Способ получения противовирусного средства и противовирусное средство


 


Владельцы патента RU 2522880:

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина" (RU)

Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно противовирусному средству. Способ получения противовирусного средства проводят путем приготовления посевного мицелия базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer, приготовления жидкой питательной среды, содержащей воду, в качестве источников углерода - растительное масло и мелассу, в качестве источника азота - кукурузную муку, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия и сульфат магния, ее стерилизации, засева приготовленным посевным мицелием стерильной жидкой питательной среды, культивирование в ней базидиомицета в аэробных условиях, полученную погруженную культуру разделяют на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость, из которой выделяют сгусток посредством добавления к последней этилового спирта, который отжимают, высушивают и измельчают с получением противовирусного средства, при определенных условиях. Вышеописанный способ позволяет упростить технологический процесс, повысить выход противовирусного средства, обладающего повышенной активностью. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

 

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу получения противовирусного средства путем культивирования штамма базидиомицета, в частности Flammulina velutipes (Curtis) Singer, на жидкой питательной среде в погруженной культуре и к противовирусному средству.

Известно, что базидиальный ксилотрофный гриб опенок зимний F. velutipes способен к синтезу биологически активных соединений, которые содержатся в плодовых телах и вегетативном мицелии. Выделенные активные метаболиты, относящиеся к различным классам соединений: полисахариды, тритерпены, жирные кислоты и др. Метаболиты F. velutipes способны оказывать выраженное противовирусное действие (X-h Не et al., 2008, M. Gong et al., 2009, V.P. Sharma et al., 2009, N.K. Sinha, 2011).

Известен способ получения противовирусной субстанции из плодовых тел и субстратного мицелия, выращенных на твердом питательном субстрате на основе отходов переработки сахарного тростника (US 4629627, 16.12.1986). Недостатками описанного способа являются длительность процесса культивирования гриба и сложность технологии выделения противовирусной субстанции. Точная длительность процесса в данном патенте не указывается. Однако известно, что сроки формирования плодовых тел F. velutipes составляют от 1 до 4 недель, длительность процесса освоения питательного субстрата вегетативным мицелием - не менее 3 недель. Кроме того, в технологической схеме присутствуют энергоемкие операции измельчения пророщенных грибным мицелием блоков субстрата и экстракции целевого продукта горячей водой с последующим отжимом и прямой сушкой водного экстракта.

Более близкими к описываемой группе изобретений являются способ получения противовирусного средства с использованием съедобного гриба и противовирусное средство (RU 2004130188, 2004). Способ получения противовирусного средства, содержащего в качестве активного вещества модифицированный водорастворимый лигнин-полисахаридный комплекс, включает разложение и модификацию лигнинов и полисахаридов из растительных отходов съедобным грибом Pleurotus ostreatus в условиях твердофазного культивирования, экстракцию, отделение жидкой фазы, ее подкисление, отделение осадка, его промывку. При этом пептидную составляющую осадка гидролизуют водным раствором соляной кислоты при 70°C в течение нескольких часов, остаточный осадок промывают до нейтрального pH, сушат, смешивают с NaOH в соотношении по сухой массе 100:21, растворяют при нагревании, добавляют HCl до pH 7,0.

Противовирусное средство широкого спектра действия для лечения инфекционных заболеваний, выделенное из водного экстракта растительных отходов, подвергнутых разложению съедобным грибом P. ostreatus, содержит в качестве активного вещества модифицированный водорастворимый лигнин-полисахаридный комплекс, не содержит пептиды, содержание лигнина в лигнин-полисахаридном комплексе по массе составляет не менее 90%.

Недостаток способа получения противовирусного средства заключается в длительности процесса твердофазного культивирования Р. ostreatus, сложности и многостадийности технологии выделения целевого продукта, в низком содержании в целевом продукте полисахаридов, ответственных в отличие от лигнина за противовирусные свойства получаемого комплекса. Получаемое при этом противовирусное средство обладает недостаточно высокой активностью.

