Способ стимуляции цитотоксического иммунного ответа против клеток опухолевой линии аденокарциномы молочной железы, экспрессирующих специфические антигены, с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной днк-конструкцией


 


Владельцы патента RU 2520091:

Общество с ограниченной ответственностью "АваксисБио" (RU)

Изобретение относится к иммунологии, медицине и биотехнологии. Предложен способ стимуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа против клеток рака молочной железы с помощью дендритных клеток, трансфецированных полиэпитопной ДНК-конструкцией. Полученные из периферической крови условно-здоровых доноров, трансфецированные полиэпитопной конструкцией, культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток. Способ позволяет повысить эффективность и экономичность получения цитотоксических лимфоцитов. 1 ил.

 

Изобретение относится к биотехнологии, белковой инженерии и медицине, конкретно - к созданию рекомбинантных плазмид, обеспечивающих экспрессию полиэпитопных опухоль-ассоциированных антигенов в дендритных клетках, способных стимулировать цитотоксический противоопухолевый ответ.

В настоящее время активно используются новые клеточные и молекулярно-генетические технологии для создания противоопухолевого иммунитета. Одним из перспективных подходов является создание генмодифицированных вакцин на основе дендритных клеток. ДК являются профессиональными антиген-презентирующими клетками и обладают специальными механизмами захвата и представления антигена Т-клеткам В частности дендритные клетки играют важную роль во взаимодействии врожденного и приобретенного иммунитета при онкологических заболеваниях. Как компонент врожденной иммунной системы, ДК выполняют главную функцию представление антигена для регуляции активности адаптивного иммунного ответа, определяя тип иммунного реагирования. Направленность иммунных реакций определяется профилем цитокинов продуцирующихся ДК и их микроокружением. При этом показано, что для формирования полноценного клеточного ответа дендритные клетки должны стимулировать преимущественное формирование специфического иммунного ответа по Т-хелпер 1 типу и увеличивать цитотоксический потенциал лимфоцитов.

Рак молочной железы являются ведущей онкологической патологией населения России и составляет более 1/5 доли среди всех злокачественных опухолей у женщин. Учитывая высокую актуальность этой проблемы и низкую эффективность традиционных методов лечения и профилактики рака молочной железы, становится важным поиск новых подходов стимуляции противоопухолевого иммунного ответа.

Использование полиэпитопных конструкций позволяет запускать поликлональную реакцию Т-клеток, обеспечивающих запуск более мощного иммунного ответа против различных раковых клеток, составляющих опухоль, и позволяет преодолевать возможную потерю экспрессии данного эпитопа опухоль-ассоциированного антигена в опухолевых клетках. Дополнительное проведение HLA-типирования позволяет выбирать только те эпитопы, которые увеличивают шанс развития специфического CD8+ или/и СD4+Т-клеточного ответа, или обоих одновременно. Также, данный способ уменьшает риск возникновения аутоиммунных реакций, так как используется только ограниченный набор эпитопов опухолевого белка, что существенно снижает возможность развития аутоиммунного ответа на собственные ткани.

Наиболее близким к предполагаемому способу является получение ДК и нагрузки их полиэпитопной pVaxl/pet-neu конструкцией, несущей специфические HLA-A*0201 связанные участки гена ErbB2/Her2 [Scardino A., Alimandi M., Correale Р., et al. A Polyepitope DNA Vaccine Targeted to Her-2/ErbB-2 Elicits a Broad Range of Human and Murine CTL Effectors to Protect against Tumor Challenge. // Cancer Res. - 2007. - Vol.67(14). - p.7028-7036]. В работе использовались мононуклеарные клетки периферической крови условно здоровых доноров. Дендритные клетки получали из прилипающей фракции МНК при добавлении в культуру 50 нг/мл грану-лоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и 0,5 нг/мл ИЛ-4. Через 7 дней 100 тыс. ДК трансфецировались 1 мкг pVaxl/pet-neu, с использованием трансфецирующего реагента «Effecten» (Qiagen). Трансфецированные ДК облучались и добавлялись в культуру лимфоцитов (неприлипшая фракция МНК) в соотношении ДК:МНК=1:5. Далее, совместная культура инкубировалась в течение 5 дней. Далее, в течение 10 дней продолжалось культивирование в присутствии ИЛ-2 (20 МЕ/мл), с заменой среды и цитокина каждые 3 дня. Для постановки цитотоксического теста, таргетные клетки C1R-A2 (клеточная линия, стабильно трансфецированная геном HLA-A*0201, и неэкспрессирующая другие типы молекул HLA) метились 150 мкСi 51Сr, помещались в 96-луночные круглодонные планшеты, и потом, когда необходимо, нагружались пептидом (1 мкмоль/л) в течение 90 минут. Эффекторы добавлялись к таргетным клеткам в различных соотношениях и инкубировались в течение 6 часов. После инкубации, собирались супернатанты и измерялась радиоактивность на гамма счетчике. Процент специфического лизиса рассчитывался как (эксперимент спонтанный/максимум спонтанный 51Сr)×100. Исследователями было показано, что уровень ЦТЛ ответа варьировал в зависимости от донора, иммуногенности эпитопа опухоль-ассоциированного гена Неr2, а также от соотношения таргетных и эффек-торных клеток.

