Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой (варианты)

Изобретение относится к области получения рекомбинантных белков и касается способов их получения. Представлены способы получения антител, включающие: культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; подпитку клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток, где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей. Представленными способами возможно получать, в частности, такие антитела, как анти-TNFα-антитело или анти-IL-12-антитело. Охарактеризованное решение позволяет получить повышенное количество антител и может быть использовано в фармацевтической промышленности. 3 н. и 25 з.п. ф-лы, 46 табл., 4 пр., 1 ил.

 

Родственные заявки

Эта заявка заявляет приоритет предварительной заявки США № 60/845158, поданной 13 сентября 2006 года, и предварительной заявки США № 60/876374, поданной 21 декабря 2006 года. Содержания каждого из вышеуказанных приоритетных документов включены посредством ссылки.

Уровень техники

Технология рекомбинантных ДНК обеспечила средства для получения белков в количествах, которые позволяют применять их в некотором спектре применений, включающих в себя терапевтические, диагностические, сельскохозяйственные и исследовательские цели.

Одной задачей получения рекомбинантных белков является оптимизация сред и условий культур клеток для получения наибольшего количества белка и наиболее эффективных способов продуктивности. Любое усовершенствование, в том числе постепенные усовершенствования, могут иметь огромные экономические выгоды. В фармацевтической промышленности, оптимизация получения белков для биологических веществ, используемых в терапии для лечения заболевания, является выгодной, так как любое усовершенствование может оказывать существенное влияние при производстве этого биологического вещества в большом масштабе. Вследствие этого остается потребность в максимизации получения белков из культур клеток, экспрессирующих биологические белки, для применения в медицине.

Обычно, культура клеток млекопитающих основывается на коммерчески доступных композициях сред, в том числе, например, DMEM или HAM F12. Часто композиции сред являются недостаточно обогащенными для поддержания как роста клеток, так и экспрессии биологических белков. Остается потребность в усовершенствованных культуральных средах, добавках и способах культивирования клеток для усовершенствованного получения белков.

Сущность изобретения

Данное изобретение обеспечивает способы и композиции для усовершенствования экспрессии белка в культуре клеток, в частности в культуре клеток млекопитающих. Это изобретение относится к усовершенствованным средам культуры клеток, оптимизированным для экспрессии белков.

Это изобретение включает в себя также оптимизированные способы и композиции сред для высокой экспрессии белков в культуре клеток млекопитающих. В частности, среду культуры клеток оптимизируют для экспрессии антител в культуре клеток млекопитающих, например, клеток СНО. Обеспечены также усовершенствованные способы с подпиткой и композиции для усиления продуцирования белков добавлением растворов-добавок, например, содержащих гидролизат растворов и концентрированных растворов базальных (минимальных) сред.

Данное изобретение обеспечивает усовершенствованные бессолевые базальные среды для выращивания для применения в культуре клеток млекопитающих. Это изобретение включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую Часть А, Часть В и Часть С, где Часть А состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; Часть В состоит по существу из неорганического источника железа; и Часть С содержит рекомбинантный фактор роста; буфер; регулятор осмолярности; источник энергии и по меньшей мере два различных гидролизата из сырья не животного происхождения.

В одном варианте осуществления, Часть А дополнительно содержит ионы цветных металлов, витамины или их комбинации. В одном варианте осуществления, неорганическим источником железа Части В является цитрат трехвалентного железа, например, цитрат трехвалентного железа с конечной концентрацией раствора приблизительно 100-150 мг/л или 0,1-1 мМ. В другом варианте осуществления, неорганическим источником железа Части В является цитрат трехвалентного железа, например цитрат трехвалентного железа с конечной концентрацией раствора приблизительно 122,5 мг/л или 0,5 мМ.

В одном варианте осуществления, рекомбинантный фактор роста Части C выбран из группы, состоящей из инсулина или рекомбинантного аналога, IGF-1, и комбинации инсулина и IGF-1, например, приблизительно 4 мг/л - 13 мг/л инсулина или его рекомбинантного аналога.

В одном варианте осуществления, буфером, который исключен из модифицированной базальной среды, является буфер HEPES.

В одном варианте осуществления, буфер Части С содержит фосфатный буфер, HEPES и бикарбонат натрия, например, приблизительно 0,1-3 г/л бикарбоната натрия, приблизительно 0,1-3 г/л HEPES. В одном варианте осуществления, буфер Части С содержит 1,6 г/л бикарбоната натрия и/или приблизительно 1,8 г/л HEPES. В одном варианте осуществления, фосфатный буфер содержит приблизительно 0,01-0,5 г/л одно- и двухосновных фосфатов натрия.

В дополнительном варианте осуществления, Часть С дополнительно содержит аспарагин, глутамин или глутамин и аспарагин.

В одном варианте осуществления, регулятором осмолярности Части С является NaCl, например, приблизительно 1,0-6,4 г/л NaCl.

В одном варианте осуществления, источником энергии Части С является моносахарид, например, глюкоза (например, D-глюкоза), мальтоза, манноза, галактоза и фруктоза. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения содержит не более приблизительно 7,0 г/л глюкозы.

В другом варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения содержит по меньшей мере два разных гидролизата продуктов, не относящихся к продуктам животного происхождения, Части С, которые являются гидролизатом продуктов растительного происхождения и гидролизатом, который не является ни гидролизатом продуктов животного происхождения, ни гидролизатом продуктов растительного происхождения. Примером гидролизата продуктов растительного происхождения, который может быть использован в этом изобретении, является гидролизат сои. Примером гидролизата, который не является ни гидролизатом продукта животного происхождения, ни гидролизатом продуктов растительного происхождения, является гидролизат дрожжей.

В одном варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения дополнительно содержит метотрексат. Еще в одном варианте осуществления, среда культуры клеток дополнительно содержит приблизительно 100 нМ-5000 нМ метотрексат.

Еще в одном варианте осуществления, среда культуры клеток дополнительно содержит протектор клетки или поверхностно-активное вещество. Примером поверхностно-активного вещества, которое может быть использовано в среде культуры клеток этого изобретения, является метилцеллюлоза или плюроник-полиол, например Плюроник F-68. В одном варианте осуществления, эта культуральная среда содержит приблизительно 0,1-5 г/л Плюроника F-68. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток содержит приблизительно 1,0 г/л Плюроника F-68.

В еще одном варианте осуществления этого изобретения, среда культуры клеток дополнительно содержит L-глутамин.

В одном варианте осуществления, среда культуры клеток имеет рН в диапазоне 7,1-7,3.

В другом варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения имеет осмолярность в диапазоне от приблизительно 320 до 450 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую: базальную среду; приблизительно 8-12 мл/кг или 116-126 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 2-5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,01-0,05 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; и приблизительно 1,0-3,0 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток содержит базальную среду; приблизительно 10,0 мл/кг или 122 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4,0 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 3,5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,03 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; и приблизительно 2,0 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток состоит по существу из базальной среды; приблизительно 10,0 мл/кг или 122 мг/л цитрата трехвалентного металла; приблизительно 4,0 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 3,5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,03 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O и приблизительно 2,0 г/кг гидролизата дрожжей.

Это изобретение дополнительно обеспечивает бессывороточную среду культуры клеток, состоящую по существу из базальной среды; приблизительно 8-12 мл/кг или 116-126 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 2-5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,01-0,05 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O и приблизительно 1,0-3,0 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, эта культура клеток состоит по существу из базальной среды; приблизительно 8-12 мл/кг или 116-126 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 2-5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 0,01-0,05 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O и приблизительно 1,0-3,0 г/кг гидролизата дрожжей.

В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток дополнительно содержит приблизительно 2,50 мл/кг метотрексата.

Это изобретение включает в себя также способ получения белка, предусматривающий культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, в культуральной среде этого изобретения; и перенос этой культуры в продукционную среду культуры клеток, так что продуцируется этот белок.

В одном варианте осуществления, белком является антитело, например, D2E7 (адалимумаб).

Это изобретение дополнительно обеспечивает бессывороточную продукционную среду культуры клеток, содержащую: модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-0,7 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей; и приблизительно 60-70 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда для культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-0,7 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей; и приблизительно 60-70 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, эта продукционная среда культуры клеток содержит базальную среду, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,0 мл/кг или 12 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,4-2,5 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение дополнительно обеспечивает бессывороточную среду культуры клеток, содержащую: модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 6-8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-2 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 6-8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-2 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 0,4-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/кг цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,8-0,9 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,6-2,7 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 0,45 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 4,0 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2,6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение также включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,8-0,9 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,3-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1,0 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-10 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3-5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,8-0,9 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,3-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1,0 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,87-0,88 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,45 г/кг моногидрата аспарагина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,67-2,68 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 4,0 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2,6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение включает в себя бессывороточную среду культуры клеток, содержащую базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 150-250 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; и приблизительно 5-15 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, среда для культуры клеток состоит по существу из базальной среды для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 150-250 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; и приблизительно 5-15 г/кг гидролизата дрожжей. В следующем варианте осуществления среда для культуры клеток содержит базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 200 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29-0,30 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; и приблизительно 11 г/кг гидролизата дрожжей. В дополнительном варианте осуществления, этот белок является антителом, в том числе, например, полностью человеческим анти-IL-12-антителом, например ABT-874.

Это изобретение включает в себя также бессывороточную среду культуры клеток, содержащую базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 1-3 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия и приблизительно 1-4 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток состоит по существу из базальной среды для выращивания клеток; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 1-3 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия и приблизительно 1-4 г/кг гидролизата дрожжей. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит базальную среду для выращивания клеток; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 1,5 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,29-0,30 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия и приблизительно 2 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, pH этой среды культуры клеток равен приблизительно 7,10-7,30 и осмолярность находится в диапазоне приблизительно 300-340 мОсм/кг. Еще в одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит по меньшей мере 8 г/кг гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, белок, который продуцируется в клетке млекопитающего, например в клетке СНО, с использованием этой среды культуры клеток, является антителом, например анти-IL-12-антителом, или анти-ЕРО-R-антителом, например ABT-874.

Это изобретение обеспечивает дополнительно среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-l2 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2,5-4,5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,1-1 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-4 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂0; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 2,5-4,5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,5-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,1-1 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-4 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂0; приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного натрия; приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,87-0,88 г/кг L-глутамина; приблизительно 0,45 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,67 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 4,0 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2,6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение включает в себя также продукционную среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, которая модифицирована для удаления следующих компонентов: бикарбоната натрия, буфера HEPES, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, регулятора осмолярности, поверхностно-активного вещества и моносахарида глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток этого изобретения состоит по существу из модифицированной базальной среды, которая модифицирована для удаления следующих компонентов: бикарбоната натрия, буфера HEPES, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, регулятора осмолярности, поверхностно-активного вещества и моносахарида глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, продукционная среда содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,0 мл/кг или 12 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Другим аспектом этого изобретения является продукционная среда культуры клеток, содержащая модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; приблизительно 12-16 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 8-10 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрат трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 1-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; приблизительно 12-16 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 8-10 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В другом варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток этого изобретения содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,5 мл/кг или 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 14,2-14,3 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 9,2-9,3 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток имеет pH приблизительно 6-8. В другом варианте осуществления, среда культуры клеток имеет pH приблизительно 7,10-7,20.

В одном варианте осуществления, эта среда культуры клеток имеет осмоляльность приблизительно 350-450 мОсм/кг. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток имеет осмоляльность приблизительно 373-403 мОсм/кг.

Среда культуры клеток этого изобретения может дополнительно содержать метотрексат. В одном варианте осуществления, среда культуры клеток дополнительно содержит метотрексат, например, приблизительно 1-10 мл/кг. В другом варианте осуществления, эта среда культуры клеток дополнительно содержит метотрексат, например, приблизительно 2,50 мл/кг.

В одном варианте осуществления, белком, который экспрессируется в этой культуре клеток, является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. В одном варианте осуществления, антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, является анти-TNFα-антитело или анти-EPO-R-антитело. В другом варианте осуществления, анти-TNFα-антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, является полностью человеческое анти-TNFα-антитело, в том числе, например, полностью человеческое анти-TNFα-антитело D2E7 (адалимумаб). Еще в одном варианте осуществления, антителом, или его антигенсвязывающим фрагментом, является анти-IL-12- или анти-IL-18-антитело, в том числе полностью человеческое анти-IL-12- или анти-IL-18-антитело.

Это изобретение включает в себя также способ получения белка, например антитела или его антигенсвязывающей части, предусматривающий культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую этот белок, например антитело, в представленной здесь среде культуры клеток. В одном варианте осуществления, этой средой культуры клеток является продукционная среда культуры клеток. Примеры антител, или их антигенсвязывающих фрагментов, которые могут быть получены с использованием способов и композиций этого изобретения, включают в себя анти-IL-18-антитело, анти-TNFα-антитело, анти-IL-12-антитело и анти-EPO-рецептор-(EPO-R)-антитело.

В одном варианте осуществления, это изобретение дополнительно предусматривает выделение этого белка из среды культуры клеток, например продукционной среды культуры клеток, описанной здесь.

В одном варианте осуществления, среды культуры клеток и способы этого изобретения предназначены для культивирования клеток млекопитающих, в том числе клеток яичника китайского хомячка (СНО).

Это изобретение включает в себя также клетку яичника китайского хомячка (СНО) в любой из описанных здесь сред культуры клеток.

Это изобретение обеспечивает также усовершенствованный способ культуры с подпиткой и соответствующие среды культуры клеток для получения белков в культуре клеток млекопитающего, например клеток СНО. Один аспект этого изобретения является способом с подпиткой получения белка, предусматривающий культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и фидинг (подпитку) этих клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к этой культуре клеток на протяжении некоторого периода времени, причем обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется этот белок.

В одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды содержит концентрированную базальную среду. В другом варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу. Еще в одном варианте осуществления, базальной средой является среда PF CHO.

В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного происхождения или не животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, гидролизатом, который получен из продуктов не растительного происхождения или не животного происхождения, является гидролизат дрожжей. В одном варианте осуществления, гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.

В одном варианте осуществления, белком, который продуцируется, является антитело, или его антигенсвязывающая часть. Примеры антител, или их антигенсвязывающих частей, которые могут быть использованы в способах культуры с подпиткой этого изобретения, включают в себя анти-TNFα-антитело, анти-IL-12-антитело, анти-IL-18-антитело и анти-EPO-рецептор (EPO-R)-антитело.

Это изобретение включает в себя способ с подпиткой получения анти-TNFα-антитела, в том числе, например, полностью человеческого анти-TNFα-антитела, такого как адалимумаб, предусматривающий культивирование клеток яичника китайского хомячка (СНО), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNFα-антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и фидинг (подпитку) этих клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток на протяжении некоторого периода времени, причем обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и причем обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется анти-TNFα-антитело. Это изобретение описывает также способ с подпиткой получения анти-TNFα-антитела, предусматривающий культивирование клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNFα-антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток, содержащую по меньшей мере 1-5 г/л, например, 2,0 г/л глюкозы, причем концентрация глюкозы регулируется добавлением глюкозы к продукционной среде по мере необходимости для поддержания концентрации по меньшей мере 1-5 г/л, например, 2,0 г/л глюкозы; и фидинг (подпитку) клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток на протяжении некоторого периода времени, причем обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и причем обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется анти-TNFα-антитело.

В одном варианте осуществления, это изобретение включает в себя дополнительно извлечение анти-TNFα-антитела.

Еще в одном варианте осуществления, культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°С, например при 35°С.

В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток поддерживается при диапазоне 20-65% растворенного кислорода, например при приблизительно 30% растворенного кислорода.

В одном варианте осуществления, осмолярность продукционной среды культуры клеток поддерживается на протяжении всего культивирования не выше 500 мОсм.

В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного происхождения или животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения. Еще в одном варианте осуществления, гидролизат, который получен из продуктов не растительного происхождения или животного происхождения, является гидролизатом дрожжей. Еще в одном варианте осуществления гидролизат продуктов растительного происхождения является гидролизатом сои. В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор состоит по существу из приблизительно 50-280 г/кг, например, 250-280 г/кг, гидролизата сои и приблизительно 75-300 г/кг, например, 150-180 г/кг, гидролизата дрожжей. В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор содержит приблизительно 50-280 г/кг, например, 250-280 г/кг, гидролизата сои и приблизительно 75-300 г/кг, например, 150-180 г/кг, гидролизата дрожжей.

В одном варианте осуществления, базальной средой является среда PF CHO.

В одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды имеет pH приблизительно 9,0-10,5.

Еще в одном варианте осуществления, период времени способа с подпиткой равен приблизительно 9-15 дням; или приблизительно 12 дням.

Еще в одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды добавляют в продукционную среду культуры клеток по меньшей мере в один из следующих дней этого периода времени: день 4, день 6, день 9 и день 11. В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор добавляют в продукционную среду культуры клеток в день 4, день 7 или день 4 и день 7 этого периода времени.

Еще в одном варианте, способы с подпиткой дополнительно предусматривают коррекцию рН продукционной среды культуры клеток в соответствии с линейным снижением рН, причем линейное снижение рН имеет начало с рН приблизительно 6,5-8, например 7,1-7,2, и получение конечного рН приблизительно 6,5-7,0, например 6,9. В одном варианте осуществления, линейное снижение pH корректируют на протяжении периода по меньшей мере приблизительно 24 часов. В другом варианте осуществления, линейное сползание pH корректируют на протяжении по меньшей мере приблизительно 48 часов. Еще в одном варианте осуществления, линейное снижение pH корректируют на протяжении периода приблизительно 72 часов.

Это изобретение включает в себя также применение описанной здесь среды культуры клеток в способе с подпиткой, например, продукционной среды культуры клеток, содержащей модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-10 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-3 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-0,1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток содержит модифицированную базальную среду; приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,0 мл/кг или 12 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение обеспечивает также способ с подпиткой получения анти-IL-12-антитела, такого как, например, полностью человеческое анти-IL-12-антитело (например, ABT-874), предусматривающий культивирование клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток, фидинг (подпитку) этих клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды в культуру клеток на протяжении некоторого периода времени, причем обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и причем обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется указанное анти-IL-12-антитело.

В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор содержит дополнительно глюкозу.

В одном варианте осуществления, это изобретение предусматривает также извлечение анти-IL-12-антитела.

В одном варианте осуществления, культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°C, например, при приблизительно 33°C.

В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток поддерживается при диапазоне 20-65% растворенного кислорода, например, при приблизительно 40% растворенного кислорода.

Еще в одном варианте осуществления этого изобретения, продукционная среда этого изобретения имеет pH приблизительно 6,7-7,2.

В дополнительном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат, который получен из продуктов не растительного происхождения или животного происхождения, и гидролизат продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, гидролизат, который получен из продуктов не растительного происхождения или животного происхождения, является гидролизатом дрожжей. Еще в одном варианте осуществления, гидролизат продуктов растительного происхождения является гидролизатом сои. Еще в одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор состоит по существу из приблизительно 50-225 г/кг, например, 150-180 г/кг, гидролизата сои; приблизительно 75-300, например, 250-280 г/кг, гидролизата дрожжей и приблизительно 1-5 г/л, например, 2-3 г/л, глюкозы. Еще в одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор содержит приблизительно 50-225 г/кг, например, 150-180 г/кг, гидролизата сои, приблизительно 75-300, например, 250-280 г/кг, гидролизата дрожжей и 1-5 г/л, например, 2-3 г/л, глюкозы. В одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу.

Еще в одном варианте осуществления обогащенный раствор базальной среды имеет рН приблизительно 9-10, например, приблизительно 9,7, и осмолярность приблизительно 1400-1500 мОсм. В дополнительном варианте осуществления, базальной средой в обогащенном растворе базальной среды является среда PF CHO.

В одном варианте осуществления, период времени способа с подпиткой равен 14-15 дням.

В одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды добавляют в продукционную среду культуры клеток каждый второй день, начиная с дня 5 этого периода времени.

В одном варианте осуществления этого изобретения, обогащенный гидролизатом раствор добавляют в продукционную среду культуры клеток каждый день, начиная с дня 6 этого периода времени. Еще в одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды и обогащенный гидролизатом раствор добавляют в продукционную среду культуры клеток каждый день, начиная с дня 5 этого периода времени.

Это изобретение включает в себя применение описанной здесь среды культуры клеток в способе с подпиткой, например, продукционной среды культуры клеток, содержащей модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 5-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина; приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1-2 г/кг HEPES; приблизительно 2-3 г/кг NaCl; приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 6-12 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток содержит приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,5 мл/кг или 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

В одном варианте осуществления, это изобретение описывает способы культивирования клеток в крупном масштабе. В одном варианте осуществления, крупномасштабная культура клеток является культурой, большей чем 10 л. В другом варианте осуществления крупномасштабная культура клеток имеет объем приблизительно 13 л.

Это изобретение обеспечивает также комбинированные подпитывающие растворы, которые являются предпочтительными, так как эти растворы обеспечивают комбинацию нутриентов в одном растворе. Это изобретение включает в себя комбинированный подпитывающий раствор, содержащий глюкозу; базальную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения. Это изобретение включает в себя также комбинированный подпитывающий раствор, состоящий по существу из глюкозы; базальной среды; аминокислоты, другой, чем глутамин; и по меньшей мере двух различных гидролизатов продуктов животного происхождения.

В одном варианте осуществления, этот подпитывающий раствор имеет pH приблизительно 6,0-8,0.

В одном варианте осуществления, комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 100-250 г/кг глюкозы. В одном варианте осуществления, комбинированный подпитывающий раствор содержит аминокислоту аспарагин, например приблизительно 1,0-15,0 г/кг аспарагина; или приблизительно 3,0-5,0 г/кг аспарагина.

В одном варианте осуществления, эти по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения в комбинированном подпитывающем растворе являются гидролизатом продуктов растительного происхождения и гидролизатом продуктов не животного происхождения или продуктов не растительного происхождения. В одном варианте осуществления, гидролизат, который является гидролизатом продуктов не животного происхождения или продуктов не растительного происхождения, является гидролизатом дрожжей. В одном варианте осуществления, гидролизат продуктов растительного происхождения является гидролизатом сои.

В одном варианте осуществления, комбинированный подпитывающий раствор содержит базальную среду, которая является либо средой PF-CHO, либо средой DMEM/F12. В одном варианте осуществления, базальная клеточная среда является модифицированной базальной средой, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество, глутамин и глюкоза.

Еще в одном варианте осуществления, комбинированный подпитывающий раствор дополнительно имеет мутность, меньшую чем приблизительно 15 NTU.

Это изобретение описывает способ поддержания постоянного уровня глюкозы продукционной среды культуры клеток, предусматривающий добавление комбинированных подпитывающих растворов, описанных здесь.

Другим аспектом этого изобретения является способ приготовления комбинированных подпитывающих растворов, содержащих базальную среду, глюкозу и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, предусматривающий а) объединение глюкозы и базальной клеточной среды в раствор; доведение рН раствора а) до 9,5-10,5; добавление по меньшей мере двух различных гидролизатов продуктов животного происхождения к раствору b); и коррекцию рН раствора c), так что комбинированный подпитывающий раствор имеет рН приблизительно 6,5-7,5. В одном варианте осуществления, стадия c) предусматривает добавление первого гидролизата, который является гидролизатом продуктов не животного происхождения или продуктов не растительного происхождения, и второго гидролизата продуктов растительного происхождения. В одном варианте осуществления, гидролизат, который является гидролизатом продуктов не животного происхождения или продуктов не растительного происхождения, является гидролизатом дрожжей. Еще в одном варианте осуществления, гидролизат продуктов растительного происхождения является гидролизатом сои.

Это изобретение обеспечивает далее способы увеличенного продуцирования белка, например антитела, или его антигенсвязывающих частей, из культуры клеток млекопитающих. Это изобретение обеспечивает способ получения по меньшей мере приблизительно 1,5 г/л антитела из культуры клеток млекопитающего, предусматривающий культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и добавление комбинированного подпитывающего раствора, имеющего рН приблизительно 6,7-7,2, в продукционную среду культуры клеток, причем комбинированный подпитывающий раствор содержит глюкозу; базальную клеточную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что продуцируется по меньшей мере приблизительно 1,5 г/л антитела. В одном варианте осуществления, продуцируются по меньшей мере 2 г/л антитела. В другом варианте осуществления, продуцируются по меньшей мере 4 г/л антитела. В другом варианте осуществления, продуцируются по меньшей мере 6 г/л антитела.

В одном варианте осуществления, комбинированный подпитывающий раствор содержит 100-250 г/кг глюкозы.

Это изобретение обеспечивает также способ увеличения титра антитела, полученного из культуры клеток млекопитающих, предусматривающий культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и добавление комбинированного подпитывающего раствора, имеющего рН приблизительно 6,7-7,2, в продукционную среду культуры клеток, причем комбинированный подпитывающий раствор содержит глюкозу; базальную клеточную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, так что титр полученного антитела является по меньшей мере на 50% большим, чем контрольной культуры клеток млекопитающих, которую культивируют в соответствии со стадией а) и с исключением стадии b). В одном варианте осуществления, титр полученного антитела по меньшей мере на 100% больше, чем в контроле. В другом варианте осуществления, титр полученного антитела по меньшей мере на 150% больше, чем в контроле.

В одном варианте осуществления, комбинированный подпитывающий раствор добавляют, когда плотность клеток достигает по меньшей мере 2,0×10⁶ клеток/мл. В одном варианте осуществления, комбинированный подпитывающий раствор добавляют, когда плотность клеток достигает по меньшей мере 3,5×10⁶ клеток/мл.

Это изобретение дополнительно обеспечивает способ получения белка, например антитела, или его антигенсвязывающей части, в культуре клеток млекопитающих, предусматривающий культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую этот белок, в продукционной среде культуры клеток; и добавление комбинированного подпитывающего раствора в продукционную среду культуры клеток с использованием системы регуляции с обратной связью для мониторинга уровня метаболического индикатора в продукционной среде культуры клеток, причем комбинированный подпитывающий раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток во временной точке, определенной системой регуляции с обратной связью, так что продуцируется антитело. В одном варианте осуществления, этим метаболическим индикатором является глюкоза или глутамин. В другом варианте осуществления, подпитывающий раствор является комбинированным подпитывающим раствором, содержащим глюкозу; базальную клеточную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения. В одном варианте осуществления, антитело является анти-TNFα-антителом, анти-IL-12-антителом, анти-IL-18-антителом и анти-EPO-рецептор (EPO-R)-антителом.

В одном варианте осуществления, с использованием способов этого изобретения получают титр антитела по меньшей мере 1,5 г/л. В другом варианте осуществления, получают титр антитела по меньшей мере 2 г/л.

В одном варианте осуществления этого изобретения, комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 3,0-12,5 г/кг аспарагина.

В одном варианте осуществления этого изобретения, комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 100-200 г/кг глюкозы.

Еще в одном варианте осуществления, это изобретение предусматривает мониторинг уровня глюкозы в среде культуры клеток, так что уровень глюкозы поддерживается в диапазоне приблизительно 0,25-20,0 г/л. В одном варианте осуществления, уровень глюкозы подвергают мониторингу с использованием автоматизированного устройства для взятия проб.

В одном варианте осуществления, антитело, или его антигенсвязывающую часть, которые продуцируются с использованием способов и композиций, описанных здесь, выбирают из группы, состоящей из анти-TNFα-антитела, анти-IL-18-антитела, анти-EPO-рецептор (EPO-R)-антитела и анти-IL-12-антитела. В одном варианте осуществления, антитело, или его антигенсвязывающая часть, является полностью человеческим антителом. В одном варианте осуществления, анти-TNFα-антителом является D2E7 (адалимумаб). В одном варианте осуществления, анти-IL-18-антителом является ABT-325. В одном варианте осуществления, анти-IL-12-антителом является ABT-874.

Это изобретение обеспечивает также способ определения профиля подпитки для получения белка в культуре клеток млекопитающего, предусматривающий культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую это антитело, в продукционной среде культуры клеток; и добавление комбинированного подпитывающего раствора в продукционную среду культуры клеток с использованием системы регуляции с обратной связью для мониторинга метаболического индикатора в продукционной среде культуры клеток, причем комбинированный подпитывающий раствор добавляют в продукционную среду культуры клеток для соответствия заданному значению метаболического индикатора-мишени; и определение количества комбинированного подпитывающего раствора, добавляемого в день в продукционную среду культуры клеток, так что определяют профиль подпитки. В одном варианте осуществления, этим метаболическим индикатором является глюкоза или глутамин.

Настоящее изобретение включает в себя также способ с подпиткой для получения белка в культуре клеток млекопитающих, предусматривающий добавление комбинированного подпитывающего раствора в культуру клеток млекопитающего в соответствии с профилем подпитки, определяемым с использованием способа этого изобретения.

Другим аспектом настоящего изобретения являются усовершенствованные среды культуры клеток, которые включают в себя бутират натрия и/или N-ацетилцистеин. Это изобретение описывает способ получения антитела в культуре клеток млекопитающего, так что титр антитела равен по меньшей мере 300 мг/л, причем указанный способ предусматривает культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток, причем бутират натрия добавляют до конечной концентрации приблизительно 0,1 мМ-10 мМ, а N-ацетилцистеин добавляют до конечной концентрации приблизительно 1 мМ-80 мМ, так что антитело продуцируется при титре по меньшей мере 300 мг/л. В одном варианте осуществления, титр антитела равен по меньшей мере приблизительно 100 мг/л. В одном варианте осуществления, титр антитела равен по меньшей мере приблизительно 200 мг/л. В одном варианте осуществления, титр антитела равен по меньшей мере приблизительно 250 мг/л. В одном варианте осуществления, титр антитела равен по меньшей мере приблизительно 300 мг/л. В одном варианте осуществления, титр антитела равен по меньшей мере приблизительно 400 мг/л.

Это изобретение обеспечивает также способ получения антитела в культуре клеток млекопитающих, так что титр антитела по меньшей мере на 10% больше, чем в контрольной культуре клеток млекопитающего, причем указанный способ предусматривает a) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и b) добавление бутирата натрия, N-ацетилцистеина или их комбинации в среду культуры клеток, причем бутират натрия добавляют до конечной концентрации приблизительно 0,1 мМ до 10 мМ, а N-ацетилцистеин добавляют до конечной концентрации приблизительно 1 мМ-80 мМ, так что титр антитела по меньшей мере на 10% выше, чем в контроле, причем контрольная культура клеток млекопитающего предусматривает стадию a) и исключает стадию b). В одном варианте осуществления, титр антител культуры клеток млекопитающего улучшается по меньшей мере на 29% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего. В одном варианте осуществления, титр антител культуры клеток млекопитающего улучшается по меньшей мере на 40% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего. В одном варианте осуществления, титр антител культуры клеток млекопитающего улучшается по меньшей мере на 70% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего. В одном варианте осуществления, титр антител культуры клеток млекопитающего улучшается по меньшей мере на 90% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего.

В одном варианте осуществления, бутират натрия, N-ацетилцистеин или их комбинацию добавляют в культуру клеток млекопитающего во время фазы роста культуры клеток млекопитающего.

В одном варианте осуществления, бутират натрия, N-ацетилцистеин или их комбинацию добавляют в культуру клеток млекопитающего между днями 4 и 7 периода времени культуры.

В одном варианте осуществления, бутират натрия, N-ацетилцистеин или их комбинацию добавляют в культуру клеток млекопитающего в день 0 периода времени культуры.

В другом варианте осуществления, конечная концентрация бутирата натрия равна приблизительно 0,1 мМ-10 мМ. В одном варианте осуществления, конечная концентрация бутирата натрия равна приблизительно 0,1 мМ-8,0 мМ. В одном варианте осуществления, конечная концентрация бутирата натрия равна приблизительно 0,1 мМ-3,0 мМ.