Задачей группы изобретений в части способа является упрощение технологии процесса с получением целевого средства при его высоком выходе, в части вещества - повышение противовирусной активности средства.

Поставленная задача решается описываемым способом получения противовирусного средства путем приготовления посевного мицелия базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer, приготовления жидкой питательной среды, содержащей воду, в качестве источников углерода - растительное масло в количестве 19,0-27,0 г/л воды и мелассу в количестве 15-40 г/л воды, в качестве источника азота - кукурузную муку в количестве 7-15 г/л воды, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия в количестве 2,0-2,4 г/л воды и сульфат магния в количестве 0,18-0,20 г/л воды, ее стерилизации, засева приготовленным посевным мицелием стерильной жидкой питательной среды, культивирования в ней базидиомицета в аэробных условиях с получением погруженной культуры, последующим разделением погруженной культуры на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость и выделением из последней посредством добавления к ней при температуре 4°C 96%-ного этилового спирта, при соотношении объемов культуральной жидкости и этилового спирта 1:2-1:4, сгустка, который отжимают, высушивают при температуре 40°C до содержания влаги 6% и измельчают с получением противовирусного средства.

Предпочтительно жидкая питательная среда дополнительно содержит зеатин в количестве 0,0010-0,0015 г/л воды, витамин B3 в количестве 0,0060-0,0065 г/л воды, дрожжевой экстракт в количестве 0,050-0,055 г/л воды.

Поставленная задача решается также описываемым противовирусным средством, полученным вышеописанным способом.

Техническими результатами описываемой группы изобретений являются упрощение технологии процесса, получение с высоким выходом противовирусного средства, обладающего повышенной активностью.

Приведенные ниже примеры иллюстрируют изобретения, но не ограничивают их.

Пример 1.

Готовят посевной мицелий базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer. Для этого готовят стерильную посевную жидкую питательную среду, состава, г/л: меласса - 30,0, соевая мука - 6,0, дигидрофосфат калия - 2,0, фосфат магния - 0,28, арахидоновая кислота -1,0×10-5 и засевают ее мицелием F. velutipes, выращенным на агаровой питательной среде. Процесс получения посевного мицелия проводят в колбах на ротационной качалке при 200 об/мин, при 22°C в течение 4 суток при аэрации.

Затем готовят жидкую питательную среду, состава, г/л воды: растительное масло - 19,00, меласса - 40,00, кукурузная мука - 7,00, дигидрофосфат калия KH2PO4 - 2,40, сульфат магния MgSO4 - 0,18, вода - до 1,00 л.

Данную среду разливают в колбы, стерилизуют и засевают мицелием, полученным вышеописанным способом.

Погруженное культивирование осуществляют в колбах на ротационной качалке в аэробных условиях при температуре 25°C в течение 4 суток с получением погруженной культуры. Погруженную культуру разделяют на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость. Культуральную жидкость охлаждают до температуры 4°C, затем при непрерывном перемешивании к последней добавляют 96% этиловый спирт той же температуры при соотношении объемов культуральной жидкости и этилового спирта 1:2. Образовавшийся при осаждении сгусток отжимают, высушивают при температуре 40°C до содержания влаги 6%, измельчают и получают противовирусное средство. Очистку противовирусного средства осуществляют путем трехкратного перерастворения экзополисахарида в дистиллированной воде с последующим осаждением спиртом по описанной выше методике. Выход противовирусного средства - 0,65 г/л.

Пример 2.

Процесс получения противовирусного средства осуществляют по примеру 1.

При этом используют жидкую питательную среду следующего состава, г/л воды: растительное масло - 27,00, меласса - 20,00, кукурузная мука -15,00, дигидрофосфат калия - 2,00, сульфат MgSO4 - 0,20, вода - до 1,00 л.