Описанный способ получения антиген-активированных дендритных клеток достаточно длителен (12 суток), требует использования большого количества рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4, и рчИЛ-2), что ведет к значительному удорожанию технологии, так и обладает недостаточной цитотоксической активностью.

Новой задачей является создание эффективного и экономичного способа генерации антиген-специфических цитотоксических лимфоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови условно здоровых доноров, обладающих достаточной эффективностью для индукции цитотоксического ответа против клеток линии рака молочной железы человека (MCF-7) in vitro.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в следующем:

Из прилипающей фракции мононуклеарных клеток периферической крови человека получают последовательно незрелые и зрелые ДК, с использованием рчГМ-КСФ+рчИЛ-4 и рчФНО-α соответственно. Антигенную активацию зрелых ДК проводят с помощью магнитной трансфекции различных полиэпитопных конструкций [“Polyepitope constructs and methods for their preparation and use”, Application No.: 61/311,981, дата подачи 09.03.2010, international publication number: WO 2011/110953 A2]. Далее, неприлипшую фракцию мононуклеарных клеток периферической крови культивируют с антиген-активированными ДК в соотношении 10:1. Для улучшения модуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа в совместную культуру МНК и ДК добавляют рчИЛ-12 и рчИЛ-18, что позволяет повысить потенциал цитотоксической активности мононуклеарных антиген-специфических клеток, против опухолевых клеток рака молочной железы человека (клеточная линия MCF-7), обуславливая цитотоксическую направленность Т-клеток при их пролиферации и дифференцировки в эффекторные клетки.

Принципиальным отличием разработанного способа от прототипа является:

1. Использование рчФНО-α для созревания культуры дендритных клеток, что позволяет сократить процесс созревания ДК до 96 часов;

2. Использование ДНК-конструкций, содержащие наиболее иммуногенные эпитопы основных опухоль-ассоциированных антигенов рака молочной железы, позволяет стимулировать специфический цитотоксический иммунный ответ;

3. Использование рчИЛ-12 и рчИЛ-18 при сокультивировании ДК, трансфецированных ДНК-конструкциями, содержащие наиболее иммуногенные эпитопы основных опухоль-ассоциированных антигенов рака молочной железы, и МНК, что повышает эффективность стимуляции и направленную дифференцировку наивных Т-клеток по Т-хелперы 1 типу.

Предполагаемое изобретение повышает эффективность генерации цитотоксических клеток, а также позволяет сократить сроки сокультивирования ДК и МНК, что в итоге приводит к снижению стоимости способа.

Техническим результатом изобретения является генерация in vitro антиген-специфических клонов Т-клеток с активностью CD8+ Т-клеток и Т-хелперов 1 типа, необходимых для формирования противоопухолевого цитотоксического ответа против клеток рака молочной железы человека.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенная из периферической крови условно-здоровых доноров прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируется в концентрации 1 млн/мл в полной среде содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентами-цина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% СO2 при 37°С с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл) и рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 96 часа культивирования для созревания незрелых дендритных клеток в культуру вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл. Через 24 часа после добавления ФНО-α, проводится магнитная трансфекция полученных зрелых ДК различными полиэпитопными конструкциями, универсальной или специфической по HLA-A*0201 [“Polyepitope constructs and methods for their preparation and use”, Application No.: 61/311,981, дата подачи 09.03.2010, international publication number: WO 2011/110953 A2], с использованием реагентов коммерческого набора компании «Promokine» согласно инструкции производителя.

