Способ длительного хранения in vitro растений осины

Авторы патента:

Шестибратов Константин Александрович (RU)

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2522823:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л и витаминов MS 1 мл/л, сорбитола 5-10 г/л и маннитола 5-10 г/л, причем хранение растений осуществляют при температуре +4°С в режиме освещения 8 ч день/16 ч ночь с интенсивностью 2000 люкс. Изобретение позволяет повысить сохранность in vitro культур ценных селекционных генотипов и генетически модифицированных клонов осины. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии растений и лесному хозяйству, и может быть использовано для беспересадочного хранения особо ценных и траснформированных клонов растений осины в условиях in vitro.

В современной биотехнологии сохранение in vitro культур растений используется для снижения затрат на пересадку трансгенных и нетрансгенных клонов, и для сохранения особо ценных генотипов. Наиболее приемлемым способом депонирования является хранение in vitro культур при положительных температурах (+4°C).

Осина (Populus tremula) и ее гибриды широко используются в биотехнологии как модель для изучения различных аспектов генетики лесных древесных растений по ряду причин: относительно небольшой размер генома и возможность его эффективной трансформации, быстрый рост, простота клонального микроразмножения и выращивания in vitro. В лесном хозяйстве осина начинает занимать приоритетное направление для использования в целлюлозно-бумажной промышленности и получении стройматериалов. Поэтому беспересадочное депонирование in vitro культур на длительный период рассматривается как способ сохранения растений, обладающих ценными свойствами.

Известно несколько способов хранения растений при положительных температурах, в частности известен способ депонирования растений винограда «Способ длительного сохранения in vitro растений винограда» (патент России №2110172). Он включает перенос фрагментов растений длиной 10-12 мм на твердую питательную среду, в которую добавляют тонкоизмолотые зерна винограда. Возможность использования данного способа для других растений не описана и, очевидно, потребует дополнительных модификаций метода и финансовых затрат.

Известен также состав питательной среды для длительного хранения растений in vitro (патент России №94011805). Новым в питательной среде является совместное введение в ее состав сорбита в концентрации 1-10 г/л и 6-бензиламинопурина в концентрации 0,1-1,0 мг/л. Влияние на культуру древесных растений, в частности осины, не оценивалось.

Наиболее близким техническим решением из описанных является «Effect of abscisic acid, cold hardening, and photoperiod on recovery of cryopreserved in vitro shoot tips of silver birch» (Ryynänen L. // Cryobiology, 1998, №36, PP.32-39). В статье описывается методика предварительного кратковременного хранения перед криоконсервацией почек микрорастений березы серебристой. Для введения в состояние покоя использовалось добавление абсцизовой кислоты в концентрации 10^-6, 10^-5 и 10^-4 М в питательную среду для укоренения и хранения MS (Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962. 15 (3): P.473-497), а также изменялись условия инкубации - понижение температуры до +4°C и режим освещения (8 ч день/16 ч ночь). Однако при таких условиях растения долго не хранили, а лишь вводили в состояние покоя in vitro для последующих манипуляций. Пригодность метода введения в состояние покоя для других древесных растений в данной работе не оценивали.

Целью предлагаемого изобретения является повышение сохранности микрорастений осины в условиях in vitro при хранении на +4°C, без пересадок культур в течение 12 месяцев.

Поставленная цель достигается за счет того, что используются оптимальные концентрации минеральных и органических компонентов питательной среды и изменяется режим освещения (длительность и интенсивность).

Суть изобретения заключается в том, что для пассажа на укоренение и последующее хранение используют среду WPM (Lloyd G., McCown В., Commercially feasiblemicropropagation of mountain laural (Kalmla latlfolia) by use of shoot tip cultures. Ccmb Proc Intl Soc 1980. 30: PP.421-427.) с добавлением к легко метаболизируемой сахарозе (10-20 г/л) таких осмолитиков, как сорбитол (5-10 г/л) и маннитол (5-10 г/л), а также агар-агара (9 г/л) и витаминов MS 1 мл/л. После инкубации растений в течение 2 недель при интенсивном (примерно 5000 люкс) длиннодневном режиме освещения (16 ч день/8 ч ночь) при температуре +22°C растения переносятся в условия хранения на +4°C при пониженном освещении (примерно 2000 люкс) и режиме короткого дня (8 ч день/16 ч ночь). В результате использование осмолитиков в составе питательной среды и подбор правильного освещения во время хранения способствуют постепенному переходу растений в состояние покоя, что повышает до 100% их сохранность в течение года. Способ подходит для хранения in vitro культур осины как генетически модифицированных клонов, так и ценных селекционных генотипов, отобранных в природе.

