Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда



Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда
Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда
Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда

 

G01N1/28 - Исследование или анализ материалов путем определения их химических или физических свойств (разделение материалов вообще B01D,B01J,B03,B07; аппараты, полностью охватываемые каким-либо подклассом, см. в соответствующем подклассе, например B01L; измерение или испытание с помощью ферментов или микроорганизмов C12M,C12Q; исследование грунта основания на стройплощадке E02D 1/00;мониторинговые или диагностические устройства для оборудования для обработки выхлопных газов F01N 11/00; определение изменений влажности при компенсационных измерениях других переменных величин или для коррекции показаний приборов при изменении влажности, см. G01D или соответствующий подкласс, относящийся к измеряемой величине; испытание

Владельцы патента RU 2518333:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НЦРВХ" СО РАМН) (RU)

Изобретение относится к области медицины. Для патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда фиксируют образец ткани и помещают его в парафин. Получают срезы, проводят их депарафинизацию и прогревание, отмывание в буферном растворе, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду. В качестве реагента используют антитела к матриксной металлопротеазе 9 в разведении 1:100-1:250. Срезы инкубируют с реагентом при температуре 25°С и относительной влажности 100% в течение 60 минут. При микроскопическом выявлении в препарате ярко окрашенных нейтрофилов в сосудах периинфарктной зоны и ярко окрашенных нейтрофилов в зоне инфаркта устанавливают срок давности инфаркта от 2 часов до 1 суток. При выявлении дегрануляции нейтрофилов и яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта - от 1 до 2 суток. При выявлении окрашенных клеток фибробластического ряда в пограничной зоне инфаркта - от 3-х до 30-ти суток. Способ позволяет дифференцировать срок давности наступления инфаркта миокарда от 2 часов до 30 суток. 3 ил., 1 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии.

Известно, что точное установление срока давности инфаркта миокарда имеет большое значение для патологоанатома.

Известен способ макроскопической диагностики ранних сроков инфаркта миокарда, основанный на взаимодействии теллурита калия с дегидрогеназами тканей. Вне зоны инфаркта теллурит калия окрашивает миокард в серый или черный цвет, при этом зона некроза остается неокрашенной, за счет разрушения указанных ферментов в зоне инфаркта миокарда (Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. В 2-х т., Т.2, Ч.1. - М.: Медицина, 2001. - С.82).

Недостатком известного способа является отсутствие возможности дифференцированного определения срока наступления инфаркта миокарда. Известный способ позволяет выявить только некротическую стадию инфаркта миокарда (срок от 2-х часов до 3-х суток), поскольку после наступления стадии организации активность дегидрогеназ в ткани постепенно восстанавливается.

Кроме того, применение данного способа затрудняет получение качественных образцов для гистологического и иммуногистологического исследования и снижает качество документирования морфологических изменений в миокарде за счет того, что красители стойко окрашивают ткань в серый цвет. При дальнейшем обязательном исследовании материала эта окраска мешает окрашиванию стандартными красителями.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ диагностики ишемического некроза сердечной мышцы (Пат. 2094806 Российская Федерация, МПК G01N 33/68, G01N 33/50, Способ диагностики некроза в гистологических срезах / Козлов Д.В.; заявитель и патентообладатель Новокузнецк, гос. ин-т усовершенствования врачей, - №94005367/14; заявл. 14.02.1994; опубл. 27.10.1997).

