Способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови


 


Владельцы патента RU 2522237:

Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" (RU)

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови. Способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови, заключающийся в размораживании свежезамороженной плазмы человека при постоянном перемешивании, далее добавляют в плазму насыщенный раствор сульфата аммония, полученную смесь выдерживают при температуре, после чего центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, затем в фосфатном буфере растворяют мочевину и подогревают, далее в этом буфере растворяют полученный ранее осадок фибриногена, затем добавляют сюда же тромбин человека, перемешивают и оставляют смесь при комнатной температуре, далее разделяют полученную смесь на три части, в емкость с одной из трех частей исходного раствора фибриногена вносят фосфатный буфер, образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают, промывают в дистиллированной воде и отжимают, в результате получают три отмытых фибриновых сгустка, далее отмыв фибринового сгустка повторяют таким же образом еще два раза, конечный продукт - фибрин-мономер получают путем растворения отмытого фибринового сгустка в ацетатном буфере с мочевиной, полученный фибрин-мономер разливают во флаконы, далее флаконы с фибрин-мономером замораживают и лиофильно высушивают при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет повысить выход фибрин-мономера. 2 пр.

 

Способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови относится к области медицины и системе гемостаза человека, фармацевтическому производству. Получаемый продукт - фибрин-мономер может быть использован как местное или системное кровоостанавливающее средство, для ускорения заживления швов и ран в хирургии, травматологии, гинекологии, спортивной медицине и т.д. После стерилизации может использоваться для внутривенного введения с целью остановки кровотечений в экстренных случаях.

Известные способы выделения фибрин-мономера из плазмы крови отличаются высокой трудоемкостью и продолжительным циклом изготовления, дороговизной расходных материалов, невысоким выходом фибрин-мономера. Кроме того, эти способы получения применимы для небольшой лаборатории и не подходят для фармацевтического производства.

Известен способ получения растворимого фибрин-мономера (патент №2253474), в котором в качестве сырья используют фибриноген человека.

При получении фибрин-мономера фибриноген человека подвергают обработке тромбиноподобным ферментом - анцистрон (из яда змеи). Образовавшийся фибрин растворяют путем диализа против 0,01 нормальной НСl. Полученный фибрин-мономер может использоваться для определения тканевого активатора плазминогена и/или его ингибитора.

Недостатками известного способа являются:

1. В качестве сырья для получения фибрин-мономера предлагается использовать фибриноген человека, а не плазму.

2. Растянутость по времени - 6-8 часов инкубации при +37°C и несколько часов диализа.

3. Высокая дороговизна используемых реагентов (в частности, анцистрона и пептидного субстрата плазмина).

4. Малый масштаб производства (для небольшой лаборатории).

5. Ограниченное применение продукта фибрин-мономера - для определения тканевого активатора плазминогена и/или его ингибитора.

Наиболее близким по достигаемому техническому результату является способ получения фибрин-мономера (патент №SU 663404), принятый за прототип.

В качестве сырья при изготовлении фибрин-мономера используют 0,2% раствор фибриногена. К 1000 мл 0,2% раствора фибриногена добавляют монойодуксусную кислоту или монойодацетамид в конечной концентрации 0,001-0,05 М и эпсилоаминокапроновую кислоту в концентрации 0,3-0,6% с последующим добавлением к фибриногену 100-200 ед. активности тромбина в объеме 10 мл физиологического раствора.

Образующийся сгусток собирают стеклянной палочкой, отжимают, промывают в физиологическом растворе и переносят в 100 мл 10-20% раствора мочевины в ацетатном буфере (pH 5,2) и растворяют при комнатной температуре. После растворения сгустка раствор белка разбавляют 800 мл физиологического раствора и добавляют 200 мл буфера Палитча. Сгусток снова собирают, отжимают, промывают в физиологическом растворе и растворяют в минимальном объеме раствора мочевины. Эту операцию повторяют 3-4 раза.

В результате получают 50-100 мл 0,5-1% раствора фибрин-мономера, который хранят при +4-5°C.

Общими признаками известного способа с заявляемым являются:

а) для перевода фибриногена в фибрин добавляется тромбин;

б) при растворении фибринового сгустка используется ацетатный буфер (pH 5,2) с 10-20% мочевиной;

в) операцию отмыва фибринового сгустка проводят 3-4 раза.

Недостатками способа-прототипа является низкая эффективность, связанная:

1. В качестве сырья используют раствор фибриногена с концентрацией 0,2%, который требует отдельной технологии получения из плазмы или использования готового дорогостоящего лиофильно высушенного фибриногена.