В одном варианте осуществления, конечная концентрация N-ацетилцистеина равна приблизительно 20 мМ-60 мМ. В одном варианте осуществления, конечная концентрация N-ацетилцистеина равна приблизительно 10 мМ. В одном варианте осуществления, конечная концентрация N-ацетилцистеина равна приблизительно 8 мМ.

Это изобретение обеспечивает способ продления долговечности культуры клеток млекопитающего по меньшей мере на 35% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего, причем указанный способ предусматривает а) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и b) добавление приблизительно 1 мМ-80 мМ N-ацетилцистеина к этой клеточной среде; так что долговечность этой культуры клеток млекопитающего удлиняется по меньшей мере на 35% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего, причем контрольная культура клеток млекопитающего включает в себя стадию а) и исключает стадию b).

В одном варианте осуществления, долговечность культуры клеток млекопитающего удлиняется по меньшей мере на приблизительно 45% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего. В одном варианте осуществления, долговечность культуры клеток млекопитающего удлиняется по меньшей мере на приблизительно 55% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего.

В одном варианте осуществления, способ этого изобретения описывает добавление конечной концентрации приблизительно 8 мМ N-ацетилцистеина в продукционную среду культуры клеток.

В одном варианте осуществления, антитело, или его антигенсвязывающая часть, выбрано из группы, состоящей из анти-TNFα-антитела, анти-IL-18-антитела (например, ABT-325) и анти-IL-12-антитела.

Это изобретение обеспечивает бессывороточную среду культуры клеток, содержащую Часть А, Часть В и Часть С, где Часть А состоит по существу из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; Часть В состоит по существу из неорганического источника железа; и Часть С содержит рекомбинантный фактор роста; буфер; регулятор осмолярности; источник энергии и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения. В одном варианте осуществления, Часть C состоит по существу из рекомбинантного фактора роста; буфера; регулятора осмолярности; источника энергии и по меньшей мере двух гидролизатов продуктов не животного происхождения.

Это изобретение обеспечивает также бессывороточную среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, имеющую уменьшенное содержание витаминов и в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа; приблизительно 6,5 мл/кг или 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 7,0 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение обеспечивает также бессывороточную среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, имеющую уменьшенное содержание витаминов и исключающую следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 150 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 5,0 г/кг моногидрата L-аспарагина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 65 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 41 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение обеспечивает дополнительно бессывороточную среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную среду, имеющую уменьшенное содержание витаминов и в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; приблизительно 10 мл/кг или 122,45 мг/л цитрат трехвалентного железа; приблизительно 6,5 мл/кг или 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; приблизительно 200 г/кг безводной глюкозы; приблизительно 0,58-0,59 г/кг L-глутамина; приблизительно 1,6 г/кг бикарбоната натрия; приблизительно 1,8 г/кг HEPES; приблизительно 2,45 г/кг NaCl; приблизительно 1,0 г/кг Плюроника F-68; приблизительно 0,03-0,04 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; приблизительно 0,43-0,44 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; приблизительно 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 6,9-7,0 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

Это изобретение обеспечивает также следующие варианты осуществления для усовершенствованных сред. Это изобретение включает в себя усовершенствованные среды для культивирования клеток СНО для экспрессии рекомбинантных биологических веществ (биопрепаратов), содержащих части А, В и С, где: Часть А содержит воду, аминокислоты, витамины и другие кофакторы; Часть В содержит неорганический источник железа и Часть С содержит рекомбинантные факторы роста, буферы, регулятор осмолярности, источник энергии, ионы цветных металлов, гидролизаты и дополнительные агенты.

В одном варианте осуществления, часть С содержит бикарбонат натрия, HEPES, одно- и двухосновные фосфаты натрия, хлорид натрия, Плюроник F-68 и глюкозу. В другом варианте осуществления, добавляют 1,5 г/л бикарбоната натрия. В дополнительном варианте осуществления, добавляют 1,8 г/л HEPES. Еще в одном варианте осуществления, добавляют 0,1-0,5 г/л одно- и двухосновных фосфатов натрия. Еще в одном варианте осуществления, добавляют 1-6,5 г/л хлорида натрия. В дополнительном варианте осуществления, добавляют 1,0 г/л Плюроника F-68. В одном варианте осуществления, добавляют 1 г/л-7 г/л глюкозы. В одном варианте осуществления, витамины выбраны из группы, состоящей из PABA (п-аминобензойной кислоты), Биотина, D-Ca Пантотената (витамина B5), фолиевой кислоты, i-Инозита, Ниацинамида, Пиродоксина (витамина B6), Рибофлавина (витамина B2), Тиамина (витамина B1) и Цианокобаламина (витамина B12). В другом варианте осуществления, другие кофакторы выбраны из группы, состоящей из липидных факторов, аминоспиртов, аминокислот и пептидов. Еще в одном варианте осуществления, липидные факторы выбраны из группы, состоящей из холинхлорида и фосфатидилхолина. Еще в одном варианте осуществления, аминоспиртом является этаноламин. В одном варианте осуществления, аминокислоты выбраны из группы, состоящей из аспарагина, глутамина и путресцина.

В одном варианте осуществления, пептидом является глутатион. В одном варианте осуществления, добавляют 0,4 мг/л-1,65 мг/л глутатиона.

Еще в одном варианте осуществления, неорганическим источником железа в Части В является цитрат трехвалентного железа. В одном варианте осуществления, добавляют 10 мл/л или 122 мг/л цитрата трехвалентного железа. Еще в одном варианте осуществления, цитрат трехвалентного железа добавляют до концентрации 122 мг/л. В одном варианте осуществления, рекомбинантным фактором роста является инсулин или рекомбинантный аналог, IGF-1, или комбинация инсулина и IGF-1. В одном варианте осуществления, добавляют 4-13 мг/л инсулина или рекомбинантного аналога. В другом варианте осуществления, добавляют 25-150 нг/л IGF-1. Еще в одном варианте осуществления, добавляют 50-100 нг/л IGF-1. В другом варианте осуществления, к инсулину добавляют 25-150 нг/л IGF-1. В одном варианте осуществления, к инсулину добавляют 50-100 нг/л IGF-1.

Еще в одном варианте осуществления, регулятор осмолярности выбран из группы, состоящей из NaCl, KCl, KNO₃. В одном варианте осуществления, добавляют 0-10 г/л регулятора осмолярности. В другом варианте осуществления, добавляют 0-6,5 г/л регулятора осмолярности.

Еще в одном варианте осуществления источником энергии является моносахарид, например глюкоза (например, D-глюкоза), мальтоза, манноза, галактоза и фруктоза. В одном варианте осуществления, добавляют 1,0-7,0 г/л глюкозы. В другом варианте осуществления добавляют 1,5-5,0 г/л глюкозы.

Еще в одном варианте осуществления добавляют ионы цветных металлов в форме хлоридных и сульфатных солей. В одном варианте осуществления, эти ионы цветных металлов выбраны из группы, состоящей из калия, магния, двухвалентной меди, селена, цинка, никеля, марганца, олова, кадмия, молибдата, ванадата и силиката. В одном варианте осуществления, буфер выбран из группы, состоящей из карбонатов, хлоридов, сульфатов и фосфатов. В одном варианте осуществления, этот буфер выбран из группы, состоящей из NaHCO₃, CaCl₂, MgSO₄, NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, C₃H₃O₃Na и N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновой кислоты], известной как HEPES.

В одном варианте этого изобретения, одним из дополнительных агентов, добавляемых к среде, является метотрексат. В одном варианте осуществления, метотрексат используют для выращивания клеток СНО, которые экспрессируют анти-IL-18-, анти-IL-12-, анти-TNFα- (например, полностью человеческое анти-TNFα-антитело) или анти-EPO-R-антитела. В одном варианте осуществления, добавляют 100-5000 нМ метотрексат. В одном варианте осуществления, к среде добавляют 500 нМ метотрексат. В одном варианте осуществления, добавляют 100 нМ метотрексат. В одном варианте осуществления, добавляют 5000 нМ метотрексат.

Еще в одном варианте осуществления этого изобретения, одним из этих дополнительных агентов является вещество-протектор клеток, например, метилцеллюлоза или плюроник-полиол (например, Плюроник F-68). В одном варианте осуществления, добавляют 0,5-1,0 г/л метилцеллюлозы. В одном варианте осуществления, добавляют 0,5-1,0 г/л Плюроника F-68. В одном варианте осуществления, добавляют 0,7-1,2 г/л Плюроника F-68.

Еще в одном варианте осуществления, pH Части А увеличивается максимально до рН 10. В одном варианте осуществления, pH Части А уменьшается затем минимально до 7,0 при добавлении гидролизатов.

Это изобретение обеспечивает также улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческое анти-TNFα-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 2 мл/кг или 4,0 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 3,5 г/кг безводной глюкозы; 0,292 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; 2,0 г/кг гидролизата и 2,50 мл/кг метотрексата.

Это изобретение обеспечивает также улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческое анти-TNFα-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 6,0 мл/кг или 12 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,584 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,45 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; 10,7 г/кг гидролизата; 6,92 г/кг Пептона Фитон и 2,50 мл/кг метотрексата.

В это изобретение включена также улучшенная среда для клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческое анти-TNFα-антитело, содержащая: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 3,88 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,876 г/кг L-глутамина; 0,45 г/кг моногидрата L-аспарагина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,67 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; 10,7 г/кг гидролизата; 6,92 г/кг Пептона Фитон и 2,50 мл/кг метотрексата.

Это изобретение обеспечивает также улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческое анти-TNFα-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 3,88 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,876 г/кг L-глутамина; 0,45 г/кг моногидрата L-аспарагина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1 г/кг HEPES; 2,67 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; 4,0 г/кг гидролизата; 2,6 г/кг Пептона Фитон и 2,50 мл/кг метотрексата.

Другим аспектом этого изобретения является улучшенная среда для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащая: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 3,88 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,876 г/кг L-глутамина; 0,45 г/кг моногидрата L-аспарагина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,675 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; 4,0 г/кг гидролизата дрожжей; 2,579 г/кг Пептона Фитон и 2,50 мл/кг метотрексата.

Это изобретение обеспечивает улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 6,5 мл/кг или 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,584 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,45 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и 6,92 г/кг Пептона Фитон.

Это изобретение обеспечивает улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 150,0 г/кг безводной глюкозы; 5,0 г/кг моногидрата L-аспарагина; 65,0 г/кг гидролизата дрожжей и 41,0 г/кг Пептона Фитон.

Это изобретение также обеспечивает улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 6,5 мл/кг или 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 200,0 г/кг безводной глюкозы; 0,584 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,45 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄·7H₂O; 10,7 г/кг гидролизата дрожжей и 6,92 г/кг Пептона Фитон.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 2 мл/кг или 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 3,5+1,5 г/кг безводной глюкозы; 0,292 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 2 г/кг гидролизата дрожжей и 0,25 мл/кг метотрексата.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 2 мл/кг или 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 3,5+1,5 г/кг безводной глюкозы; 0,292 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 11 г/кг гидролизата дрожжей и 0,250 мл/кг метотрексата.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 2 мл/кг или 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 200 г/кг безводной глюкозы; 0,292 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 8 г/кг гидролизата дрожжей и 0,250 мл/кг метотрексата.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 3,88 мл/кг или 7,76 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,876 г/л L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/л HEPES; 2,67 г/л NaCl; 1,0 г/л Плюроника; 0,031 г/л NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/л Na₂HPO₄ ^.7H₂O; 4,0 г/л гидролизата дрожжей Yeastolate; 2,579 г/л Пептона Фитон; 0,05 мл/кг метотрексата; 3,5 мл/л 2н. NaOH и 2,91 г/л 2н. HCl, что дает конечный рН 7,10-7,20 и конечную осмолярность 373-403 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,584 г/л L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/л HEPES; 2,45 г/л NaCl; 1,0 г/л Плюроника; 0,031 г/л NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/л Na₂HPO₄ ^.7H₂O; 10,7 г/л гидролизата дрожжей Yeastolate; 6,92 г/л Пептона Фитон; 0,05 мл/кг метотрексата; 5,67 мл/л 2н. NaOH и 2,5 г/л 2н. HCl, что дает конечный рН 7,10-7,20 и конечную осмолярность 373-403 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 4 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 1,5 г/кг безводной глюкозы; 0,292 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 2,0 г/л гидролизата дрожжей Yeastolate и 0,25 мл/кг метотрексата, что приводит к конечному pH 7,10-7,30 и конечной осмолярности 300-340 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,584 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,45 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; 10,7 г/л гидролизата дрожжей Yeastolate; 6,92 г/кг Пептона Фитон; 5,67 мл/кг NaOH и 2,5 мл/кг HCl, что дает конечный рН 7,10-7,20 и конечную осмолярность 373-403 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 7,76 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,876 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,67 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; 4,0 г/кг гидролизата дрожжей Yeastolate и 2,579 г/л Пептона Фитон; 0,05 мл/л метотрексата; 3,5 мл/кг NaOH и 2,91 мл/кг HCl, что дает конечный рН 7,10-7,20 и конечную осмолярность 373-403 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/л безводной глюкозы; 0,584 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 2,45 г/кг NaCl; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; 10,7 г/л гидролизата дрожжей Yeastolate; 6,92 г/л Пептона Фитон; 0,05 мл/л метотрексата; 5,67 мл/кг NaOH и 2,5 мл/кг HCl, что дает конечный рН 7,10-7,20 и конечную осмолярность 373-403 мОсм/кг.

Это изобретение включает в себя улучшенную среду для клеток СНО, экспрессирующих анти-IL-18-антитело, содержащую: 10,0 мл/кг или 122 мг/кг цитрата трехвалентного железа; 13 мг/кг рекомбинантного инсулина человека; 7,0 г/кг безводной глюкозы; 0,584 г/кг L-глутамина; 1,6 г/кг бикарбоната натрия; 1,8 г/кг HEPES; 1,0 г/кг Плюроника F-68; 0,031 г/кг NaH₂PO₄·H₂O; 0,436 г/кг Na₂HPO₄ ^.7H₂O; 14,27 г/кг гидролизата дрожжей Yeastolate; 9,23 г/л Пептона Фитон; 0,05 мл/л метотрексата; 8,95 мл/кг NaOH и 4,1 мл/кг HCl, что дает конечный рН 7,10-7,20 и конечную осмолярность 373-403 мОсм/кг.

Это изобретение описывает также способ увеличения продуктивности клеточной линии СНО, продуцирующей IgG1-антитело, посредством увеличения конечного титра, предусматривающий: добавление бутирата натрия; и добавление N-ацетилцистеина. В одном варианте осуществления, антителом IgG1 является анти-IL-18-антитело. В одном варианте осуществления, это увеличение продуктивности измеряют по увеличению конечного титра. В одном варианте осуществления, увеличение конечного титра достигается посредством добавления бутирата натрия в концентрации 0,1-10 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация бутирата натрия равна 0,1-8,0 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация бутирата натрия равна 0,1-3,0 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация бутирата натрия равна 0,125-2,0 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация бутирата натрия равна 0,125 мМ. В одном варианте осуществления, увеличение конечного титра равно 10-80%. В одном варианте осуществления, увеличение конечного титра равно 20-60%. В одном варианте осуществления, увеличение конечного титра равно 35-55%. В одном варианте осуществления, увеличение конечного титра равно 40%. В одном варианте осуществления, долговечность улучшенной культуры клеток достигается добавлением N-ацетилцистеина в концентрации 0,1-10 мМ. В одном варианте осуществления, увеличение долговечности культуры клеток равно 5-50%.

Это изобретение обеспечивает также среду культуры клеток, увеличивающую продуктивность клеточной линии СНО, продуцирующей IgG1-антитело, посредством увеличения конечного титра, содержащую: SR-371 и бутират натрия. В одном варианте осуществления, антителом IgG1 является анти-IL-18-антитело. В одном варианте осуществления, это увеличение продуктивности измеряют по увеличению конечного титра анти-IL-18-антитела на 10-80%. В одном варианте осуществления, это увеличение продуктивности измеряют по увеличению конечного титра анти-IL-18-антитела на 20-60%. В одном варианте осуществления, это увеличение продуктивности измеряют по увеличению конечного титра анти-IL-18-антитела на 35-55%. В одном варианте осуществления, это увеличение продуктивности измеряют по увеличению конечного титра анти-IL-18-антитела на 40%. В одном варианте осуществления, концентрация добавляемого бутирата натрия равна 0,125-8,0 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация добавляемого бутирата натрия равна 0,2-3,0 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация добавляемого бутирата натрия равна 0,3-2,0 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация добавляемого бутирата натрия равна 0,125 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация добавляемого N-ацетилцистеина равна 1-10 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация добавляемого N-ацетилцистеина равна 5-10 мМ. В одном варианте осуществления, средний конечный титр увеличивается на 5-50%. В одном варианте осуществления, средний конечный титр увеличивается на 15-35%. В одном варианте осуществления, средний конечный титр увеличивается на 25-35%.

Описание фигуры

Фиг.1 графически изображает титр роста ABT-874 как функцию плотности жизнеспособных клеток в посевном материале. Результаты титра в день 15 строго коррелируют с плотностью жизнеспособных клеток при подпитке. Полином, полученный по приведенным выше точкам данных, предполагает, что оптимальная плотность подпитки имеет место около 3,5×10⁶ клеток/мл. Параметрами процесса были рН=6,9, T=35°C, DO=40%, отношение инокулята 1:5 или 1:4 в 4X-среду, подпитка начиналась при указанной плотности, 1% исходного объема в течение 10 дней.

Подробное описание изобретения

I. Определения

Хотя терминология, используемая в этой заявке, является стандартной в данной области, здесь приведены определения некоторых терминов для гарантии ясности и определенности значения этих притязаний.

Термин "антитело", в данном контексте, относится к молекулам иммуноглобулина, состоящим из четырех полных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, взаимосвязанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращаемой как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращаемой здесь как LCVR или LH) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. VH- и VL-области могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность районами (CDR), имеющие в промежутках между ними участки, которые являются более консервативными, называемые каркасными областями (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Примеры антител, которые могут быть получены с использованием способов и композиций этого изобретения, включают в себя антитела к фактору некроза опухолей (TNF)-α (также называемые анти-TNFα-антителами), интерлейкин (IL)-12-антитела (также называемые анти-IL-12-антителами), интерлейкин (IL)-18-антитела (также называемые анти-IL-18-антителами) и EPO/R-антитела (также называемые здесь анти-EPO/R-антителами). TNFα-антитела, которые могут быть получены с использованием этого изобретения, описаны более подробно в патентах США с номерами 6090382; 6258562 и 6509015, каждый из которых включен здесь в виде ссылки в его полном виде.

Это изобретение может быть также использовано для получения фрагментов антител. Термин “антигенсвязывающая часть" или “антигенсвязывающий фрагмент антитела” (или просто “часть антитела"), в данном контексте, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hTNFα). Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающая часть» антитела, включают в себя (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH единственного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH или VL; (vi) выделенный определяющий комплементарность район (CDR); и (vii) антитело с двумя вариабельными доменами (DVD). Кроме того, хотя эти два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть соединены, с использованием рекомбинантных способов, синтетическим линкером, который может делать их единой белковой цепью, в которой VL- и VH-области спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие одноцепочечные антитела также включены в термин “антигенсвязывающая часть" антитела. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также включены в этот термин. Диатела являются двухвалентными, биспецифическими антителами, в которых VH- и VL-домены экспрессируются на единой полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволить спаривание между этими двумя доменами на одной и той же цепи, что заставляет эти домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123). Примеры частей антител, которые могут быть получены способами этого изобретения, описаны более подробно в патентах США с номерами 6090382, 6258562, 6509015, каждый из которых включен здесь в виде ссылки в его полном виде. Получение фрагментов или частей антител с использованием способов и композиций этого изобретения также включено в объем этого изобретения.

Термин “рекомбинантное антитело человека", в данном контексте, включает в себя все антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека (описанные дополнительно ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным в отношении генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, L.D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287), или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любым другим способом, который включает в себя сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими ДНК-последовательностями. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, происходящие из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Однако в некоторых вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергают мутагенезу in vitro (или, когда используют животных трансгенных в отношении последовательностей Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, следовательно, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей этих рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, хотя они и произведены из VH- и VL-последовательностей зародышевой линии человека и являются родственными VH- и VL-последовательностям зародышевой линии человека, могут не существовать в природе в репертуаре антител зародышевой линии человека in vivo.

Термин “выделенное антитело", в данном контексте, относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих отличающиеся антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывает hTNFα, по существу не содержит антител, которые специфически связывают антигены, другие, чем hTNFα). Однако выделенное антитело, которое специфически связывает hTNFα, может иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы TNFα из других видов. Кроме того, выделенное антитело может не содержать другого клеточного материала и/или химикалиев.

Термин “базальная среда" относится к любой среде, которая способна поддерживать рост клеток. Базальная среда доставляет стандартные неорганические соли, такие как соли цинка, железа, магния, кальция и калия, а также микроэлементы, витамины, источник энергии, буферную систему и незаменимые аминокислоты. Примеры базальных сред включают в себя, но не ограничиваются ими, модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM), DME/F12, минимальную эссенциальную среду (MEM), базальную среду Игла (ВМЕ), RPMI 1640, F-10, F-12, α-минимальную эссенциальную среду (α-MEM), минимальную эссенциальную среду Glasgow (G-MEM), PF CHO (SAFC Biosciences) и модифицированную по Исков среду Дульбекко.

Термин “модифицированная базальная среда", в данном контексте, относится к базальной среде, из которой по меньшей мере один стандартный ингредиент, компонент или нутриент (т.е. по меньшей мере один ингредиент, компонент или нутриент, обнаруживаемые в классически приготовленной базальной среде, известной в данной области) был исключен, уменьшен или увеличен по количеству. Термин «модифицированная», используемый в контексте «модифицированной базальной среды», может также относиться к изменениям в соотношении между индивидуальными компонентами в этой базальной среде. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения, модифицированная базальная среда исключает по меньшей мере один из следующих компонентов: бикарбонат натрия, буфер, фосфат натрия (одноосновный и/или двухосновный), регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и глюкозу, например, моносахарид глюкозы.

В данном контексте, термины “среда культуры клеток”, “культуральная среда” и “состав среды” относятся к питательному раствору для поддержания, размножения или экспансии клеток в искусственной среде in vitro вне многоклеточного организма или ткани. Среда культуры клеток может быть оптимизирована для конкретного применения культуры клеток, в том числе, например, среда для выращивания, которая приготовлена для стимуляции клеточного роста, или продукционная среда культуры клеток, которая приготовлена для стимуляции продуцирования рекомбинантного белка. Термины нутриент, ингредиент и компонент используются здесь взаимозаменяемо для обозначения составных частей, которые создают среду культуры клеток.

Термины “продукционная среда культуры клеток” или “продукционная среда” относятся, в данном контексте, к среде культуры клеток, предназначенной для использования во время продукционной фазы культуры клеток. В предпочтительном варианте осуществления, продукционная среда предназначена для экспрессии рекомбинантного белка во время продукционной фазы. Здесь обеспечены примеры продукционных сред, включающие в себя таблицы 2-7 в разделе примеры.

Термины “культура клеток с подпиткой” и “культура с подпиткой”, относятся к культуре клеток, где эти клетки, предпочтительно клетки млекопитающего, и культуральная среда исходно подаются в сосуд для культивирования, и дополнительные нутриенты культуры подаются, непрерывно или в виде дискретных приращений, в культуру во время культивирования, с периодическим сбором клеток и/или сбором продукта или без периодического сбора клеток и/или сбора продукта перед завершением культуры.

“Способ с подпиткой" обозначает способ, посредством которого культура клеток с подпиткой снабжается дополнительными нутриентами. Например, способ с подпиткой может предусматривать добавление дополнительных сред в соответствии с заданной схемой фидинга (подпитки) в конкретном периоде времени.

В данном контексте, термин “подпитка” относится к любому добавлению любого вещества к культуре после инокуляции. Фидинг (подпитка) может быть одним или несколькими добавлениями.

В данном контексте, термины "подпитывающий раствор", "подпитывающая среда" и "среда подпитки (фидинга)" относятся к среде, содержащей один или несколько нутриентов, которые добавляют в культуру, начиная при некотором времени после инокуляции. В одном варианте осуществления, этот подпитывающий раствор является комбинированной подпиткой, содержащей базальную среду и по меньшей мере один гидролизат, например, гидролизат сои, гидролизат дрожжей или комбинацию этих двух типов гидролизата. В другом варианте осуществления этого изобретения, подпитывающий раствор может включать в себя только базальную среду, например, концентрированную базальную среду, или может включать в себя только гидролизаты или концентрированные гидролизаты.

В данном контексте, термин “система регуляции с обратной связью” относится к процессу мониторинга конкретного параметра, посредством чего добавляют дополнительный агент или выполняют модификацию окружающей среды данной культуры клеток для соответствия заданному значению желаемого параметра. В одном варианте осуществления, конкретным параметром является уровень глюкозы культуры клеток млекопитающего, посредством чего этот уровень глюкозы используют для определения, когда подпитывающий раствор, например, комбинированный подпитывающий раствор, должен добавляться в культуру клеток. Система регуляции с обратной связью может быть использована для поддержания питательных компонентов, необходимых для оптимизации продуцирования белка в культуре клеток млекопитающего.

В данном контексте, термин “профиль подпитки” относится к схеме дополнения культуры клеток млекопитающего подпитывающим раствором, например, комбинированным подпитывающим раствором. Профиль подпитки генерируют предпочтительно с использованием системы регуляции с обратной связью.

Клетки могут быть “генетически сконструированы” для экспрессии конкретного полипептида или белка, когда рекомбинантные последовательности нуклеиновой кислоты, которые позволяют экспрессировать этот полипептид, были введены в клетки с использованием способов «генной инженерии», таких как вирусная инфекция рекомбинантным вирусом, трансфекция, трансформация или электропорация. См., например, Kaufman et al. (1990), Meth. Enzymol. 185: 487-511; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, New York, 1988, and quarterly updates). Способы и векторы для генетически сконструированных клеток и/или клеточных линий для экспрессии представляющего интерес белка хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам. Способы генной инженерии включают в себя, но не ограничиваются ими, экспрессирующие векторы, нацеленную гомологичную рекомбинацию и/или активацию генов (см., например, патент США № 5272071, выданный Chappel) и трансактивацию с использованием сконструированных факторов транскрипции (см., например, Segal et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(6):2758-63). Необязательно, эти полипептиды экспрессируются под контролем гетерологичного регуляторного элемента, такого как, например, промотор, который не управляет в природе продуцированием этого полипептида. Например, этим промотором может быть сильный вирусный промотор (например, промотор CMV, SV40), который управляет экспрессией полипептида млекопитающего. Клетка-хозяин в норме может продуцировать или не может продуцировать этот полипептид. Например, этой клеткой-хозяином может быть клетка СНО, которая была генетически сконструирована для продуцирования полипептида человека, в том смысле, что в эту клетку СНО была введена нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид человека. Альтернативно, этой клеткой-хозяином может быть клетка человека, которая была генетически сконструирована для продуцирования увеличенных уровней полипептида человека, в норме присутствующего только при очень низких уровнях (например, заменой эндогенного промотора сильным вирусным промотором).

Термин “фаза роста”, в данном контексте, относится к периоду, во время которого культивируемые клетки быстро размножаются и увеличиваются в числе. Во время фазы роста клетки могут обычно культивироваться в среде и при условиях, предназначенных для максимизации пролиферации клеток.

Термин "гидролизат" включает в себя любой ферментативный продукт расщепления, в частности экстракт специализированного типа, приготовленный обработкой экстрагируемого вещества (например, компонентов растений или клеток дрожжей) по меньшей мере одним ферментом, способным разрушать компоненты этого вещества на более простые формы (например, в препарат, содержащий моно- или дисахариды и/или моно-, ди- или трипептиды). “Гидролизат” может быть дополнительно расщеплен ферментативно, например, папаином, и/или образован автолизом, термолизом и/или плазмолизом. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения, этот гидролизат получают не из животного-источника, т.е. он является гидролизатом продуктов не животного происхождения. Примеры предпочтительных гидролизатов продуктов не животного происхождения включают гидролизаты продуктов растительного происхождения, например, гидролизат сои, и гидролизаты, которые получены из продуктов не растительного и не животного происхождения, например гидролизаты дрожжей.

Термины “обогащенный гидролизатом раствор” и “обогащенная гидролизатом среда” относятся к среде, содержащей гидролизат или комбинацию гидролизатов, т.е. гидролизатов, экстрагированных из различных источников, в качестве основного ингредиента, который добавляют к культуре клеток. Обогащенный гидролизатом раствор может быть, например, добавлен к культуре клеток для усиления продуцирования белка. Подобным образом, термины “базальный обогащенный раствор” и “базальная обогащенная среда” относятся к среде, содержащей базальную среду (или комбинацию базальных сред) в качестве основного ингредиента. В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор или базальный обогащенный раствор или комбинацию этих двух обогащенных растворов добавляют в культуру клеток для увеличения продуктивности культуры клеток в продуцировании белка.

Продуцирование белка “увеличивают” добавлением дополнительного агента или изменением параметра процесса продуцирования белка, если количество полипептида, продуцируемого в культуре, содержащей дополнительный агент или измененный параметр процесса продуцирования белка, является большим, чем количество полипептида, продуцируемого в идентичной в остальном культуре, которая не содержит этого дополнительного агента или измененного параметра процесса продуцирования белка. Примеры изменений процесса продуцирования белка включают в себя, но не ограничиваются ими, добавление добавок для сред, увеличения количества дополнительной среды, вариации в температуре культивирования и концентрации кислорода, при которых культивируют эти клетки. Дополнительный агент может быть обеспечен в культуре клеток с использованием дополнительного раствора, такого как подпитывающий раствор.

Термин “ингредиент” относится к любому соединению, химического или биологического происхождения, которое может быть использовано в средах культуры клеток для поддержания или стимуляции роста пролиферации клеток. Термины “компонент”, “нутриент” и “ингредиент” используются взаимозаменяемо и все относятся к таким соединениям. Типичные ингредиенты, которые используются в средах культуры клеток, включают в себя аминокислоты, соли, металлы, сахара, липиды, нуклеиновые кислоты, гормоны, витамины, жирные кислоты, белки и т.п. Другие ингредиенты, которые стимулируют или поддерживают культивирование клеток ex vivo, могут быть выбраны специалистами, квалифицированными в данной области в объеме этого изобретения и в соответствии с конкретной необходимостью.

В данном контексте, термин “инокуляция" относится к добавлению клеток к среде для начала культуры.

“Продукционной фазой" называют период, во время которого клетки продуцируют максимальные количества рекомбинантного полипептида или белка. Продукционная фаза характеризуется меньшим делением клеток, чем деление клеток во время фазы роста, и может также включать в себя использование среды и условий культивирования, предназначенных для максимизации продуцирования полипептида.

“Рекомбинантным полипептидом" или “рекомбинантным белком" является полипептид или белок, полученный из процесса генетического конструирования. В предпочтительном варианте осуществления, рекомбинантные белки получают из культивирования клеток, экспрессирующих указанные белки в культуре клеток.

“Переходная фаза" является периодом культуры клеток между “фазой роста” и “продукционной фазой”. Во время переходной фазы среда и условия окружающей среды могут быть смещены от среды и условий окружающей среды, предназначенных для максимизации продуцирования белка.

Данное изобретение обеспечивает новые композиции и способы для получения белков, предпочтительно рекомбинантного белка, например, антител, культурами клеток млекопитающих, например, клеток яичника китайского хомячка (СНО). Среды культуры клеток и процессы, описанные здесь, использовали для получения рекомбинантных белков, в частности для получения рекомбинантных (полностью человеческих, гуманизированных или химерных) моноклональных антител. Эти среды и процессы модифицировали на многих продуцирующих антитела линиях для включения различных усовершенствований и улучшений, приводящих к увеличенному росту и увеличенной продуктивности клеток млекопитающих, например, клеток СНО. Ниже обеспечены аспекты улучшенных композиций и способов этого изобретения.