Известный способ осуществляют следующим образом. Фрагменты сердечной мышцы фиксируют 15% водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой заливке, после чего готовят гистологические срезы, которые депарафинируют обработкой в трех порциях о-ксилола и последующим прогреванием в термостате при 37°С в течение 3 часов. Обезвоживание срезов достигают 3-х минутной обработкой в каждой из четырех порций этанола (абсолютный, 96% 70% и 56%). Далее срезы на 5 минут переводят в 0,05 М забуференный физиологический раствор с рН 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют свежим раствором 3% перекиси водорода в течение 10 минут, промывают забуференным физиологическим раствором 5 минут. Далее срезы выдерживают под каплей 5%-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина. После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг срезов. На последние наносят каплю афинно-очищенных кроличьих первичных антител против ассоциированного с беременностью альфаз-гликопротеина в концентрации 8 мкг/мл. Инкубацию срезов осуществляют в течение 30 минут при 37°С во влажной камере, после чего дважды отмывают забуференным физиологическим раствором. Инкубируют гистологические срезы во вторичных биотинилированных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл забуференного физиологического раствора в течение 30 минут, после чего отмывают забуференным физиологическим раствором 5 минут. Затем обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 минут и отмывают забуференным физиологическим раствором. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03% растворе субстрата на основе диаминобензидина (ДАБ хромогена) в течение 10 мин. Реакцию останавливают ополаскиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды. Ядра клеток докрашивают гематоксилином в течение 3 мин. Далее срезы проводят через свежие спирты восходящей концентрации (56% 70% 96%, абсолютный этанол) и три порции о-ксилола, затем заключают в бальзам.

При исследовании готовых микропрепаратов отмечают четкое окрашивание очагов ишемического некроза сердечной мышцы в зоне инфаркта миокарда. Очаг некроза имеет коричневый цвет, а остальные ткани - желто-серую окраску.

Недостатком известного способа, как и аналогичного, является отсутствие возможности точного определения срока давности инфаркта миокарда, поскольку способ-прототип позволяет идентифицировать только некротическую его стадию.

К недостаткам известного способа следует отнести и то, что период полувыведения комплексов ассоциированного с беременностью альфа2-гликопротеина с протеиназами не превышает 2 минут. Следовательно, уже через полчаса практически все комплексы ферментов с ассоциированным с беременностью альфа2-гликопротеином достигают органов-мишеней, в частности печени, где и метаболизируются. Вне кровеносных сосудов это распределение имеет иные характеристики, поскольку высокая молекулярная масса комплексов препятствует их поступлению в кровеносные сосуды (Зорин Н.А. Ассоциированный с беременностью АЛЬФА-2-ГЛИКОПРОТЕИН. НОВОСТИ "Вектор-Бест", N 9, Сентябрь, 1998. Цит. По ссылке http://www.vector-best.ru/nvb/st9_5.htm 29.04.12 г.). Следовательно, выявление комплексов в пограничной зоне инфаркта миокарда ограничено очень коротким сроком; выявление комплексов возможно только в зоне некроза, т.е. вне зон сохранного кровоснабжения.

Задачей заявляемого изобретения является разработка способа определения срока давности инфаркта миокарда при патоморфологических исследованиях.

Техническим результатом предлагаемого способа является определение срока давности инфаркта миокарда от 2-х часов до 30 суток.

Технический результат достигается тем, что способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда включает фиксацию образца ткани, помещение его в парафин, изготовление срезов, их депарафинизацию и прогревание, отмывание в буферном растворе, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду.

Основным отличительным приемом заявляемого способа является то, что в качестве реагента используют антитела к матриксной металлопротеазе 9 в разведении 1:100-1:250.

Отличительным приемом предлагаемого способа также является и то, что инкубацию с реагентом проводят при температуре +25°С и относительной влажности 100%. Длительность инкубации составляет 60 минут.

Отличия заявляемого способа заключаются и в том, что при микроскопическом выявлении в препарате ярко окрашенных нейтрофилов в сосудах периинфарктной зоны и ярко окрашенных нейтрофилов в зоне инфаркта устанавливают срок давности инфаркта от 2-х часов до 1-х суток, при выявлении дегрануляции нейтрофилов и яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта - от 1-х до 2-х суток, а при выявлении окрашенных клеток фибробластического ряда в пограничной зоне инфаркта - от 3-х до 30-ти суток.

Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение возможности определения при патоморфологических исследованиях срока давности инфаркта миокарда от 2-х часов до 30 суток при одновременном снижении трудоемкости и длительность исследования.

Так, авторами заявляемого способа установлено, что используемые первичные антитела связываются с веществами, синтезируемыми нейтрофилами, фиброкластами, а также с веществами во внеклеточном матриксе в строго определенные временные промежутки после развития инфаркта миокарда. Поэтому использование при иммуногистохимическом окрашивании гистологических препаратов, в качестве первичных антител к матриксной металлопротеазе 9, позволило авторам заявляемого способа дифференцировать сроки давности наступления инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании.

Преимуществом предлагаемого способа является также то, что он позволяет выявить не только некротическую стадию инфаркта миокарда, но и стадию организации, что определяет его сильную сторону по сравнению с прототипом.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Это дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».

Сущность заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.

Пример

Объектом исследования явился патологоанатомический материал 30 больных, погибших от острого инфаркта миокарда. Во всех случаях диагностирован первичный острый трансмуральный инфаркт миокарда. Средний возраст - 63.7 года. Мужчин - 18, женщин - 12. По срокам наступления инфаркта больные распределились следующим образом: 16 больных погибли в срок до 3-х суток; 14 больных - в сроки от 3-х суток до 1 месяца.

Образцы ткани из зоны инфаркта миокарда и пограничной к ней зоне фиксировали 10% раствором нейтрального формалина и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике (Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - С.13-15, 52-59).

Затем готовили срезы толщиной 5 мкм, которые монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Депарафинировали препараты вначале в толуоле - 5 минут, а затем последовательно в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° и 50° по 1 минуте. После чего препараты выдерживали в дистиллированной воде в течение 10 минут.

Для демаскирования антигенов препараты помещали в цитратный буфер (рН6.0) и нагревали 8 минут в микроволновой печи мощностью 800W при 100% мощности, а затем 10 минут при 60% мощности. После чего препараты охлаждали до 25°С в цитратном буфере (рН6.0) и промывали дистиллированной водой 2 раза по 5 минут. Образец ткани обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002).

Для инактивации эндогенной пероксидазы на каждый препарат наносили по 50 мкл 3%-ной перекиси водорода и выдерживали в течение 5 минут. После чего отмывали Трис-буфером (рН7.6) дважды по 5 минут. Затем наносили 50 мкл 0.4% раствора казеина, инкубировали 5 минут, отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут.

Далее на каждый препарат наносили первичные антитела - антитела к ММР9 rabbit monoclonal antibody IgG (Epitomics, Clone ID: EP1254, Cat. N2551-1, Lot YG 11300 IP) в рабочем разведении 1:100-1:250 и инкубировали во влажной камере при температуре 25°С и 100% влажности в течение 1 часа. Потом отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Затем на препараты наносили по 50 мкл раствора, содержащего 10% сыворотку в Трис-буфере (рН7.6), инкубировали во влажной камере при температуре +25°С в течение 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Затем наносили вторичные антитела Novolink Polymer (Novocastra, REF=7112, Lot 711236), меченные пероксидазой, по 50 мкл, инкубировали во влажной камере при температуре +25°С 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Добавляли по 50 мкл субстратной смеси, содержащей 50 мкл 1.74% 3'3'-диаминобензидина в 1 мл 0.05% перекиси водорода (Novocastra, REF=RE7105, Lot 710550), выдерживали 5 минут. Отмывали водой. Срезы докрашивали 0.02% раствором гематоксилина 30 секунд. Отмывали водой. Дегидратировали последовательно в спиртах 70°, 90°, 96°, 100° по 1 минуте. Затем в толуоле 5 минут. Помещали в заключающую среду Permanent Slide Mounting Medium (Novocastra, REF=7137, Lot 713708) под покровные стекла. Микроскопическое исследование проводили с использованием светового микроскопа Nikon 80L

Установлено, что при летальных исходах, развившихся в течение нескольких часов после развития инфаркта миокарда, регистрировали ярко окрашенные нейтрофилы в сосудах периинфарктной зоны (Фиг.1, позиция А), а также ярко окрашенные нейтрофилы в зоне инфаркта (Фиг.1, позиция В).