Погруженное культивирование осуществляют в колбах на ротационной качалке в аэробных условиях при температуре 25°C в течение 4 суток. Процесс выделения противовирусного средства осуществляют при соотношении объемов культуральной жидкости и этилового спирта 1:4.

Выход противовирусного средства - 0,87 г/л.

Пример 3.

Процесс получения осуществляют по примеру 1, при этом состав жидкой питательной среды имеет следующее соотношение компонентов, г/л воды: растительное масло - 24,00, меласса - 15,00, кукурузная мука - 12,00, KH2PO4 - 2,20, MgSO4 - 0,19, зеатин - 0,0010 г/л воды, витамин B3 - 0,0065 г/л воды, дрожжевой экстракт - 0,05 г/л воды, вода - до 1,00 л.

При этом компоненты зетаин, витамин B3, дрожжевой экстракт вводят следующим образом.

Готовят раствор зеатина, для чего 100 мг вещества растворяют в 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 112°C в течение 30 минут. Вносят из расчета 1 мл раствора на 1 л производственной питательной среды.

Готовят раствор витамина B3, для чего 100 мг вещества (или 1 таблетку пантотената кальция в аптечной расфасовке) растворяют в 50 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 112°C в течение 30 минут. Вносят из расчета 3 мл раствора на 1 л производственной питательной среды.

Готовят раствор дрожжевого экстракта, для чего 5 г сухого препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды и стерилизуют при 112°C в течение 30 минут. Вносят из расчета 1 мл раствора на 1 л производственной питательной среды.

Погруженное культивирование осуществляют в колбах на ротационной качалке при температуре 25°C в течение 4 суток, внося 5 порций мелассы по 5 г через 24, 36, 48, 60 и 72 часа культивирования.

Выделение противовирусного средства осуществляют согласно примеру 1.

Выход противовирусного средства - 1,2 г/л.

Пример 4.

Для оценки противовирусных свойств полученного средства на основе лекарственного базидиомицета F. velutipes вышеописанным способом проводят тест, оценивающий индукцию интерферона лейкоцитами донорской крови человека.

Для исследования используют сухой образец экзополисахаридов лекарственного базидиомицета F. velutipes, полученный по примеру 1. Готовят исходный раствор полученного образца экзополисахаридов с концентрацией 800 мкг/мл. С этой целью из образца берут навески массой по 4 мг. К навеске добавляют по 5 мл дистиллированной воды. Затем методом разведений готовят растворы экзополисахаридов с концентрацией 400, 200, 100, 50, 10, 5, 1 и 0,1 мкг/мл. Эти образцы используют в качестве индукторов интерферона.

Клетками-продуцентами служат лейкоциты донорской крови человека. Концентрация лейкоцитов составляла 1×106 /мл. В качестве среды использовали среду RPMI 1640, объем среды в каждой пробе составлял 1,0 мл. К взвеси лейкоцитов в каждой пробе добавляют по 0,1 мл соответствующего разведения исследуемой суммарной фракции. В качестве контроля используют вирус болезни Ньюкасла (ВБН) как индуктор α-интерферона и фитогемагглютинин P (ФГА) как индуктор γ-интерферона, а также взвесь лейкоцитов в среде без добавления индуктора. Синтез интерферона проводят при температуре 37°C. Образцы отбирают через 24, 48 и 72 часа. Активность интерферона определяют путем титрования в диплоидной культуре фирбобластов эмбриона человека против 10 и 1 ЦПД50 вируса энцефаломиокардита мышей. За титр интерферона принимают последнее его разведение, в котором наблюдается 50% защиты клеточного монослоя от цитопатического действия вируса.

Результаты теста на способность экзополисахаридов из культуральной жидкости F. velutipes, полученной по примеру 1, индуцировать в лейкоцитах крови человека продукцию интерферона приведены в таблице.