Полученные дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл в течение 72 часов.

Способность полученных трансфецированных плазмидами ДК стимулировать прямую цитотоксическую активность против опухолевых клеток, как аутоло-гичных, так и специфической линии, оценивалась по уровню высвобождения внутриклеточного фермента (лактатдегидрогеназы) с помощью коммерческого набора фирмы «Promega» согласно протоколу производителя. Для праймирования опухолевых антигенов, полученные ДК, трансфецированные плазмидами, совместно культивировались с неприлипшей фракцией МНК в соотношении 1:10. Также, оценивался цитотоксический ответ МНК в зависимости от добавления в культуру рчИЛ-18 и рчИЛ-12. Во все группы через 48 часов сокультивирования вносились клетки опухолевой линии рака молочной железы человека (MCF-7).

Изобретение поясняется чертежом. На фигуре 1 изображена цитотоксич-ность совместной культуры МНК здоровых доноров позитивных по HLA-A*02 и аутологичных трансфецированных ДК по отношению к опухолевым клеткам линии MCF-7 (n=8). Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего.

На фигуре обозначено:

МНК+Дк0 - совместная культура МНК и ДК без трансфекции;

МНК+Дкр5 - совместная культура МНК и ДК, трансфецированных плазмидой р5;

МНК+ДкU - совместная культура МНК и ДК, трансфецированных универсальной плазмидой;

МНК+ДкА - совместная культура МНК и ДК, трансфецированных плазмидой специфичной для НLА-А*0201;

МНК+ДкЕ - совместная культура МНК и ДК, трансфецированных плазмидой несущей ген Erbb2;

Стрелками обозначены статистически значимые различия

В результате проведенного эксперимента установлено, что группы с трансфекцией универсальной плазмидой и плазмидой специфичной к HLA-A*0201 обладают достоверно большей стимулирующей цитотоксической способностью по сравнению с группами МНК с совместно с ДК без трансфекции, с трансфекцией плазмидами р5. Добавление иммунорегуляторных цитокинов ИЛ-18 и ИЛ-12 в совместную культуру МНК и ДК приводит к увеличению гибели опухолевых клеток, при этом в группе МНК+ДкА, с трансфекцией плазмидой специфической для HLA-А*0201 отмечается повышение цитотоксического ответа по сравнению с группами контроля.

Таким образом, можно сделать вывод, что конструкции плазмид универсальная и специфичная для HLA-A*0201 являются эффективными способами индукции цитотоксической активности культуры МНК в условиях магнитной трансфекции на стадии зрелых дендритных клеток.

Способ генерации антиген-специфических Т-клеток с активностью CD8+ Т-клеток и Т-хелперов 1 типа, обладающих противоопухолевой активностью против линии клеток рака молочной железы человека (MCF-7), включающий: выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови условно здоровых доноров; культивирование МНК с разделением клеток на прилипающую и неприлипающую фракции; созревание прилипающей фракции МНК под действием ростовых факторов (рчГМ-КСФ (50 нг/мл), рчИЛ-4 (100 нг/мл) и через 96 часов последующее культивирование дендритных клеток в присутствии рчФНО-α в дозе 25 нг/мл); трансфекция зрелых ДК генетическими ДНК-конструкциями, несущими ЦТЛ- и Тх-эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов рака молочной железы, универсальной и HLA-A*0201-специфической; - отличающийся тем, что для генерации антиген-специфических цитотоксических клеток используют совместное культивирование зрелых ДК, трансфицированных ДНК-конструкциями, несущими иммуногенные эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов рака молочной железы, и неприлипающей фракции МНК в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 (10 нг/мл) и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 (100 нг/мл).



 

Похожие патенты:

Предложенная группа изобретений относится к области медицины и ветеринарии. Предложен биокомпозит для обеспечения восстановительных процессов после повреждения у млекопитающего, содержащий носитель, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, содержащую гены, кодирующие VEGF и/или SDF-1, и клетки, обеспечивающие репаративную регенерацию.