В срок давности инфаркта от 1-х до 2-х суток фиксировали дегрануляцию нейтрофилов, потерю окраски цитоплазмы нейтрофилов. Параллельно с этим была зафиксирована яркая окраска внеклеточного матрикса в зоне инфаркта, что отражает выделение ММР-9 из нейтрофилов в ткани (Фиг.2, позиция С). В случае летальных исходов в более поздние сроки (3-30 суток) отмечали окраску клеток фибробластического ряда в пограничной зоне. При этом максимальная выраженность окраски отмечена на 7-14 сутки (Фиг.3, позиция D).

Авторы отмечают хорошую воспроизводимость предлагаемого способа - при окрашивании серийных срезов в разных партиях достигнуты идентичные результаты окрашивания.

Таким образом, предлагаемый способ позволять четко дифференцировать срок давности наступления инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании. Данный способ может быть использован в медицине, а именно в патологической анатомии.

Способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда, включающий фиксацию образца ткани и помещение его в парафин, изготовление срезов, их депарафинизацию и прогревание, отмывание в буферном растворе, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду, отличающийся тем, что в качестве реагента используют антитела к матриксной металлопротеазе 9 в разведении 1:100-1:250, длительность инкубации с реагентом при температуре 25°С и относительной влажности 100% составляет 60 минут, и при микроскопическом выявлении в препарате ярко окрашенных нейтрофилов в сосудах периинфарктной зоны и ярко окрашенных нейтрофилов в зоне инфаркта устанавливают срок давности инфаркта от 2 часов до 1 суток, при выявлении дегрануляции нейтрофилов и яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта - от 1 до 2 суток, а при выявлении окрашенных клеток фибробластического ряда в пограничной зоне инфаркта - от 3 до 30 суток.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области анализа биологической ценности объектов пищевого и медицинского назначения, в частности животного сырья и продукции на его основе, и может быть использовано в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, а также сельском хозяйстве.

Изобретение относится к погружному зонду для расплавов железа или стали с несущей трубкой с погружным концом и окружной боковой поверхностью, причем зонд может быть выполнен в качестве пробоотборника для шлака, находящегося на расплаве железа или стали.

Изобретение относится к области охраны труда и техники безопасности в угольной и других областях промышленности, связанных с загрязнением атмосферы (газа) твердыми частицами, и, в частности, к пылеизмерительным приборам - аспираторам воздуха.

Изобретение относится к испытательной технике. Призматический образец имеет форму призмы, продольную и поперечную плоскости симметрии, два боковых выступа, расположенных продольно, по концам призмы - опорные поверхности, а в центральной ее части - поверхность нагружения поперечной испытательной нагрузкой.

Изобретение относится к медицинскому контейнеру для сбора и хранения проб, в частности к модифицированному многофункциональному пробоотборному контейнеру. Контейнер содержит корпус (1), крышку (2), расположенную на отверстии корпуса (1), фиксированный вращаемый стержень (4), установленный на крышке (2) с возможностью свободного вращения относительно крышки (2), и заборную ложку (5), расположенную в нижней части указанного фиксированного вращаемого стержня (4).

Группа изобретений относится к устройству и способу улавливания биологических частиц, взвешенных в жидкой среде, для приготовления биологических образцов, предназначенных для проведения цитологического анализа, способу приготовления цитологического препарата с использованием данного устройства, а также к платформе и системе для мультианализа, включающих данное устройство.
Изобретение относится к области разработки биокатализаторов, предназначенных для использования в составе биологических фильтров для очистки газов, и может быть использовано для проведения лабораторных экспериментов с образцами биокатализаторов, осуществляющих удаление из воздуха летучих компонентов натурального табачного сырья, а также для создания селективных условий в процессе выделения и исследования микроорганизмов, составляющих биологически активную компоненту данного типа биокатализаторов.

