Способ микроклонального размножения подвоев яблони

Авторы патента:

Бунцевич Леонид Леонтьевич (RU)

Палецкая Екатерина Николаевна (RU)

Ненько Наталия Ивановна (RU)

Костюк Марина Александровна (RU)

Макаркина Марина Викторовна (RU)

A01H4/00 - Разведение растений из тканевых культур

Владельцы патента RU 2523305:

Государственное научное учреждение Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии (RU)
Общество с ограниченной ответственностью Малое инновационное предприятие "Здоровый сад" (RU)

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения подвоев яблони, где на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения в среду Мурасиге-Скуга в качестве стимулятора роста добавляется препарат фуролан в концентрации 0,004 мг/л. Изобретение позволяет повысить ряд показателей качества эксплантов подвоев яблони. 1 табл., 3 пр.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к микроклональному размножению сельскохозяйственных культур.

Наиболее часто в технологии микроклонального размножения с.-х. растений используют природные фитогормоны и их синтетические аналоги: цитокинины: природный - зеатин, синтетический - 6-бензиламинопурии (БАП), гиббереллины (ГК).

Известен способ клонального микроразмножения яблони, при котором для повышения относительного количества побегов длиной более 15 мм экспланты культивируют на средах, содержащих пониженные концентрации 6-бензиламинопурина (0,1-0,2 мг/л) [Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений: автореф. дис. … д-ра с.-х. наук: 06.01.07 и 03.00.12 / Высоцкий Валерий Александрович. - М., 1998. - 44 с.].

Недостатком способа является дороговизна используемого стимулятора 6-БАП.

Известен другой способ клонального микроразмножения плодовых культур, при котором на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения вводятся в среду 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1,5 мг/л и гиббереллиновая кислота (ГК) в концентрации 10 мг/л [Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами/ под ред. Е.Н. Джигадло - Орел: ГНУ ВНИИСПК - 2005. - 51 с.].

Недостатками способа являются высокая себестоимость размноженных таким образом растений из-за высокой стоимости использованных препаратов, а также низкое качество оздоравливаемых растений (до 21% укорененных растений со стеблем более 15 мм, высокое каллусообразование и др.).

Техническим результатом изобретения является повышение при микроклональном размножении подвоев яблони, ряда показателей качества эксплантов; уменьшение стоимости этапа введения в культуру и собственно микроразмножения; снижение себестоимости оригинального посадочного материала, полученного с помощью технологии in vitro.

Технический результат достигается тем, что на этапах введения в культуру меристем в среду субстрата Мурасиге-Скуга в качестве стимулятора роста добавляется препарат фуролан, полученный на основе доступного и возобновляемого сырья - продукта фурфурольного производства и нефтехимии [Создание ресурсосберегающей технологии получения экологически чистого регулятора роста растений фуролан [Электронный ресурс]/ Косулина Т.П., Сухоцкий С.А., Саенко А.Г., Василии В.К. // Программа по сближению научной общественности Российской Федерации. - 2009. - Режим доступа: http:/www.rfcontact.ru/text/1214].

Для улучшения качества эксплантов размножаемых подвоев яблони обоснована концентрация фуролана - 0,004 мг/л. Фуролан в полевых условиях применяют как рострегулирующее вещество, повышающее урожай и качество сельскохозяйственной продукции, и как эффективное средство, повышающее устойчивость растений к неблагоприятным условиям произрастания: к засухе, засолению почвы, поражению грибковыми заболеваниями [Высокоэффективные, экологически чистые регуляторы роста растений, улучшающие качество сельскохозяйственной продукции / Косулина Т.П., Калашникова В.Г., Барчукова А.Я., Маслов С.В., Лукаш P.M. - Краснодар: Кубанский государственный технологический университет., 2010. - 8 с.]. В культуре in vitro данный препарат еще не был испытан.

