептидную последовательность, расщепляемую летальным фактором B.

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно при получении водного раствора меда. Способ предусматривает нагрев дистиллированной воды до температуры кипения.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и может быть использована для определения уровня токсикантов в воде, продуктах питания или физиологических жидкостях.

Настоящее изобретение относится к табачной промышленности. Предлагаемый способ предназначен для определения содержания хлора в табачном сырье и мешке курительных изделий.

Изобретение относится к технике определения качественных показателей кофейных напитков и может быть использовано в пищеконцентратной промышленности. Способ характеризуется тем, что используют анализатор запахов с методологией «электронный нос», в котором в качестве измерительного массива применяют 7 сенсоров на основе пьезокварцевых резонаторов объемно-акустических волн с базовой частотой колебаний 10,0 МГц и разнохарактерными пленочными сорбентами на электродах, пробы напитков термостатируют при комнатной температуре, отбирают среднюю пробу объемом 50 см3, отстаивают ее, помещают в герметичный стеклянный сосуд с полимерной мягкой мембраной, выдерживают при постоянной температуре 20±2°C в течение 30 минут, индивидуальным для каждой пробы шприцем отбирают 2 см3 равновесной газовой фазы и вводят в ячейку детектирования, фиксируют частоту колебаний пьезокварцевых резонаторов равномерно через 1 с в течение 120 с, формируют суммарный аналитический сигнал в виде «визуальных отпечатков» максимумов и с помощью программного обеспечения прибора сравнивают с эталонными «визуальными отпечатками», полученными при анализе кофейных напитков для четырех различных социальных групп, приготовленных в точном соответствии с рецептурами из сырья, обжаренного при точном соответствии технологических параметров заданным, устанавливая степень их сходства с каким-либо эталоном из базы данных по кофейным напиткам, составляет более 95%, то делают вывод о принадлежности исследуемого напитка к этой группе, если степень сходства составляет 90-95%, то исследуемый напиток изготовлен из сырья с отличающимися от эталона свойствами, если степень соответствия менее 90%, то напиток не принадлежит к выбранной группе и его сравнивают с эталоном для другой социальной группы; по максимальным сигналам отдельных сенсоров судят о соответствии содержания отдельных веществ в образце эталону: сигнал сенсора с покрытием полидиэтиленгликоль сукцинат (ПДЭГСк) характеризует содержание аминов, сигнал сенсора с покрытием полиэтиленгликоль фталат (ПЭГфт) характеризует содержание сложных эфиров, сигнал сенсора с покрытием полиэтиленгликоль (ПЭГ-2000) характеризует содержание спиртов; если сигналы этих сенсоров в анализируемой пробе соответствуют с погрешностью ±2 Гц их сигналам для стандартной пробы, то содержание спиртов, сложных эфиров, аминов можно считать идентичным эталону.

Изобретение относится к области пищевой промышленности, в частности к способу и устройству определения зрелости икры. Икру (W) погружают на загрузочный лоток (6), направляют свет от светового излучателя (11) на икру (W) и изображение, по меньшей мере, части икры (W) в состоянии облучения светом от светового излучателя (11) икры (W) снимают с помощью устройства для съемки изображений (12).

Изобретение относится к погружному зонду для расплавов железа или стали с несущей трубкой с погружным концом и окружной боковой поверхностью, причем зонд может быть выполнен в качестве пробоотборника для шлака, находящегося на расплаве железа или стали.

Изобретение относится к области охраны труда и техники безопасности в угольной и других областях промышленности, связанных с загрязнением атмосферы (газа) твердыми частицами, и, в частности, к пылеизмерительным приборам - аспираторам воздуха.

Изобретение относится к испытательной технике. Призматический образец имеет форму призмы, продольную и поперечную плоскости симметрии, два боковых выступа, расположенных продольно, по концам призмы - опорные поверхности, а в центральной ее части - поверхность нагружения поперечной испытательной нагрузкой.

Изобретение относится к медицинскому контейнеру для сбора и хранения проб, в частности к модифицированному многофункциональному пробоотборному контейнеру. Контейнер содержит корпус (1), крышку (2), расположенную на отверстии корпуса (1), фиксированный вращаемый стержень (4), установленный на крышке (2) с возможностью свободного вращения относительно крышки (2), и заборную ложку (5), расположенную в нижней части указанного фиксированного вращаемого стержня (4).

Группа изобретений относится к устройству и способу улавливания биологических частиц, взвешенных в жидкой среде, для приготовления биологических образцов, предназначенных для проведения цитологического анализа, способу приготовления цитологического препарата с использованием данного устройства, а также к платформе и системе для мультианализа, включающих данное устройство.
Изобретение относится к области разработки биокатализаторов, предназначенных для использования в составе биологических фильтров для очистки газов, и может быть использовано для проведения лабораторных экспериментов с образцами биокатализаторов, осуществляющих удаление из воздуха летучих компонентов натурального табачного сырья, а также для создания селективных условий в процессе выделения и исследования микроорганизмов, составляющих биологически активную компоненту данного типа биокатализаторов.

Изобретение предназначено для применения в химической промышленности, агропромышленном комплексе, производстве строительных материалов и других отраслях. Способ определения коэффициента неоднородности смеси трудноразделимых сыпучих материалов включает подсчет числа проб, минимально допустимого веса пробы, отбор проб смеси и ее компонентов.
Изобретение относится преимущественно к горно-обогатительной отрасли промышленности в части разработки технологических процессов и оборудования и может быть использовано при опробовании пульпы в системе контроля качества для подготовки продуктов к анализу.

Группа изобретений относится к системе и к способу охарактеризовывания частиц в потоке продуктов помола зерна в установке для его помола, где охарактеризовывание включает в себя охарактеризовывание частиц зерна по размеру.

Изобретение относится к диагностике состояния желудочно-кишечного тракта птицы и может быть использовано для определения дисбиоза по составу равновесной газовой фазы над пробами помета.

Изобретение относится к применению пептида, имеющего последовательность, имеющую происхождение из аминокислотной последовательности белка SNAP-25, для лечения боли и/или воспаления.
Наверх