Изобретение предназначено для применения в химической промышленности, агропромышленном комплексе, производстве строительных материалов и других отраслях. Способ определения коэффициента неоднородности смеси трудноразделимых сыпучих материалов включает подсчет числа проб, минимально допустимого веса пробы, отбор проб смеси и ее компонентов.
Изобретение относится преимущественно к горно-обогатительной отрасли промышленности в части разработки технологических процессов и оборудования и может быть использовано при опробовании пульпы в системе контроля качества для подготовки продуктов к анализу.

Группа изобретений относится к системе и к способу охарактеризовывания частиц в потоке продуктов помола зерна в установке для его помола, где охарактеризовывание включает в себя охарактеризовывание частиц зерна по размеру.

Изобретение относится к устройству для сбора и экстрагирования образцов кала, в частности, предназначенного для проведения лабораторных диагностических анализов в полностью автоматизированной лаборатории, а именно для выделения одного или большего числа анализируемых веществ и проверки на наличие требуемых диагностических маркеров для профилактики и лечения.
Изобретение относится к области медицины, а именно к неврологии, нейропсихологии и профессиональной патологии. Проводят нейропсихологическое тестирование с определением показателя аналитико-синтетического мышления; показателя уровня депрессии; показателя уровня личностной тревожности; показателя уровня реактивной тревожности; показателя концентрации внимания; показателя темна психомоторной деятельности и электроэнцефалографию с определением β1-ритма и β2-ритма.
Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано для определения давности наступления смерти по морфологическим изменениям гнилостно измененных спаек.

Изобретение относится к медицине, ортопедии, оценке результатов мануальной терапии больных после эндопротезирования тазобедренного сустава. Проводят анализ рентгеновского изображения проксимальной трети бедра и клинического состояния пациента до и после лечения.
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и эндоскопии, и может быть использовано для прогнозирования развития и прогрессирования рефлюкс-эзофагита.

Группа изобретений относится к медицине. Система для биопсии содержит: систему визуализации для получения диагностических изображений, зонд, содержащий выдвигающуюся иглу для биопсии, компьютер, связанный с системой слежения, системой визуализации и ультразвуковой системой визуализации.
Изобретение относится к медицине, а именно к реабилитологии, и может быть использовано для оздоровления организма человека. Для этого осуществляют традиционное медицинское обследование пациента.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройству и способу легкого сбора, разбавления, перемешивания и дозирования жидкостей для анализа в изолированной системе.
Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии. Для прогнозирования эффективности предоперационной лучевой терапии плоскоклеточных карцином головы и шеи проводят иммуноферментное исследование уровня ТИМП-1 и ТИМП-2 в сыворотке крови.
Изобретение относится к медицине, в частности к инфектологии, и касается прогнозирования развития сосудистых нарушений у больных гриппом. Для этого учитывают возраст больных, срок наблюдения за больным и определяют значения ристомицин-агрегации тромбоцитов в сыворотке крови.

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к устройству, с помощью которого можно получать мазки-отпечатки с конъюнктивы глаза. Устройство (10) для взятия образцов с глаза (2) содержит опорное устройство (12), имеющее поверхность (11) для взятия образцов. Опорное устройство способно упруго деформироваться при переходе из исходного положения в положение для взятия образцов и деформируется таким образом, что при использовании для взятия образцов поверхность для взятия образцов, прилегающая в положении для взятия образцов к участку (2) для взятия образцов, отделяется от него посредством отслаивающего движения при переходе из положения для взятия образцов в исходное положение. Изобретение просто в использовании, но позволяет надежно и воспроизводимо получать мазки-отпечатки. 12 з.п.ф-лы, 8 ил.
Наверх