Таблица
Результаты теста на способность экзополисахаридов культуральной жидкости F. velutipes, полученных по примеру 1, индуцировать в лейкоцитах крови человека продукцию интерферона (ед/мл)
Концентрация препарата, мг/мл Время после индукции
24 часа 48 часов 72 часа
50 <8 <8 <8
5 8 8 4
0,5 8 8 4
0,1 8 16 8-16
0,05 16 32 16
0,01 16 32 16
0,005 8 16 8
0,001 <2 16 8
0,0001 <2 8 8
контроль клеток <2 <2 <2
контроль ВБН 160 80 8
контроль ФГА 16 16 16

При тестировании интерферона биологическим методом в культуре диплоидных фибробластов человека по подавлению репродукции индикаторного вируса описываемое противовирусное средство в концентрации от 0,0001 мг/мл до 5 мг/мл индуцирует в лейкоцитах человека продукцию интерферона. Наибольшая активность интерферона составляет 16-32 ед/мл и выявляется при использовании препарата в концентрации 0,005-0,1 мг/мл. Оптимальное время для выявления наибольшего титра интерферона составляет 48 часов. Средство индуцирует интерферон на уровне контрольного индуктора гамма интерферона ФГА.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о наличии достаточно высокой противовирусной активности экзополисахаридов F. velutipes, полученных описываемым способом.

1. Способ получения противовирусного средства путем приготовления посевного мицелия базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer, приготовления жидкой питательной среды, содержащей воду, в качестве источников углерода - растительное масло в количестве 19,0-27,0 г/л воды и мелассу в количестве 15-40 г/л воды, в качестве источника азота - кукурузную муку в количестве 7-15 г/л воды, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия в количестве 2,0-2,4 г/л воды и сульфат магния в количестве 0,18-0,20 г/л воды, ее стерилизации, засева приготовленным посевным мицелием стерильной жидкой питательной среды, культивирования в ней базидиомицета в аэробных условиях с получением погруженной культуры, с последующим разделением погруженной культуры на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость и выделением из последней посредством добавления к ней при температуре 4°C 96%-ного этилового спирта, при соотношении объемов культуральной жидкости и этилового спирта 1:2-1:4, сгустка, который отжимают, высушивают при температуре 40°C до содержания влаги 6% и измельчают с получением противовирусного средства.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что жидкая питательная среда дополнительно содержит зеатин в количестве 0,0010-0,0015 г/л воды, витамин B3 в количестве 0,0060-0,0065 г/л воды, дрожжевой экстракт в количестве 0,050-0,055 г/л воды.

3. Противовирусное средство, полученное по любому из пп.1-2.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 продуцирует мальтогенную α-амилазу и депонирован в ВКМ ИБФМ им.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Fusarium sambucinum, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения пищевой грибной биомассы с высоким содержанием белка.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутантного штамма Glarea lozoyensis и его применения. Мутантный штамм получен путем воздействия на штамм Glarea lozoyensis АТСС 20957 нитрозогуанидином и депонирован в CGMCC под №CGMCC 2933.
Способ обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 in vitro включает предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, обеспечение возможности формирования сферул и обнаружение сферул, заполненных эндоспорами.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению препаратов кератиназы, и может быть использовано для получения препаратов кератиназ, применяемых в медицине, косметологии, легкой промышленности и сельском хозяйстве.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает приготовление посевного мицелия базидиомицета, выбранного из группы Flammulina velutipes (Curtis) Singer и/или Hericium erinaceus (Bull.) Pers.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов - обладает способностью продуцировать протеолитические и амилолитические ферменты.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, депонирован в коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им.