2. Невысокий выход фибрин-мономера. Максимальный выход фибрин мономера - до 50% от раствора фибриногена.

3. Раствор фибрин-мономера, который хранят при +4-5°C неопределенное время.

4. Малый масштаб производства (в пределах лаборатории).

5. Способ применения - только как аналитический реагент в биохимии, физиологии и фармакологии.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение эффективности, выраженной в более высоком выходе продукта фибрин-мономера; в получении достаточно чистого и более стабильного в виде раствора фибрин-мономера.

Технический результат достигается тем, что берут 30 л свежезамороженной плазмы человека и размораживают при температуре +37°C, при постоянном перемешивании добавляют в плазму 10 л насыщенного раствора сульфата аммония и полученную смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают, затем в 7 л 0,05 М фосфатного буфера растворяют 1,4 кг мочевины и подогревают до температуры +37°C, далее в этом буфере растворяют полученный ранее осадок фибриногена, затем добавляют сюда же 50000 ед. тромбина человека, перемешивают и оставляют смесь на 1 час при комнатной температуре, далее разделяют полученную смесь на три части, в емкость с одной из трех частей исходного раствора фибриногена вносят 40 л 0,05 М фосфатного буфера с температурой +37°C, образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают, промывают в дистиллированной воде и отжимают, в результате получают три отмытых фибриновых сгустка, далее отмыв фибринового сгустка повторяют таким же образом еще два раза, конечный продукт - фибрин-мономер получают путем растворения отмытого фибринового сгустка в 4 л ацетатного буфера с 10-20% мочевиной и pH 5,0-5,5, который разливают во флаконы из расчета 10-20 мг/флакон, далее флаконы с фибрин-мономером замораживают и лиофильно высушивают, после чего укупоренные флаконы подвергают лучевой стерилизации, лиофилизированный фибрин-мономер растворяется дистиллированной водой, в лиофилизированном виде хранится не менее 2-х лет, в жидком виде стабилен более 24 часов при +4-8°C.

Способ осуществляют следующим образом:

Для осуществления способа используют следующее оборудование:

1. Центрифуга ЦР-6 (загрузка до 10 л, до 4000 об/мин), производитель БФК (Россия).

2. pH-метр WTW 315i (Германия).

3. Спектрофотометр Shimadzu UV1800 (Япония).

4. Мешалка магнитная Heidolph (Германия).

5. Весы прецизионные Ohaus (Швейцария).

6. Емкости пластиковые или из нерж. стали: 10 л - 1 шт. Бак 50 л - 3 шт.

7. Автоматический дозатор на 10-200 мкл, производитель Biohit (Финляндия).

8. Автоматический дозатор на 5000 мкл, производитель Biohit (Финляндия).

9. Аппарат для размораживания плазмы Quick Thaw (Helmer, США) и реактивы:

1. Ацетат натрия (CH3COONaH2O), производитель Panreac (Испания).

2. Уксусная кислота ледяная (CH3COOH), производитель Реахим (Россия). Приготовление 0,2М ацетатного буфера (pH 5,0-5,5):

30 г ацетата натрия и 5 мл ледяной уксусной кислоты растворить в 6 л дистиллированной воды.

3. Натрий фосфорнокислый однозамещенный, 2-водный (NaH2PO4), производитель Реахим (Россия).

4. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный (Na2HPO4), производитель Реахим (Россия).

Приготовление 0,05М фосфатного буфера pH 7,4: 725 г NaH2PO4 2-водного и 72,5 г Na2HPO4 12-водного растворить в 100 л дистиллированной воды.

5. Сульфат аммония ((NH4)2SO4), производитель «Реахим» (Россия). Приготовление насыщенного раствора сульфата аммония:

5 кг сульфата аммония растворить в дистиллированной воде до объема 10 л.

6. Мочевина (NH2CONH2), производитель «Panreac» (Испания).

7. Набор Coomassie G250 (для метода Бредфорда), производитель ЗАО «Силекс» (Россия).

8. Тромбин человека стерильный 500 ед/флакон, производитель фирма «Технология-Стандарт» (Россия).

9. Фибриноген человека, производитель Sigma-Aldrich.

10. Набор для определения концентрации фибриногена в плазме крови (Тех-Фибриноген тест производства ООО фирма Технология-Стандарт).

Способ осуществляют поэтапно.

1. Осаждение фибриногена

Берут 30 л свежезамороженной плазмы человека, размораживают при температуре +37°C. При постоянном перемешивании добавляют в плазму 10 л насыщенного раствора сульфата аммония и полученную смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, полученный осадок представляет собой фибриноген (промежуточный продукт - 1).