В результате проведенного исследования и сравнения с контролем было установлено, что на средах с добавлением фуролана в указанной концентрации экспланты по комплексу показателей качества значительно превосходят контроль.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1 (контроль). Способ заключается в том, что приготавливают питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга (Состав среды, мг/л: NH₄NO₃ - 1650, KNO₃ - 1900, CaCl₂, 2H₂O - 440, MgSO₄·7H₂O - 370, KH₂PO₄ - 170, H₃BO₃ - 6,2, MnSO₄·4H₂O - 22,3, CoCl₂·6H₂O - 0,025, CuSO₄·5H₂O - 0,025, ZnSO₄·7H₂O - 8,6, NaMoO₄·7H₂O - 0,25, KI - 0,83, FeSO₄·7H₂O - 27,8, Тиамин хлорид - 0,5, Пиридоксин хлорид - 0,5, Никотиновая кислота - 0,5, Мезоинозит - 100, Агар - 5000, вода до 1 л), в среду добавляют регуляторы роста 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1,5 мг/л и гиббереллиновую кислоту (ГК) в концентрации 10 мг/л, pH раствора доводят до 5,6. Приготовленный раствор нагревают до 95°C, разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 1 атм, 120°C в течение 15-20 минут. После этого в ламинарбоксе высаживают на питательную среду простерилизованные апексы терминальных участков однолетних побегов (верхушек) или пазушных почек подвоя ММ 106, изолированных с отрезком стебля.

Пример 2. Использование на этапе введения в культуру и собственно микроразмножения среды Мурасиге-Скуга (аналогично примеру 1) с добавлением фуролана в концентрации 0,004 мг/л вместо 6-БАП и ГК. Препарат испытывали при микроклональном размножении среднерослого подвоя яблони ММ 106 на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения. Повторность опыта 5-кратная, по 10 пробирок с эксплантами в повторности.

Пример 3. Аналогично примеру 2, карликовый подвой СК 4 (селекция СКЗНИИСиВ).

Экспланты на среде с фуроланом в концентрации 0,004 мг/л по всем показателям качества значительно превосходят контроль.

На данной среде микрорастения в среднем образуют на 2 листа больше, чем в контрольном варианте, причем больше (на 18,3-20%) листьев имеют здоровую интенсивно зеленую окраску; на 33-39,5% больше эксплантов образуют стебель, длиной более 15 мм, такие экспланты лучше укореняются на следующем этапе микроразмножения; коэффициент размножения на 4 единицы превышает контроль; практически отсутствует явление зарастания эксплантов каллусом (0 и 3,7% микрорастений образовали каллус, в контрольном варианте 45%); по качественному состоянию микропобеги на 0,8-1,0 балла превосходят контроль.

Таблица
Состояние эксплантов на средах с различными ростовыми веществами после 1-го пассажа
Ростовое вещество	Число листьев на одном экспланте	Коэффици ент размноже ния	Общее состояние микрорастений по 5-балльной шкале	Число растений с интенсив ной зеленой окраской листьев, %	Число растений со стеблем более 15 мм, %	Число растений с каллусом, %
Пример 1 (контроль)	4,0	1:3	3,5	40,0	21,0	45,0
Пример 2 Фуролан 0,004 мг/л, ММ 106	7,1	1:7	4,3	58,3	54,0	3,7
Пример 3 Фуролан 0,004 мг/л, подвой СК 4	7,5	1:7	4,5	60,0	60,5	0,0

Сортовые особенности подвоев проявились незначительно, главным фактором, определяющим качество микрорастений, оказалось присутствие и концентрация стимулятора роста (см. табл.).

Таким образом, фуролан в концентрации 0,004 мг/л можно использовать для получения качественных, здоровых, хорошо укореняющихся в дальнейшем микропобегов подвоев яблони длиной более 15 мм, то есть данный препарат можно использовать вместо 6-бензиламинопурина (6-БАП) и ГК, что позволит значительно удешевить технологию, так как стоимость препарата фуролан (1 г - 10 р.) в 20 раз меньше стоимости 6-БАП (1 г - 198,9 р.) и в 50 раз меньше стоимости ГК (1 г - 500 р.)

Способ микроклонального размножения подвоев яблони, отличающийся тем, что на этапах введения в культуру и собственно микроразмножения в среду Мурасиге-Скуга в качестве стимулятора роста добавляется препарат фуролан в концентрации 0,004 мг/л.

Изобретение относится к области биотехнологии растений. Изобретение представляет собой способ хранения растений осины в условиях in vitro, включающий культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л и витаминов MS 1 мл/л, сорбитола 5-10 г/л и маннитола 5-10 г/л, причем хранение растений осуществляют при температуре +4°С в режиме освещения 8 ч день/16 ч ночь с интенсивностью 2000 люкс.

Способ микрочеренкования винограда in vitro // 2521992

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к виноградарству. Способ включает микроразмножение пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с добавлением макроэлементов, витаминов и биопрепаратов.