Анализ известных способов хранения микрорастений трансгенной и нетрансгенной осины при температуре +4°C в условиях in vitro, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует такому условию патентоспособности изобретения, как «новизна».

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. В нестерильных условиях готовится питательная среда для укоренения и последующего хранения. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, pH 5,6-5,8. Растворяются необходимые количества сахарозы, сорбитола и маннитола. После этого добавляется навеска агара. Среда разливается по колбам; автоклавирование проводится при 1 атм (=1 изб. атм) в течение 25 минут. В охлажденную до 55°C среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам. Все манипуляции с растительным материалом производятся в ламинар-боксе в условиях стерильного воздуха. Число эксплантов в одном сосуде составляет 20 штук.

2. После переноса растительного материала на среду для укоренения и последующего хранения инкубацию побегов проводят 2 недели при интенсивном (5000 люкс) длиннодневном (16 ч день/8 ч ночь) режиме освещения, при температуре +22°C.

3. Укорененные микрорастения затем переносят в условия хранения. Режим освещения на протяжении всего периода хранения короткодневный - 8 часов «день», 16 часов «ночь», интенсивность освещения должна не превышать 2000 люкс. Температура хранения +4°C.

4. Пересадку верхушечной почки растений на среду для восстановления (WPM с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, гиббереллиновой кислоты 0,5 мг/л) необходимо провести через год депонирования. Восстановление осуществляется при длиннодневном режиме освещения 16 часов «день», 8 часов «ночь» интенсивностью 5000 люкс, при температуре +22°C. Процент выживания оценивается после 2 недель инкубации на среде для восстановления.

В таблицах 1-2 представлены результаты выживаемости растений осины в зависимости от условий хранения. Для подтверждения неочевидности представленного изобретения нами был проведены исследования роли каждого из основополагающих, по нашему мнению, факторов для хранения культуры осины in vitro (таблица 1).

Для сравнения была использована методика кратковременного хранения, предложенная Ryynänen L. (1998). Показано, что абсцизовая кислота действительно ускоряет процесс перехода в состояние покоя, но после переноса на среду для восстановления образуются витрифицированные побеги с измененной формой листа, что не происходит при использовании разработанного нами способа (таблица 2).

Данный способ хранения подходит как для растений дикого типа, так и для трансформированных растений осины. Было проведено хранение разных нетрансформированных генотипов осины (Pt, f2, PtV22) и трансгенных растений осины с разными рекомбинантными генами (GFP, Gus, Bar, Xeg, GS). Сохранность и трансгенных, и нетрансгенных клонов всех генотипов после года хранения составляла 100% (таблица 3). Сохранение экспрессии рекомбинантных генов в трансгенных растениях осины после года хранения при температуре +4°C, интенсивностью освещения 2000 люкс и режиме 8 день/16 ночь подтверждено методом ОТ-ПЦР (рисунок 1).

Преимуществом предложенного способа хранения при температуре +4°C является сохранение параметров микрорастений и увеличение доли жизнеспособных эксплантов (микрорастений) после хранения.

Предложенный способ хранения при температуре +4°C не является затратным, так как требует лишь добавления осмолитиков и инкубации при разработанных режимах освещения. Поэтому способ может быть успешно использован для научных исследований, сохранения ценных генотипов осины или при производстве посадочного материала растений в лесном хозяйстве.

Таблица 1
Процент выживших растений осины при разных условиях инкубации после месяца, полугода и года хранения при температуре +4°C
Опыт	Состав сахаров в питательной среде (г/л)	Интенсивность освещения (люкс)	Режим освещения (день/ночь)	Выживание после хранения (%)
1 мес	6 мес	12 мес
1	сахароза - 30	5000	16/8	42	0	0
2	сахароза - 15	5000	16/8	56	0	0
	сорбитол - 7,5
маннитол - 7,5
3	сахароза - 15	2000	16/8	73	0	0
	сорбитол - 7,5
маннитол - 7,5
4	сахароза - 15	2000	12/12	100	57	0
	сорбитол - 7,5
маннитол - 7,5
5	сахароза - 15	2000	8/16	100	100	100
	сорбитол - 7,5
маннитол - 7,5

Таблица 2
Процент выживших растений осины при добавлении в среду разных концентраций абсцизовой кислоты (АВА) и менее усвояемых сахаров после месяца, полугода и года хранения при температуре +4°C, интенсивностью освещения 2000 люкс и режиме 8 день/16 ночь
Опыт	Концентрация АВА, М	Выживание после хранения (%)
1 мес	6 мес	12 мес
1	10^-4	100	24*	0
2	10^-5	100	100	62*
3	10^-6	100	100	100*
4	0	100	100	100
* - образование витрифицированных побегов с измененной формой листа