В 7 л 0,05 М фосфатного буфера растворяют 1,4 кг мочевины и подогревают до температуры +37°C. Приготовливают 50000 ед. тромбина человека стерильного (100 флаконов по 500 ед./флакон), растворив содержимое каждого флакона 2 мл воды для инъекций. В приготовленном буфере растворяют полученный ранее осадок фибриногена при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. Затем добавляют сюда же 50000 ед. тромбина человека, перемешивают и оставляют смесь на 1 час при комнатной температуре.

2. Выделение фибринового сгустка и его отмывка

После выдержки полученной смеси выделяют фибриновый сгусток (промежуточный продукт - 2). Для этого разделяют полученную смесь на 3 части по 4 л. В емкость с одной из трех частей исходного раствора фибриногена вносят 40 л 0,05 М фосфатного буфера, имеющего температуру +37°C. Образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают, промывают в 5 л дистиллированной воды и отжимают. В результате проведения трех таких циклов получают 3 фибриновых сгустка.

Отмыв фибринового сгустка проводят следующим образом:

В 6 л 0,2 М ацетатного буфера растворяют 1 кг мочевины. В приготовленном буфере растворяют фибриновые сгустки, интенсивно перемешивая на магнитной мешалке в течение 1,5-2-х часов. Разделяют исходный раствор фибрин-мономера на три части, по 3 л в отдельные емкости. В емкость с одной из трех частей исходного раствора фибрин-мономера вносят 30 л 0,05 М фосфатного буфера с температурой +37°C.

Образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают и промывают в 5 л дистиллированной воды и отжимают. Повторяют отмыв два-три раза.

3. Подготовка раствора фибрин-мономера к лиофилизации, определение концентрации фибрин мономера

Отмытый фибриновый сгусток растворяют при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке в течение 1,5-2-х часов в 4 л 0,2 М ацетатного буфера с 15% мочевины.

Концентрацию фибрин-мономера в растворе определяют фотометрически по методике Бредфорд, в качестве стандарта используют очищенный фибриноген человека. После определения концентрации осуществляют розлив из расчета по 10-20 мг/флакон. Разлитый фибрин-мономер замораживают при температуре минус 20-минус 50°C и лиофильно высушивают. Укупоренные флаконы с лиофилизированным фибрин-мономером подвергают лучевой стерилизации.

Заявленный способ обладает высокой эффективностью за счет более высокого выхода фибрин-мономера (до 90% фибриногена плазмы) по сравнению с прототипом при относительно невысоких затратах.

Примеры, подтверждающие расчет выхода фибрин-мономера:

Пример 1

5 мешков замороженной плазмы человека (по 300 мл) разморозить при +37°.

Используя набор для определения концентрации фибриногена, определяют концентрацию фибриногена в плазме в каждом мешке. Определили: №1 - 3 г/л, №2 - 3,2 г/л, №3 - 2,3 г/л, №4 - 2,8 г/л, №5 - 3,7 г/л. При смешивании плазмы в пуле (1500 мл) 3 г/л.

Фибрин-мономер получают по заявленному способу.

Концентрацию фибрин-мономера определяют на фотометре при длине волны 605 нм по методу Бредфорда. Разливают во флаконы из расчета по 10 мг/флакон, получено 315 флаконов. Выход фибрин-мономера составил 70% от фибриногена плазмы.

Пример 2

5 мешков замороженной плазмы человека (по 600 мл) разморозить при +37°.

Используя набор для определения концентрации фибриногена, определяют концентрацию фибриногена в плазме в каждом мешке. Определили: №1 - 2,5 г/л, №2 - 2,0 г/л, №3 - 3,2 г/л, №4 - 2,1 г/л, №5 - 2,9 г/л. При смешивании плазмы в пуле (3000 мл) определили 2,5 г/л.

Фибрин-мономер получают по описанному выше способу.

Концентрацию фибрин-мономера определяют на фотометре при длине волны 605 нм по методу Бредфорда. Разливают во флаконы из расчета по 15 мг/флакон, получено 450 флаконов. Выход фибрин-мономера составил 90% от фибриногена плазмы.

Перед использованием флакон с стерильным лиофилизированным фибрин-мономером растворяется дистиллированной водой. Концентрация фибрин-мономера во флаконе не менее 5 мг/мл. Водный раствор фибрин-мономера отличается высокой стабильностью (более 24 часов при +4-8°C) и способностью к полимеризации. Лиофилизированный фибрин-мономер хранится не менее 24 мес при температуре +4-8°C.