Изобретение относится к области получения рекомбинантных белков и касается способов их получения. Представлены способы получения антител, включающие: культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело или его фрагмент, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; подпитку клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток, где обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат продуктов растительного происхождения и 75-300 г/мл гидролизата дрожжей.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителам, которые специфично связываются с рецепторами эпидермального фактора роста (EGFR), а также к ДНК, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи указанных антител, ДНК, которые кодируют вариабельные области легкой цепи указанных антител.
Изобретение относится к области клеточной биологии и биотехнологии, а также медицины. Предложен способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга.
Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и вирусологии и касается штамма диплоидных клеток легкого плода крупного рогатого скота. Охарактеризованный штамм выделен из легкого плода коровы и депонирован в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных РККК(П) (СХЖ РАСХН) при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в кардиологии для исследования формирования и разрыва бляшек в контролируемых лабораторных условиях, наблюдения за жизнедеятельностью различных клеток в бляшке в заданных условиях и проведения сравнения ех vivo и in vivo.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к мутеинам липокалина слезной жидкости человека, и может быть использовано в медицине. Мутеин липокалина слезной жидкости человека (hTLc) имеет обнаруживаемую аффинность связывания с рецепторной тирозинкиназой Met (c-Met) человека, или ее доменом, или фрагментом c-Met человека.
Изобретение относится к биотехнологии и медицине, в частности к генной инженерии, и касается выделения жизнеспособных клеток из такого биологического материала, как стенка тонкого кишечника мыши.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественного определения клеток-предшественников в кроветворной ткани.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения длительно незаживающей раны и/или раневой полости. Для этого проводят многократное нанесение на поверхность раны и/или раневой полости пациента композиции, включающей культуральную питательную среду, кондиционированную продуктами жизнедеятельности и ростовыми факторами мезенхимальных стволовых клеток человека, полученную на стадиях логарифмической фазы и стационарной фазы роста стабильной клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток, содержащую биологически активные соединения на основе низкомолекулярных пептидов и цитокинов, используемую для культивирования in vitro мезенхимальных стволовых клеток человека.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в производстве медикаментов для лечения гепатита С. Предложено использовать при изготовлении лекарственного средства для лечения гепатита С ПЭГ-илированной метионин-содержащей формы усеченного по N-концу варианта IL-29 с заменой остатка цистеина в положении, соответствующем положению 171 аминокислотной последовательности зрелого белка дикого типа, который экспрессируется в гетерологичной системе в виде высоко гомогенных препаратов.
Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложен способ in vitro генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника.

Изобретение относится к области молекулярной фармакологии и, в частности, к пептиду, представляющему собой производное последовательности интерлейкина-15 (IL-15), оптимизированное для ингибирования биологической активности этого соединения.
Изобретение раскрывает полностью человеческие моноклональные антитела (IgG аутоантитела), которые связываются с человеческим IL-1α. Антитело содержит тяжелую цепь, ковалентно связанную с легкой цепью, для которых определены аминокислотные последовательности.

Изобретение относится к области биохимии. .

Соединение, предназначенное для стимуляции пути передачи сигнала через il-15rбета/гамма, с целью индуцировать и/или стимулировать активацию и/или пролиферацию il-15rбета/гамма-положительных клеток, таких как nk-и/или t-клетки, нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, вектор экспрессии, клетка-хозяин, адъювант для иммунотерапевтической композиции, фармацевтическая композиция и лекарственное средство для лечения состояния или заболевания, при котором желательно повышение активности il-15, способ in vitro индукции и/или стимуляции пролиферации и/или активации il-15rбета/гамма-положительных клеток и способ получения in vitro активированных nk-и/или t-клеток // 2454463
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению стимуляторов пути передачи сигнала через IL-15Rбета/гамма, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к областям молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и медицины. .

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к модификациям молекулы IL-7, и может быть использовано в медицине. .

Настоящее изобретение относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены: фармацевтическая композиция и способ, основанные на введении пациенту терапевтически эффективного количества антитела против CD200, содержащего константный участок G2/G4, для лечения больного злокачественным новообразованием, содержащим положительные по CD200 злокачественные клетки.
Наверх