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии. Представлены альтернативные способы получения дрожжевого экстракта для придания пищевым продуктам вкуса “kokumi”, содержащего пептид γ-Glu-X или γ-Glu-X-Gly.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении вакцины против ящура. Способ изготовления вакцины против ящура включает культивирование вирусного антигена в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37 °С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса ящура и соединение концентрата антигена с адъювантом, при этом очистку вирусной суспензии от балластных примесей проводят добавлением производных полигуанидинов в конечной концентрации 0,005-0,01% или смеси хлороформа и производных полигуанидинов, взятых в весовых соотношениях (40-160):1, соответственно, в конечной концентрации 0,4-0,8.
Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики и, в частности, для получения вакцины против бешенства животных.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии. Способ оценки активности лечебно-профилактических препаратов против вируса натуральной оспы включает введение в организм модельных животных контрольной и испытуемой групп по заданной схеме суспензии исследуемого противовирусного препарата, интраназальное заражение их штаммом вируса натуральной оспы, инкубацию вируса в организме животных и определение концентрации вируса в легких животных с последующим вычислением оценочных показателей снижения концентрации вируса в легких.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения вирусных заболеваний. Для этого вводят лекарственное средство, содержащее в качестве действующих компонентов активированную-потенцированную форму антител к гамма-интерферону человека и активированную-потенцированную форму антител к CD4 рецептору.

Заявленная группа изобретений относится к области ветеринарии и предназначена для лечения субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции у животных. Заявлены способ лечения субклинической формы вызываемой PCV 2 инфекции; способ уменьшения нарушения роста из-за субклинической формы вызываемой PCV2 инфекции; способ снижения количества животных с вирусной нагрузкой, превышающей 106 геномных копий на мл сыворотки; способ снижения выделения вируса из носа и/или продолжительности виремии у животных, инфицированных субклинической формой PCV2.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается профилактики и лечения инфекционных вирусных заболеваний. Для этого вводят комплексное лекарственное средство, содержащее смесь нескольких компонентов в виде активированных-потенцированных форм антител к растворенному антигену и антигену, связанному с наружной мембраной клеток иммунной системы.

Предложенная группа изобретений относится к области ветеринарии. Предложена иммуногенная композиция для собак, содержащая эффективное количество вирионов парвовируса с белком типа VP-2, содержащим нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4.
Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к композиции, содержащей инкапсулированную тритерпеновую кислоту: бетулиновую кислоту, урсоловую кислоту или их производные в виде солей и эфиров или тритерпеновый спирт - бетулин, которая может быть использована в медицине для лечения и профилактики вирусных инфекций, вызываемых ДНК- и РНК-содержащими вирусами, такими как вирусы гриппа, онковирусы, герпес, опоясывающий лишай, а также инфекций, вызываемых грамположительными и грамотрицательными бактериями: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Shigella spp., Escherichia spp., Salmonella spp., Proteus spp., Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Klebsiella spp., Antracoides spp., Cryptococcus spp., патогенными грибами рода Microsporum, Trichophyton, Nocardia, Aspergillus, дрожжеподобными грибами рода Candida, в т.ч.

Настоящее изобретение относится к новым алкил [2-(2-{5-[4-(4-{2-[1-(2-метоксикарбониламино-ацетил)-пирролидин-2-ил]-3Н-имидазол-4-ил}-фенил)-бута-1,3-диинил]-1Н-имидазол-2-ил}-пирролидин-1-ил)-2-оксо-этил]-карбаматам или их нафталин-1,5-дисульфонатам, которые обладают свойствами ингибитора белка NS5A и могут быть использованы для профилактики и лечения вирусных заболеваний, вызываемых вирусами гепатита С (HCV) и гепатита GBV-C.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к композиции, обладающей противовирусной активностью (варианты). Композиция, обладающая противовирусной активностью, включающая глицирризинат аммония, β-циклодекстрин, эмульгатор, консервант, лизоцим, полимерный носитель, регулятор pH, воду деминерализованную, при определенном соотношении компонентов.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой фармакологическую геропротекторную композицию, включающую полифенольный компонент, витамины и микроэлементы, гуминовые кислоты, содержащие полифенольные компоненты, витамин C, витамин A, хлорид железа(II) и двуокись селена(IV), причем компоненты в композиции находятся в определенном соотношении в масс.
Наверх