Конечная продукция после стерилизации может использоваться как высокоэффективное кровоостанавливающее средство, при внутренних или наружных кровотечениях, а также для внутривенного введения в экстренных случаях. Может использоваться для диагностических и биохимических исследований, как отдельный реагент или в составе различных наборов.

Способ промышленного получения фибрин-мономера из плазмы крови, заключающийся в выделении фибриногена из плазмы крови и его переводе в нерастворимый фибрин, дальнейшем растворении фибринового сгустка в ацетатном буфере с мочевиной, многократном отмыве фибринового сгустка в буферном растворе, отличающийся тем, что берут 30 л свежезамороженной плазмы человека и размораживают при температуре +37°C, при постоянном перемешивании добавляют в плазму 10 л насыщенного раствора сульфата аммония и полученную смесь выдерживают 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 2500 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость сливают, затем в 7 л 0,05 М фосфатного буфера растворяют 1,4 кг мочевины и подогревают до температуры +37°C, далее в этом буфере растворяют полученный ранее осадок фибриногена, затем добавляют сюда же 50000 ед. тромбина человека, перемешивают и оставляют смесь на 1 час при комнатной температуре, далее разделяют полученную смесь на три части, в емкость с одной из трех частей исходного раствора фибриногена вносят 40 л 0,05 М фосфатного буфера с температурой +37°C, образовавшийся в емкости фибриновый сгусток собирают, промывают в дистиллированной воде и отжимают, в результате получают три отмытых фибриновых сгустка, далее отмыв фибринового сгустка повторяют таким же образом еще два раза, конечный продукт - фибрин-мономер получают путем растворения отмытого фибринового сгустка в ацетатном буфере с мочевиной, полученный фибрин-мономер разливают во флаконы из расчета 10-20 мг/флакон, далее флаконы с фибрин-мономером замораживают и лиофильно высушивают.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к медицине, в частности к травматологии, ортопедии, и касается восстановления целостности костной ткани при замещении ее дефектов. Для этого костные аутотрансплантаты покрывают по типу «чулка» слоем обогащенной тромбоцитами аутоплазмы пациента.

Изобретение относится к медицине, в частности к дерматологии, хирургии, терапии, и может быть использовано для лечения заболеваний, требующих стимуляции иммунитета и репаративных процессов.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для хирургического лечения несросшихся переломов и ложных суставов трубчатых костей при наличии дефицита мягких тканей.
Изобретение относится к медицине, а именно, к урологии, и может быть использовано для лечения эректильной дисфункции. Для этого по общепринятой методике получают богатую тромбоцитами плазму и вводят ее в 3 этапа.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для нормализации (улучшения, восстановления, стимуляции) репродуктивной функции млекопитающих и, в частности человека.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для профилактики гнойно-воспалительных осложнений при использовании аппаратов внешней фиксации в процессе лечения пациентов в травматологии и ортопедии.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к иммуномодулятору. Иммуномодулятор для иммунокоррекции при комплексной терапии хронических неспецифических заболеваний легких, хронической обструктивной болезни легких, синдрома бронхиальной обструкции, хронической бронхопневмонии, пневмосклероза, трахеобронхита, хронического ларингита, рака легких, трахеи и гортани получен путем смешивания водного настоя листьев кипрея и водного настоя травы донника лекарственного желтого, взятых в равных соотношениях, с порошком из легких и гортани крупного рогатого скота, настаивания полученной смеси, выдерживания на кипящей водяной бане, охлаждения, далее смесь фильтруют, в полученный раствор добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота, содержащую антитела к онковирусам лейкоза, настойку болиголова, аскорбиновую, сорбиновую кислоту до полного растворения всех компонентов, полученный раствор помещают в водяную баню, охлаждают, фильтруют, стерилизуют при определенных условиях.
Изобретение относится к фармацевтической и косметической промышленности, а именно к лечебно-косметическому средству для кожи. Лечебно-косметическое средство для кожи, содержащее сухую плазму крови пантовых оленей, мумие, Д-пантенол, облепиховое масло и вспомогательные вещества при определенном соотношении компонентов.