Способ получения растений-регенерантов земляники (in vitro) // 2516341

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения растений-регенерантов земляники in vitro, включающий в себя введение эксплантов в культуру, размножение и укоренение вновь образованных in vitro побегов, где в качестве эксплантов используют фрагменты цветоложа и цветоножки из цветов земляники, взятых в фазе бутонизации, которые промывают под проточной водой в течение 15-25 минут, стерилизуют 0,1% раствором сулемы 10 минут, затем трижды промывают стерильной дистиллированной водой, цветоложе освобождают от чашелистиков и лепестков, разрезают на фрагменты 5×5 мм и помещают срезом на питательную среду, цветоножку отделяют от цветка, отрезают фрагмент длиной 5 мм и также помещают на питательную среду.

Способ микроклонального размножения ольхи черной in vitro // 2515385

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к микроклональному размножению in vitro. В способе культивируют каллусные культуры из стерильных эксплантов стеблевых сегментов, листьев, листовых черешков.

Способ введения в культуру клеток льна многолетнего // 2506741

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой получение каллуса на питательной среде Мурасиге-Скуга, доведенной до 1 литра водой, в течение одного пассажа, где в питательную среду добавляют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту с концентрациями 4-8 мг/л, культивируют семена льна многолетнего, в питательную среду Гамборга добавляют 6-бензиламинопурин с концентрацией 1-2 мг/л и α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и затем на питательную среду Гамборга пересаживают полученные каллусы для регенерации и культивируют в течение 2-4 пассажей, в жидкую питательную среду Мурасиге-Скуга с концентрацией всех компонентов 50% добавляют α-нафтилуксусную кислоту с концентрацией 0,1-0,5 мг/л и на нее пересаживают растения-регенеранты и культивируют их в течение 2-4 пассажей.

Способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта "королек" in vitro // 2490871

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ поверхностной стерилизации эксплантов и апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта «Королек» in vitro.

Способ укоренения сенполии узамбарской // 2489848

Изобретение относится к способу укоренения черенков сенполии узамбарской и может быть использовано для цветочной рассады. .

Способ микроклонального размножения картофеля // 2487532

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, семеноводству картофеля, картофелеводству. .

Питательная среда для размножения яблони и груши in vitro // 2486237

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе клонального микроразмножения яблони и груши на этапе собственно микроразмножения. .

Питательная среда для ризогенеза яблони и груши in vitro // 2485768

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой питательную среду для укоренения побегов яблони и груши in vitro. .

Способ размножения цимбидиума in vitro // 2523604

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения цимбидиума in vitro включающий введение стерильных эксплантов в культуру in vitro, микроразмножение путем отделения псевдобульб от экспланта и посадки на питательную среду Мурасиге-Скуга, укоренение псевдобульб в грунте, где после введения в культуру in vitro образовавшиеся псевдобульбы отделяют от экспланта и переносят на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга,содержащую 30 г/л сахарозы и раствор препарата эпибрассинолида в концентрации 0,001 мг/л, затем псевдобульбы, имеющие корнепобеги, отделяют от эксплантов, обрабатывают раствором индолилуксусной кислоты в концентрации 1,0 мг/л в течение 15 минут и укореняют в условия ex vitro в грунте с добавлением мха и древесной коры. Изобретение позволяет повысить выход размножаемого материала за счет увеличения количества образующихся псевдобульб, при положительном влиянии оптимальных концентраций регуляторов роста.3 табл.

Способ получения форм картофеля in vitro, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза // 2524424

(57) Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии. Листовые экспланты, вычлененные из тридцатидневных асептических растений исходных сортов, выращенных в сосудах 1 л, помещают в чашки Петри с жидкой средой определенного состава и прединкубируют, кокультивируют и культивируют на питательных средах определенного состава. При появлении регенерантов размером не менее 10 мм их срезают и переносят на среду определенного состава. Проводят первый этап отбора форм, устойчивых к возбудителям фитофтороза и альтернариоза, путем культивирования срезанных регенерантов на среде МС с 50 мл/л канамицина сульфата в течение 30-45 дней при 22-25°C и освещенности 6000-10000 лк при 16-часовом фотопериоде с последующим отбором укоренившихся регенерантов картофеля с зелеными листьями и стеблями. Проводят второй этап отбора форм, устойчивых к возбудитялям фитофтороза и альтернариоза, включающий проверку укоренившихся растений методом ПЦР на наличие целевой ДНК и размножение регенерантов с подтвержденной ПЦР вставкой целевой ДНК микрочеренкованием. Использование заявленного способа позволяет получить устойчивые к возбудителям фитофтороза и альтернариоза формы картофеля. 5 табл.