Таблица 3
Процент выживших растений осины разных генотипов при добавлении в среду менее усвояемых сахаров после месяца, полугода и года хранения при температуре +4°C, интенсивностью освещения 2000 люкс и режиме 8 день/16 ночь
Название клонов	Количество посажанных растений	Выживание после хранения (%)
1 мес	6 мес	12 мес
Pt	200	100	100	100
f2	200	100	100	100
PtV22	200	100	100	100
Pt III GFP 3с*	200	100	100	100
Pt III GFP 5b*	200	100	100	100
Pt III GFP 5c*	200	100	100	100
f2 VII Gus 1a*	200	100	100	100
f2 VII Gus 1b*	200	100	100	100
Pt I Gus 5a*	200	100	100	100
Pt V Gus 2c*	200	100	100	100
PtV22 V Gus 14a*	200	100	100	100
f2 XI Bar 2a*	200	100	100	100
Pt XI Bar 24a*	200	100	100	100
PtXIV Xeg 1a*	200	100	100	100
PtXIV Xeg 1b*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 1a*	200	100	100	100
PtXVXeg 2b*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 3a*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 3b*	200	100	100	100
PtXVXeg 4a*	200	100	100	100
Pt XV Xeg 4c*	200	100	100	100
PtXVXeg 5a*	200	100	100	100
PtXVI Xeg 5c*	200	100	100	100
* трансгенные клоны осины с рекомбинантными генами GFP, Gus, Bar, Xeg, полученные на основе растений дикого типа генотипов Pt, f2, PtV22.

1. Способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л, витаминов MS 1 мл/л, сорбитола 5-10 г/л и маннитола 5-10 г/л, причем хранение растений осуществляют при температуре +4°C в режиме освещения 8 ч день/16 ч ночь с интенсивностью 2000 люкс.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пригоден для хранения растений генетически модифицированной осины с рекомбинантными генами.

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к виноградарству. Способ включает микроразмножение пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с добавлением макроэлементов, витаминов и биопрепаратов.

Способ получения растений-регенерантов земляники (in vitro) // 2516341

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов земляники in vitro, включающий в себя введение эксплантов в культуру, размножение и укоренение вновь образованных in vitro побегов, где в качестве эксплантов используют фрагменты цветоложа и цветоножки из цветов земляники, взятых в фазе бутонизации, которые промывают под проточной водой в течение 15-25 минут, стерилизуют 0,1% раствором сулемы 10 минут, затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой, цветоложе освобождают от чашелистиков и лепестков, разрезают на фрагменты 5×5 мм и помещают срезом на питательную среду, цветоножку отделяют от цветка, отрезают фрагмент длиной 5 мм и также помещают на питательную среду.

Способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro // 2515385

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к микроклональному размножению in vitro. В способе культивируют каллусные культуры из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков.

Способ введения в культуру клеток льна многолетнего // 2506741

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, где в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей.

Способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта "королек" in vitro // 2490871

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта «Королек» in vitro.

Способ укоренения сенполии узамбарской // 2489848

Изобретение относится к способу укоренения черенков сенполии узамбарской и может быть использовано для цветочной рассады. .

Способ микроклонального размножения картофеля // 2487532

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, семеноводству картофеля, картофелеводству. .

Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro // 2486237

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения. .

Питательная среда для ризогенеза яблони и груши in vitro // 2485768

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой питательную среду для укоренения побегов яблони и груши in vitro. .

Способ адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям // 2483530

Изобретение относится к адаптации растений к нестерильным условиям. .

Способ микроклонального размножения подвоев яблони // 2523305

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения подвоев яблони, где на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения в среду Мурасиге-Скуга в качестве стимулятора роста добавляется препарат фуролан в концентрации 0,004 мг/л. Изобретение позволяет повысить ряд показателей качества эксплантов подвоев яблони. 1 табл., 3 пр.

Способ размножения цимбидиума in vitro // 2523604

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения цимбидиума in vitro включающий введение стерильных эксплантов в культуру in vitro, микроразмножение путем отделения псевдобульб от экспланта и посадки на питательную среду Мурасиге-Скуга, укоренение псевдобульб в грунте, где после введения в культуру in vitro образовавшиеся псевдобульбы отделяют от экспланта и переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга,содержащую 30 г/л сахарозы и раствор препарата эпибрассинолида в концентрации 0,001 мг/л, затем псевдобульбы, имеющие корнепобеги, отделяют от эксплантов, обрабатывают раствором индолилуксусной кислоты в концентрации 1,0 мг/л в течение 15 минут и укореняют в условия ex vitro в грунте с добавлением мха и древесной коры. Изобретение позволяет повысить выход размножаемого материала за счет увеличения количества образующихся псевдобульб, при положительном влиянии оптимальных концентраций регуляторов роста.3 табл.

Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза // 2524424

(57) Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных в сосудах 1 л, помещают в чашки Петри с жидкой средой определенного состава и прединкубируют, кокультивируют и культивируют на питательных средах определенного состава. При появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на среду определенного состава. Проводят первый этап отбора форм, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, путем культивирования срезанных регенерантов на среде МС с 50 мл/л канамицина сульфата в течение 30-45 дней при 22-25°C и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде с последующим отбором укоренившихся регенерантов картофеля с зелеными листьями и стеблями. Проводят второй этап отбора форм, устойчивых к возбудитялям фитофтороза и альтернариоза, включающий проверку укоренившихся растений методом ПЦР на наличие целевой ДНК и размножение регенерантов с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК микрочеренкованием. Использование заявленного способа позволяет получить устойчивые к возбудителям фитофтороза и альтернариоза формы картофеля. 5 табл.

Способ получения лапчатки белой (potentilla alba) // 2525676

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения растений лапчатки белой (Potentilla alba) методом культуры in vitro, включающий отделение вегетативных почек от корневища, стерилизацию, высаживание на питательные среды, микроразмножение побегов, укоренение побегов, адаптацию растений-регенерантов к нестерильным условиям. Использование заявленного способа позволяет получить более 150 тысяч саженцев в год от одного экспланта. 5 ил., 1 табл.

Способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях in vitro // 2529837

Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает отделение листьевых дисков от микропобегов после 4-5 пассажа, полученных в культуре in vitro, дальнейшее культивирование их на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией макроэлементов и дополненной веществом цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном, при этом культивирование проводят при пониженной интенсивности освещения. 4 табл.

Способ повышения коэффициента размножения капусты белокочанной в условиях in vitro // 2538163

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции. Изобретение представляет собой способ повышения коэффициента размножения капусты белокочанной в условиях in vitro, включающий выращивание эксплантов, культирование их на питательной среде Мурасиге-Скуга, внесение в нее регуляторов роста тидиазурон в концентрации 1 мг/л в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой - 0,5 мг/л, при использовании цветолож размером 0,2-0,3 мм, изолированных из бутонов длиной 0,5-0,7 мм, где цветоложе используют за 1-2 дня до распускания цветков и после выращивания их на питательных средах культивируют до образования почек в течение 14-21 суток. Способ позволяет получить большое количество растений-регенерантов с признаками ЦМС и получить генетически стабильный урожай селекционных образцов. 3 табл.

Способ размножения гречихи in vitro // 2538167

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян. Семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов. Субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность процесса размножения микрорастений гречихи в условиях in vitro за счет его упрощения, ускорения, снижения затрат и увеличения выхода пробирочных растений. 3 табл.

Способ клонального микроразмножения винограда in vitro // 2538859

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на питательную среду в присутствии ростовых веществ и культивирование, где высадку и культивирование осуществляют на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей в качестве росторегулирующего вещества препарат Мелафен в концентрации 10-7-10-11%. Заявляемый способ позволяет увеличить выход растений за счет эффективной приживаемости микрочеренков, хорошей регенерации, улучшения качественных показателей растений. 6 табл.

Способ клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции // 2541769

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов. При этом в состав питательной среды дополнительно вводится антибиотик гентамицин в два этапа: при первом субкультивировании гентамицин вводится в концентрациях 0,05-0,3 мл/л; при втором - в концентрациях 0,01-0,04 мл/л одновременно с введением препарата эмистим в разведении 10-6-10-12 мл/л. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность клонального микроразмножения растений винограда в культуре in vitro, повысить приживаемость и выход оздоровленных от микоплазм растений с улучшенным морфогенезом и качественными характеристиками. 7 табл.

Способ размножения копеечника чайного (hedysarum theinum krasnob.) // 2547593

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения копеечника чайного, где вызревшие простерилизованные семена копеечника чайного (Hedysarum theinum Krasnob.) высаживают на питательные среды Мурасиге-Скуга для введения в культуру ткани, через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают на среды размножения MS, затем образовавшиеся конгломераты микропобегов делят и пересаживают на среды, содержащие 1,0 БАП+L-глютамин и аденин сульфат 100 мг/л. Растения-регенеранты размножают, укореняют и адаптируют к нестерильным условиям. Изобретение позволяет повысить эффективность процесса, тиражируемости, адаптации в условиях гидропоники и получить стандартные саженцы копеечника чайного. 4 ил., 1 табл.