II. Представляющие интерес белки

Обычно, способы и композиции этого изобретения применимы для получения рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки являются белками, продуцируемыми процессом генной инженерии. Особенно предпочтительными белками для получения в соответствии со способами и композициями этого изобретения являются терапевтические вещества белков, также известные как биологические вещества (агенты). Предпочтительно, эти белки секретируются в виде внеклеточных продуктов.

Белки, которые могут быть получены с использованием способов и композиций этого изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. В данной области известны многочисленные способы, при помощи которых ДНК, кодирующая молекулы антител, может быть подвергнута манипуляциям таким образом, что образуются ДНК, способные кодировать рекомбинантные белки, такие как одноцепочечные антитела, антитела с повышенной аффинностью или другие полипептиды антител (см., например, Larrick et al., 1989,Biotechnology 7:934-938; Reichmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Roberts et al., 1987, Nature 328:731-734; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536; Chaudhary et al., 1989, Nature 339:394-397, содержание каждой из которых включено ссылкой). Рекомбинантные клетки, продуцирующие полностью человеческие антитела (такие как полученные с использованием трансгенных животных и, необязательно, дополнительно модифицированные in vitro), а также гуманизированные антитела, могут быть также использованы в настоящем изобретении (См., например, Cabilly et al., патент США No. 4816567; Cabilly et al., европейский патент No. 0125023 Bl; Boss et al патент США No. 4816397; Boss et al., европейский патент No. 0120694 B1; Neuberger, M.S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., европейский патент No. 0194276 B1; Winter, патент США No. 5225539; Winter, европейский патент No. 0239400 B1; Queen et al., европейский патент No. 0451216 B1; и Padlan, E.A. et al., EP 0519596 Al, каждый из которых включен здесь в виде ссылки). Например, это изобретение может быть использовано в получении антител человека и/или гуманизированных антител, которые иммуноспецифически узнают конкретные клеточные мишени, например, любой из вышеуказанных белков, рецептор EGF человека, антиген her-2/neu, антиген CEA, простата-специфический мембранный антиген (PSMA), CD5, CD11a, CD18, NGF, CD20, CD45, CD52, Ep-cam, другие молекулы поверхности раковых клеток, TNF-альфа, TGF-β1, VEGF, другие цитокины, альфа 4 бета 7 интегрин, IgE, вирусные белки (например, цитомегаловирус). Примеры антител, которые могут быть получены с использованием композиций и способов этого изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, анти-TNFα-антитело, анти-IL-12-антитело, анти-IL-18-антитело и анти-EPO-рецептор (EPO-R)-антитело. В одном варианте осуществления, анти-TNFα-антитело является полностью человеческим анти-TNFα-антителом, например, адалимумабом/D2E7 (см. Патент США № 6090382, включенный здесь в виде ссылки; Humira^®; Abbott Laboratories). В одном варианте осуществления, анти-IL-12-антитело является полностью человеческим анти-IL-12-антителом, например ABT-874 (Abbott Laboratories; см. патент США № 6914128, включенный здесь в виде ссылки). В одном варианте осуществления, анти-IL-18-антитело является полностью человеческим антителом (например, ABT-325), например, см. также антитела, описанные в US 20050147610 A1. В одном варианте осуществления, анти-EPO/R-антитело (также называемое ABT-007) является полностью человеческим антителом, таким как антитело, описанное в публикации патента США № US 20060018902 A1, включенной здесь в виде ссылки.

Другой пример типа белка, который может быть получен с использованием способов и композиций этого изобретения, включает в себя слитые белки. Слитый белок является белком или доменом белка (например, растворимым внеклеточным доменом), слитым с гетерологичным белком или пептидом.

Примеры таких слитых белков включают в себя белки, экспрессируемые в виде слияния с частью молекулы иммуноглобулина, белки, экспрессируемые в виде слитых белков с «застежкой-молнией», и новые полифункциональные белки, такие как слитые белки цитокина и фактора роста (т.е. GM-CSF и IL-3, MGF и IL-3). WO 93/08207 и WO 96/40918 описывают получение различных растворимых олигомерных форм молекулы, называемой CD40L, включающих в себя слитый белок иммуноглобулина и слитый белок застежки-молнии, соответственно; способы, обсуждаемые здесь, применимы и к другим белкам. Другим слитым белком является рекомбинантный TNFR:Fc, известный также как этанерцепт. Этанерцепт (или Enbrel^®; Amgen/Wyeth) является димером из двух молекул внеклеточной части TNFα-рецептора р75, причем каждая молекула состоит из 235 аминокислот произведенного из TNFR полипептида, который слит с 232 аминокислотами Fc-части IgG1 человека. Фактически любая молекула может быть экспрессирована в виде слитого белка, в том числе, но не только, внеклеточного домена молекулы клеточного рецептора, фермента, гормона, цитокина, части молекулы иммуноглобулина, домена застежки-молнии и эпитопа.

III. Среды культуры клеток этого изобретения

Данное изобретение обеспечивает среды культуры клеток для применения в культуре клеток млекопитающих для продуцирования или экспрессии рекомбинантных белков, например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Различные среды культуры клеток, описанные здесь, могут быть использованы отдельно или вместе для улучшенного культивирования клеток, в том числе увеличенного продуцирования белка и продленной долговечности клеток.

В предпочтительном варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения является бессывороточной, в том смысле, что эта среда не содержит сыворотки (например, фетальной телячьей сыворотки (ФТС), лошадиной сыворотки, козьей сыворотки или полученной из любого другого животного сыворотки, известной квалифицированному в данной области специалисту).

В первом аспекте, это изобретение обеспечивает среду культуры клеток млекопитающих, которая включает в себя, в целом или частично, модифицированную базальную (минимальную) среду. Модифицированные базальные клеточные среды могут быть произведены из стандартных базальных клеточных сред, известных в данной области. Подходящие базальные среды включают в себя, но не ограничиваются ими, модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM), DME/F12, минимальную эссенциальную среду (MEM), базальную среду Игла (ВМЕ), RPMI 1640, F-10, F-12, α-минимальную эссенциальную среду (α-MEM), минимальную эссенциальную среду Glasgow (G-MEM), PF CHO (см., например, не содержащую белка среду СНО (Sigma) или EX-CELL™ 325 PF CHO бессывороточную среду для клеток СНО, не содержащую белка (SAFC Biosciences) и модифицированную по Исков среду Дульбекко. Другие примеры базальных сред, которые могут быть использованы в этом изобретении, включают в себя базальную среду ВМЕ (Gibco-Invitrogen; см. также Eagle, H (1965) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 89, 36); модифицированную по Дульбекко среду Игла (DMEM, порошок) (Gibco-Invitrogen (# 31600); см. также Dulbecco и Freeman (1959) Virology 8, 396; Smith et al. (1960) Virology 12, 185. Tissue Culture Standards Commitee, In Vitro 6:2, 93); среду CMRL 1066 (Gibco-Invitrogen (#11530); см. также Parker R.C. et al (1957) Special Publications, N.Y. Academy of Sciences, 5, 303).

Базальная среда может быть модифицирована для удаления определенных не имеющих питательного значения соединений, обнаруживаемых в стандартной базальной среде, таких как различные неорганические и органические буферы, поверхностно-активные вещества и хлорид натрия. Удаление таких компонентов из базальной клеточной среды позволяет увеличить концентрацию оставшихся питательных компонентов и улучшает общий рост клеток и экспрессию белка, как описано здесь. Кроме того, удаленные компоненты могут быть добавлены обратно в среду культуры клеток, содержащую модифицированную базальную клеточную среду, в соответствии с требованиями условий культуры клеток. Как описано ниже, было обнаружено, что отделение определенного ингредиента из базальной клеточной среды, т.е. добавление модифицированной базальной среды в качестве ингредиента в среду культуры клеток, и последующее добавление этого ингредиента обратно в среду культуры клеток в виде отдельного ингредиента, обеспечивает предпочтительные свойства для роста культуры клеток и продуцирования белка.

Эта модифицированная базальная среда данного изобретения исключает любой, если не все, из следующих ингредиентов: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы. Эти ингредиенты обычно обнаруживаются в коммерческих базальных клеточных средах.

Исключение компонентов, например, бикарбоната натрия, буфера, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, регулятора осмолярности, поверхностно-активного вещества и моносахарида глюкозы, может быть выполнено коммерческими службами сред, например, SAFC Pharma™. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что модифицированная базальная среда может быть получена, в одном варианте осуществления, с использованием коммерческой службы, занимающейся средами культуры клеток, т.е. службы изготовления сред по заказу. Примеры служб изготовления сред по заказу обеспечиваются такими компаниями, как SAFC (ранее JRH Bioscience), Invitrogen^®, Atlanta Biologicals^® и Lonza.

Альтернативно, специалист с квалификацией в данной области может сам приготовить базальную клеточную среду, в которой конкретные описанные здесь ингредиенты удалены (см., например, Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; BD Bionutrients Technical Manual, (2006), Third edition; Jenkins, ed. (1999), Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Humana Press; Doyle and Griffiths, eds., (1997) Essential Techniques: Mammalian Cell Culture, John Wiley and Sons; Butler, ed. (1991) Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach Oxford University Press; Darling and Morgan (1994) Animal Cells: Culture and Media, John Wiley and Sons; Freshney, ed. (1992), Animal Cell Culture: A Practical Approach (2nd ed), Oxford University Press; Pollard and Walker (1997), Basic Cell Culture Protocols (2nd Ed), Humana Press, (Part of the Methods in Molecular Biology series, Volume 75), содержания которых включены ссылкой).

В одном варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения содержит модифицированную базальную клеточную среду, источник железа (предпочтительно неорганический, например, цитрат трехвалентного железа), рекомбинантный фактор роста; буфер; поверхностно-активное вещество; регулятор осмолярности; источник энергии и по меньшей мере два разных гидролизата продуктов не животного происхождения. Кроме того, эта модифицированная базальная клеточная среда может необязательно содержать аминокислоты, витамины или комбинацию как аминокислот, так и витаминов.

В данном контексте, термин “железо" означает произведенный не из животного источник железа, используемый для дополнения этой среды. Этот источник железа в данной среде культуры клеток является предпочтительно неорганическим. Этот источник железа является предпочтительно неорганическим и включает в себя, например, соли трехвалентного и двухвалентного железа, такие как цитрат трехвалентного железа и сульфат двухвалентного железа. Хелатированные соли, такие как цитрат трехвалентного железа и цитрат трехвалентного железа-аммония, являются предпочтительными. Однако могут быть использованы другие источники железа, которые не являются выделенными из источника-животного, например, химические хелатирующие агенты железа или содержащие железо носители рекомбинантного белка, которые обеспечивают эквивалентные количества железа. Хелатные соединения железа, которые могут быть использованы, включают в себя, но не ограничиваются ими, хелаты железа и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), этиленгликоль-бис(бета-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЭГТА), мезилата дефероксамина, димеркаптопропанола, диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДРТА) и транс-1,2-диаминоциклогексан-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (ЦДТА), а также хелат цитрата трехвалентного железа и хелат сульфата двухвалентного железа. Особенно предпочтительным источником железа является цитрат трехвалентного железа, который предпочтительно присутствует в конечном объеме среды культуры клеток в концентрации 0,1-1 мМ. В одном варианте осуществления, концентрация цитрата трехвалентного железа равна приблизительно 0,5 мМ. В другом варианте осуществления, концентрация цитрата трехвалентного железа равна 100-150 мг/л, например, 122 мг/л Предполагается, что числа, промежуточные относительно приведенных выше мМ, например 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 и 1,0 мМ, и мг/л, например 100, 110, 120, 130, 140 и 150, также являются частью этого изобретения.

Неограничивающими примерами факторов роста, которые могут быть включены в среду культуры клеток, являются инсулин или его рекомбинантный аналог, IGF-1 и комбинация инсулина и IGF-1. Особенно предпочтительным рекомбинантным фактором роста является инсулин или его рекомбинантный аналог, который предпочтительно присутствует в конечном объеме среды культуры клеток в концентрации приблизительно 4-13 мг/л. Предполагается, что числа, промежуточные относительно приведенных выше концентраций инсулина, также являются частью этого изобретения, например 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 и 13.

Среда культуры клеток может также включать в себя буфер. В предпочтительном варианте осуществления, буфер исключают из модифицированной базальной среды, но добавляют в виде отдельного компонента в среду культуры клеток (в которую также добавляют эту модифицированную базальную клеточную среду). Буферы для применения в среде культуры клеток известны в данной области. Неограничивающими примерами буферов, которые могут быть включены в среду культуры клеток, являются фосфатный буфер, HEPES и бикарбонат натрия. В одном варианте осуществления, бикарбонат натрия добавляют в качестве буфера в среду культуры клеток в конечной концентрации приблизительно 0,1-3 г/л. В одном варианте осуществления, бикарбонат натрия добавляют в качестве буфера в среду культуры клеток в конечной концентрации приблизительно 1,6 г/л. В одном варианте осуществления, HEPES добавляют в качестве буфера в среду культуры клеток в конечной концентрации 0,1-3 г/л. В другом варианте осуществления, HEPES добавляют в качестве буфера в среду культуры клеток в конечной концентрации 1,8 г/л. В одном варианте осуществления, фосфатный буфер, например, одноосновный и двухосновный фосфаты натрия, добавляют в среду культуры клеток в конечной концентрации 0,01-0,5 г/л. Предполагается, что числа, промежуточные относительно приведенных выше концентраций, также являются частью этого изобретения, например, концентрация бикарбоната натрия или HEPES 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 и 3,0 или концентрация фосфатного буфера 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,18, 0,2, 0,22, 0,24, 0,26, 0,28, 0,3, 0,32, 0,34, 0,36, 0,38, 0,4, 0,42, 0,44, 0,46, 0,48 и 0,5 г/л.

Буфер включают для лучшего поддержания среды культуры клеток при желаемом pH. В одном варианте осуществления, pH среды культуры клеток находится в диапазонах 6,0-8,0; 6,5-7,5 или 7,1-7,2. Предполагается, что числа, промежуточные относительно этих величин рН, например, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 и 8,0, а также все другие числа, на которые ссылаются здесь, также находятся в объеме этого изобретения. Предполагается, что диапазоны величин, использующие комбинацию любых из вышеуказанных величин в качестве верхней или нижней границ, включены в объем этого изобретения.

Среда культуры клеток может также включать в себя регулятор осмолярности, такой как NaCl. В одном варианте осуществления, NaCl добавляют к среде культуры клеток в конечной концентрации приблизительно 1,0-6,5 г/л. В одном варианте осуществления, осмолярность среды культуры клеток находится в диапазоне 260-450 мОсм/кг. В одном варианте осуществления, осмолярность среды культуры клеток находится в диапазоне 320-450 мОсм/кг. Предполагается, что числа, промежуточные относительно указанных концентраций NaCl и величин мОсм/кг, например, концентрации NaCl 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6 и 6,5 или диапазон мОсм/кг 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, а также числа, промежуточные относительно этих цифр, являются также частью этого изобретения. Предполагается, что диапазоны величин, использующие комбинацию любых из вышеуказанных величин в качестве верхней или нижней границ, включены в объем этого изобретения.

Источник энергии может быть также добавлен к среде культуры клеток этого изобретения. Предпочтительно, этим источником энергии является моносахарид. Примеры моносахаридов, которые могут быть использованы в среде культуры клеток, включают в себя глюкозу (например, D-глюкозу), мальтозу, маннозу, галактозу и фруктозу. В одном варианте осуществления, глюкозу добавляют к среде культуры клеток в конечной концентрации в диапазоне 3,5-7,0 г/л. В одном варианте осуществления, глюкозу добавляют к среде для культуры клеток в конечной концентрации, не большей чем 7,0 г/л. В одном варианте осуществления, глюкозу добавляют в конечной концентрации приблизительно 7,0 г/л. Предполагается, что числа, промежуточные относительно указанных концентраций глюкозы, например, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8 и 7, а также числа, промежуточные относительно этих цифр, являются также частью этого изобретения. Предполагается, что диапазоны величин, использующие комбинацию любых из вышеуказанных величин в качестве верхней или нижней границ, также включены в объем этого изобретения.

Важным ингредиентом в среде культуры клеток этого изобретения является добавляемый гидролизат. Среда культуры клеток этого изобретения может включать гидролизат, полученный из единственного источника, например, из дрожжей или сои, или может включать в себя комбинацию гидролизатов, например, гидролизаты дрожжей и сои. Предпочтительно, гидролизаты, используемые в средах культуры клеток этого изобретения, являются гидролизатами продуктов не животного происхождения. Примеры гидролизатов продуктов не животного происхождения включают гидролизаты продуктов растительного происхождения и гидролизаты продуктов не растительного происхождения, например, гидролизаты дрожжей, Триптон, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт или расщепленный папаином Пептон сои. Гидролизаты, используемые в средах этого изобретения, являются коммерчески доступными, включающими в себя, например, HyPep 1510.RTM., Hy-Soy.RTM., Hy-Yeast 412.RTM. и Hi-Yeast 444.RTM., из таких источников, как Quest International, Norwich, N.Y., OrganoTechnie, S.A. France, Deutsche Hefewerke GmbH, Germany или DMV Intl. Delhi, N.Y. Источники дрожжевых экстрактов и гидролизатов сои также описаны в WO 98/15614, WO 00/03000, WO 01/23527 и патенте США № 5741705. Примеры гидролизата дрожжей, которые могут быть также использованы в этом изобретении, включают в себя TC Yeastolate (BD Diagnostic) и Yeastolate UF (SAFC Biosciences), тогда как примеры гидролизатов продуктов растительного происхождения включают гидролизат сои UF (SAFC Biosciences) и гидролизат сои HyQ^® (HyClone Media).

В одном варианте осуществления, среда культуры клеток этого изобретения дополнительно включает в себя глутамин, например, L-глутамин. Подходящие источники L-глутамина доступны из различных коммерческих источников, таких как Gibco (Cat. No. 25030-081).

Необязательно, среда культуры клеток этого изобретения, в том числе среды, описанные ниже в разделе Примеры, может включать в себя метотрексат. Примеры количеств метотрексата, используемых в средах культуры клеток для культивирования клеток СНО, включают в себя приблизительно 100-5000 нМ метотрексата. Предполагается, что числа, промежуточные относительно указанной молярности метотрексата, например, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2000, 2200, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800 и 5000 нМ, а также числа, промежуточные относительно этих цифр, также являются частью этого изобретения. Предполагается, что диапазоны величин, использующие комбинацию любых из вышеуказанных величин в качестве верхней или нижней границ, также включены в объем этого изобретения.

В крупномасштабных биореакторах, клетки СНО являются особенно чувствительными к усилиям сдвига, возникающим при барботировании сосуда газами и смешивании импеллером. Таким образом, среда культуры клеток этого изобретения может, необязательно, включать в себя вещество-протектор клеток. Термин “протектор клеток” обозначает, в данном контексте, вещество, которое защищает эукариотические клетки от повреждения. Такое повреждение может вызываться, например, усилием сдвига или действиями барботирования газами в сосуде биореактора. Для минимизации появления клеточного повреждения предпочтительно, чтобы эта среда содержала протектор клеток, такой как метилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, поливиниловые спирты и плюроник-полиолы. Из них предпочтительным является Плюроник.RTM. (полиол, BASF Wyandotte Corp.) полиол F68, так как, в отличие от поливиниловых спиртов, он является нетоксичным веществом и, в отличие от полиэтиленгликолей, не мешает последующей очистке.

Среда культуры клеток этого изобретения может также включать в себя ионы цветных металлов. Примеры ионов цветных металлов включают в себя, но не ограничиваются ими хлоридные и сульфатные соли, калий, магний, двухвалентную медь, селен, цинк, никель, марганец, олово, кадмий, молибдат, ванадат и силикат.

Среда культуры клеток этого изобретения может также включать в себя витамины и кофакторы ферментов. Примеры таких витаминов и кофакторов ферментов включают в себя, но не ограничиваются ими, PABA (п-аминобензойную кислоту), Витамин K (биотин), Витамин B5 (D-кальцийпантотенат), фолиевую кислоту, I-Инозит, Ниацинамид (амид никотиновой кислоты), Витамин В6 (Пиридоксин-HCl) (и Пиридоксаль-HCl), Витамин B2 (Рибофлавин), Витамин B1 (Тиамин) и Витамин B12 (Цианокобаламин). Альтернативно, к средам может быть добавлен витамин С (L-аскорбиновая кислота). Может быть также добавлен холинхлорид, он обычно считается витамином, но может рассматриваться также как липидный фактор.

Дополнительно, среда культуры клеток этого изобретения может также включать в себя липидоподобные факторы. Примеры липидных факторов включают в себя холинхлорид и фосфатидилхолин. Может быть также включено вспомогательное средство для продуцирования липидов, например, аминоспирт, такой как этаноламин.

В способах и композициях этого изобретения, клетки предпочтительно культивируют в бессывороточных средах. Термин «бессывороточные» в применении к средам включает в себя любую среду культуры клеток млекопитающих, которая не содержит сыворотки, например, фетальной телячьей сыворотки.

В объем этого изобретения включены клетки млекопитающих, например, клетки СНО, в любых усовершенствованных средах культуры клеток, описанных здесь.

В одном аспекте этого изобретения, обеспечены композиции для сред культуры клеток, оптимизированные для продуцирования определенного антитела. Примеры оптимизированных композиций включают в себя среды культуры клеток для роста или продуцирования белка клеток СНО, которые экспрессируют анти-TNFα-антитело, анти-IL-12-антитело, анти-IL-18-антитело и анти-ЕРО-рецептор (ЕРО-R)-антитело.

В это изобретение включены среды культуры клеток для клеток млекопитающих, например, клеток СНО, которые экспрессируют анти-TNFα-антитела, в том числе полностью человеческие анти-TNFα-антитела. В предпочтительном варианте осуществления, полностью человеческим анти-TNFα-антителом является адалимумаб (также называемый D2E7 и Humira^®: Abbott Laboratories). Свойства адалимумаба, в том числе последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот, описаны в патенте США № 6090382, включенном здесь в виде ссылки. Адалимумаб может быть получен культивированием клеток млекопитающих, например, клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую этот белок, например, адалимумаб, в среде культуры для выращивания клеток, перенесением этой культуры клеток в продукционную среду культуры клеток и выделением белка из продукционной среды культуры клеток.

В одном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает среду для выращивания культуры клеток, оптимизированную для клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую адалимумаб. Композиция бессывороточной среды культуры клеток, оптимизированная для клеток СНО, экспрессирующих адалимумаб, включает в себя базальную среду; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 8-12 мл/кг, приблизительно 10,0 мл/кг или 122 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 2-6 мг/кг или 4,0 мг/кг); безводную глюкозу (например, 2-5 г/кг, приблизительно 3,5 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,29 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); NaH₂PO₄·H₂O (например, приблизительно 0,03 г/кг); Na₂HPO₄·7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг) и гидролизат дрожжей (например, приблизительно 2,0 г/кг). Другой пример бессывороточной среды для выращивания культуры клеток, оптимизированной для клеток СНО, экспрессирующих адалимумаб, включает в себя следующие ингредиенты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осиолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/кг); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 7,0 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,8-0,9 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); HEPES (например, приблизительно 1,8 г/кг); NaCl (например, приблизительно 2,6-2,7 г/кг); Плюроник F-68 (например, приблизительно 1,0 г/кг); NaH₂PO₄·H₂O (например, приблизительно 0,03-0,04 г/кг); Na₂HPO₄·7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг); моногидрат L-аспарагина (например, приблизительно 0,45 г/кг); гидролизат дрожжей (например, приблизительно 4,0 г/кг) и гидролизат продуктов растительного происхождения (например, приблизительно 2,6 г/кг). Среда для выращивания культуры клеток, экспрессирующих адалимумаб, может дополнительно содержать метотрексат, например, приблизительно 1-5 мл/кг или приблизительно 2,50 мл/кг.

В одном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает продукционную среду культуры клеток, оптимизированную для клеток СНО, экспрессирующих антитело, в том числе, например, анти-TNFα-антитело человека (например, адалимумаб) или антитело против рецептора эритропоэтина (EPO/R). Примеры анти-EPO/R-антител описаны в публикации патента № 20040071694, включенной здесь в виде ссылки. Композиция продукционной бессывороточной среды культуры клеток, оптимизированная для клеток СНО, экспрессирующих антитела, такие как адалимумаб или анти-EPO/R-антитело, включает в себя модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 6,0 мл/кг или 12 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 7,0 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,58-0,59 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); HEPES (например, приблизительно 1,8 г/кг); NaCl (например, приблизительно 2,4-2,5 г/кг); Плюроник F-68 (например, приблизительно 1,0 г/кг); NaH₂PO₄·H₂O (например, приблизительно 0,03-0,04 г/кг); Na₂HPO₄·7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг); гидролизат дрожжей (например, приблизительно 10,7 г/кг) и гидролизат продуктов растительного происхождения (например, приблизительно 6,9-7,0 г/кг). В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток имеет рН в диапазоне приблизительно 7,1-7,2 и осмолярность в диапазоне 373-403 мОсм/кг. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин, например, указанных величин инсулина, рН или осмолярности, также являются частью этого изобретения.

Другой аспект этого изобретения относится к среде культуры клеток, оптимизированной для продуцирования анти-интерлейкин-12 (IL-12)-антител, например, полностью человеческих IL-12-антител, продуцируемых клетками СНО. В предпочтительном варианте осуществления, полностью человеческим анти-IL-12-антителом является ABT-874. Характеристики ABT-874, в том числе последовательности нуклеиновой кислоты и аминокислот, описаны в Патенте США № 6914128, включенном здесь в виде ссылки.

В одном варианте осуществления, бессывороточная среда для выращивания культуры клеток, оптимизированная для выращивания клеток СНО, экспрессирующих ABT-874, включает в себя следующее: модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 7,0 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,87-0,88 г/кг); моногидрат L-аспарагина (например, приблизительно 0,45 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); HEPES (например, приблизительно 1,8 г/кг); NaCl (например, приблизительно 2,67-2,68 г/кг); Плюроник F-68 (например, 1,0 г/кг); NaH₂PO₄·H₂O (например, приблизительно 0,03-0,04 г/кг); Na₂HPO₄·7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг); гидролизат дрожжей (например, приблизительно 4,0 г/кг) и гидролизат продуктов растительного происхождения (например, приблизительно 2,6 г/кг).

В одном варианте осуществления, бессывороточная продукционная среда культуры клеток для экспрессии ABT-874 включает в себя следующее: модифицированную базальную среду, имеющую уменьшенное содержание витамина и исключающую следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 6,5 мл/кг или 13 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 7,0 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,87-0,88 г/кг); моногидрат L-аспарагина (например, приблизительно 0,45 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); HEPES (например, приблизительно 1,8 г/кг); NaCl (например, приблизительно 2,45 г/кг); Плюроник F-68 (например, приблизительно 1,0 г/кг); NaH₂PO₄·H₂O (например, приблизительно 0,03-0,04 г/кг); Na₂HPO₄ ^.7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг); гидролизат дрожжей (например, приблизительно 10,7 г/кг) и гидролизат продуктов растительного происхождения (например, приблизительно 6,9-7,0 г/кг).

В одном варианте осуществления, это изобретение обеспечивает среду для выращивания культуры клеток для клеток СНО, экспрессирующих антитела, например, анти-IL-12- и анти-ЕРО/R-антитела, содержащую следующее: базальную среду; цитрат трехвалентного железа (например, 10 мл/кг или 122,45 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 4 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 1,5 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,29-0,30 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг) и гидролизат дрожжей (например, по меньшей мере приблизительно 2 г/кг). В одном варианте осуществления, среда для выращивания культуры клеток для клеток СНО, экспрессирующих антитела, например, анти-IL-12- и анти-EPO/R-антитела, имеет рН приблизительно 7,10-7,30 и осмолярность приблизительно 300-340 мОсм/кг. Эта среда культуры клеток может также содержать гидролизат дрожжей (например, по меньшей мере приблизительно 8 г/кг).

Другой аспект этого изобретения относится к среде культуры клеток, оптимизированной для продуцирования анти-интерлейкин-18 (IL-18)-антител, например, полностью человеческих IL-18-антител, продуцируемых клетками СНО. Примеры полностью человеческих IL-18-антител, которые могут быть получены с использованием способов и композиций этого изобретения, описаны в РСТ публикации WO 01/058956, включенной здесь в виде ссылки.

В одном варианте осуществления, среда для выращивания культуры клеток, оптимизированная для продуцирования IL-18-антитела в клетках СНО, включает в себя следующие ингредиенты: модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 3,8-3,9 мл/кг или 7,8 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 7,0 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,87-0,88 г/кг); моногидрат L-аспарагина (например, приблизительно 0,45 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); HEPES (например, приблизительно 1,8 г/кг); NaCl (например, приблизительно 2,67 г/кг); Плюроник F-68 (например, 1,0 г/кг); NaH₂PO₄·H₂O (например, приблизительно 0,03-0,04 г/кг); Na₂HPO₄·7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг); гидролизат дрожжей (например, приблизительно 4,0 г/кг) и гидролизат продуктов растительного происхождения (например, приблизительно 2,6 г/кг). Эта среда культуры клеток для выращивания клеток, экспрессирующих полностью человеческие IL-18-антитела человека, может иметь рН 7,10-7,20 и осмолярность 373-403 мОсм/кг. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин, например, указанных величин инсулина, рН или осмолярности, также являются частью этого изобретения.

Один пример продукционной среды культуры клеток, оптимизированной для продуцирования IL-18-антитела в клетках СНО, включает в себя следующие ингредиенты: модифицированную базальную среду, которая модифицирована для удаления следующих компонентов: бикарбоната натрия, буфера, одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия, регулятора осмолярности, поверхностно-активного вещества и моносахарида глюкозы; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 6,0 мл/кг или 12 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 7,0 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,58-0,59 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); HEPES (например, приблизительно 1,8 г/кг); NaCl (например, приблизительно 2,45 г/кг); Плюроник F-68 (например, приблизительно 10 г/кг); NaH₂PO₄۰H₂O (например, приблизительно 0,03-0,04 г/кг); Na₂HPO₄ ^.7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг); гидролизат дрожжей (например, приблизительно 10,7 г/кг) и гидролизат продуктов растительного происхождения (например, приблизительно 6,9-7,0 г/кг). Другой пример продукционной среды культуры клеток для получения полностью человеческих анти-IL-18-антител включает в себя модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы; цитрат трехвалентного железа (например, приблизительно 10,0 мл/кг или 122,45 мг/л); рекомбинантный инсулин человека (например, приблизительно 6,5 мл/кг или 13 мг/кг); безводную глюкозу (например, приблизительно 7,0 г/кг); L-глутамин (например, приблизительно 0,58-0,59 г/кг); бикарбонат натрия (например, приблизительно 1,6 г/кг); HEPES (например, приблизительно 1,8 г/кг); NaCl (например, приблизительно 2,45 г/кг); Плюроник F-68 (например, приблизительно 1,0 г/кг); NaH₂PO₄۰H₂O (например, приблизительно 0,03-0,04 г/кг); Na₂HPO₄ ^.7H₂O (например, приблизительно 0,43-0,44 г/кг); гидролизат дрожжей (например, приблизительно 14,2-14,3 г/кг) и гидролизат продуктов растительного происхождения (например, приблизительно 9,2-9,3 г/кг). Эта среда культуры клеток для клеток СНО, продуцирующих полностью человеческие IL-18-антитела, может иметь pH 7,10-7,20 и осмолярность 373-403 мОсм/кг. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин, например, указанных величин инсулина, рН или осмолярности, также являются частью этого изобретения.