Заявленное изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для лечения желудочно-кишечных болезней телят. Способ включает использование подкожной инъекции сыворотки крови животных-реконвалесцентов, содержащей антигемагглютинины к рота- и коронавирусам в титрах 1:128 и 1:64 соответственно.
Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и представляет собой иммуномодулятор для лечения хронических гепатитов, рака печени, лимфосаркомы, хронического бластозного лейкоза и улучшения функций печени и органов кроветворения, повышения иммунобиологических свойств организма, полученный путем смешивания 1000 мл водного настоя цветков бессмертника песчаного, травы мяты перечной и травы цикория с 50 мл сыворотки крупного рогатого скота, содержащей антитела к онковирусам лейкоза, 20 мл настойки болиголова, 40 г аскорбиновой, 2 г сорбиновой, 0,2 г фолиевой кислот до полного растворения всех компонентов с последующим добавлением 60 г порошка печени, 30 г порошка лимфатических узлов, 30 г порошка селезенки молодняка крупного рогатого скота, с дальнейшим отстаиванием полученного раствора при комнатной температуре в течение 24 часов и далее выдерживанием на кипящей водяной бане в течение 30 минут и охлаждением в течение 6-8 часов при комнатной температуре и фильтрованием отстоявшегося раствора, где водный настой трав готовят путем смешивания в равных соотношениях отдельно полученных водных настоев 40 г травы мяты перечной в 1000 мл воды, 30 г цветков бессмертника песчаного в 1000 мл воды и 30 г травы цикория в 1000 мл воды, а настойку болиголова получают настаиванием 60 г измельченных соцветий болиголова в 1000 мл 70% очищенного этилового спирта.

Изобретение относится к медицине, а именно к пластической хирургии. По внешней границе ареолы выполняют надрез не более чем на 1/2 ее длины.
Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен способ очистки фактора, способствующего заживлению ран, представляющего собой фактор роста гепатоцитов (HGF).
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и предназначено для выбора тактики ведения беременных с плацентарной недостаточностью (ПН) и синдромом задержки роста плода (СЗРП).
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству для профилактики синдрома хронической усталости у мужчин. Средство для профилактики синдрома хронической усталости у мужчин выполнено в виде суппозиториев, содержащих плазму крови самца марала, сухой экстракт красного корня, L-аргинин и вспомогательные вещества при определенном соотношении компонентов.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, и может быть использовано для профилактики воспалительных осложнений при абдоминальном родоразрешении. Для этого используют направленный транспорт антибактериального препарата в зону воспаления путем однократного применения экстракорпоральной антибиотикотерапии с учетом антибиотикограммы.
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и представляет собой способ получения комбинированного антибактериального средства для лечения острых кишечных инфекций.

Изобретение относится к медицине и клеточной биотехнологии. Для получения биологически активной субстанции после электростимуляции куриных голов в режиме 100-120 В, силой тока 3-5 А в течение 3-5 секунд осуществляют забор и инкубацию крови.
Изобретение относится к медицине, онкологии, лечению больных раком легкого, которым противопоказано оперативное лечение. Проводят введение химиопрепаратов (ХП), инкубированных с аутокровью, - аутогемохимиотерапию (АГХТ) и лучевую терапию (ЛТ).
Изобретение относится к ветеринарии. Препарат для профилактики диарей у новорожденных телят, включающий кислотный гидролизат крови животных, молочную, бензойную, янтарную кислоты, содержит дополнительно уксусную кислоту, при следующем соотношении компонентов, мас.%: уксусную кислоту 0,4-0,5, молочную кислоту 0,05-0,06, бензойную кислоту 0,04-0,05, янтарную кислоту 0,02-0,03, кислотный гидролизат крови - остальное.
Изобретение относится к области медицины. Способ лечения больных с осложненными формами диабетической стопы путем забора крови, центрифугирования, удаления плазмы, выделения эритроцитарной фракции, введением в нее ангиотропного лекарственного препарата алпростадила, облучением лазерным излучением мощностью 12 мВт в течение 20 минут, добавляют 100 мл физиологического раствора на 200 мл эритроцитарной фракции и реинфузии в течение 1,5-2 часов, при этом совместно с ангиотропным веществом алпростадилом в эритроцитарную фракцию вводят 2 мл АТФ, реинфузию эритроцитарной фракции производят через 1 день, чередуя с внутривенным капельным введением Весел-Дуэ-Ф 600 ЛЕ и 5 мл актовегина на 100 мл физиологического раствора, при общем курсе лечения 10 дней.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для коррекции морфофункционального состояния спортсменов. Для этого в рацион питания включают многокомпонентные натуральные концентрированные пищевые продукты (НКПП) с повышенным содержанием биологически активных веществ (БАВ) из растительного (НКППРС) и (или) белково-растительного сырья (НКППБРС), с учетом целей нутриентивной поддержки организма спортсменов различных видов спорта, их индивидуальных физиологических потребностей; следствием чего является восстановление совокупности характеристик физиологических функций и качеств, определяющих уровень активности морфофункциональных систем организма, особенности жизнедеятельности и состояния профессиональной работоспособности, и обеспечивающих предупреждение донозологических и патологических состояний, достижение высоких спортивных результатов.
Наверх