Другие примеры сред в объеме этого изобретения описаны ниже в связи со способами с подпиткой и дополнительными средами, которые улучшают продуцирование антител, наряду с примерными средами, описанными в разделе Примеры.

Среды данного изобретения могут быть использованы для осуществления подходящей культуры клеток приведением этих сред и их компонентов в контакт со всей популяцией клеток или с частью популяции клеток. Эти среды могут быть приведены в контакт с клетками смешиванием, добавлением, объединением, посевом или встряхиванием одной или нескольких клеток с одним или несколькими соединениями, растворами, средами и т.д. Среды могут быть также приведены в контакт с этими клетками все сразу, нарастающим образом (инкрементально) или ступенчатым образом, например, «фидингом» (подпиткой) для замены или пополнения среды, в которой культивируются клетки, как описано более подробно ниже.

IV. Способы и композиции для улучшенного продуцирования белка

Способы или композиции этого изобретения относятся к культуре клеток млекопитающих. В одном варианте осуществления, используемой клеткой млекопитающего является клетка СНО.

Установленные способы введения ДНК в клетки млекопитающих были описаны (Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69). Для трансфекции клеток могут быть использованы дополнительные протоколы с использованием коммерчески доступных реагентов, таких как катионные липидные реагенты Липофектамин™, Липофектамин™-2000 или Липофектамин™-плюс (которые могут быть куплены из Invitrogen) (Feigner et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417). Кроме того, электропорация или бомбардировка микроснарядами, покрытыми нуклеиновыми кислотами, могут быть использованы для трансфекции клеток млекопитающих с использованием процедур, таких как процедуры, описанные в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и Fitzpatrick-McElligott (1992), Biotechnology (NY) 10(9): 1036-40. Отбор стабильных трансформантов может выполняться с использованием способов, известных в данной области, таких как, например, устойчивость к цитотоксическим лекарственным средствам. Kaufman et al. ((1990), Meth. in Enzymology 185:487-511) описывает несколько схем отбора, таких как схема устойчивости к дигидрофолатредуктазе (DHFR) Подходящим штаммом-хозяином для DHFR-отбора может быть штамм CHO DX-B11, который является недостаточным в отношении DHFR (Urlaub and Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220). Плазмида, экспрессирующая кДНК DHFR, может быть введена в штамм DX-B11, и только клетки, которые содержат эту плазмиду, могут расти в соответствующих элективных средах. Другие примеры селектируемых маркеров, которые могут быть включены в экспрессирующий вектор, включают в себя кДНК, придающие устойчивость к антибиотикам, таким как G418 и гигромицин B. Клетки, захватывающие этот вектор, могут быть отобраны на основе устойчивости к этим соединениям.

Дополнительные регуляторные последовательности, которые, как было показано, улучшают экспрессию гетерологичных генов из экспрессирующих векторов млекопитающих, включают в себя такие элементы, как элемент последовательности, усиливающий экспрессию (EASE), полученный из клеток СНО (Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997); Патенты США с номерами 6312951 B1, 6027915 и 6309841 B1) и состоящий из трех частей лидер (TPL) и РНК гена VA из Adenovirus 2 (Gingeras et al. (1982), J. Biol. Chem. 257:13475-13491). Последовательности внутреннего сайта вхождения рибосом (IRES) вирусного происхождения делают возможной эффективную трансляцию дицистронных мРНК (Oh and Sarnow (1993), Current Opinion in Genetics and Development 3:295-300; Ramesh et al. (1996), Nucleic Acids Research 24:2697-2700). Было показано, что экспрессия гетерологичной кДНК в виде части дицистронной мРНК с последующим геном селектируемого маркера (например, DHFR) улучшает способность к трансфекции хозяина и экспрессию гетерологичных кДНК (Kaufman et al. (1990), Methods in Enzymol. 185:487-511). Примерными экспрессирующими векторами, которые используют дицистронные мРНК, являются pTR-DC/GFP, описанные Mosser et al., Biotechniques 22:150-161 (1997), и p2A5I, описанный Morris et al., in Animal Cell Technology, pp. 529-534 (1997).

Применимый вектор высокой экспрессии, pCAVNOT, был описан Mosley et al. ((1989), Cell 59:335-348). Другие экспрессирующие векторы для применения в клетках-хозяевах млекопитающих могут быть сконструированы, как описано Okayama and Berg ((1983), Mol. Cell. Biol. 3:280). Применимая система для стабильной экспрессии высокого уровня кДНК млекопитающих в эпителиальных клетках молочной железы мыши С127 может быть сконструирована в основном, как описано Cosman et al. ((1986), Mol. Immunol. 23:935). Применимый вектор высокой экспрессии, PMLSV N1/N4, описанный Cosman et al. ((1984), Nature 312:768), был депонирован как ATCC 39890. Дополнительные применимые экспрессирующие векторы млекопитающих описаны в Европейском патенте № -A-0367566 и WO 01/27299 A1. Эти векторы могут быть произведены из ретровирусов. Вместо природной сигнальной последовательности, может быть добавлена гетерологичная сигнальная последовательность, такая как одна из следующих последовательностей: сигнальная последовательность для IL-7, описанная в патенте США № 4965195; сигнальная последовательность для IL-2-рецептора, описанная в Cosman et al. (Nature 312:768 (1984)); сигнальный пептид IL-4, описанный в Европейском патенте № 0367566; сигнальный пептид IL-1-рецептора типа I, описанный в патенте США № 4968607; и сигнальный пептид IL-1-рецептора типа II, описанный в Европейском патенте № 0460846.

Эти полипептиды могут быть получены рекомбинантно в эукариотических клетках и предпочтительно секретированы клетками-хозяевами, адаптированными к росту в культуре клеток. Клетки-хозяева для применения в этом изобретении являются предпочтительно клетками млекопитающих. Эти клетки могут быть также генетически сконструированы для экспрессии представляющего интерес гена, могут быть продукционными клетками млекопитающих, адаптированными для роста в культуре клеток, и/или могут быть однородными клеточными линиями. Примерами таких клеток, обычно используемых в промышленности, являются клетки VERO, BHK, HeLa, CV1 (в том числе COS), MDCK, 293, 3T3, линии миеломных клеток (например, NSO, NS1), PC12, WI38 и клетки яичника китайского хомячка (CHO), которые широко используются для получения нескольких комплексных рекомбинантных полипептидов, например, цитокинов, факторов свертывания и антител (Brasel et al. (1996), Blood 88:2004-2012; Kaufman et al. (1988), J.Biol Chem 263:6352-6362; McKinnon et al. (1991), J Mol Endocrinol 6:231-239; Wood et al. (1990), J. Immunol. 145:3011-3016). Дигидрофолатредуктаза (DHFR)-недостаточные линии мутантных клеток (статья Urlaub et al. (1980), Proc Natl Acad Sci USA 77: 4216-4220, которая включена здесь в виде ссылки), DXB11 и DG-44 являются желаемыми линиями клеток-хозяев СНО, так как эта эффективная DHFR-селектируемая и амплифицируемая система экспрессии генов делает возможной экспрессию высокого уровня рекомбинантного полипептида в этих клетках (статья Kaufman R.J. (1990), Meth Enzymol 185:537-566, включенная здесь в виде ссылки). Кроме того, эти клетки легко поддаются манипуляции в виде прикрепленных или суспензионных культур и проявляют относительно хорошую генетическую стабильность. Клетки СНО и рекомбинантные полипептиды, экспрессируемые в них, были экстенсивно охарактеризованы и были одобрены для применения в клиническом коммерческом изготовлении регулирующими ведомствами. Способы этого изобретения могут также практиковаться с использованием гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитело. Способы получения гибридомных линий хорошо известны в данной области. См., например, Berzofsky et al. in Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, pp.315-356, at 347-350, Raven Press Ltd., New York (1989). Клеточные линии, произведенные из вышеуказанных линий, также пригодны для применения на практике этого изобретения.

После трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего, например, клетки СНО, полинуклеотидными последовательностями, кодирующими рекомбинантный белок, клетки, демонстрирующие стабильную экспрессию этого рекомбинантного белка, идентифицируют и выделяют. Стабильная экспрессия рекомбинантного белка достигается трансфекцией подходящих ДНК-векторов в дигидрофолатредуктаза-недостаточные (DHFR-) клетки яичника китайского хомячка (CHO AM-1/D, патент США № 6210924) с последующим выделением и тестированием индивидуальных клонов, демонстрирующих наивысшую экспрессию рекомбинантного белка, в соответствии со способами, известными в данной области. На основе роста и продуцирования в маломасштабных центрифугах и крупномасштабных реакторах, выбирают конкретную клеточную линию в качестве клеточной линии для производства рекомбинантного белка.

Клетки, продуцирующие наивысшие уровни рекомбинантного белка, могут быть клонированы хорошо известными в данной области способами, например, множественными раундами лимитирующего разведения в 96- и/или 24-луночных планшетах при бессывороточных условиях, с использованием среды культуры клеток данного изобретения. Клоны отбирали на основе характеристик продуцирования и роста в различных суспензионных сосудах. Ферментные иммуноанализы (EIA) могут выполняться для отбора клона, который продуцирует наивысший уровень рекомбинантного белка. Характеристики роста, в том числе время удвоения и плотности, могут быть измерены выращиванием этих клонов в различных колбах для шейкеров или центрифуг и биореакторах с размерами в диапазоне от 100 мл до 3 л. Оптимальный клон, например, клон с наиболее быстрым временем удвоения, который достигает наивысшей плотности в культуре, отбирают и выбирают в виде клеточной линии для применения в получении рекомбинантного белка. В одном варианте осуществления, это получение рекомбинантного белка является получением для коммерческих целей и выполняется в крупномасштабном биореакторе.

Обычно культивирование клеток выполняют при стерильных условиях с контролируемыми температурой и атмосферными условиями в планшетах для культуры ткани (например, 10-см-чашках, 96-луночных планшетах, и т.д.) или другой прикрепленной культуре (например, на гранулах-микроносителях) или в суспензионной культуре, например, в роллерных флаконах. Культуры могут выращиваться во встряхиваемых колбах, маломасштабных биореакторах и/или крупномасштабных биореакторах. Биореактор является устройством, используемым для культивирования клеток, в котором условия окружающей среды, такие как температура, атмосфера, перемешивание и/или рН могут подвергаться мониторингу, корректироваться и регулироваться. Способы, включающие в себя способы с подпиткой, и композиции этого изобретения могут быть использованы в крупномасштабной культуре клеток млекопитающих, например, 10 л, 11 л, 12 л, 13 л, 14 л и т.д. В одном варианте осуществления, крупномасштабные способы и композиции этого изобретения являются подходящими для культуры клеток СНО и получения антител.

Согласно данному изобретению, клетку-хозяина млекопитающего культивируют при условиях, которые стимулируют продуцирование представляющего интерес полипептида, который может быть антителом или рекомбинантным полипептидом. Квалифицированный в данной области специалист сможет выбрать применение одной или нескольких из описанных здесь сред, которые были разработаны для максимизации роста клеток, жизнеспособности клеток и/или продуцирования рекомбинантного полипептида в конкретной культивируемой клетке-хозяине. Альтернативно, способы и композиции согласно данному изобретению могут быть использованы в комбинации с коммерчески доступными средами культуры клеток.

Подходящие условия культуры для клеток млекопитающих известны в данной области (см., например, Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford university press, New York (1992)) и могут быть объединены с улучшенными способами этого изобретения. Клетки млекопитающих могут культивироваться в суспензии или в виде прикрепленных к твердому субстрату клеток. Кроме того, клетки млекопитающих могут культивироваться, например, в биореакторах с псевдоожиженным слоем, например, биореакторах с полыми волокнами, роллерных флаконах, встряхиваемых колбах или перемешиваемых биореакторах в виде резервуаров (чанов), с микроносителями или без микроносителей, и функционировать в периодическом, с подпиткой, непрерывном, полунепрерывном или перфузионном режиме.

Способы в соответствии с данным изобретением могут быть использованы для улучшения продуцирования рекомбинантных полипептидов в процессах культивирования как с единственной фазой, так и с множественными фазами. В процессе с единственной фазой, клетки инокулируют в среду культуры и используют описанные способы во время единственной продукционной фазы. В процессе с множественными фазами, клетки культивируют в двух или более отдельных фазах. Например, клетки могут культивироаться сначала в фазе роста, при условиях среды, которые максимизируют пролиферацию и жизнеспособность клеток, затем переносят в продукционную фазу, при условиях, которые максимизируют продуцирование полипептида. Фаза роста и продукционная фаза могут предшествовать одной или нескольким фазам переноса или быть разделены одной или несколькими фазами переноса. В процессе с множественными фазами, способы данного изобретения используют по меньшей мере во время продукционной фазы.

Для целей понимания, но без ограничения, квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что культуры клеток и циклы культивирования для продуцирования белка могут включать в себя три общих типа, а именно, непрерывную культуру, периодическую культуру и культуру с подпиткой. Например, в непрерывной культуре добавление свежей культуральной среды (т.е. загрузочной среды) обеспечивают клеткам во время периода культивирования при удалении старой среды один раз в день или непрерывно, и продукт собирают, например, один раз в день или непрерывно. В непрерывной культуре загрузочная среда может добавляться один раз в день и может добавляться непрерывно, т.е. в виде капельного добавления или инфузии. Для непрерывного культивирования клетки могут оставаться в культуре так долго, как желательно, пока эти клетки остаются живыми и поддерживаются условия окружающей среды и культивирования.

В периодической культуре клетки сначала культивируют в среде и затем эту среду не удаляют, не заменяют и не дополняют, т.е. клетки не подпитывают новой средой во время или перед концом цикла культивирования. Желаемый продукт собирают в конце цикла культивирования.

Для культур с подпиткой, время цикла культивирования увеличивают дополнением культуральной среды один или несколько раз в день (или непрерывно) питательными растворами во время этого цикла, т.е. клетки «подпитывают» подпитывающей средой во время периода культивирования. Культуры с подпиткой могут включать в себя различные схемы и периоды подпитки, как описано ниже, например, ежедневно, каждый второй день, каждые два дня и т.д., более чем один раз в день или менее чем один раз в день и т.д. Далее, культуры с подпиткой могут подпитываться непрерывно подпитывающей средой. Затем желаемый продукт собирают в конце цикла культивирования/продуцирования. Данное изобретение предпочтительно включает в себя культуры клеток с подпиткой, с подпитыванием с использованием оптимизированных подпитывающих растворов, которые увеличивают продуцирование белка и могут удлинять фазу продуцирования белка.

Улучшенная культура с подпиткой: обогащенные гидролизатом и базальной средой растворы

Один аспект этого изобретения описывает способы и композиции для увеличения продуцирования белка с использованием усовершенствованного способа с подпиткой в комбинации с дополнительными растворами базальной среды и гидролизатов. Этот усовершенствованный способ с подпиткой, частично, основан на добавлении двух обогащенных растворов, т.е. обогащенного гидролизатами раствора и базального обогащенного раствора, которые добавляют к среде культуры клеток во время периода времени во время продуцирования белка. Обогащенный гидролизатами раствор, используемый в способе с подпиткой этого изобретения, содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного происхождения или животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения. Примером гидролизата, который получен из продуктов не растительного происхождения или животного происхождения, является гидролизат дрожжей. Примером гидролизата продуктов растительного происхождения, который может быть использован в обогащенном растворе гидролизата, является гидролизат сои. Базальный обогащенный раствор включает в себя базальную среду, например, PF CHO, аспарагин и глюкозу, а обогащенный гидролизатом раствор включает в себя по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения. Эти обогащенный гидролизатом раствор и базальный обогащенный раствор добавляют в культуру клеток с интервалами во время периода времени культуры, например, с интервалами в один день во время 11-15-дневного периода времени, и они могут добавляться в один и тот же день или в разные дни.

Это изобретение описывает способ с подпиткой для получения анти-TNFα-антитела, например, адалимумаба/D2E7, предусматривающий культивирование клеток яичника китайского хомячка (СНО), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNFα-антитело, в культуре клеток при температуре культивирования в диапазоне 32-38°C. В одном варианте осуществления, температура культивирования равна 35°C. Клетки CHO снабжаются обогащенным гидролизатом раствором и базальным обогащенным раствором для регуляции, например, устранения или коррекции дефицитов питательных веществ для максимизации продуктивности. Эти обогащенные гидролизатом растворы или базальные обогащенные растворы добавляют в культуру клеток. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток содержит 20 - 65% растворенного кислорода, например, приблизительно 30% растворенного кислорода. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток содержит уровень глюкозы, необходимый для продуцирования белка, например, по меньшей мере приблизительно 1-5 г/л глюкозы. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток содержит 1,5-2,5 г/л глюкозы. В следующем варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток содержит 2,0 г/л глюкозы. Концентрация глюкозы может регулироваться на протяжении процесса культивирования для продуцирования белка добавлением глюкозы в продукционную среду культуры клеток по мере необходимости для поддержания заданной концентрации, например, по меньшей мере 2,0 г/л глюкозы. В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатами раствор, используемый в способе с подпиткой для анти-TNFα-антитела, содержит приблизительно 50-280 г/л гидролизата сои (в том числе диапазоны и числа в них, например, 100-225, 50-225, 255-275 и 265 г/л) и приблизительно 75-300 г/л гидролизата дрожжей (в том числе диапазоны и числа в них, например, 100-250, 150-200, 145-175 и 165 г/л).

Базальный обогащенный раствор, оптимизированный для применения в способе с подпиткой для получения анти-TNFα-антитела, например, адалимумаба/D2E7, в клетках CHO, имеет pH приблизительно 9,0-10,5 (в том числе диапазоны и числа в них, например, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,1, 10,2, 10,3, 10,4, 10,5). Период времени, во время которого добавляют обогащенный гидролизатом раствор и базальный обогащенный раствор, составляет 9-15 дней, например, 12 дней. В одном варианте осуществления, базальный обогащенный раствор добавляют в среду культуры по меньшей мере в один из следующих дней этого периода времени: день 4, день 6, день 9 и день 11, а обогащенный гидролизатом раствор добавляют в среду культуры клеток в день 4, день 7 или день 4 и день 7 этого периода времени. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин, также являются частью этого изобретения.

В другой альтернативе, способ с подпиткой для получения анти-TNFα-антитела, например, адалимумаба/D2E7, может включать в себя коррекцию рН среды культуры клеток в соответствии с линейным снижением рН, начинающимся от рН приблизительно 6,5-8, например, 7,1-7,2, и приводящим к конечному рН приблизительно 6,9. В одном варианте осуществления, линейное снижение pH корректируют на протяжении периода по меньшей мере приблизительно 24 часов, 48 часов или 72 часов.

Это изобретение описывает также способ с подпиткой получения IL-12-антитела, например, ABT-874, предусматривающий культивирование клеток яичника китайского хомячка (СНО), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-IL-12-антитело, в культуре клеток при температуре культивирования в диапазоне 32-38°C, например, 33°C. Обогащенный гидролизатом раствор, используемый для получения IL-12-антитела, может также содержать глюкозу. В одном варианте осуществления, клетки CHO культивируют при рН 6,9. Эти клетки CHO снабжают обогащенным раствором гидролизата и обогащенным раствором базальной среды для поддержания пищевых недостаточностей для максимизации продуктивности. Эти обогащенные растворы гидролизата и базальной среды добавляют в культуру клеток. В одном варианте осуществления, продукционная среда культуры клеток содержит 20 - 65% растворенного кислорода, например, приблизительно 40% растворенного кислорода. В одном варианте осуществления, обогащенный гидролизатом раствор, используемой в этом способе с подпиткой для анти-IL-12-антитела, содержит приблизительно 50-280 г/л гидролизата сои (в том числе диапазоны и числа в них, например, 100-225, 50-225, 255-275 и 265 г/л), приблизительно 75-300 г/л гидролизата дрожжей (в том числе диапазоны и числа в них, например, 100-250, 150-200, 145-175 и 165 г/л) и приблизительно 2-3 г/л глюкозы, например, 2,4 г/л глюкозы. Обогащенный раствор базальной среды, оптимизированный для применения в способе с подпиткой для экспрессии анти-IL-12-антитела, например, ABT-874, в клетках CHO имеет pH приблизительно 9,7 и осмолярность приблизительно 1480 мОсм. Временной период, во время которого добавляют обогащенный гидролизатом раствор и обогащенный раствор базальной среды, находится между 14-15 днями, например, составляет 12 дней. В одном варианте осуществления, обогащенный раствор базальной среды добавляют к продукционной среде культуры клеток каждый второй день, начиная с дня 5 этого временного периода, а обогащенный гидролизатом раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток каждый день, начиная с дня 6 этого временного периода. Альтернативно, обогащенный раствор базальной среды добавляют и обогащенный гидролизатом раствор могут быть добавлены к продукционной среде культуры клеток каждый день, начиная с дня 5 этого временного периода. Предполагается, что числа, промежуточные относительно величин вышеуказанного диапазона, также являются частью этого изобретения.

Стабильный подпитывающий раствор высокой концентрации

Один аспект этого изобретения описывает способы и композиции, относящиеся к улучшенному, стабильному подпитывающему раствору высокой концентрации для улучшения продуктивности белка. Этот улучшенный подпитывающий раствор может быть использован для добавления к продукционной среде культуры клеток в получении антитела. Этот подпитывающий раствор содержит глюкозу (например, 100-250 г/кг); базальную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин, например, аспарагин (например, 1,0-15,0 г/кг; 3-12,5 г/кг или 3-5 г/кг); и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения. Кроме того, этот подпитывающий раствор имеет рН приблизительно 6,0-7,5. Эти два различных гидролизата продуктов не животного происхождения могут включать гидролизат продуктов растительного происхождения, например, гидролизат сои, и гидролизат, который является гидролизатом продуктов не животного происхождения и продуктов не растительного происхождения, например, гидролизат дрожжей. Любая базальная среда, известная в данной области, может быть использована в этом улучшенном подпитывающем растворе, в том числе, но не только, среда PF CHO или DMEM/F12. Может быть также использована модифицированная базальная среда. В одном варианте осуществления, эта базальная клеточная среда исключает следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество, глутамин и глюкозу. Эта улучшенная подпитывающая среда является стабильной, имеет мутность менее приблизительно 15 NTU. Это изобретение включает в себя также поддержание постоянного уровня глюкозы продукционной среды культуры клеток добавлением этого подпитывающего раствора. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин диапазонов, также являются частью этого изобретения, например, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,6, 3,8, 4, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 и 5 г/кг аспарагина.

В настоящее изобретение включен также способ приготовления подпитывающего раствора, содержащего глюкозу и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения. Способ приготовления этого подпитывающего раствора включает в себя объединение глюкозы и базальной клеточной среды в комбинированный раствор и доведение рН этого комбинированного раствора до приблизительно 9,5-10,5. Затем к этому раствору добавляют по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения и рН опять корректируют таким образом, что полученный подпитывающий раствор имеет рН 6,5-7,5. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин диапазонов, также являются частью этого изобретения, например, pH 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5.

Подпитывающий раствор настоящего изобретения может быть использован для достижения высоких уровней получения рекомбинантого белка, например, получения антитела, из культуры клеток млекопитающего. В одном варианте осуществления, это изобретение описывает способ получения по меньшей мере 1,5 г/л антитела из культуры клеток млекопитающего, предусматривающий культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток. Затем подпитывающий раствор, имеющий рН приблизительно 6,7-7,0, добавляют к этой продукционной среде культуры клеток. Этот подпитывающий раствор включает в себя глюкозу (например, приблизительно 100-250 г/кг); базальную клеточную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения. В одном варианте осуществления, такой процесс приводит по меньшей мере к 2 г/л получаемого антитела; по меньшей мере 4 г/л получаемого антитела; по меньшей мере приблизительно 5 г/л антитела и по меньшей мере 6 г/л антитела. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин, также являются частью этого изобретения, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5 г/л антитела.

С использованием подпитывающего раствора, имеющего рН приблизительно 6,7-7,2 и включающего в себя следующие компоненты: глюкозу; базальную клеточную среду; приблизительно одну аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, титр антитела, получаемого из культуры клеток млекопитающего, может быть увеличен. В одном варианте осуществления, добавление этого подпитывающего раствора к продукционной среде культуры клеток для клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, приводит к увеличению по меньшей мере на 50% большему, чем увеличение в контрольной культуре клеток млекопитающего, которые культивируют без добавления этого подпитывающего раствора. В одном варианте осуществления, добавление этого подпитывающего раствора приводит к увеличению титра по меньшей мере на 100% большего, чем контроль. В одном варианте осуществления, добавление этого подпитывающего раствора приводит к увеличению титра по меньшей мере на 150% большего, чем контроль. Этот дополнительный подпитывающий раствор может быть добавлен в культуру клеток при определенной плотности, например, при достижении плотности клеток по меньшей мере 2,0×10⁶ клеток/мл или при достижении плотности клеток по меньшей мере 3,5×10⁶ клеток/мл. Предполагается, что числа, промежуточные относительно вышеуказанных величин, также являются частью этого изобретения. Предполагается, что диапазоны величин, использующие комбинацию любой из вышеуказанных величин в качестве верхней и/или нижней границ, включены в объем этого изобретения.

Поскольку способы с подпиткой служат для регуляции, например, устранения или коррекции пищевых недостаточностей культуры клеток для продуцирования белка, может быть полезным мониторинг определенных ингредиентов. Ингредиенты, которые могут быть подвергнуты мониторингу, включают в себя любой метаболический индикатор, т.е. индикатор метаболизма клетки. В одном варианте осуществления, способ с подпиткой этого изобретения предусматривает мониторинг уровня глюкозы в среде культуры клеток, так что он поддерживается в диапазоне 0,25-20 г/л. В одном варианте осуществления, уровень глюкозы поддерживается при 0,5-5,5 г/л или 4,0-5,5 г/л. Посредством мониторинга уровней глюкозы может осуществляться непрямой мониторинг метаболизма клеток. Как описано в примере 3 ниже, глюкоза может быть использована в качестве метаболического индикатора. В одном варианте осуществления, культура клеток может быть дополнена питательным компонентом (питательными компонентами), например гидролизатом, этого уровня глюкозы. Способы мониторинга уровней глюкозы известны в данной области и могут включать в себя мониторинг с использованием автоматизированного устройства взятия проб. Другим примером метаболического индикатора, который может быть использован, является глутамин. Предполагается, что числа в вышеуказанных диапазонах, а также все другие числа, указанные здесь, являются также частью изобретения. Предполагается, что диапазоны величин, использующие комбинацию любой из вышеуказанных величин в качестве верхней и/или нижних границ, включены в объем этого изобретения.

Система регуляции с обратной связью может быть использована для мониторинга уровня метаболического индикатора в продукционной среде культуры клеток. В одном варианте осуществления, для получения установленного значения желаемого параметра, например, заданного уровня глюкозы, к продукционной среде культуры клеток добавляют комбинированный подпитывающий раствор, как определено системой регуляции с обратной связью.

Система регуляции с обратной связью может быть также использована для определения профиля подпитки для конкретной культуры клеток млекопитающего и получения представляющего интерес белка. В одном варианте осуществления, способ определения профиля подпитки для продуцирования белка в культуре клеток млекопитающего включает в себя культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую этот белок, и добавление подпитывающего раствора, например, комбинированного подпитывающего раствора, в среду культуры клеток с использованием системы регуляции с обратной связью для мониторинга метаболического индикатора. Этот подпитывающий раствор добавляют в продукционную среду культуры клеток для получения установленного значения метаболического индикатора-мишени, например уровня глюкозы. После завершения этой культуры клеток количество подпитывающего раствора, добавленного в продукционную среду культуры клеток в день, определяют, и это количество обеспечивает профиль подпитки, определяющий, когда подпитывающий раствор должен добавляться в культуру клетки. После установления профиля подпитки, мониторинг метаболического индикатора уже не требуется для конкретной культуры клеток млекопитающего, продуцирующей представляющий интерес белок. Профиль подпитки предоставляет многие преимущества, в том числе уменьшенный риск загрязнения, так как уже не требуется частое взятие проб.

Способы и композиции, использующие N-ацетилцистеин и бутират натрия

Как описано здесь, процессы культуры клеток этого изобретения позволяют выгодным образом получать увеличенный титр антитела. Другой аспект этого изобретения для достижения продуктивности белка в культуре клеток млекопитающего использует добавление бутирата натрия, N-ацетилцистеина или их комбинации к среде культуры клеток. В одном варианте осуществления, это изобретение описывает способ получения антитела добавлением бутирата натрия (например, 0,1-10 мМ), N-ацетилцистеина (например, 1-80 мМ), или их комбинации, к среде культуры клеток. В одном варианте осуществления, титр антитела равен по меньшей мере приблизительно 100 мг/л; по меньшей мере приблизительно 150 мг/л; по меньшей мере приблизительно 200 мг/л; по меньшей мере приблизительно 250 мг/л; по меньшей мере приблизительно 300 мг/л; по меньшей мере приблизительно 350 мг/л или по меньшей мере приблизительно 400 мг/л.

Это изобретение описывает также способ получения антитела в культуре клеток млекопитающего таким образом, что титр антитела улучшается по меньшей мере на 10% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего добавлением бутирата натрия (например, до конечной концентрации 0,1-10 мМ), N-ацетилцистеина (например, до конечной концентрации 1-80 мМ), или их комбинации, к среде культуры клеток (контроль, соответственно, лишен бутирата натрия, N-ацетилцистеина, или их комбинации). В одном варианте осуществления, титр антител культуры клеток млекопитающего улучшается по меньшей мере на 29% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего; по меньшей мере на 40% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего; по меньшей мере на 70% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего или по меньшей мере на 90% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего. Бутират натрия, N-ацетилцистеин, или их комбинация, могут быть добавлены к культуре клеток млекопитающего во время фазы роста этой культуры клеток млекопитающего. В одном варианте осуществления, бутират натрия, N-ацетилцистеин, или их комбинацию, добавляют к культуре клеток млекопитающего в диапазоне 4-7 дней периода культивирования. В одном варианте осуществления, N-ацетилцистеин добавляют, отдельно или вместе с бутиратом натрия, в количестве в диапазоне конечной концентрации 5-80 мМ, например, 20-60 мМ или приблизительно 10 мМ.

Это изобретение описывает также способ продления долговечности культуры клеток млекопитающего по меньшей мере на приблизительно 45% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего добавлением приблизительно 0,1 мМ - 10 мМ N-ацетилцистеина к среде клеток (контроль лишен этого добавления). В одном варианте осуществления, долговечность этой культуры клеток млекопитающего удлиняется по меньшей мере на 35% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего или по меньшей мере приблизительно на 55% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего.

Следует отметить, что среды культуры клеток и улучшенные способы культивирования, описанные здесь, могут быть использованы отдельно или в комбинации друг с другом.

После культивирования с использованием способов и композиций этого изобретения, полученный экспрессированный белок может быть затем извлечен или собран. Кроме того, этот белок может быть очищен или частично очищен из такой культуры или компонента (например, из среды культуры или клеточных экстрактов или биологических жидкостей) с использованием известных способов. Процедуры фракционирования могут включать в себя, но не ограничиваются ими, одну или несколько стадий фильтрации, центрифугирования, осаждения, разделения фаз, аффинной очистки, гель-фильтрации, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC; с использованием таких смол, как фениловый эфир, бутиловый эфир или пропиловый эфир), ВЖХ или некоторую комбинацию вышеописанного.

Например, очистка этого полипептида может включать в себя аффинную колонку, содержащую агенты, которые будут связываться с полипептидом; одну или несколько колоночных стадий через такие аффинные колонки, как конканавалин А-агароза, HEPARIN-TOYOPEARL (среда для хроматографии) или Cibacrom blue 3GA SEPHAROSE (гранулы агарозы); одну или несколько стадий, включающих в себя элюцию, и/или иммуноаффинную хроматографию. Этот полипептид может быть экспрессирован в форме, которая облегчает очистку. Например, он может быть экспрессирован в виде слитого белка, такого как слитые полипептиды с мальтозусвязывающим белком (MBP), глутатион-S-трансферазой (GST) или тиоредоксином (TRX). Наборы для экспрессии и очистки таких слитых полипептидов коммерчески доступны из New England BioLab (Beverly, Mass.), Pharmacia (Piscataway, NJ.) и InVitrogen, соответственно. Этот белок может быть маркирован эпитопом и затем очищен с использованием специфического антитела, нацеленного на такой эпитоп. Один такой эпитоп FLAG (эпитопная метка) коммерчески доступен из Kodak (New Haven, Conn.). Можно также использовать аффинную колонку, содержащую полипептидсвязывающий полипептид, такой как моноклональное антитело к этому рекомбинантному белку, для аффинной очистки экспрессированных полипептидов. Другими типами стадий аффинной очистки могут быть Белок А- или Белок G-колонки, аффинные агенты которых связываются с белками, которые содержат Fc-домены. Полипептиды могут быть извлечены из аффинной колонки с использованием общепринятых способов, например, в буфере для элюции с высокой концентрацией соли, и затем диализованы в низкосолевой буфер для использования, или изменением рН или других компонентов в зависимости от используемого аффинного матрикса, или могут быть извлечены конкурентно с использованием природно-встречающегося субстрата аффинной части молекулы. В одном варианте осуществления, антитела, полученные с использованием способов и композиций этого изобретения, очищают в соответствии со способами, описанными в Заявке на патент США № 11/732918, включенной здесь в виде ссылки.

Желаемая степень конечной чистоты зависит от предполагаемого применения полипептида. Способ и композиции этого изобретения пригодны для терапевтических применений представляющего интерес белка. Таким образом, относительно высокая степень чистоты желательна, когда полипептид должен вводиться in vivo. В таком случае, эти полипептиды очищают таким образом, что никакие полипептидные полосы, соответствующие другим полипептидам, не детектируются после анализа электрофорезом в ДСН-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ). Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что электрофорезом в ДСН-ПААГ могут быть визуализированы множественные полосы, соответствующие этому полипептиду, вследствие дифференциального гликозилирования, дифференциального процессинга и т.п. Наиболее предпочтительно, полипептид этого изобретения очищают по существу до гомогенности, о чем свидетельствует единственная полоса полипептида после анализа электрофорезом в ДСН-ПААГ. Эта полоса полипептида может быть визуализирована окрашиванием серебром, окрашиванием Кумасси синим или (если этот полипептид является радиоактивно меченым) авторадиографией.

Это изобретение включает в себя, необязательно, также приготовление этих белков. Под термином «приготовление» имеется в виду, что эти белки могут быть подвергнуты смене буфера, стерилизованы, упакованы в большом объеме и/или упакованы для конечного пользователя. Такие композиции могут содержать эффективное количество этого белка, в комбинации с другими компонентами, такими как физиологически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент. Термин «физиологически приемлемый» обозначает нетоксичный материал, который не мешает эффективности биологической активности этого активного ингредиента (ингредиентов).

Следует отметить, что в отношении приведенных здесь чисел, предполагается, что числа, которые являются промежуточными относительно вышеуказанных диапазонов, а также все другие приведенные числа, являются также частью этого изобретения. Предполагается также, что диапазоны величин, использующие комбинацию любых из указанных величин, указанных в качестве верхней и/или нижней границы, включены в объеме этого изобретения.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры иллюстрируют усовершенствованные способы и композиции для культивирования клеток, в том числе усовершенствованные способы и композиции для экспрессии биологических агентов в клетках млекопитающих. Улучшенная среда с биохимически определенным составом для культивирования клеток яичника китайского хомячка (СНО), используемая для экспрессии различных рекомбинантных биологических агентов, описана ниже. Кроме того, иллюстрированы также среды для крупномасштабной культуры клеток в биореакторах, работающих при разных конфигурациях и масштабах, содержащие одни и те же компоненты, но с различающимся балансом компонентов, и обогащенные для возможности большего роста клеток и увеличенной экспрессии продукта.

ПРИМЕР 1

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Обычно, среда культуры клеток млекопитающих, например, яичника китайского хомячка (СНО), основана на коммерчески доступных препаратах сред, таких как DMEM, Ham F12 или комбинациях этих типов сред. Для получения белков в клетках млекопитающих, среда культуры клеток должна быть достаточно обогащенной для поддержания увеличений как роста клеток, так и биологического продукта экспрессии. Следующий пример описывает усовершенствованную среду с биохимически определенным составом для культивирования клеток млекопитающих, т.е. клеток яичника китайского хомячка (СНО), для экспрессии различных рекомбинантных биологических агентов, в том числе антител.

Клетки яичника китайского хомячка (СНО), недостаточные в отношении дигидрофолатредуктазы [dhfr(-)], адаптировали для роста в суспензии в отсутствие сыворотки или любого другого материала, полученного из животного источника. Клетки росли в отсутствие гипоксантина и тимидина, в среде культуры клеток определенного состава, полученной из коммерческого источника, JRH PF-CHO (Catalog # 67147). Хотя эта линия не была дефектной в отношении глутаминсинтазы, в среду культуры добавляли дополнительный глутамин.

Линии клеток CHO, экспрессирующие биологические агенты, такие как антитела к конкретной мишени, генерировали с использованием молекулярно-биологических способов, хорошо известных в данной области. Вкратце, экспрессирующий вектор, способный экспрессировать представляющее интерес антитело и способный экспрессировать ген фермента dhfr, вводили в клетки СНО с использованием способов, хорошо известных в данной области. Трансфицированные представляющие интерес клетки получали отбором этих клеток в присутствии гипоксантина и тимидина. Далее, отобранные трансформанты культивировали с увеличивающимися концентрациями метотрексата для амплификации трансфицированных генов и увеличения выхода экспрессируемых белков. Эта усовершенствованная среда культуры клеток, используемая для культивирования клеток СНО, описана ниже.

Пример 1.1

Среда для культуры клеток яичника китайского хомячка

Обычно композиции сред для культивирования клеток СНО готовят из трех частей, обозначенных как Части А, В и С. Часть А была базальной средой и содержала воду, аминокислоты, витамины, неорганические соли металлов, микроэлементы, этаноламин, путресцин, поверхностно-активное вещество, пируват натрия, глутатион и 2-меркаптоэтанол. Часть В содержала неорганический источник железа и Часть С содержала рекомбинантные факторы роста, буферы и регулятор осмолярности, источник энергии, различные ионы цветных металлов, поверхностно-активное вещество и гидролизаты. Эти компоненты среды были в основном неорганическими или происходили из рекомбинантного источника и были высокоочищенными. Эти среды не содержали белков, липидов и углеводов из источников-животных. Комплексные гидролизаты получали из тщательно обработанных источников дрожжей и растений.

Часть А этой среды включала в себя безбелковую среду СНО (PF CHO) (JRH - SAFC Biosciences; JRH Cat # 67147 - также называемую исходной Частью А). Таким образом, Часть A включала в себя базальную среду, включающую в себя воду, аминокислоты и витамины. Эта базальная среда (PF CHO) была выбрана для модификации и повторного приготовления для поддержания дополнительных увеличений роста клеток и продуктивности экспрессируемого белка. PF CHO модифицировали для удаления определенных компонентов, в том числе бикарбоната натрия, буфера HEPES, одноосновного фосфата, двухосновного фосфата, регулятора осмолярности, поверхностно-активного вещества и моносахарида глюкозы (модифицированную PF CHO называют здесь модифицированной Частью A (также называемой здесь JRH Catalog # 67411)). Эти модификации производили также для облегчения усовершенствований в условиях процесса культуры клеток в крупномасштабных биореакторах.

Компонент Части В (JRH) состоял из концентрированного раствора цитрата трехвалентного железа, добавляемого отдельно. Концентрацию компонента Части В поддерживали постоянной во всех проектах с использованием культуры клеток СНО.

Компоненты Части С включали в себя фактор роста, например инсулин, и аминокислоту глутамин, TC Yeastolate и гидролизат сои Фитон, метотрексат, необходимый для сохранения давления отбора, и основание NaOH и кислоту HCl для доведения рН после гидратации этих сред во время приготовления.

Композиции усовершенствованных сред культуры клеток готовили следующим образом. Сначала клетки СНО выращивали исходно в среде PF-CHO (SAFC-JRH Catalog No. 67147), полученной из JRH. Среду PF-CHO (Catalog # 67147) дополнительно модифицировали для применения с линиями клеток СНО, как описано ниже. Эту модифицированную среду называли JRH с новым Catalog # 67411. Задачей этих модификаций было получение возможности увеличения концентраций Части А среды культуры клеток таким образом, что осмолярность и рН не изменялись. Эта исходная Часть А (Cat # 67147), согласно изготовителю (JRH), не содержит бикарбоната натрия, глутамина и белка (в нее не добавлены инсулин или другой белковый или пептидный факторы роста). Затем эти устраненные компоненты добавляют к композициям Части А 67147 и 67411 независимо, специально для клеточных линий CHO, когда они оказываются эффективными. Они становятся некоторыми из компонентов, описанных более подробно ниже в виде Части С.

Таблица 1
Сравнение исходной композиции культуры клеток (Части А 67147) с модифицированной композицией среды культуры клеток (модифицированной Части А 67411)
Компонент	Среда культуры клеток, содержащая 67147 (RM-003) (Исходную Часть А) Часть А)	Среда культуры клеток, содержащая модифицированную среду (модифицированную 67411 (RM-230) (модифицированную Часть А) при 1Х, 2Х, 3Х и 4Х г/л
Часть А:
Исходный порошок Части А: Источник JRH только концентрация 1Х	16,45 г/л	NA
Модифицированная Часть А: Особый источник JRH выбранные компоненты без бикарбоната натрия, HEPES и одно- и двухосновного фосфатов натрия, регулятора осмолярности хлорида натрия, поверхностно-активного вещества Плюроника F-68 и моносахарида глюкозы	NA	2,63, 5,26, 7,89 и 10,52 г/л
Часть В:
Часть В: Исходный раствор цитрата трехвалентного железа JRH	10 мл/л (0,5 мМ)	10 мл/л (0,5 мМ)
Часть С:
Фактор роста, моносахарид, источник энергии - аминокислота: множественные уровни
Рекомбинантный инсулин	2-4 мг/л	4-13 мг/л
Глюкоза	1,5-3,5 г/л	до 7,0 г/л максимально
L-глутамин	0,292 г/л	0,584 г/л
Буферы: поддерживаемые до единственной концентрации
Бикарбонат натрия	1,6 г/л	1,6 г/л
HEPES	NA	1,8 г/л
NaH2PO4∙Н2О	NA	0,031 г/л

Na2HPO4∙7Н2О	NA	0,436 г/л
Регулятор осмолярности: множественные уровни на одну технологическую линию
NaCl	NA	0-6,5 г/л
Гидролизаты, множественные уровни на одну технологическую линию
Bacto TC Yeastolate	NA	2,0-10,7 г/л
Пептон BD Фитон (соя)	NA	0-6,92 г/л
Приматон	NA	2-8 г/л
Другие/дополнительные агенты
Давление отбора (система dhfr): множественные уровни на одну технологическую линию
Метотрексат	до необходимого уровня амплификации	до необходимого уровня амплификации
Поверхностно-активное вещество-протектор против усилий сдвига: единственный уровень
Плюроник F-68	1,0 г/л	1,0 г/л
Кислота-основание для коррекции рН
NaOH	по необходимости	по необходимости
HCl	по необходимости	по необходимости
Растворы-мишени
Конечный рН	7,2-7,4	7,1-7,3
Конечная осмолярность	280-320	320-450

Часть А среды культуры клеток для культуры клеток СНО

Как описано выше, Часть А усовершенствованной среды культуры клеток содержала модифицированную версию базальной среды, т.е. среду PF-CHO. Среду PF-CHO (Catalog No. 67147), полученную из JRH, модифицировали удалением буферов бикарбоната натрия, HEPES и одно- и двухосновных фосфатов, регулятора осмолярности хлорида натрия, поверхностно-активного вещества Плюроника F-68 и моносахарида глюкозы из Части А. Эти компоненты добавляли обратно к Части А в различных концентрациях в зависимости от необходимости конкретного проекта культуры клеток. Это позволяло поддерживать постоянной концентрацию буферов и поддерживать концентрацию поверхностно-активных веществ ниже уровней, токсичных для этих клеток, с сохранением возможности манипулирования уровнями осмолярности и субстрата углерода для увеличенного роста клеток и увеличенного продуцирования антитела. После отделения этих компонентов из исходной композиции Части А JRH, это облегчало увеличения концентрации остальных компонентов в Части А JRH, как видно в модифицированной среде культуры клеток (модифицированной PF CHO - называемой # 67411 в таблице 1), что делало возможными увеличенный рост клеток и увеличенную экспрессию антитела, как определено по титру антител. Индивидуальные компоненты модифицированной композиции порошка Части А (67411), в том числе аминокислоты, витамины, микроэлементы и другие разнообразные фракции компонентов, увеличивались максимально в четыре раза в сравнении с концентрацией исходной композиции без изменения объема среды. Сравнение исходной композиции Части А с использованием 67147 и модифицированной композиции с использованием 67411 описано выше в таблице 1.

По определению, исходной базальной средой JRH PF CHO (catalog # 67147) была базальная среда PF CHO без глутамина и без бикарбоната натрия. Исходная концентрация глюкозы в Части 1 была равна 1,5 мг/л.

Часть В среды культуры клеток для культуры клеток СНО

Компонент Части B среды культуры клеток содержал концентрированный раствор цитрата трехвалентного железа, который был таким же, что и компонент Части В в среде PF-CHO (Catalog No. 67147), полученный из JRH, и его добавляли отдельно.

Неорганические источники железа, такие как соли трехвалентного и двухвалентного железа, в частности цитрат трехвалентного железа и сульфат двухвалентного железа, добавляли в базальную среду, т.е. Часть А или модифицированную Часть А. Хотя добавляли малое количество сульфата двухвалентного железа (0,2-0,8 мг/л) и негидрата нитрата трехвалентного железа (0,025-0,11 мг/л), предпочтительными были хелатированные соли, такие как цитрат трехвалентного железа. Цитрат трехвалентного железа добавляли в более высокой концентрации в виде жидкой добавки и включали в среду культуры клеток в виде Части В PF-CHO. Хотя концентрация других компонентов среды может изменяться и иметь более высокий диапазон концентраций, цитрат трехвалентного железа поддерживали до единственной концентрации 122 мг/л. Это было вызвано образованием супероксидов и свободных радикалов вследствие повреждения клеток и образованием нежелательных соединений в базальной среде.

Часть С среды культуры клеток для культуры клеток СНО

Часть С среды культуры клеток содержала прежде всего рекомбинантные факторы роста, буферы, регулятор осмолярности, источник энергии и гидролизаты. Дополнительные соединения, добавляемые к среде культуры клеток, которые не включены в обычные группы аминокислот, витаминов и кофакторов, неорганические соли и буферы, микроэлементы или минеральные соединения, в ходе развития, описаны в таблице 1 выше в виде “Части С”. Что касается Части C, описанной ниже в таблице 1, следует отметить, что ингредиенты, описанные в Части С, могут добавляться по отдельности или в комбинации.

Рекомбинантные факторы роста

Пептидный гормон инсулин, или альтернативно рекомбинантный аналог, добавляли к среде культуры клеток в диапазоне концентрациий 4-13 мг/л. IGF-1 может быть также использован вместо инсулина или добавлен к инсулину, добавленному в эту среду культуры клеток в концентрации 50-100 нг/л.

Регулятор осмолярности

Осмолярность в различных средах культуры клеток была в диапазоне 260 мОсм - 460 мОсм. Регуляция осмолярности осуществлялась посредством солей, в частности, NaCl, KCl и KNO₃, хотя все из аминокислот и гидролизатов в значительной степени вносят вклад в изменение осмолярности.

Источник энергии

Наиболее изобилующим моносахаридом в этой среде была глюкоза (D-глюкоза), и она добавлялась по мере необходимости. Исходная концентрация в среде культуры клеток находилась в диапазоне 3,5-7,0 г/л. Могут добавляться другие сахара в качестве метаболита или протектора против сдвигающего усилия, и они могут включать в себя мальтозу, маннозу, галактозу или фруктозу.

Гидролизаты

Гидролизаты считаются дополнительным источником свободных аминокислот вместе с ди- и трипептидами.

Поддержание рН (буфер)

Различные буферы используют для поддержания рН в среде культуры клеток в диапазоне 6,5-7,5. Неорганические буферы (или буферная система), используемые в этих средах, включают в себя карбонаты (NaHCO₃), хлориды (CaCl₂), сульфаты (MgSO₄) и фосфаты (NaH₂PO₄ и Na₂HPO₄). Органические буферы включают в себя также пируват натрия (C₃H₃O₃Na) и N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновая кислота], известный также как HEPES.

Глутамин

Глутамин также включали в Часть С, когда его удаляли как из исходной Части А, так и модифицированной Части А. Глутамин включали в Часть С, например, 0,2-0,4 (0,29) г/л в среде культуры клеток, содержащей исходную Часть А, и 0,3-0,7, например, 0,58, в среде культуры клеток, содержащей модифицированную Часть А (см. таблицу 1 выше).

Другие компоненты среды культуры клеток для культуры клеток СНО

Следующее описание обеспечивает дополнительные компоненты, которые могут быть добавлены в эту среду культуры клеток. Следует отметить, что дополнительные компоненты, которые могут быть добавлены, не ограничиваются обеспеченными ниже примерами.

Дополнительные пептиды

Соль путресцин-HCl, которая способствует поддержанию структуры эндоплазматического ретикулума и роста, специфических для линий клеток СНО, добавляли в концентрации 0,4-1,65 мг/л к базальной среде.

Глутатион (трипептид) добавляли в количествах в диапазоне 0,5-2,0 мг/л. 2-Меркаптоэтанол также добавляли до 3,6 мг/л, и он действует как восстанавливающий агент в поддержании сульфгидрильных групп и связывает и транспортирует различные металлы, такие как медь. Он восстанавливает дегидроаскорбат и цистин и регенерирует аскорбат и цистеин.

Метотрексат

Концентрации метотрексата различались между технологическими линиями в зависимости от конечных уровней выходов, которые должны были быть достигнуты. С использованием исходного раствора с концентрацией 2 мМ, объемы добавления и конечные концентрации были следующими: 0,250 мл/кг дает конечный выход 500 нМ как для анти-IL-12, так и для анти-EPO-R, 0,5 мл/кг дает конечный выход 100 нМ для анти-IL-18 и, наконец, 2,5 мл/кг дает конечный выход 5000 нМ для анти-TNF-альфа.

Протектор клеток/поверхностно-активное вещество

Среду, описанную в этом примере, использовали для выращивания клеток СНО в суспензии в реакторах всех масштабов, колбах и вращающихся колбах как при встряхивании, так и при барботировании, которые создавали более высокие усилия сдвига. Для минимизации клеточного повреждения протектор клеток, такой как плюроник-полиолы, в частности, Плюроник F-69, добавляли в концентрации приблизительно 1 г/л среды. Использовали также другие ослабители сдвига, в том числе метилцеллюлозу в концентрации, меньшей или равной 1 г/л, и некоторые гидролизаты и экстракты растений при варьирующихся концентрациях до количеств, выражаемых в граммах на литр.

Аминокислоты

Эта среда культуры клеток имеет описанные здесь диапазоны количеств аминокислот. Две аминокислоты, аспарагин и глутамин добавляли в более высоких концентрациях, чем другие аминокислоты, так как они быстро становятся ограничивающими нутриентами во время хода культуры клеток СНО. Аспарагин, в частности, находится в концентрации приблизительно 0,4-0,5 г/кг в базальной среде.

Хотя аспарагин был компонентом в Части А (в том числе как исходной, так и модифицированной PF CHO), концентрацию аспарагина увеличивали добавлением его в эту среду культуры клеток.

Эта среда культуры клеток способна поддерживать рост СНО от очень низких исходных плотностей до более 1,0×10⁷ клеток/мл в течение некоторого количества дней в зависимости от концентрации этих компонентов с желаемым результатом и воздействием на клетки этой среды. Процесс СНО-культуры дополнительно включал в себя фазу роста и продукционную фазу, как описано в последующих разделах, и требовал различных диапазонов компонентов. Однако соотношения и идентичности композиции среды культуры клеток оставались теми же самыми.

Конечное приготовление сред клеток СНО

Приготовление усовершенствованной среды культуры клеток требовало добавления различных компонентов в конкретном порядке с коррекциями рН с использованием основания или кислоты в конкретных временных точках. Основание в форме NaOH добавляли по мере увеличения концентрации Части А базальной среды для облегчения растворения аминокислот в этой композиции до рН 10. Этот рН снижали минимально до 7,0, когда добавляли гидролизаты, с использованием кислоты в форме HCl. Дополнительные доведения (коррекции) до конкретного рН достигались с использованием растворов NaOH или HCl по мере необходимости.

Следующие примеры описывают среды культуры клеток на основании приведенного выше описания для экспрессии различных конкретных антител.

Пример 1.2

Среда культуры клеток для культивирования клеток СНО, экспрессирующих анти-TNFα-антитело

Линии клеток CHO, экспрессирующие полностью человеческое антитело к TNFα (т.е. адалимумаб; D2E7), культивировали в среде культуры клеток, описанной в таблице 2.

Таблица 2
Среды культуры клеток для культивирования клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческое анти-TNFα-антитело
Компоненты среды	Исходный материал № спецификации	AF-D2E7-1XP	AF-D2E7-1XP	AF и AY-D2E7	AY-D2E7-2XP	AY-D2E7-2XP
Список компонентов: Часть А и Часть В JRH	SR-248 рост	SR-2S0+рост MTX	SR-286 продукцияprod_3XP	SR-332 рост 1	SR-333 рост 2
Добавленные компоненты АВС	Конечный рН:	7,2+0,1	7,2+0,1	7,2+0,1	7,2+0,1	7,2+0,1
	Конечная осмолярность:	280-320	280-320	370-390	320-360	320-360
Часть А: немодифицированная-исходная-коммерчески доступная	RM-003	16,45	16,45	NA	NA	NA
Особая (модифицированная) Часть А: бессолевая	RM-230	NA	NA	7,89 г/кг	5,26 г/кг	5,26 г/кг
Часть В: цитрат трехвалентного железа:хелатиро-ванный источник железа	RM-004	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг
Часть С:
rHu-инсулин: рекомбинантный белковый регулятор глюкозы	SR-055	2,0 мл/кг(4 мг/кг)	2,0 мл/кг(4 мг/кг)	6,0 мл/кг (12 мг/кг)	3,88 мл/кг (8 мг/кг)	3,88 мл/кг (8 мг/кг)
Глюкоза, безводная: источник углерода	RM-011	3,5 г/кг	3,5 г/кг	7,0 г/кг	7,0 г/кг	7,0 г/кг
L-глутамин: аминокислота и источник энергии	RM-071	0,292 г/кг	0,292 г/кг	0,584 г/кг	0,876 г/кг	0,876 г/кг
NaH2PO4∙Н2О: фосфатный буфер	RM-200	Часть A: 0,031 г/кг	Часть A: 0,031 г/кг	0,031 г/кг	0,031 г/кг	0,031 г/кг

Na2HPO4∙7Н2О: фосфатный буфер	RM-233	Часть A: 0,436 г/кг	Часть A: 0,436 г/кг	0,436 г/кг	0,436 г/кг	0,436 г/кг
Bacto TC Yeastolate: дрожжевой источник гидролизата	RM-216	2,0 г/кг	2,0 г/кг	10,7 г/кг	4,0 г/кг	4,0 г/кг
Пептон Фитон: растительный соевый источник гидролизата	RM-238	NA	NA	6,92 г/кг	2,6 г/кг	2,6 г/кг
Бикарбонат натрия: буфер: СО2-регулятор рН	RM-077	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг
HEPES: органический буфер	RM-090	HA	NA	1,8 г/кг	1,8 г/кг	1,8 г/кг
NaCl (соль): регулятор осмолярности	RM-174	Часть A: 6,5 г/кг	Часть A: 6,5 г/кг	2,45 г/кг	2,67 г/кг	2,67 г/кг
Другие компоненты:
Моногидрат L-аспарагина: аминокислота	RM-284	NA	NA	NA	0,45 г/кг	0,45 г/кг
Плюроник F-68 (Полаксамер 188, NF): поверхностно-активное вещество, носитель	RM-188	NA	NA	1,0 г/кг	1,0 г/кг	1,0 г/кг
Метотрексат: селективный агент в DFHR-системе амплификации СНО	SR-133	2,50 мл/кг	2,50 мл/кг	2,50 мл/кг	2,50 мл/кг	2,50 мл/кг
NaOH: 2н.: основание	SR-288	По мере необходимо-сти	По мере необходимо-сти	5,67 мл/кг	3,5 мл/кг	3,5 мл/кг
HCl, 2н.: кислота	SR-287	По мере необходимо-сти	По мере необходимо-сти	2,5 мл/кг	2,91 мл/кг	2,9 1 мл/кг

Пример 1.3

Композиция (состав) среды для культивирования клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческое анти-IL-12-антитело (АВТ-874)

Линию клеток CHO, экспрессирующих полностью человеческое анти-IL-12-антитело, культивировали в среде для выращивания, описанной в таблице 3.

Таблица 3
Среда для культивирования клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческое ант-IL-12-антитело (АВТ-874)
	Исходный материал	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874
Название среды	№ спецификации	рост SR-383	Про-дук-ция SR-352	Под-питка SR-468	Под-питка глюко-зой SR-351	SR-274	SR-273	SR-272
Конечный рН:						6,5-6,9	6,5-6,9	6,5-6,9
Конечная осмолярность:						265-282	265-282	265-282
Часть А: немодифицированная-исходная-коммерчески доступная	RM-003	NA	NA	NA	NA	16,45 г/кг	16,45 г/кг	16,45 г/кг
Часть А (модифицирован-ная): бессолевая	RM-230	5,26 г/кг	NA	NA	NA	NA	NA	NA
Часть А (модифицирован-ная): бессолевая и с уменьшенными витаминами	RM-322	NA	7,89 г/кг	21,0 г/кг	7,89 г/кг	NA	NA	NA
Часть В: цитрат трехвалентного железа: хелатированный источник железа	RM-004	10 мл/кг	10 мл/кг	NA	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг
Часть С:
Бычий трансферрин: источник животного носителя Fe	SR-057	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
rHu-инсулин: рекомбинантный белковый регулятор глюкозы	SR-055	3,88 мл/кг	6,5 мл/кг	NA	6,5 мл/кг (13 мг/кг)	2 мл/кг (4 мг/л)	2 мл/кг (4 мг/л)	2 мл/кг (4 мг/л)
Глюкоза, безводная:	RM-011	7,0 г/кг	7,0 г/кг	150 г/кг	200 г/кг	3,5+ 1,5 г/кг	3,5+ 1,5 г/кг	200 г/л
Источник углерода	Исходный материал	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874	ABT-874
L-глутамин: аминокислота и источник энергии	RM-071	0,876 г/кг	0,584 г/кг	NA	0,584 г/кг	0,292 г/кг	0,292 g/kg	0,292 g/kg
Бикарбонат натрия: буфер: СО2-регулятор рН	RM-077	1,60 г/кг	1,60 г/кг	NA	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг
HEPES: органический буфер	RM-090	1,80 г/кг	1,80 г/кг	NA	1,8 г/кг	NA	NA	NA
NaCl (соль): регулятор осмолярности	RM-174	2,675 г/кг	2,45 г/кг	NA	2,45 г/кг	NA	NA	NA
NaH2PO4∙Н2О: фосфатный буфер	RM-200	0,031 г/кг	0,031 г/кг	NA	0,031 г/кг	NA	NA	NA

Na2HPO4∙7Н2О: фосфатный буфер	RM-233	0,436 г/кг	0,436 г/кг	NA	0,436 г/кг	NA	NA	NA
Bacto TC Yeastolate: дрожжевой источник гидролизата	RM-216	4,0 г/кг	10,7 г/кг	65,0 г/кг	10,7 г/кг	2 г/кг	11 г/кг	8 г/кг
Пептон Фитон: растительный соевый источник гидролизата	RM-238	2,579 г/кг	6,92 г/кг	41,0 г/кг	6,92 г/кг	NA	NA	NA
Другие компоненты
Плюроник F-68 (Полаксамер 188, NF): поверхностно-активное вещество, носитель	RM-188	100 г/кг	1,00 г/кг	NA	1,0 мл/кг	NA	NA	NA
Моногидрат L-аспарагина: аминокислота	RM-284	0,450 г/кг	NA	5,0 г/кг	NA	NA	NA	NA
Приматон: источник гидролизата животного (говядины)	RM-149	NA	NA	NA	NA	NA	NA	NA
Метотрексат: селективный агент в DFHR-системе амплификации СНО	SR-133	0,250 мл/кг	NA	NA	NA	0,250 мл/кг	0,250 мл/кг	0,250 мл/кг
NaOH: 2н.: основание	SR-288	3,50 мл/кг	5,67 мл/кг	По мере необходи-мости	5,67 мл/кг	По мере необходи-мости	По мере необхо-димости	По мере необходи-мости
HCl, 2н.: кислота	SR-287	2,91 мл/кг	2,5 мл/кг	По мере необходи-мости	2,5 мл/кг	По мере необходи-мости	По мере необходимости	По мере необходи-мости

Что касается модифицированной базальной среды, которая является бессолевой и имеет уменьшенные витамины, на которую дается ссылка выше, количество витаминов уменьшают на одну треть относительно немодифицированной базальной среды, описанной выше как RM-003, или модифицированной бессолевой базальной среды, описанной выше как RM-230. Таким образом, базальная среда с уменьшенными витаминами, как описано выше, имеет одну треть витаминов RM-003 и RM-230. При применении в количествах, приведенных в описанной выше таблице, конечная концентрация витаминов в этой среде уменьшена на треть, в отличие от концентрации витаминов, использующей RM-003 или RM-230. Однако, следует отметить, что при необходимости могут быть также использованы продукционная и подпитывающая среды, использующие RM-230.

Пример 1.4

Композиция сред для культивирования клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческие анти-IL-18- и анти-ЕРО/R-антитела

Таблица 4 обеспечивает суммирование сред для выращивания и продукционной среды, используемых для экспрессии анти-IL-18- и анти-ЕРО/R-антител. Дополнительные подробности в отношении сред для экспрессии этих антител могут быть найдены в таблице 5 (анти-IL-18) и таблице 6 (анти-ЕРО/R).

Таблица 4
Среда для культивирования клеток СНО, экспрессирующих полностью человеческие анти-IL-18- и анти-ЕРО/R-антитела
Компоненты среды	Исходный материал	Анти-IL18-2XP	Анти-IL18 3xP	Анти-IL18 4XP	Анти-EPO/R 1XP	Анти-EPO/R 3XP
Список компонентов: Часть А и Часть В JRH	№ спецификации	Рост SR-371	Продукция SR-372	Продукция SR-382	Рост SR-274	Продукция SR-286
Добавленные компоненты АВС	Конечный рН:	7,0+0,1	6,9+0,05	7,0+1,0	7,2+0,1	7,2+0,1
	Конечная осмолярность:	280-300	373-403	360-400	280-320	370-390
Часть А-: немодифицированная-исходная-коммерчески доступная	RM-003	NA	NA		16,45	HA
Особая (модифицированная) Часть А: бессолевая	RM-230	5,26 г/кг	7,89 г/кг	10,52 г/кг	NA	7,89 г/кг
Часть В: цитрат трехвалентного железа:хелатированный источник желаз	RM-004	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг	10 мл/кг
Часть С:

rHu-инсулин: рекомбинантный белковый регулятор глюкозы	SR-055	3,88 мл/кг(8 мг/кг)	6,0 мл/кг(12 мг/кг)	6,5 мл/кг(12 мг/кг)	2,0 мл/кг(4 мг/кг)	6,0 мл/кг (12 мг/кг)
Глюкоза, безводная: источник углерода	RM-011	7,0 г/кг	7,0 г/кг	7,0 г/кг	1,5 г/кг	7,0 г/кг
L-глутамин: аминокислота и источник энергии	RM-071	0,876 г/кг	0,584 г/кг	0,584 г/кг	0,292 г/кг	0,584 г/кг
Бикарбонат натрия: буфер: СО2-регулятор рН	RM-077	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг	1,6 г/кг
HEPES: органический буфер	RM-090	1,8 г/кг	1,8 г/кг	1,8 г/кг	NA	1,8 г/кг
NaCl (соль): регулятор осмолярности	RM-174	2,67 г/кг	2,45 г/кг	2,45 г/кг	Часть A: 6,5 г/кг	2,45 г/кг
NaH2PO4∙Н2О: фосфатный буфер	RM-200	0,031 г/кг	0,031 г/кг	0,031 г/кг	Часть A: 0,031 г/кг	0,031 г/кг
Na2HPO4∙7Н2О: фосфатный буфер	RM-233	0,436 г/кг	0,436 г/кг	0,436 г/кг	Часть A: 0,436 г/кг	0,436 г/кг
Bacto TC Yeastolate: дрожжевой источник гидролизата	RM-216	4,0 г/кг	10,7 г/кг	14,27 г/кг	2,0 г/кг	10,7 г/кг
Пептон Фитон: растительный соевый источник гидролизата	RM-238	2,6г/кг	6,92 г/кг	9,23 г/кг	NA	6,92 г/кг
Другие компоненты:
Моногидрат L-аспарагина: аминокислота	RM-284	0,45 г/кг	NA	NA	NA	NA
Плюроник F-68 (Полаксамер 188, NF): поверхностно-активное вещество, носитель	RM-188	1,0 г/кг	1,0 г/кг	1,0 г/кг	NA	1,0 г/кг
Метотрексат: селективный агент в DFHR-системе амплификации СНО	SR-133	0,05 мл/кг	0,05 мл/кг	0,05 мл/кг	0,25 мл/кг	2,50 мл/кг
NaOH: 2н.: основание	SR-288	По мере необхо-димости	По мере необхо-димости	По мере необхо-димости	По мере необхо-димости	5,67 мл/кг
HCl, 2н.: кислота	SR-287	По мере необхо-димости	По мере необхо-димости	По мере необхо-димости	По мере необхо-димости	2,5 мл/кг

Экспрессирующую IL-18 линию клеток СНО культивировали в среде для выращивания 2xP (SR-371), и затем эти клетки продуцировали антитело в продукционной среде 3xP (SR-372) для получения конечного титра приблизительно 1 г/л. Этот процесс с получением высокого титра антител использовал 4xP (SR-382) в качестве продукционной среды для достижения конечного титра приблизительно 2 г/л. Продукционная среда, используемая для получения анти-EPO/R-антитела, была идентична SR-286, но для выращивания клеток использовали среду 1xP (SR-274). Все среды описаны в таблицах 4 и 5.

Пример 1.5

Процессы культуры клеток для получения антител в клетках млекопитающих

Среды, описанные выше, разрабатывали также в две продукционные платформы, используемые в двух проектах для культивирования клеток млекопитающих, т.е. клеток СНО. Первую платформу разрабатывали с использованием композиции среды, сходной с модифицированной продукционной средой, описанной в таблицах 2-4 выше, с единственным отличием, заключающимся в температуре, используемой для культуры клеток. Эту платформу использовали для получения анти-IL-18-антитела, а также получения антитела против рецептора эритропоэтина (анти-EPO/R). Вторую платформу среды, дополнительно усиливающую питательные компоненты, использовали для получения анти-IL-18-антитела с высоким титром для достижения более высокой объемной продуктивности антитела.

Все антитела, включающие в себя анти-IL-12-, анти-IL-18- и анти-ЕРО/R-антитела, были полностью человеческими IgG1-антителами, экспрессируемыми трансфицированными dhfr(-) линиями клеток CHO, описанными ранее. Эти клеточные линии культивировали в суспензии и без помощи бычьего источника сыворотки или других материалов-источников животных.

Для получения анти-IL-18-антител, экспрессирующую анти-IL-18 линию клеток СНО культивировали в среде для выращивания, называемой здесь SR-371. Среду SR-371 использовали для поддержания более высокой продуктивности клеток с умеренным ростом клеток. После достижения плотности клеток, соответствующей критериям переноса, эти клетки переносили в продукционную среду (SR-372) для начала продукционной стадии.

Таблица 5
Композиции сред культуры в процессе А анти-IL-18-антитела
Среду для выращивания SR-371 использовали в подготовке посевного материала и реакторах для посевного материала Продукционную среду SR-372 использовали в продукционном биореакторе на 3000 литров.
Компонент	Среда для выращивания SR-371	Продукционная среда SR-372
Часть А PFCHO, особая бессолевая композиция	5,26 г/л	7,89 г/л
Часть В PFCHO, (исходный раствор цитрата трехвалентного железа)	10 мл/л	10 мл/л
Рекомбинантный инсулин человека	7,76 мг/л	13 мг/л
Декстроза, безводная	7,0 г/л	7,0 г/л
L-глутамин	0,876 г/л	0,584 г/л
Бикарбонат натрия	1,6 г/л	1,6 г/л
HEPES	1,8 г/л	1,8 г/л
NaCl	2,67 г/л	2,45 г/л
Плюроник F-68 (Полоксамер 188, NF)	1,0 г/л	1,0 г/л
NaH2PO4∙Н2О	0,031 г/л	0,031 г/л
Na2HPO4∙7Н2О	0,436 г/л	0,436 г/л
Bacto TC Yeastolate	4,0 г/л	10,7 г/л
Пептон Фитон	2,579 г/л	6,92 г/л
Метотрексат, 2 мМ	0,05 мл/л	0,05 мл/л

NaOH, 2н.	3,5 мл/л	5,67 мл/л
HCl, 2н.	2,91 г/л	2,5 мл/л
Конечный рН	7,10-7,20	7,10-7,20
Конечная осмолярность (мОсм/кг)	373-403	373-403

Температуру поддерживали при 35°C на протяжении этого культивирования. Когда уровень глюкозы культуры клеток был ниже 2 г/л, добавляли дополнительные 4 г/л глюкозы.

Сходный процесс использовали также для получения анти-EPO/R-антитела. Однако в подготовке посевного материала использовали более скудную среду (SR-274). Среду SR-286, ту же самую среду, которую использовали для получения Humira, использовали в продукционной стадии для анти-EPO/R-антитела (таблица 6). Среду для выращивания SR-274 использовали для роста клеток в подготовке посевного материала и в реакторах для посевного материала. Продукционную среду SR-286 использовали в продукционном биореакторе на 3000 литров.

Таблица 6
Композиции сред культуры в процессе анти-EPO/R-антитела
Компонент	Среда для выращивания SR-274	Продукционная среда SR-286
Часть А PFCHO, RM-003	16,45 г/кг	N/A
Часть А PFCHO, RM-230 (бессолевая)	N/A	7,89 г/кг
Часть В PFCHO, (исходный раствор цитрата трехвалентного железа)	10 мл/л	10 мл/л
Рекомбинантный инсулин человека	4 мг/л	13 мг/л
Декстроза, безводная	1,5 г/кг	7,0 г/кг
L-глутамин	0,292 г/кг	0,584 г/кг
Бикарбонат натрия	1,6 г/кг	1,6 г/кг
HEPES	N/A	1,8 г/кг

NaCl	N/A	2,45 г/кг
Плюроник F-68 (Полоксамер 188, NF)	N/A	1,0 г/кг
NaH2PO4∙Н2О	N/A	0,031 г/кг
Na2HPO4∙7Н2О	N/A	0,436 г/кг
Bacto TC Yeastolate	2,0 г/кг	10,7 г/кг
Пептон Фитон	N/A	6,92 г/л
Метотрексат, 2 мМ	0,25 мл/кг	N/A
NaOH, 2н.	По необходимости	5,67 мл/кг
HCl, 2н.	По необходимости	2,5 мл/кг
Конечный рН	7,20±0,10	7,15±0,05
Конечная осмолярность (мОсм/кг)	320±20	388±15

Среду для выращивания SR-274 использовали в роллерных флаконах, Wave-мешке, биореакторе Z-4605 для посевного материала на 100 л и начальной стадии культуры 575 мл в продукционном биореакторе Z-3600 на 3000 л. Продукционную среду SR-286 использовали только в продукционном реакторе Z-3600 на 3000 л.

Продукционные среды SR-286 и SR-372 состояли из компонентов среды, перечисленных в таблицах 5 и 6, но имели разный уровень MTX (0 нМ для SR-286 и 100 нМ для SR-372).

Один усовершенствованный процесс развивали для получения анти-IL-18-антител для достижения более высокой продуктивности. Этот новый процесс, Процесс В, вводил новую среду для продления долговечности культуры клеток и увеличения объемной продуктивности антител. Продукционная среда (SR-382) отличалась от предыдущих продукционных сред по количеству нутриентов, используемых в продукционной стадии. Полный состав SR-382 описан в таблице 7. В этом новом процессе для получения анти-IL-18, хотя клетки все еще культивировали в среде SR-371 во время подготовки посевного материала, среду SR-372 использовали в одной стадии биореактора для посевного материала перед продукционной стадией. Затем клетки культивировали в среде SR-382 в продукционной стадии со смещением температуры с 35°C до 33°C для пролонгирования долговечности культуры клеток и, следовательно, продления действий среды SR-382 на эти клетки.

Среду для выращивания SR-371 использовали в роллерных флаконах, Wave-мешке и биореакторе для посевного материала на 100 л. Кратковременную среду SR-372 использовали в начальной стадии 575-литровой культуры в продукционном биореакторе на 3000 литров. Продукционную среду SR-382 использовали только в продукционном биореакторе на 3000 литров.

Таблица 7
Композиции сред культуры в Процессе В анти-IL-18-антитела
Компонент	Среда для выращивания SR-371	Кратковременная среда SR-372	Продукционная среда SR-372
Часть А PFCHO, особая бессолевая композиция	5,26 г/л	7,89 г/л	10,52 г/л
Часть В PFCHO, (исходный раствор цитрата трехвалентного железа)	10 мл/л	10 мл/л	10 мл/л
Рекомбинантный инсулин человека	7,76 мг/л	13 мг/л	13 мл/л
Декстроза, безводная	7,0 г/л	7,0 г/л	7,0 г/л
L-глутамин	0,876 г/л	0,584 г/л	0,584 г/л
Бикарбонат натрия	1,6 г/л	1,6 г/л	1,6 г/л
HEPES	1,8 г/л	1,8 г/л	1,8 г/л
NaCl	2,67 г/л	2,45 г/л	0 г/л
Плюроник F-68 (Полоксамер 188, NF)	1,0 г/л	1,0 г/л	1,0 г/л
NaH2PO4∙Н2О	0,031 г/л	0,031 г/л	0,031 г/л
Na2HPO4∙7Н2О	0,436 г/л	0,436 г/л	0,436 г/л
Bacto TC Yeastolate	4,0 г/л	10,7 г/л	14,27 г/л

Пептон Фитон	2,579 г/л	6,92 г/л	9,23 г/л
Метотрексат, 2 мМ	0,05 мл/л	0,05 мл/л	0,5 мл/л
NaOH, 2н.	3,5 мл/л	5,67 мл/л	8,95 мл/л
HCl, 2н.	2,91 г/л	2,5 мл/л	4,1 мл/кг
Конечный рН	7,1-7,2	7,1-7,2	7,1-7,2
Конечная осмолярность (мОсм/кг)	373-403	373-403	373-403

Нутриенты в этой среде были обогащены для дополнительного обеспечения источников энергии и строительных компонентов для роста клеток СНО и продуцирования антител. В этом Процессе В, хотя клетки все еще культивировали в среде SR-371 во время подготовки посевного материала, использовали среду SR-372 в одной стадии биореактора посевного материала перед продукционной стадией. Затем клетки культивировали в среде SR-382 в продукционной стадии со смещением температуры с 35°C до 32°C для пролонгирования долговечности культуру и, следовательно, продления действий среды SR-382 на эти клетки.

Процесс А: Производительность анти-IL-18-клеток и анти-EPO/R-клеток в среде SR-372 и среде SR-286

Анти-IL-18-экспрессирующие клетки культивировали в среде SR-371 с 100 нМ MTX для накапливания клеточной массы для продукционной стадии. Среду SR-371 использовали для поддержания более высокой продуктивности с умеренным ростом клеток. Таблица 8 показывает репрезентативный профиль роста продукции анти-IL-18-продуцирующих клеток СНО в продукционном биореакторе на 3000 л. С использованием этого процесса (Процесса А) со средой SR-372 может быть получен конечный титр до 1 г/л.

Таблица 8
Продуцирование анти-IL-18-антитела в среде 372 (Процессе А)
Измеряемые результаты	Процесс лабораторного масштаба (n=5), темп.=35°С	Процесс в 3000 л (n=6), темп.=35°С
Максимальная плотность клеток (106 жизнеспособных клеток/мл)	8,68	9,2
Продолжительность до 50% жизнеспособности (дни)	11	11
Удельная продуктивность клеток (пг/клетка-день)	20,5	17,6
Объемная продуктивность до сбора при 50% жизнеспособных клеток (мг/л-день)	98,8	81,8
Титр при 50% жизнеспособных клеток (мг/л)	1004	900

Среду 286, которая имеет тот же самый состав, что и среда 372, за исключением уровня MTX, использовали для получения анти-EPO/R-антител. Хотя обычно получают более низкую плотность клеток на продукционной стадии, достигалась более высокая продуктивность, позволяющая этим клеткам продуцировать до 1,8 г/л антитела в масштабе 3000 л с использованием среды SR-286 в качестве продукционной среды. Наблюдали приемлемый рост клеток, как суммировано в таблице 9. Результаты, полученные в лабораторном масштабе, так же как и результаты из цикла с 3000 л, демонстрировали, что эта среда увеличивала удельную продуктивность клеток, и наблюдали конечный титр до 1,9 г/л. Эти результаты показывают, что среды со сходным составом (SR-372 и SR-286 в таблицах 1 и 2) поддерживают хороший рост клеток и высокие скорости продуцирования антител в крупномасштабной культуре клеток СНО.

Таблица 9
Продуцирование анти-ЕРО/R-антитела в среде 286
Измеряемые результаты	Процесс лабораторного масштаба (n=2), темп.=35°С	Процесс в 3000 л (n=1), темп.=35°С
Максимальная плотность клеток (106 жизнеспособных клеток/мл)	4,50	4,80
Продолжительность до 50% жизнеспособности (дни)	13	13
Удельная продуктивность клеток (пг/клетка-день)	38,0	53,2
Объемная продуктивность до сбора при 50% жизнеспособных клеток (мг/л-день)	114,4	146,1
Титр при 50% жизнеспособных клеток (мг/л)	1487	1900

Процесс В: Производительность анти-IL-18-клеток в Процессе В со средой SR-382

Среда SR-382 была наиболее обогащенной средой, используемой в пролонгированном периодическом процессе для получения анти-IL-18-антитела. Процесс B включает в себя применение среды SR-371 в подготовке посевного материала и SR-372 в биореакторе для посевного материала перед продукционной стадией или кратковременной стадией. Рост клеток был умеренным в сравнении с ростом клеток в среде SR-372 на продукционной стадии. Однако, со смещением температуры, получали конечный титр до 2,5 г/л с использованием среды SR-382.

Среда SR-382 была создана для исследования, показывающего, что удельная клеточная продуктивность анти-IL-18-экспрессирующих клеток увеличивалась пропорционально с увеличением нутриентов в продукционной среде. Среда SR-382 была оптимальной средой, которая обеспечивала баланс между ростом клеток и увеличением конечного титра. Хотя достигалась максимальная плотность клеток только 5,9×10⁶ клеток/мл, удельная продуктивность клеток увеличивалась в 2 раза. Объединение со смещением температуры для пролонгирования продолжительности культуры клеток давало конечный титр до 2,2 г/л, как показано в таблице 10.

Таблица 10
Продуцирование анти-IL-18-антитела в среде SR-382 (Процессе В)
Измеряемые результаты	Процесс лабораторного масштаба (n=1), темп.=35-33°С	Процесс в 3000 л (n=1), темп.=35-33°С
Максимальная плотность клеток (106 жизнеспособных клеток/мл)	7,85	5,90
Продолжительность до 50% жизнеспособности (дни)	12	13
Удельная продуктивность клеток (пг/клетка-день)	32,0	42,1
Объемная продуктивность до сбора при 50% жизнеспособных клеток (мг/л-день)	181,1	191,8
Титр при 50% жизнеспособных клеток (мг/л)	2173	2110

ПРИМЕР 2

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ ПРОЦЕСС С ПОДПИТКОЙ И ПОДПИТЫВАЮЩИЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ АНТИТЕЛ

Анализ отработанной среды биореакторов, работающих в периодическом режиме, показал истощение (уменьшение) некоторых аминокислот. Это открытие предполагало также истощение других компонентов среды, даже если они не измерялись, которое могло бы приводить к дополнительным недостаточностям питательных веществ. Для компенсации этих потенциальных недостаточностей, добавляли растворы нутриентов. В области биотехнологии этот подход обычно называют подходом с подпиткой.

С эксплуатационной точки зрения, удобно использовать концентрированные подпитывающие растворы. Следующие примеры описывают добавление высококонцентрированных растворов базальной среды с химически определенным составом (PFCHO, Catalog # 67411-50L) и комплексных гидролизатов, например, Yeastolate и Фитон. Было определено, что эта пара гидролизатов проявляла синергическое действие на увеличение продуктивности в расчете на соотношение их концентраций.

Пример 2.1

Процесс с подпиткой для получения адалимумаба

Начальный процесс для получения адалимумаба (Humira/D2E7) состоял из 3-дневного процесса, в котором среду удаляли и восполняли последовательно 8 раз. Улучшенный процесс с подпиткой разрабатывали посредством замены в этой среде гидролизата Приматон гидролизатом Yeastolate и с использованием новых параметров реактора. Этот усовершенствованный процесс с подпиткой длился приблизительно 12 дней.

Продуктивность начального периодического процесса дополнительно улучшали переделкой базальной среды, PFCHO, и добавлением нового гидролизата, т.е. Фитона. Содержащую этот гидролизат среду использовали в процессе, названном выше SR-286 (см. таблицу 2). Исследовали также параметры эксплуатации реактора, что привело к нахождению оптимальной температуры для проведения всего процесса получения адалимумаба.

Анализ проб, которые брали ежедневно из этих экспериментов с использованием реактора, выявил некоторые потенциальные пищевые недостаточности. В случае периодического процесса получения адалимумаба, эту потенциальную недостаточность питательных веществ устраняли подачей 25х-концентрированного раствора PFCHO 33x-раствора гидролизатов Yeastolate и Фитон. Эти гидролизаты являются комплексными компонентами, которые проявляют синергическое действие относительно соотношения их концентраций. Это соотношение поддерживается в их высококонцентрированной 33х версии.

План эксперимента

Задачей этого эксперимента было сравнение нового процесса с подпиткой с двумя периодическими контрольными процессами (смещение температуры 37→33°C против константной температуры 35°C).

Модификации культуры с подпиткой были следующими:

1. 25х обогащенный раствор базальной среды (PFCHO), подаваемый недостаточностей аминокислот.

2. 33х обогащенный гидролизатами раствор, подаваемый при интервалах, так что осмолярность среды никогда не превышала 440 мОсм (условие, которое приводит к уменьшенному росту клеток и жизнеспособности).

3. Заданное значение температуры должно быть равно 35°C на протяжении всего культивирования.

Контролями для этого эксперимента были:

a) Идентичный реактор, работающий с существующей в настоящее время средой (SR-286) и при параметрах контрольного периодического процесса (контрольные условия включают в себя реакторы, использующие среду SR-286 со смещением температуры и линейным снижением рН), названный контролем № 1; и

b) Идентичный реактор, работающий с существующей в настоящее время средой (SR-286) и при всех параметрах контрольного существующего в настоящее время периодического процесса, за исключением рабочей температуры 35°C на протяжении всего процесса, названный контролем № 2.

Материалы:

Реакторы Braun ED с рабочим объемом 13 л

Опытный растительный инокулят AFI915A из Working Cell Bank WCB970513-6

Раствор базальной среды 3XP11Y7P (SR-286)

Обогащенный раствор базальной среды (25x) (раствор PF CHO)

Обогащенный гидролизатами раствор (33x)

Подпитка глюкозы (200 г/л) (раствор глюкозы)

0,5н раствор гидроксида натрия для регуляции pH.

Приготовление растворов:

1. Продукционная среда (см. данные раствора SR-286, описанные выше в таблице 2).

2. 2 кг обогащенного раствора PFCHO (25x) (базального обогащенного раствора): готовят в следующем порядке, при постоянном перемешивании и смешивании в течение 10 минут после каждой стадии добавления:

Компонент	Масса (г)	Примечания
MilliQ Н2О	1500
PFCHO	131,5
10н. NaOH	49 мл	До рН 10
Аспарагин	15	рН упадет до ~9,73
Глюкоза	100	рН упадет до ~9,71
MilliQ Н2О	По мере необходимости	Доведите массу до 2000 г, рН ~9,70, осмолярность ~1480 мОсм

Отфильтруйте с использованием фильтрующей мембраны PES 0,2µ, храните при 4°С
Каждое добавление 1% исходного объема вышеуказанного раствора будет увеличивать: а) концентрацию PFCHO в 0,25 раз в сравнении с исходной 3-кратной концентрацией b) Аспарагин на 75 мг/л с) Концентрацию глюкозы на 0,5 г/л d) Осмолярность на 10 мОсм е) рН на ~0,10 единиц рН

3. 1 кг обогащенного гидролизатами раствора (33х): готовят в следующем порядке, при постоянном перемешивании и смешивании в течение 10 минут после каждой стадии добавления:

Компонент	Масса (г)	Примечания
MilliQ Н2О	500
ТС Yeastolate	265
Пептон Фитон	165
MilliQ Н2О	По мере необходимости	Доведите массу до 1000 г
Отфильтруйте с использованием фильтрующей мембраны PES 0,2µ, храните при 4°С
Примечание: Каждое добавление 1% исходного объема вышеуказанного раствора будет увеличивать: а) концентрацию ЕС Yeastolate на 2,65 г/л (0,33х) в сравнении с исходной концентрацией загрузки. b) концентрацию Пептона Фитон на 1,65 г/л (0,33х) в сравнении с исходной концентрацией загрузки.

Способы

Эксплуатация реактора:

Для инокуляции реактора флакон оттаивали и размножали в соответствии с описанием процесса подготовки посевного материала Humira. После выращивания в реакторе, этот реактор опустошали до 3,62 л для стимуляции кратковременной стадии. Затем реактор доливали до уровня 13 л продукционной средой (SR-286).

Реакторы работали со следующими параметрами:

a) Перемешивание 70 об/мин

b) Температура 35°C

c) Линейное снижение pH начиналось с рН 7,16 до рН 6,90 на протяжении 72-часового периода

d) Растворенный кислород 30%

e) Реакторы подпитывали 195 г 200 г/л раствором глюкозы, когда уровень глюкозы был ниже 2,0 г/л.

Режим подпитки:

Следующее описание представляет режим подпитки для добавления дополнительных нутриентов, т.е. дополнительной базальной среды и гидролизатов к периодической культуре адалимумаба.

Таблица 11
Режим подпитки процесса с подпиткой для получения адалимумаба
День	Количества подпитывающего раствора (г)
25х PECHO	33х гидролизаты
0-3
4	130	130
5
6	260
7		130, глюкоза
8
9	260, глюкоза
10
11	130
12-13

Результаты:

Результаты (а также спланированные улучшения) в сравнении с контрольными процессами № 1 и № 2 для улучшенного процесса с подпиткой описаны в таблицах 12 и 13. Как показано в таблице 12, продуктивность адалимумаба увеличивалась добавлением усиленной обогащенной базальной среды и обогащенного гидролизатами раствора с использованием усовершенствованного процесса с подпиткой при постоянной температуре.

Таблица 12
Сравнение процессов с подпиткой для получения адалимумаба
Измеряемые результаты	Контроль № 1 (процесс с 3000 л) Темп.=37°С→33°С	Контроль № 2 (процесс с 3000 л) Темп.=35°С	Эксперимент с подпиткой Температура 35°С
Максимальная плотность клеток (106 жизнеспособных клеток/мл)	3,63	4,45	4,41
Продолжительность до 50% жизнеспособности (дни)	13	10	12
Удельная продуктивность клеток (пг/клетка-день)	42,5	46,7	61,4
Объемная продуктивность до сбора при 50% жизнеспособных клеток (мг/л-день)	98	114	163
Титр при 50% жизнеспособных клеток (мг/л)	1322	1178	1979
Таблица 13
Сравнение спланированных результатов с использованием процессов с подпиткой для получения адалимумаба
Спланированный результат	Контроль № 1 (процесс с 3000 л) Темп.=37°С→33°С	Контроль № 2 (процесс с 3000 л) Темп.=35°С	Эксперимент с подпиткой Температура 35°С
Сборы на год (с позволением 3-дневного оборота)	22	28	24
Ежегодный выход продукта (кг/год) (сбора 2600 л) (кг/год)	75,6	85,7	123,4

Увеличенный ежегодный выход (контроль=100%)

100%

114%

163%

Пример 2.2

Процесс с подпиткой для ABT-874

Как и для случая усовершенствованного процесса с подпиткой для адалимумаба, описанного выше, анализ проб, которые брали ежедневно из реактора, работающего для получения ABT-874 в периодическом режиме, выявил истощение аминокислот. Эту недостаточность опять устраняли с использованием 25х раствора PFCHO и концентрированного 33x раствора гидролизата.

Периодический процесс для ABT-874 был первоначально разработан для D2E7 (адалимумаба) заменой гидролизата в среде и введением новых параметров реактора. Кроме того, как и в случае D2E7 (адалимумаба), изменяли состав базальной среды и добавляли новый гидролизат. Эту композицию среды использовали в существующем процессе для D2E7 в виде SR-286 (см. таблицу 2 выше).

План эксперимента:

Задачей этого эксперимента было сравнение контрольного периодического процесса со следующими условиями с подпиткой, начинающейся в обоих случаях во время, когда было ранее обнаружено истощение аминокислот:

a) Подавайте альтернативно обогащенные базальной средой 25х PFCHO и обогащенные гидролизатами 33x растворы

b) Подавайте ежедневно как обогащенные базальной средой 25х PFCHO, так и обогащенные гидролизатами 33x растворы.

Контроль для этого эксперимента включал в себя идентичный реактор, работающий с существующей средой (SR-286) и при параметрах контрольного периодического процесса (среда SR-286, со смещением температуры и линейным уменьшением рН).

Материалы:

Реакторы Braun ED с рабочим объемом 13 л

W990107-J695 из Working Cell Bank

Раствор базальной среды 3XP11Y7P (SR-286-111899-1)

Среда для выращивания PFCHO-0-500-HG2Y

Обогащенный базальной средой раствор (25x)

Обогащенный гидролизатами раствор (33x)

0,5н. раствор гидроксида натрия.

Приготовление растворов:

1. Продукционная среда (см. данные раствора SR-286)

2. 25х раствор PFCHO (базальный обогащенный раствор: описанный в предыдущем примере; за исключением того, что использовали 462 г раствора глюкозы вместо порошка глюкозы, следовательно, конечная масса была равна 2170 г).

Примечание: Каждое добавление 1% исходного объема вышеуказанного раствора будет увеличивать:

a) концентрацию PFCHO в 0,25x в сравнении с исходной 3х концентрацией

b) аспарагин на 75 мг/л

c) концентрацию глюкозы на 2,1 г/л

• pH на ~0,10 единиц pH.

3. 33x раствор гидролизата (описанный в предыдущем примере с добавлением 2,40 г/л глюкозы)

Примечание: добавление 1% исходного объема вышеуказанного раствора будет увеличивать:

a) концентрацию TC Yeastolate на 2,65г/л (0,33x) в сравнении с первоначальной концентрацией загрузки

b) концентрацию Пептона Фитон на 1,65 г/л (0,33х) в сравнении с исходной концентрацией загрузки.

Способ:

Для инокуляции реактора флакон оттаивали и размножали в соответствии с описанием процесса подготовки посевного материала АВТ-874. После выращивания в реакторе, этот реактор опустошали до 4,06 л (обозначения циклов В9013-ED2 и В9014-ED3, как описано в таблице 13) для стимуляции кратковременной стадии. Затем реактор доливали до уровня 13 л продукционной средой (SR-286).

Реакторы работали со следующими параметрами:

a) Перемешивание 70 об/мин

b) Температура 33°C

c) pH 6,90

d) Растворенный кислород 40%.

Таблица 13
Режим подпитки для АВТ-874
	Количества подпитывающего раствора (г)
	Другой режим подпитки, обозначение опыта В9013-ED2	Ежедневный режим подпитки, обозначение опыта В9014-ED3
	25х PECHO	33х гидролизаты	25х PECHO	33х гидролизаты
0-4
5	130		65	65
6		130	65	65
7	130		65	65
8		130	65	65

9	130		65	65
10		130	65	65
11	130		65	65
12		130	65	65
13	130		65	65
14-15

Результаты

Результаты сравнения этих усовершенствованных процессов с подпиткой описаны ниже в таблицах 14 и 15.

Таблица 14
Результаты процесса с подпиткой
Измеряемые результаты	Контроль (процесс с 1000 л) Темп.=33°С	Эксперимент с чередующейся подпиткой Темп.=33°С	Эксперимент с ежедневной подпиткой Темп.=33°С
Максимальная плотность клеток (106 клеток/мл)	3,79	5,39	4,15
Продолжительность до 50% жизнеспособности (дни)	14-76%	15	15
Удельная продуктивность клеток (пг/клетка-день)	71	83	82
Объемная продуктивность до сбора при 50% жизнеспособных клеток (мг/л-день)	188	281	212
Титр при 50% жизнеспособных клеток (мг/л)	2505 при 76%	3995	3033
Таблица 15
Результаты процесса с подпиткой
Запланированный результат	Контроль (процесс с 1000 л) Темп.=33°С	Эксперимент с чередующейся подпиткой Темп.=33°С	Эксперимент с ежедневной подпиткой Темп.=33°С
Сборы в год (с позволением 3-дневного оборота)	21	20	20

Ежегодный выход продукта (сбора 2600 л) (кг/год)	137	208	158
Увеличенный ежегодный выход (контроль = 100%)	100%	152%	115%

ПРИМЕР 3

СТАБИЛЬНЫЕ КОМБИНИРОВАННЫЕ ПОДПИТЫВАЮЩИЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ОБЪЕМНОЙ ПРОДУКТИВНОСТИ КУЛЬТУРЫ С ПОДПИТКОЙ

Следующие примеры описывают новый подход к приготовлению подпитывающих растворов высокой концентрации, которые используют два гидролизата, по меньшей мере одну аминокислоту, другую, чем глутамин, сахар и базальную среду с химически определенным составом. Полученные подпитывающие растворы способны увеличивать объемную продукцию клеточных линий млекопитающих, продуцирующих рекомбинантные белки. Наконец, предложен ускоренный способ развития процесса с подпиткой регуляции с обратной связью концентрации глюкозы.

Материалы и способы

Комбинированные подпитывающие растворы содержали гидролизаты Bacto TC Yeastolate, (RM-216) (BD Difco 255771) и Пептон Фитон, (BD Difco 2922450) плюс глюкозу, моногидрат L-аспарагина (Sigma-Aldrich), уменьшенную версию DMEM/F12 (NaCl, фосфатные соли, индикаторы pH и другие неэссенциальные компоненты были удалены; Invitrogen 12500) или Ex-Cell PFCHO (A)-S1 (модифицированную, недостаточную) без глутамина, без NaHCO, (JRH Biosciences 67411- 500L35470).

Для приготовления растворов, воду фильтровали с использованием Millipore Milli-Q PF с фильтрующим тампоном PMQ004D2. Материалы растворяли в указанной массе воды с использованием настольной магнитной мешалки. После добавления каждого компонента проверяли полноту растворения перед включением следующего компонента.

Когда было возможно, мутность определяли количественно с использованием портативного турбидиметра HACH 2100P (Hach Co. Loveland, CO). Порог глаза человека для детектирования мутности равен приблизительно 15 NTU (нефелометрических единиц мутности).

Эксперименты в биореакторах проводили в биореакторах Applikon на 3 л при рабочем объеме 1,5 л с контролем рН, температуры, перемешивания и кислорода посредством ниспадающего каскадом воздуха и потока кислорода. Счет клеток выполняли при помощи Cedex (Innovatis AG, Bielefeld, Germany). Глюкозу, лактат определяли с использованием YSI 2700 (YSI Inc., Yellow Springs, OH) и в некоторых случаях определяли также дополнительные метаболиты с использованием Nova Bioprofile 400 (Nova Biomedical Corp., Waltham, MA). Равновесное парциальное давление кислорода (pO₂), диоксида углерода (pCO₂) и рН проверяли с использованием газоанализатора ABL 5 для крови (Radiometer A/S, Copenhagen, Brønshøj, Denmark).

Пример 3.1

Получение стабильных комбинированных подпитывающих растворов с использованием PFCHO в качестве базальной среды

Единый высококонцентрированный подпитывающий раствор облегчает создание культуры клеток с подпиткой, так как он уменьшает объем и число требуемых добавлений. Однако это осложняется вследствие того, что порошок PFCHO должен быть растворен при величинах рН более 9,00. Кроме того, гидролизаты растворимы в условиях нейтрального рН. Таким образом, попытка просто смешивания обоих компонентов в условиях нейтрального или высокого рН будет приводить к (нерастворенным) суспензиям порошка. Как сообщалось в литературе, «полностью оптимизированные подпитывающие растворы часто существуют в виде двух или более отдельных растворов, которые поддерживают более чем одну скорость введения и рН подпитывающего раствора (например, по причинам растворимости)» [1].

Эксперимент по определению стабильности комбинированного подпитывающего раствора

Было определено, что добавление гидролизатов позволяло концентрациям PFCHO оставаться стабильными в течение более продолжительных периодов, как описано в следующей таблице. Количества компонентов 20 г/кг PFCHO, 7,5 г/кг аспарагина, 21 г/кг глюкозы, 22 г/кг Yeastolate и 14 г/кг Фитона добавляли последовательно к приблизительно 700 г воды и в конце добавляли воду для получения конечной массы 1 кг. Растворы смешивали и затем рН снижали до необходимого рН с использованием 2н. HCl. В следующей таблице мутность определяли визуальным наблюдением невооруженным глазом.

Таблица 16
Действие конечного рН на различные комбинированные подпитывающие композиции
	Композиция	Конечный рН раствора
6,75	7,00	7,25	7,50	7,75

1	PFCHO, аспарагин и глюкоза, растворенные при рН 10,0	N/A	N/A	N/A	Полностью осаждались до 4 часов
2	То же, что и (1) выше, до рН 7,75, затем добавляли Фитон и Yeastolate	N/A	N/A	конечный рН 7,3	N/A	N/A
3	То же, что и (2) выше, затем рН до 6,75, 7,00, 7,25, 7,50, 7,75	Слабая степень мутности в пределах 30-60 минут; все-таки полученный раствор остается стабильным

Как видно в таблице 16, наименее мутными были 2) и 3), рН 6,75 и 7,25. Обратите внимание, что как 2), так и 3) не становились мутными даже после почти 24 часов. На основании этих результатов, было ясно, что гидролизаты стабилизируют PFCHO в растворе, так как достигается низкая мутность.

Поскольку гидролизаты стабилизируют полученную смесь, Фитон и Yeastolate могли бы добавляться к раствору PFCHO при рН 10,0; затем вся эта смесь должна доводиться до желаемого рН. Этот порядок добавления мог бы удалять нестабильную стадию поддерживания раствора PFCHO при величинах pH ниже 8,0, особенно уязвимых при смешивании больших объемов.

Для испытания предыдущей гипотезы авторы изобретения испытывали новый порядок добавления с композицией, содержащей 20 и 7,5 г/кг PFCHO и аспарагина, соответственно. Полученный раствор, X-1, делили на части и доводили до рН 7,0, 6,75, 6,5 и 6,25. Эти растворы оказались стабильными, как можно видеть из следующей таблицы:

Таблица 17
Профили мутности (NTU) композиции Х-1 при различных величинах рН
	рН
Время (часы)	6,25	6,50	6,75	7,0
2,25	n/a	8,44	9,86	11,32
4,00	8,77	7,8	9,25	10,70
6,00	7,02	5,71	6,28	4,25

Спустя три часа наименее мутным раствором был раствор с рН 6,50. Видимое уменьшение мутности, в частности, для рН 7,0, было обусловлено осаждением некоторого количества малых частиц.

Глюкоза в качестве стабилизатора

Испытывали композицию (см. таблицу 18) с 200 г/кг глюкозы, добавленной в качестве стабилизатора.

Компоненты взвешивали и добавляли последовательно. Начальная масса воды должна быть уменьшена для получения 1 кг конечной массы.

Этот раствор оказался стабильным в течение нескольких часов для диапазона величин рН, как можно видеть из следующей таблицы:

Таблица 19

Показания мутности (NTU) комбинированного подпитывающего раствора как функция времени и рН
	рН
Время (часы)	6,72	7,00	7,22	7,50
0,25	3,48	3,75	3,95	5,83
2,50	3,07	3,13	3,42	3,74
8,50	2,98	2,95	2,99	3,15

Эти модифицированные комбинированные подпитывающие растворы, содержащие глюкозу, использовали для экспрессии двух различных антител, т.е. адалимумаба (D2E7) и анти-IL-18-антитела ABT-325.

Комбинированный подпитывающий раствор для стабильного получения D2E7

Если объем композиции, добавляемый в биореактор, основывается на компоненте с самой низкой концентрацией (т.е. PFCHO), то должны добавляться очень большие количества подпитывающего раствора для возможности индивидуальной оценки. Таким образом, более высокие концентрации были следующей стадией в развитии эффективной подпитывающей композиции. Этот раствор был назван комбинированным подпитывающим раствором D2E7, и он описан в следующей таблице.

Компоненты взвешивали и добавляли последовательно. Начальная масса воды должна быть уменьшена для получения 1 кг конечной массы.

Испытывали композиции с 200, 150 и 100 г/кг глюкозы. Как можно видеть в следующей таблице, эти растворы также имели стабильную мутность в течение нескольких часов. Таблица 21 показывает, что добавление глюкозы уменьшало мутность этого раствора.

Таблица 21
Временные профили мутности для комбинированного подпитывающего раствора D2E7 как функция концентрации глюкозы
	Глюкоза (г/кг комбинированного подпитывающего раствора)
Время (часы)	100	150	200
0	n/a	9,23	7,31
1	13,80	8,77	n/a
2	13,20	9,33	n/a
3	12,80	10,30	n/a
4	12,80	10,70	5,88
7	n/a	n/a	6,80

Как показано в таблице 21, увеличение уровня глюкозы уменьшало мутность этого раствора. Эти различные композиции, на основании их уровней мутности, считались приемлемыми для экспериментов с фильтрованием.

Комбинированный подпитывающий раствор для стабильного получения ABT-325

Для получения стабильного комбинированного подпитывающего раствора для ABT-325 готовили 50 л существующей композиции в соответствии со способом, использованным для комбинированного подпитывающего раствора D2E7, как показано в таблице 22.

Компоненты взвешивали и добавляли последовательно. Начальная масса воды должна быть уменьшена для получения 1 кг конечной массы.

После приготовления, этот раствор сохранял уровень мутности приблизительно 20-30 NTU, как можно видеть в следующей таблице 23.

Таблица 23
Мутность комбинированного подпитывающего раствора АВТ-325
Мутность	Время (часы) (NTU)
0,00	41,8
1,00	28,7
1,50	19,8
2,00	20,0
3,50	14,5

50 л комбинированного подпитывающего раствора композиции ABT-325 готовили в соответствии со способом D2E7 для испытания как возможности масштабирования, так и применимости этого способа приготовления. Как показано выше, этот раствор оставался стабильным в течение четырех часов.

Следует отметить, что среда PF CHO, на которую делается ссылка в приведенном выше примере, соответствует модифицированной PF CHO (модифицированной Части А), на которую делается ссылка в среде культуры клеток примера 1.

Пример 3.2

Получение стабильных комбинированных подпитывающих растворов с использованием DMEM-F12 в качестве базальной среды

Как описано в предыдущем примере, можно изготовить стабильный комбинированный подпитывающий раствор с PFCHO и двумя гидролизатами, а также глюкозой. Следующий пример демонстрирует, что эта методология может быть применена к любой базальной подпитывающей композиции и приводит к стабильному комбинированному подпитывающему раствору.

DMEM-F 12, композицию среды, которая является публично доступной, модифицировали, чтобы сделать ее совместимой с комбинированным подпитывающим препаратом, названным здесь DMEM-F12m. Были удалены следующие компоненты: NaCl, NaHCO₃, NaH₂PO₄∙H₂O, Na₂HPO₄, D-глюкоза, HEPES, Na-гипоксантин, Феноловый красный, L-глутамин и тимидин. Комбинированные подпитывающие растворы, соответствующие подпитывающим композициям D2E7 и ABT-325, готовили согласно методологии, описанной в примерах 3.0 и 3.1. Конечные компоненты и последовательность приготовления показаны в следующей таблице.

Таблица 24
Комбинированные подпитывающие растворы DMEM-F12
		Подпитка I	Подпитка II
	MilliQ Н2О	600,0	600,0	г/кг
	Глюкоза	150,0	150,0
	DMEM-F12m	27,0	21,0
+	NaOH 10н.			→ рН 10,00
	Аспарагин	3,1	5,0
	Yeastolate	21,2	65,0
	Фитон	13,5	40,0
+	HCl 5н.			→ рН 6,75
	MilliQ Н2О	до 1000 г

Компоненты взвешивали и добавляли последовательно для получения 1 кг конечной массы.

После приготовления подпитывающие растворы как I, так и II поддерживали мутность 12 NTU или менее в течение более 4 часов.

Пример 3.3

Увеличение роста клеток и продуктивности вследствие добавления комбинированного подпитывающего раствора

Для оценки стимулирующих рост и титр свойств вышеописанных комбинированных подпитывающих растворов, использовали ABT-874 клетки (которые экспрессируют полностью человеческое анти-IL-12-антитело IgG1). Линию клеток CHO обычно культивируют в среде культуры клеток SR-383 (2X с 500 нМ MTX).

Для этих экспериментов, клетки пассировали в DMEM/F12 в течение по меньшей мере 5 генераций, пока не наблюдали постоянной скорости роста. Спин-культуры (культуры с постоянным перемешиванием) перемешивали на Thermolyne stir plate при 70 об/мин в термостате при 35°C и 5% CO₂. Непосредственно перед инокуляцией брали требуемое количество суспензии клеток из поддерживаемой культуры. Эти клетки центрифугировали, супернатант выбрасывали и осадки суспендировали в свежей, предварительно согретой среде с получением плотности инокулята 4×10⁵/мл.

Культуру клеток размножали во вращающихся пробирках, пока не получали достаточный объем для инокуляции биореактора для получения сплит-отношения 1:5 в биореакторах Applikon на 1,5 л. Рабочими условиями реактора были рН 6,9, 35°C, 150 об/мин и уровень растворенного кислорода 40% насыщения. Все эксперименты в биореакторах выполняли в двух повторностях. Клетки получали три болюсных введений в количестве 1% исходного объема реактора подпитывающего комбинированного раствора в каждый второй день во время хода эксперимента.

Использование обоих комбинированных подпитывающих растворов сильно усиливало рост культуры клеток. В случае CFI, получали удвоенной пик плотности клеток, хотя культура длилась только 10 дней, в сравнении с 13 днями для контроля. В случае CFII пик плотности клеток был почти утроенным в сравнении с контролем и культура длилась в течение такого же времени. Что касается конечного титра, наблюдали более разительное действие. Титры для среды DMEM/F12 были равны приблизительно 41 мг/л, против 188 для CFI и 434 для CFII. Это действие различных подпитывающих растворов на максимальную плотность клеток, продолжительность культуры, титр и удельную продуктивность суммировано в следующей таблице:

Таблица 25
Производительность комбинированных подпитывающих растворов DMEM-F12m
Параметр
Описание	Максимальная плотность клеток (106 жизнеспособных клеток/мл)	Конечный IVC (×106 клеток-д/мл)	Длитель-ность культуры (д)	Конечный титр (мг/л)	gp (пг/клетка-день)
Контроль (n=2)	1,07+/-0,018	9,53+/-0,005	13	41+/-1,9	4,7+/-0,29
CFI (n=2)	1,92+/-0,031	11,27+/-0,004	10	188+/-0,1	16,4+/-12,03
CFII (n=2)	2,72+/-0,009	20,74+/-0,177	13	434+/-16,5	25,1+/-1,17

Пример 3.4

Процессы культуры клеток с высоким титром, получаемые посредством добавления комбинированного подпитывающего раствора

Более высокие титры делают возможными меньшие количества технологических циклов, требующихся для достижения конкретного общего выхода. Следующий пример описывает крупномасштабный процесс с подпиткой для АВТ-874, который давал средний титр приблизительно 4 г/л во время процесса с подпиткой. Кроме того, дополнительное усовершенствование среды и комбинированного подпитывающего раствора позволил получать уровни титров более 7 г/л.

Материалы и способы

В качестве модельной системы использовали технологическую линию антитела АВТ-874.

Приготовление подпитывающего раствора

Подпитывающий раствор готовили в соответствии с описанными ранее процедурами. Использовали две концентрации аспарагина, т.е. 5,0 или 7,5 г/кг. Способ приготовления показан в следующей таблице:

Таблица 26
Приготовление комбинированного подпитывающего раствора АВТ-874
	1	MilliQ Н2О	600,0	г/кг-1
	2	Глюкоза	150,0
	3	PFCHO	21,0
+	4	NaOH 10н.		→	рН 10,00
	5	Аспарагин	5,0 или 7,5
	6	Yeastolate	65,0
	7	Фитон	40,0
+	8	HCl 5н.		→	рН 6,75

Компоненты взвешивали и добавляли последовательно для получения 1 кг конечной массы.

Материалы растворяли в указанной массе воды с использованием настольной магнитной мешалки при интенсивном перемешивании с завихрением. До стадии 5, после добавления каждого компонента визуально проверяли полноту растворения перед добавлением следующего компонента. Однако это не было возможным со стадиями 6 и 7. Для этих двух стадий, включение этого порошка в раствор считали достаточным для перехода к конечному добавлению HCl.

Скрининг среды процесса

Для получения данных производительности фона (базовой линии) проводили эксперимент, описывающий процесс в 3000 л с 3Х подпиткой (FB) в качестве контроля, процесс-прототип 4Х FB и 3Х и 4Х условия без подпитки (продленный периодический процесс с единовременной загрузкой: ЕВ). В частности, было предположено, что более высокие концентрации среды создавали начальный лаг-период в профиле роста культуры; однако для удлиненных периодических процессов (ЕВ) 3Х или 4Х не наблюдали существенного лаг-периода.

Как и ожидалось, добавление подпитки приводило к более высоким титрам для процесса как 3Х, так и 4Х. Тем не менее значительную супрессию роста наблюдали для процесса 4Х при подпитке (т.е. в процессе с подпиткой). Аминокислотный анализ экспериментов в малом масштабе показал, что, даже после подпитки, все еще существовало полное истощение аминокислот аспарагина и глутамина. По этой причине общее время подпитки и количество аспарагина в комбинированном подпитывающем растворе увеличивали. В результате, было определено, что процесс 4Х FB имеет потенциал достижения более высоких конечных титров, чем процессы EB или контроль 3X FB. Таким образом, он был выбран в качестве исходной точки для дополнительного развития.

Различия между процессом с подпиткой 3Х (контролем) и процессом с подпиткой 4Х описаны в таблице 27 и описаны более подробно ниже.

Плотность жизнеспособных клеток в начале подпиток

Наблюдали, что начало подпитки при очень низких плотностях клеток имеет тенденцию подавлять рост клеток и в конечном счете снижать конечный титр. Таким образом, ожидалось, что излишне задержанная подпитка может вызывать потерю объемной продуктивности вследствие голодания клеток.

Для исследования вышеуказанной гипотезы проводили несколько экспериментов для определения значения подпитки при различных плотностях жизнеспособных клеток. Объединенные результаты этих экспериментов построены в виде графика на фиг.1. Как можно видеть на фиг.1, титр в день 15 показывает сильную зависимость от плотности жизнеспособных клеток в день, когда начинается подпитка. Полином третьей степени, полученный по этим точкам данных, показывает, что максимальный титр в день 15 мог ожидаться при плотности в день подпитки 3,5×10⁶/мл.

Воспроизводимость

Условия процесса для процесса с 6 г/л описаны ниже в таблице 27 и были определены как инокуляция при сплит-отношении 1:4 от кратковременного пребывания в SR-383, pH 7,0, DO=30%, 37°С до плотности клеток 5,0-10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Условиями работы реактора были: pH 6,9, T=35°C, DO=40%. Подпитку начинали, когда клетки достигали плотности жизнеспособных клеток 3,5х10⁶ клеток/мл, и продолжали в течение 10 дней, посредством болюсных добавлений комбинированного подпитывающего раствора, составляющих 1% исходной массы реактора, каждый день.

Условия процесса для процесса 4 г/л описаны ниже в таблице 27.

Таблица 27
Основные моменты процессов культуры клеток АВТ-874 с 4 и 6 г/л
	Процесс
Параметр
	3XFB	4XFB
Среда	SR-286 (3XPFCHO)	SR-382 (4XPFCHO)
Сплит-отношение	1:5	1:4
Плотность посевного материала (106 жизнеспособных клеток/мл)	0,5-1,0	1,0-1,25
Критерий начала подпитки	День 3	3,5·106 клеток/мл-1

Количество подпитки (%)	1	1
Длительность подпитки (дни)	7	10
Аспарагин в подпитывающем растворе (г/л)	5,0	7,5
Смещение температуры	33°C @ 3,5·106 клеток/мл-1	Нет
Конечный титр	4 г·л-1	6 г·л-1±0,24 (n=9)

Пример 3.5

Культура с подпиткой, использующая комбинированный подпитывающий раствор посредством регуляции глюкозы с обратной связью

Регуляция с обратной связью позволяет устанавливать заданное значение для конкретного параметра с очень ограниченным пониманием внутреннего поведения этой системы. Таким путем, установленная заданная точка может поддерживаться независимо от любых нарушений или изменений, которым может быть подвергнута эта система. Вследствие комплексности метаболизма культуры клеток млекопитающего развитие всеобъемлющих моделей, которые могли бы позволить предсказание траектории культуры, является трудоемким. Тем не менее желательным является развитие способа взятия проб, например, с использованием автоматизированного взятия проб, чтобы иметь возможность подачи глюкозы для поддержания заданного уровня глюкозы. Это позволяет выделить действие конкретной концентрации глюкозы (или других метаболитов), а также обеспечивает средство для исследования действия, которое различные отношения глюкозы в комбинированном подпитывающем растворе оказывают на различные культуры. Это выделение данного действия связано с действием поддержания конкретного уровня глюкозы в противоположность действию использования разного количества глюкозы в комбинированном подпитывающем растворе.

Материалы и способы

В качестве модельной системы используют технологические линии для двух различных анти-IL-12-антител, АВТ-874 и 1D4.7.

Автоматизированное взятие проб, т.е. анализатор биопроцесса YSI 2700, было выбрано в качестве средства для мониторинга уровней глюкозы в среде культуры клеток. Подключенное автоматизированное устройство для взятия проб устанавливали присоединением монитора YSI 2730 и вспомогательного оборудования контроля к анализатору биопроцесса YSI 2700 (см. YSI Life Sciences; Yellow Springs, OH). Это устройство для взятия проб состояло из насоса, который удерживал две трубки. Первая трубка имела два ответвления, одно ответвление, которое собирало пробу из биореактора, и другое ответвление, которое накачивало антисептик для поддержания стерильности. После взятия пробы ее закачивали в наружную камеру, из которой засасывающий элемент забирал пробу для текущего анализа. Вторую трубку посредством насоса использовали для сбора отходов в контейнер для отходов. Несколько параметров вспомогательного подключенного оборудования для взятия проб контролировали, например, интервал взятия проб и TPU (время на стандартную ошибку, которое соответствует времени, в течение которого насос работает на основе измеренного смещения от установленного значения).

Этот насос соединяли с YSI при помощи 15-штырькового соединителя. Штырек, соответствующий глюкозному зонду (Белый-7, Черный-11) в YSI, соединяли со штырьком TTL вкл./выкл. (8) в насосе, и один из заземленных штырьков из YSI (1-5) соединяли с шасси из 15-штырькового соединителя для насоса. Это соединение проверяли поворачиванием на положение «вкл» и «выкл» насоса из Меню установки YSI. Трубки насоса были трубками Masterflex CFLEX 082.

Таблица 28
Начальная установка эксперимента с обратной связью
Клетки	АВТ-874
Среда	3XPFCHO (SR-286)
Подпитывающий раствор глюкозы	400 г/л
YSI TPU	16
Тестируемый объем реактора	1,5 л
Время сброса YSI	60 секунд
Скорость насоса	50 (половина, ~16 об/мин)
Интервал взятия проб YSI	4 часа/2 часа (объяснено ниже)
Выходной сигнал YSI	Х2 (для YSI-A25)
Антисептик	0,1н. NaOH

Реактор YSI1-A25 регулировали при 4,9 г/л глюкозы. Регуляцию глюкозы при 4,9 г/л начинали при приблизительно дне 2 с использованием интервала взятия проб 4 часа до дня 8. В день 8 интервал взятия проб уменьшали до 2 часов и установленное значение в автоматизированном устройстве YSI переустанавливали для стирания памяти PID. Флуктуации вследствие перехода за заданную позицию от установленного значения значимо уменьшались после дня 8. Таким образом, было установлено, что интервал взятия проб 2 часа был оптимальным для этих условий. Средний переход за заданное значение от дня 2 до дня 8 был 0,43 г/л и среднее недостижение заданного значения было 0,31 г/л, с ошибкой вследствие флуктуации приблизительно 8% от установленного значения. С другой стороны, средний переход за заданное значение от дня 8 до дня 13 был 0,08 г/л и среднее недостижение было 0,09 г/л, с ошибкой вследствие флуктуации приблизительно 2%.

Регуляция концентрации глюкозы с использованием комбинированного подпитывающего раствора

Схему подачи комбинированного подпитывающего раствора в культуру в биореакторе определяли при помощи эмпирического подхода. Испытывали различные количества подачи, а также различные периоды времени подачи, пока не находили жизнеспособную схему подпитки. В идеале, эта схема подачи комбинированной подпитки должна удовлетворять конкретным требованиям конкретной культуры.

Ввиду вышесказанного, было выгодно обеспечивать комбинированный подпитывающий раствор на основе потребностей культуры клеток, например, с использованием глюкозы в качестве индикатора потребностей в питательных веществах. Таким образом, система регуляции с обратной связью может быть использована 1) для тестирования различных подпитывающих растворов с варьирующимися концентрациями глюкозы и 2) применения генерированного профиля подпитки для подпитки вручную крупномасштабной культуры.

Следующая таблица суммирует два разных режима работы реактора с использованием линии клеток, которые продуцируют mAb 1D4.7. Ссылочный эксперимент (называемый фоном в таблице 29) иллюстрирует типичные показатели титра для продленного периодического процесса в среде SR-372, работающего при рН 6,9, Т=35°C, DO=40%, в биореакторах Applikon на 1,5 литра. YSI-эксперименты проводили при тех же самых условиях плюс регуляция с обратной связью для подачи комбинированных подпитывающих растворов, содержащих 100, 150 или 200 г/л глюкозы.

Таблица 29
Функционирование регуляции с обратной связью с использованием комбинированного подпитывающего раствора
Эксперимент	Конечный титр (мг/л)
Фон (n=2)	1312±33
YSI 100 (n=1)	1974
YSI 150 (n=2)	2044±164
YSI 200 (n=2)	1837±163

Как можно видеть из таблицы 29, эта система регуляции с обратной связью, использующая различные комбинированные подпитывающие растворы, улучшала конечный титр антитела.

Профили подпитки из экспериментов, подобных предыдущему эксперименту, получали взвешиванием количества комбинированного подпитывающего раствора, подаваемого на один день. Типичный профиль подачи представлен в следующей таблице:

Таблица 30
Типичный профиль подпитки, генерируемый посредством регуляции с обратной связью (профиль для антитела 1D4.7)
День	Подпитка (%)
1	0,00
2	0,00
3	0,00

4	0,00
5	1,12
6	1,56
7	1,79
8	1,23
9	0,89
10	0,75
11	0,46
12	0,32

Приведенная выше схема может также выполняться вручную для подпитки реактора даже без системы регуляции с обратной связью. Таким путем, эта схема подпитки может быть повышающим образом масштабирована.

Резюме результатов

Было показано, что процессы с подпиткой, использующие как смесь гидролизатов, так и базальную среду определенного химического состава, увеличивают конечный титр секретируемого mAb в культуре клеток млекопитающих.

Кроме того, был продемонстрирован способ, способный генерировать следующие стабильные комбинированные подпитывающие растворы:

Комбинированную подпитку, описанную в таблице 31, готовили, начиная с MilliQ Н₂О (до 750 г). Как указано выше, ингредиенты добавляли к воде до конечной массы (общей массы комбинированной подпитки) 1000 г. Кроме того, было показано, что комбинированные подпитывающие растворы увеличивают долговечность культуры клеток, максимальную плотность жизнеспособных клеток и удельную продуктивность. Кроме того, было показано, что процессы культуры клеток с подпиткой, использующие комбинированные подпитывающие растворы, способны достигать уровней титров до 6 г/л секретируемого моноклонального антитела. Было показано, что приведенные выше комбинированные подпитывающие растворы увеличивают плотность клеток культуры клеток.

Наконец, было показано, что способ, использующий систему регуляции с обратной связью и различные комбинированные подпитывающие растворы, способен увеличивать уровни титров. Этот подход мог бы использоваться для ускорения развития процесса культуры клеток быстрым генерированием режимов подпитки.

Ссылки

1. Whitford, W.G., Fed-Bαtch Mammalian Cell Culture in Bioproduction. BioProcess International, 2006. 30-40.

2. YSI Incorporated. (1998) YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer User's Manual.

3. YSI Incorporated. (1998) YSI 2730 Monitor and Control Accessory User's Manual.

4. Watson Marlow Pumps. 101F, 101U User's Manual.

ПРИМЕР 4

ПРИМЕНЕНИЕ БУТИРАТА НАТРИЯ И N-АЦЕТИЛЦИСТЕИНА ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ПРОДУЦИРУЮЩЕЙ АНТИ-IL-18-АНТИТЕЛО ЛИНИИ КЛЕТОК СНО

Данное изобретение включает в себя новый подход к увеличению продуктивности антитела, например, анти-IL-18-продуцирующей линии клеток СНО. Более конкретно, следующий пример относится к конечному антителу, например, анти-IL-18-антителу, увеличению титра посредством добавления химикалиев к культуральной среде. Улучшения жизнеспособности клеток и титра антител описаны ниже с использованием примерного антитела, т.е. IL-18-антитела.

Клеточная линия и среды культуры

Анти-IL-18-антителом, использованным в следующем примере, является полностью человеческое IgG1-антитело ((Ab) к IL-18. Линию клеток СНО, экспрессирующую анти-IL-18, культивируют в среде для выращивания, описанной выше в таблице 4 примера 1, SR-371. Продукционными средами для этой клеточной линии являются среды, также описанные выше в примере 1, SR-372 (используемая для культуры во вращающихся колбах) и SR-382 (используемая для культуры в биореакторах).

Условия культуры для экспериментов, проводимых во вращающихся колбах

Все эксперименты с вращающимися колбами выполняли в двух повторностях. Культуры во вращающихся колбах перемешивали на Thermolyne stir plate при 80 об/мин в термостате при 35°C и 5% CO₂. Непосредственно перед инокуляцией требуемое количество суспензии клеток брали из поддерживаемой культуры. Эти клетки центрифугировали, супернатант выбрасывали и осадки ресуспендировали в свежей, предварительно согретой культуральной среде с получением плотности посевного материала 4×10⁵/мл.

Пример 4.1

Действие бутирата натрия на рост и продуктивность анти-IL-18-продуцирующей линии клеток СНО, культивируемой в среде для выращивания

Для определения диапазона концентраций бутирата натрия, первый эксперимент проводили в SR-371, содержащей различные концентрации бутирата натрия. Этот эксперимент проводили во вращающихся колбах на 100 мл с рабочим объемом 70 мл. Бутират натрия добавляли из исходного 1М раствора, который готовили растворением 1,101 г бутирата натрия в 10 мл MilliQ воды, и стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 мкм. Этот раствор хранили при -20°C.

Бутират натрия добавляли в начале этой культуры (День 0) в концентрациях 0 мМ, 0,125 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ. Плотность клеток и жизнеспособность определяли автоматическим счетчиком клеток (Cedex, Innovatis, Germany) в этом примере и во всех следующих примерах. Таблица 32 показывает плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования, а таблица 33 описывает жизнеспособность на протяжении периода культивирования. Этот эксперимент проводили в течение 12 дней.

Таблица 32
Плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования
Плотность жизнеспособных клеток (105/мл)
День	Колба 1:	Колба 2:	Колба 3:	Колба 4:	Колба 5:	Колба 6:	Колба 7:	Колба 8:
	0 мМ бутират	0 мМ бутират	0,125 мМ бутират	0,125 мМ бутират	0,5 мМ бутират	0,5 мМ бутират	1 мМ бутират	1 мМ бутират
0	3,2	3,85	4,46	3,01	3,66	3,98	3,83:
3	36,38	33,18	27,12	29,96	16,97	11,71	7,68:
5	84,48	70,37	62,56	66,1	21,79	9,77	3,25:
7	65,98	64,19	59,15	68,66	17,72	5,41	1,04
10	7,83	11,17	8,63	11,85	4,53	6,93	0,8
12	1,36	2,28	3,68	3,81	208	1,89	0,22
Таблица 33
Жизнеспособность на протяжении периода культивирования
Жизнеспособность (%)
День	Колба 1:	Колба 2:	Колба 3:	Колба 4:	Колба 5:	Колба 6:	Колба 7:	Колба 8:
	0 мМ бутират	0 мМ бутират	0,125 мМ бутират	0,125 мМ бутират	0,5 мМ бутират	0,5 мМ бутират	1 мМ бутират	1 мМ бутират
0	98,5	97,5	98,9	100	97,4	98,2	98,8	98,8
3	98,3	98,1	97,3	97,9	95,4	92,2	88,3	73,8
5	96,7	96,7	96	96,7	88,8	72,9	54	40,1
7	73,4	75,5	78,1	83,3	69	43,1	24,2	16,4
10	7,9	13,1	13,1	14,3	21	25,9	11,3	14,5
12	1,4	2,8	5,9	4,9	7,6	14,9	3,2	8,9

Можно ясно видеть, что бутират натрия влиял на рост и жизнеспособность клеток. Хотя не было явного действия на рост и жизнеспособность при концентрации бутирата 0,125 мМ, было явное действие на рост клеток при 0,5 мМ бутирате, приводящее к более низкой максимальной плотности клеток. При 0,5 мМ бутират натрия влиял на жизнеспособность после 5 дней периода культивирования. Бутират натрия полностью ингибировал рост клеток при концентрации 1 мМ, а жизнеспособность уменьшалась непрерывно со Дня 0.

Таблица 34 показывает титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования. Концентрацию анти-IL-18 определяли анализом Poros A HPLC (ВЖХ) в этом примере и во всех следующих примерах.

Таблица 34
Титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования
Титр (мг/л)
День	Колба 1:	Колба 2:	Колба 3:	Колба 4:	Колба 5:	Колба 6:	Колба 7:	Колба 8:
	0 мМ бутират	0 мМ бутират	0,125 мМ бутират	0,125 мМ бутират	0,5 мМ бутират	0,5 мМ бутират	1 мМ бутират	1 мМ бутират
0	5,4	2,4	1,8	1,6	1,3	1,3	1,1	1,3
3	68,9	58,1	67,7	65,7	52,1	41,9	36,3	26,2
5	173,2	150,4	169,4	174,3	132,6	84,2	68,6	46,4
7	235,5	211,9	253,6	278,5	217,7	110,7	85	60,9
10	265,5	241,8	304,3	365,9	278,2	163,3	91,8	70,3
12	269,7	244,4	318,7	385,8	282,7	175,9	94	75,4

Средний конечный титр культур с 0,125 мМ бутиратом был равен 352 мг/л, средний конечный титр необработанного контроля был равен 257 мг/л. При этой концентрации обработка бутиратом приводила к 40% увеличению конечного титра.

Пример 4.2

Действие бутирата натрия на рост и продуктивность анти-IL-18-продуцирующей линии клеток СНО, культивируемых в SR-372

Анти-IL-18-экспрессирующую линию клеток СНО адаптировали к росту в SR-372 для исключения любого возможного действия перенесения культуры из SR-371 в SR-372. Все эксперименты с клетками, адаптированными к росту в SR-372, проводили во вращающихся колбах на 250 мл с рабочим объемом 180 мл. Эти культуры проводили с использованием условий, описанных выше и в разделе, озаглавленном “Условия культуры для экспериментов, проводимых во вращающихся колбах”.

Один эксперимент был спланирован для добавления бутирата, когда эти клетки находились в средней или поздней экспоненциальной фазе роста. Более позднее добавление бутирата будет, вероятно, вызывать меньший стресс в отношении этих клеток и приводить к улучшенному росту и более высокому IVC в сравнении с добавлением в день 0, так как концентрация бутирата на клетку является более низкой (IVC (Интеграл жизнеспособных клеток) определяется как интеграл плотности жизнеспособных клеток в зависимости от периода культивирования). Бутират добавляли в День 4 и День 5 в концентрациях 0,5 мМ и 2 мМ. Этот эксперимент проводили в течение 12 дней. Таблица 4 показывает плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования, таблица 5 показывает жизнеспособность на протяжении периода культивирования. Только 2 мМ бутират натрия, добавленный в День 4, приводил к уменьшенной жизнеспособности в сравнении с контролем, другие условия не влияли на жизнеспособность.

Таблица 35
Плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования
Плотность жизнеспособных клеток (105/мл)
День	Колба 1: 0 мМ бутират	Колба 2: 0 мМ бутират	Колба 3: 0,5 мМ бутират в день 4	Колба 4: 0,5 мМ бутират в день 4	Колба 5: 2 мМ бутират в день 4	Колба 6: 2 мМ бутират в день 4	Колба 7: 0,5 мМ бутират в день 5	Колба 8: 0,5 мМ бутират в день 5	Колба 9: 2 мМ бутират в день 5
0	2,35	3,37	3,08	2,61	2,27	2,41	3,2	2,27
3	1451	15,79	12,79	13,69	14,04	9,42	11,41	11,36
4	28,88	20,91	18,88	26,11	25,48	16,09	1878	23,15
5	28,58	32,17	36,01	33,03	27,82	21,98	30,76	35,8
6	61,91	54,31	45,2	43,08	37,02	34,28	47,82	55,65

7	56,23	51,59	40,09	36,19	33,34	27,21	42,97	52,08
10	43,06	51,89	29,2	23,33	14,07	13,05	29,58	28,61
12	24,8	33,38	19,38	14,32	9,66	8,22	18,25	16,18
Таблица 36
Жизнеспособность на протяжении периода культивирования
Жизнеспособность (%)
День	Колба 1: 0 мМ бутират	Колба 2: 0 мМ бутират	Колба 3: 0,5 мМ бутират в день 4	Колба 4: 0,5 мМ бутират в день 4	Колба 5: 2 мМ бутират в день 4	Колба 6: 2 мМ бутират в день 4	Колба 7: 0,5 мМ бутират в день 5	Колба 8: 0,5 мМ бутират в день 5	Колба 9: 2 мМ бутират в день 5
0	98,4	94,6	92,7	99	95,2	94,9	98,8	97,7
3	96,6	97,2	98,8	99	97,2	98	97,8	97,8
4	97	98,5	99	98,6	98,5	98	98,9	97,8
5	95,6	97,7	97,5	97,3	96,6	97,9	98	97,2
6	96,5	96,4	96,2	96	93,6	92,4	96,3	96
7	95,6	95,7	93,8	92,9	87,8	87,5	94,2	94
10	62,6	69,4	61,9	53,9	40,8	39,2	63,7	55,9
12	38,3	46,2	40,4	33,6	24,5	25,2	36,7	32,7

Таблица 37 показывает титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования. 2 мМ бутират натрия, добавленный в День 5, приводил к увеличению 29% в сравнении с контролем (317 мг/л против 245 мг/л, соответственно). При этих условиях рост клеток значимо не ингибировался (см. таблицу 35).

Таблица 37
Титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования
Титр (мг/л)
День	Колба 1: 0 мМ бутират	Колба 2: 0 мМ бутират	Колба 3: 0,5 мМ бутират в день 4	Колба 4: 0,5 мМ бутират в день 4	Колба 5: 2 мМ бутират в день 4	Колба 6: 2 мМ бутират в день 4	Колба 7: 0,5 мМ бутират в день 5	Колба 8: 0,5 мМ бутират в день 5	Колба 9: 2 мМ бутират в день 5	Колба 10: 2 мМ бутират в день 5
7	138,5	141,1	147,7	139,2	183,4	182	129,5	137,5	152,8	149,5
10	192,2	208,7	226,9	203,3	269,6	259,5	202,5	205,4	266,1	260,6
12	232,2	258,7	269,4	235,3	307,8	286,2	237,4	236,9	319,3	315

Пример 4.3

Действие бутирата натрия на рост и продуктивность анти-IL-18-продуцирующей линии клеток СНО, культивируемой в SR-382 в биореакторе на 3 л

Следующий пример демонстрирует увеличение конечного титра анти-IL-18 введением бутирата натрия в Процесс В анти-IL-18 (см. Раздел 1.5) в крупном масштабе, т.е. в биореакторах на 3 л. Этот процесс был разработан в биореакторах на 3 л. Подготовку посевного материала проводили в SR-371 до стадии кратковременного наполнения (SR-372). Эту стадию кратковременного наполнения воспроизводили в мешке Biowave Bag на 20 л с рабочим объемом 10 л. Эксперимент, исследующий действие бутирата натрия на рост и продуктивность Процесса В анти-IL-18, проводили в биореакторах Applikon на 3 л с рабочим объемом 1,5 л. Каждый биореактор заполняли 1125 мл SR-382 и инокулировали добавлением 375 мл суспензии клеток из мешка Biowave Bag, содержащего анти-IL-18-клетки в SR-372.

В примере 4.2 увеличение титра достигалось добавлением бутирата, когда эти клетки находились в средней - поздней логарифмической фазе роста, что соответствовало дню 5 во вращающихся колбах. Исторически, средняя-поздняя логарифмическая фаза продукционного процесса анти-IL-18 в биореакторе на 3 л соответствует дню 7 времени культуры. В этом примере, был выбран день 7 для добавления бутирата натрия к культуре для гарантии того, что бутират добавляется в средней-поздней log-фазе.

Исходный раствор бутирата натрия в концентрации 200 мМ готовили в день 7 непосредственно перед добавлением в культуру растворением 4,404 г бутирата натрия в 200 мл MilliQ воды. Этот раствор стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм.

Этот эксперимент проводили с 5 биореакторами. Каждый эксперимент с биореактором заканчивали, когда соответствующая жизнеспособность была менее 50%. Два биореактора использовали в качестве контроля (процесс В анти-IL-18). Бутират натрия добавляли в день 7 времени культуры в другие 3 биореактора в концентрациях 0,3 мМ, 1 мМ и 3 мМ, соответственно. Таблица 38 показывает жизнеспособность на протяжении периода культивирования.

Таблица 38
Плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования
Плотность жизнеспособных клеток (105/мл)
День	Реактор 1: 1 мМ бутират	Реактор 2: без бутирата	Реактор 3: 0,3 мМ бутират	Реактор 4: 3 мМ бутират	Реактор 5: без бутирата
0	5,53	5,22	4,89	5,28	5,41
1	8,21	7,68	7,66	9,66	6,81
2	11,35	13,53	10,39	11,12	10,07
3	15,62	17,37	12,58	14,3	13,07
4	20,69	22,4	18,39	22,46	16,49
5	29,58	31,55	31,15	34,03	23,43
6	41,27	44,42	43,32	46,81	32,3
7	59,07	62,09	56,91	60,46	33,95
8	67,07	76,26	51,82	76,4	45,43
9	68,68	73,23	63,11	61,52	57,6
10	65,55	70,17	64,53	55,52	62,45
11	66,55	72,98	66,23	47,27	63,42
12	60,98	56,33	45,87	30,99	44,65

13	49,67	52,03	40,39	21,34	39,1
14	38,46	30,51	21,93		18,38
15	33,23	38,37	41,34		35,97
16	27,97	29,31	33,89		24,58
17			30,13		17,51
18			20,98
Таблица 39
Жизнеспособность на протяжении периода культивирования
Жизнеспособность (%)
День	Реактор 1: 1 мМ бутират	Реактор 2: без бутирата	Реактор 3: 0,3 мМ бутират	Реактор 4: 3 мМ бутират	Реактор 5: без бутирата
0	95,3	96	92,9	94,3	96,4
1	96,4	95,4	96,4	96,3	95,9
2	96,3	95,9	95,9	96,1	96,7
3	96,6	95,6	97,7	96,6	95,3
4	97,3	97,2	96,4	95,8	95,2
5	97,1	96,4	96,2	96,4	95,3
6	96,4	96,5	96,2	96,8	95,9
7	96,3	95,2	95,8	94,3	95,1
8	96,2	95,2	94,2	95,1	94,8
9	95,6	95,2	95,4	93,6	94,2
10	94,3	94,5	94,6	87,4	93,4
11	92,2	93,9	93,8	78,9	93
12	88,1	91,7	92,4	51,9	92
13	80,6	86,9	90,2	33,7	89,2
14	66,7	76,2	88,9		84,1
15	57	60,7	85,2		73,4
16	45,9	42,7	69,5		50,7
17			58,1		34,2
18			41

Контрольная культура росла медленнее в реакторе 5, чем в его повторности (реакторе 2) вследствие высокой начальной концентрации CO₂ в реакторе 5. Реактор 2 останавливали в день 16 периода культивирования (исторически наблюдаемого в продукционном процессе анти-IL-18), реактор 5 останавливали в день 17. Бутират натрия в концентрации 3 мМ (реактор 4) влиял на рост и жизнеспособность клеток. Спустя 2 дня после добавления бутирата клетки начинали умирать. Бутират в концентрации 1 мМ не влиял на рост и жизнеспособность клеток (реактор 1), работу этого реактора останавливали в день 16. В реакторе 2 рост клеток был очень похожим на рост в контроле в реакторе 2. Бутират при 0,3 мМ пролонгировал время культуры на 2 дня (реактор 3). Таблица 40 показывает титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования.

Таблица 40
Титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования
Титр (мг/л)
	Реактор 1: 1 мМ бутират	Реактор 2: без бутирата	Реактор 3: 0,3 мМ бутират	Реактор 4: 3 мМ бутират	Реактор 5: без бутирата
9	1033	1074,2	905,8	966,9	747,4
10	1218,4	1223,9	1096,4	1184,9	877,5
11	1410,4	1460	1261,1	1242,9	1053,5
12	1663,5	1538,1	1485,1	1269,5	1216,7
13	1700,2	1912,5	1750,9	1304,6	1303
14	1852,7	2136,9	1923,4		1429,3
15	1909,4	2223,2	2280,4		1672,3
16	1933,7	2324,7	2108,6		1540,5
17			2561,3		1589,4
18			2448,6

Конечный титр (день 16) культуры в реакторе 2 (представляющем Процесс В анти-IL-18) был равен 2325 г/л. Конечный титр в реакторе 5 был равен 1589 г/л. Этот более низкий титр, вероятно, обусловлен худшим ростом клеток, вызываемым высокой исходной концентрацией CO₂ в среде культуры. Бутират при 1 мМ и 3 мМ, добавленный в день 7, приводил к более низкому конечному титру, чем титр в контроле (реакторе 2). Бутират при 0,3 мМ, добавленный в день 7, приводил к титру 2561 г/л в день 17, что соответствует увеличению 10% в сравнении с контролем. Этот титр был наивысшим титром, достигнутым в процессе анти-IL-18.

Пример 4.4

Действие N-ацетилцистеина (10 мМ, 20 мМ, 40 мМ, 80 мМ) на рост и продуктивность анти-IL-18-продуцирующей линии клеток СНО, культивируемых в SR-372

N-ацетилцистеин может защищать клетки млекопитающих от смерти клеток. В качестве антиоксиданта он непосредственно восстанавливает реакционноспособные молекулы кислорода. Посредством деацетилирования он может быть превращен в цистеин и может увеличивать внутриклеточные уровни глутатиона. Глутатион может акцептировать реакционноспособные молекулы кислорода и служит в качестве субстрата в восстановлении пероксида водорода до воды.

Этот пример демонстрирует увеличивающее титр анти-IL-18 действие N-ацетилцистеина. Эти эксперименты проводили во вращающихся колбах на 250 мл с рабочим объемом 180 мл. Средой культуры была SR-372. Перед этим экспериментом клетки предварительно адаптировали для роста в среде SR-372, как описано в примере 4.2. Условия культуры во вращающихся колбах были такими, как условия, описанные выше в “Culture Conditions for Experiments Carried out in Spinner Flasks”.

Исходный 1М раствор N-ацетилцистеина готовили растворением 16,32 г N-ацетилцистеина в 100 мл MilliQ воды на нагреваемой перемешивающей пластине. Исходный раствор стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм. За один день перед началом этого эксперимента N-ацетилцистеин добавляли к SR-372 с получением концентраций 0 мМ, 10 мМ, 20 мМ, 40 мМ и 80 мМ. Эксперимент начинали центрифугированием клеток из поддерживающей культуры СНО с анти-IL-18, как описано выше в “Culture Conditions for Experiments Carried out in Spinner Flasks”. Каждую культуру во вращающихся колбах останавливали, когда соответствующая жизнеспособность была ниже 50%.

Рост клеток не был возможен при концентрациях N-ацетилцистеина 20 мМ, 40 мМ и 80 мМ. Таблица 41 и таблица 42 показывают сравнение плотности жизнеспособных клеток и жизнеспособности, соответственно, на протяжении периода культивирования с клетками, растущими в 0 мМ N-ацетилцистеине и 10 мМ N-ацетилцистеине.

Таблица 41
Плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования
Плотность жизнеспособных клеток (105/мл)
День	Колба 1: без N-ацетилцистеина	Колба 2: без N-ацетилцистеина	Колба 3: 10 мМ N-ацетилцистеина	Колба 4: 10 мМ N-ацетилцистеина
0	3,60	3,44	2,73	2,73
3	18,34	17,72	3,58	3,02
4	29,39	29,71	4,47	4,24

5	33,54	31,05	6,46	6,40
6	37,38	32,92	9,84	7,27
7	34,26	31,00	12,36	12,00
8	17,49	17,68	24,20	22,42
9	25,34	21,54	20,14	19,48
10	17,49	17,68	24,20	22,42
11	10,75	13,84	25,02	26,00
12			27,44	27,56
13			25,77	27,86
14			22,77	24,17
15			18,40	19,22
16			14,60	16,30
Таблица 42
Жизнеспособность NaCl на протяжении периода культивирования
Жизнеспособность (%)
День	Колба 1: без N-ацетилцистеина	Колба 2: без N-ацетилцистеина	Колба 3: 10 мМ N-ацетилцистеина	Колба 4: 10 мМ N-ацетилцистеина
0	97,4	96,9	96,2	95,3
3	98,8	98,6	57,2	52,1
4	99,0	98,8	61,9	62,2
5	98,7	98,5	69,5	72,1
6	95,4	92,8	76,0	73,5
7	87,8	84,0	81,5	80,9
8	73,3	69,6	85,5	82,7
9	64,9	60,8	82,7	86,5
10	52,5	49,0	82,5	86,9
11	38,6	38,1	81,7	87,2
12			79,2	83,1
13			74,8	78,9
14			67,2	68,7
15			56,7	56,9
16			49,3	47,2

Контрольную культуру (без N-ацетилцистеина) останавливали в день 11 периода культивирования, тогда как культура с 10 мМ N-ацетилцистеином могла быть пролонгирована до дня 16. Вначале 10 мМ N-ацетилцистеина влияло на рост и жизнеспособность клеток и приводил к снижению жизнеспособности до дня 3. Затем жизнеспособность начинала увеличиваться. Максимальная плотность клеток культур, росших в 10 мМ N-ацетилцистеине, была более низкой в сравнении с контролем. Таблица 43 демонстрирует увеличение конечного титра анти-IL-18 N-ацетилцистеином.

Таблица 43
Титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования
Титр (мг/л)
День	Колба 1: без N-ацетилцистеина	Колба 2: без N-ацетилцистеина	Колба 3: 10 мМ N-ацетилцистеина	Колба 4: 10 мМ N-ацетилцистеина
4	102,0	94,9	23,9	21,9
5	130,5	122,4	35,3	32,5
6	168,5	154,3	60,6	55,9
7	190,4	171,8	84,2	78,0
8	216,4	194,3	125,3	119,3
9	233,0	206,9	156,6	153,1
10	243,2	216,4	185,9	187,7
11	258,6	227,8	224,1	230,9
12			264,1	272,6
13			300,2	311,2
14			334,0	314,6
15			393,0	384,4
16			414,6	421,4

Средний конечный титр контрольных культур равен 243,2 мг/л, средний конечный титр культур, росших в 10 мМ N-ацетилцистеине, был равен 418 мг/л. Это соответствует увеличению 72% в сравнении с контролем.

Пример 4.5

Действие N-ацетилцистеина (1 мМ, 2 мМ, 4 мМ, 8 мМ) на рост и продуктивность анти-IL-18-продуцирующей линии клеток СНО, культивируемых в SR-372

Как описано в примере 4.4, N-ацетилцистеин в концентрации 10 мМ, добавленный в день 0, мог пролонгировать время культуры и приводить к увеличению конечного титра. Однако при этой концентрации жизнеспособность клеток вначале уменьшалась. На основании этих результатов в примере 4.4 был спланирован эксперимент, использующий одну десятую концентраций N-ацетилцистеина, используемых в примере 4.4. Условия для первой вращающейся колбы были такими же, что и условия в примере 4.4. N-ацетилцистеин добавляли в концентрациях 0 мМ (контроль), 1 мМ, 1 мМ, 2 мМ, 4 мМ и 8 мМ.

Таблица 44 показывает плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования, а таблица 45 показывает жизнеспособность на протяжении периода культивирования.

Таблица 44
Плотность жизнеспособных клеток на протяжении периода культивирования
День	Колба 1: 0 мМ N-ацетилцистеина	Колба 2: 0 мМ N- ацетилцистеина	Колба 3: 1 мМ N- ацетилцистеина	Колба 4: 1 мМ N- ацетилцистеина	Колба 5: 2 мМ N- ацетилцистеина
0	2,75	3,45	3,64	3,22	4,10
3	25,05	22,42	19,25	19,32	17,42
4	35,98	31,42	25,45	24,56	24,96
5	45,43	37,56	31,16	29,23	27,28

6	40,04	39,41	29,67	28,35	28,45
7	35,55	33,25	27,71	27,03	26,65
8	31,56	26,22	24,63	22,33	22,49
9	27,15	23,04	22,23	20,23	19,11
10	23,26	19,88	21,06	17,74	18,07
11					15,48
12
13
14

День	Колба 6: 2 мМ N-ацетил-цистеин	Колба 7: 4 мМ N-ацетил-цистеин	Колба 8: 4 мМ N-ацетил-цистеин	Колба 9: 8 мМ N-ацетил-цистеин	Колба 10: 8 мМ N-ацетил-цистеин
0	2,96	3,13	2,80	2,97	3,54
3	19,03	17,39	16,39	11,24	10,17
4	28,40	24,80	23,71	14,47	13,88
5	34,21	28,06	26,92	20,68	18,64
6	37,05	30,62	29,54	25,59	23,13
7	32,55	30,66	26,94	28,22	26,12
8	28,99	24,75	23,84	30,00	30,77
9	27,75	22,25	21,71	27,45	28,63
10	23,05	20,06	19,67	27,14	27,90
11	20,75	16,79	16,70	26,42	29,60
12				26,39	25,62
13				21,46	22,29
14				30,47	32,41
Таблица 45
Жизнеспособность на протяжении периода культвирования
День	Колба 1: 0 мМ N- ацетилцистеина	Колба 2: 0 мМ N- ацетилцистеина	Колба 3: 1 мМ N- ацетилцистеина	Колба 4: 1 мМ N- ацетилцистеина	Колба 5: 2 мМ N- ацетилцистеина
0	94,6	97,6	96,2	93,3	94,9
3	98,3	97,6	99,1	98,1	98,6

4	98,0	96,8	98,2	97,6	97,2
5	97,1	96,0	96,3	95,0	96,1
6	90,2	89,6	89,3	89,3	89,9
7	79,0	80,1	79,8	77,3	79,6
8	60,6	62,2	64,8	62,2	62,2
9	52,7	53,4	56,9	52,6	54,8
10	46,2	45,5	51,3	45,9	50,2
11					40,3
12
13
14

День	Колба 6: 2 мМ N- ацетилцистеина	Колба 7: 4 мМ N- ацетилцистеина	Колба 8: 4 мМ N- ацетилцистеина	Колба 9: 8 мМ N- ацетилцистеина	Колба 10: 8 мМ N- ацетилцистеина
0	93,8	94,9	91,7	92,1	93,6
3	97,5	97,1	98,4	96,4	94,3
4	98,2	97,4	97,6	96,4	94,4
5	97,1	97,1	96,9	96,5	94,4
6	93,0	92,4	93,1	95,8	92,0
7	86,1	84,5	85,0	93,4	89,6
8	71,9	68,4	70,6	85,6	84,7
9	65,2	58,5	60,3	79,7	79,5
10	54,9	52,0	55,0	76,3	75,0
11	45,1	42,5	45,7	68,4	69,0
12				61,3	61,2
13				51,1	52,2
14				39,4	42,6

Контрольные культуры (0 мМ N-ацетилцистеин) останавливали после 10 дней периода культивирования. N-ацетилцистеин мог пролонгировать долговечность культуры. Культуры, росшие в 8 мМ N-ацетилцистеине, останавливали после 14 дней культуры. Культуры, росшие в N-ацетилцистеине, имели более низкую максимальную плотность клеток в сравнении с контролем.

Таблица 46 показывает действие N-ацетилцистеина на конечный титр анти-IL-18.

Таблица 46
Титр анти-IL-18 на протяжении периода культивирования
Титр (мг/л)
День	Колба 1: 0 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 2: 0 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 3: 1 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 4: 1 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 5: 2 мМ N-ацетил-цистеина
7	193,1	168,3	210,1	202,5	198,0
8	230,3	199,9	241,6	232,2	227,5
9	244,7	216,2	256,6	245,4	242,0
10	262,7	227,2	268,9	258,3	253,2
11					268,3
12
13
14

День	Колба 6: 2 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 7: 4 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 8: 4 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 9: 8 мМ N-ацетил-цистеина	Колба 10: 8 мМ N-ацетил-цистеина
7	274,0	210,9	202,0	181,9	175,1
8	323,9	251,6	240,2	237,6	232,2
9	374,7	271,7	259,3	267,7	263,9
10	428,8	288,9	276,3	295,3	292,2
11	444,1	315,5	304,3	349,1	367,9
12				369,5	401,4
13				429,5	432,0
14				477,6	484,4

Средний конечный титр анти-ил-18 контрольных культур был равен 245 мг/л (очень близкий к 243 мг/л в примере 4.4). Конечный титр анти-IL-18 культур, росших в 8 мМ N-ацетилцистеине, был равен 481 мг/л. Это соответствует увеличению 96% в сравнении с контролем.

Эквиваленты

Квалифицированным в данной области специалистам будут известны, или они будут способны определить не более чем рутинным экспериментированием, многие эквиваленты относительно конкретных вариантов этого изобретения, описанных здесь. Предполагается, что такие эквиваленты включены в следующую формулу изобретения. Содержание всех ссылочных документов, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитируемые в данной заявке, включены здесь в виде ссылки.

1. Способ получения антитела или его фрагмента с подпиткой, включающий:
а) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и
b) подпитку этих клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток,
где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей,
где способ приводит к продуцированию антитела или его фрагмента.

2. Способ по п.1, где обогащенный раствор базальной среды содержит концентрированную базальную среду или обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу.

3. Способ по п.2, где базальной средой является среда PF CHO.

4.Способ по любому из пп.1-3, в котором клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка (CHO).

5. Способ по п.1, в котором гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.

6. Способ получения анти-TNFα-антитела с подпиткой, включающий:
а) культивирование клеток китайского хомячка (CHO), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNFα-антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и
b) подпитку клеток CHO добавлением обогащенного гидролизатом раствора и базального обогащенного раствора к культуре клеток,
где базальный обогащенный раствор содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и
где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей,
где способ приводит к продуцированию анти-TNFα-антитела.

7. Способ с подпиткой по п.6, в котором продукционная среда культуры клеток на стадии а) содержит по меньшей мере 2,0 г/л глюкозы, причем концентрация глюкозы на указанной стадии регулируется добавлением глюкозы к продукционной среде культуры клеток по мере необходимости для поддержания концентрации по меньшей мере 2,0 г/л глюкозы.

8. Способ по п.6 или 7, в котором:
указанный способ дополнительно включает извлечение анти-TNFα-антитела;
культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°C;
продукционную среду культуры клеток поддерживают в диапазоне 20-65% растворенного кислорода;
осмолярность продукционной среды культуры клеток поддерживают на всем протяжении культивирования не выше 500 мОсм;
обогащенный гидролизатом раствор состоит по существу из приблизительно 50-280 г/кг гидролизата сои и приблизительно 75-300 г/кг гидролизата дрожжей;
базальной средой является PF CHO; или
базальный обогащенный раствор имеет рН 9,0-10,5.

9. Способ по п.8, в котором культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°C.

10. Способ по п.8, в котором продукционную среду культуры клеток поддерживают в диапазоне 20-65% растворенного кислорода.

11. Способ по п.6, в котором гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.

12. Способ по п.6, в котором:
- подпитка происходит в течение приблизительно 9-15 дней; или
- базальный обогащенный раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток по меньшей мере в один из следующих дней этого периода времени: День 4, День 6, День 9 и День 11; или
- обогащенный гидролизатом раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток в День 4, День 7 или День 4 и День 7 этого периода времени; или
- указанный способ дополнительно включает коррекцию рН продукционной среды культуры клеток в соответствии с линейным уменьшением рН, где это линейное снижение рН приводит к конечному рН, составляющему приблизительно 6,9.

13. Способ по п.12, где указанный способ дополнительно включает коррекцию рН продукционной среды культуры клеток в соответствии с линейным уменьшением рН, где это линейное снижение рН приводит к конечному рН, составляющему приблизительно 6,9, и линейное снижение рН корректируют на протяжении периода, выбранного из группы, состоящей из по меньшей мере приблизительно 24 часов, по меньшей мере приблизительно 48 часов и приблизительно 72 часов.

14. Способ по п.6 или 7, в котором продукционная среда культуры клеток содержит:
a) 8-10 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) 0,1-1 г/кг L-глутамина;
e) 1-3 г/кг бикарбоната натрия;
f) 1-3 г/кг HEPES;
g) 2-3 г/кг NaCl;
h) 0,1-2 г/кг Плюроника F-68;
i) 0,01-0,1 г/кг NaH₂PO₄∙H₂O;
j) 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄∙7H₂O;
k) 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и
l) 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения,
m) модифицированную базальную среду.

15. Способ по п.6 или 7, в котором культура клеток является крупномасштабной культурой клеток.

16. Способ по п.15, в котором крупномасштабная культура клеток является большей чем приблизительно 10 л.

17. Способ получения анти-IL-12-антитела с подпиткой, включающий:
a) культивирование клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и
b) подпитку этих клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и базального обогащенного раствора к культуре клеток,
где базальный обогащенный раствор содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и
где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей,
где способ приводит к продуцированию анти-IL-12-антитела.

18. Способ по п.17, в котором:
- обогащенный гидролизатом раствор дополнительно содержит глюкозу; или
- дополнительно включает извлечение анти-IL-12-антитела; или
- культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°C; или
- температура культивирования равна приблизительно 33°C; или
- продукционную среду культуры клеток поддерживают при 20-65% растворенного кислорода; или
- продукционная среда культуры клеток имеет рН приблизительно 6,7-7,2; или
- обогащенный гидролизатом раствор состоит по существу из приблизительно 50-225 г/кг гидролизата сои, приблизительно 75-300 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-3 г/л глюкозы.

19. Способ по п.18, в котором продукционную среду культуры клеток поддерживают при 20-65% растворенного кислорода.

20. Способ по п.17, в котором гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.

21. Способ по п.17, в котором базальный обогащенный раствор содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и базальный обогащенный раствор
имеет рН 9,7 и осмолярность приблизительно 1400-1500 мОсм; или
базальной средой в базальном обогащенном растворе является PF CHO.

22. Способ по любому из пп.17-21, в котором:
- подпитка происходит в течение 14-15 дней; или
- базальный обогащенный раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток каждый день, начиная в день 6 этого периода времени; или
- базальный обогащенный раствор и обогащенный гидролизатом раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток каждый день, начиная в день 5 этого периода времени.

23. Способ по любому из пп.17-21, в котором продукционная среда культуры клеток содержит:
a) модифицированную базальную среду;
b) приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
с) приблизительно 5-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
d) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
е) приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина;
f) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия;
g) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
h) приблизительно 2-3 г/кг NaCl;
i) приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68;
j) приблизительно 0,01 - 0,1 г/кг NaH₂PO₄∙H₂O;
k) приблизительно 0,1-1 г/кг Na₂HPO₄∙7H₂O;
l) приблизительно 6-12 г/кг гидролизата дрожжей и
m) приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.

24. Способ по любому из пп.17-21, в котором культура клеток является крупномасштабной культурой клеток.

25. Способ по п.24, где крупномасштабная культура клеток является большей чем приблизительно 10 л.

26. Способ по п.9, в котором культуру клеток культивируют при температуре приблизительно 35°C.

27. Способ по п.10, в котором продукционную среду культуры клеток поддерживают при приблизительно 30% растворенного кислорода.

28. Способ по п.19, в котором продукционную среду культуры клеток поддерживают при приблизительно 40% растворенного кислорода.