Способ получения лапчатки белой (potentilla alba) // 2525676

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения растений лапчатки белой (Potentilla alba) методом культуры in vitro, включающий отделение вегетативных почек от корневища, стерилизацию, высаживание на питательные среды, микроразмножение побегов, укоренение побегов, адаптацию растений-регенерантов к нестерильным условиям. Использование заявленного способа позволяет получить более 150 тысяч саженцев в год от одного экспланта. 5 ил., 1 табл.

Способ регенерации микропобегов hyssopus officinalis l. в условиях in vitro // 2529837

Способ регенерации адвентивных микропобегов Hyssopus officinalis L. в условиях in vitro включает отделение листьевых дисков от микропобегов после 4-5 пассажа, полученных в культуре in vitro, дальнейшее культивирование их на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга с половинной концентрацией макроэлементов и дополненной веществом цитокининового типа действия, а именно тидиазуроном, при этом культивирование проводят при пониженной интенсивности освещения. 4 табл.

Способ повышения коэффициента размножения капусты белокочанной в условиях in vitro // 2538163

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции. Изобретение представляет собой способ повышения коэффициента размножения капусты белокочанной в условиях in vitro, включающий выращивание эксплантов, культирование их на питательной среде Мурасиге-Скуга, внесение в нее регуляторов роста тидиазурон в концентрации 1 мг/л в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой - 0,5 мг/л, при использовании цветолож размером 0,2-0,3 мм, изолированных из бутонов длиной 0,5-0,7 мм, где цветоложе используют за 1-2 дня до распускания цветков и после выращивания их на питательных средах культивируют до образования почек в течение 14-21 суток. Способ позволяет получить большое количество растений-регенерантов с признаками ЦМС и получить генетически стабильный урожай селекционных образцов. 3 табл.

Способ размножения гречихи in vitro // 2538167

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян. Семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов. Субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность процесса размножения микрорастений гречихи в условиях in vitro за счет его упрощения, ускорения, снижения затрат и увеличения выхода пробирочных растений. 3 табл.

Способ клонального микроразмножения винограда in vitro // 2538859

Изобретение относится к биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на питательную среду в присутствии ростовых веществ и культивирование, где высадку и культивирование осуществляют на твердой питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей в качестве росторегулирующего вещества препарат Мелафен в концентрации 10-7-10-11%. Заявляемый способ позволяет увеличить выход растений за счет эффективной приживаемости микрочеренков, хорошей регенерации, улучшения качественных показателей растений. 6 табл.

Способ клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции // 2541769

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения винограда in vitro с деконтаминацией от микоплазменной инфекции, включающий микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга без ростовых веществ и с уменьшенным количеством макроэлементов. При этом в состав питательной среды дополнительно вводится антибиотик гентамицин в два этапа: при первом субкультивировании гентамицин вводится в концентрациях 0,05-0,3 мл/л; при втором - в концентрациях 0,01-0,04 мл/л одновременно с введением препарата эмистим в разведении 10-6-10-12 мл/л. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность клонального микроразмножения растений винограда в культуре in vitro, повысить приживаемость и выход оздоровленных от микоплазм растений с улучшенным морфогенезом и качественными характеристиками. 7 табл.

Способ размножения копеечника чайного (hedysarum theinum krasnob.) // 2547593

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ размножения копеечника чайного, где вызревшие простерилизованные семена копеечника чайного (Hedysarum theinum Krasnob.) высаживают на питательные среды Мурасиге-Скуга для введения в культуру ткани, через 20-30 суток развившиеся побеги пересаживают на среды размножения MS, затем образовавшиеся конгломераты микропобегов делят и пересаживают на среды, содержащие 1,0 БАП+L-глютамин и аденин сульфат 100 мг/л. Растения-регенеранты размножают, укореняют и адаптируют к нестерильным условиям. Изобретение позволяет повысить эффективность процесса, тиражируемости, адаптации в условиях гидропоники и получить стандартные саженцы копеечника чайного. 4 ил., 1 табл.

Способ размножения гвоздики in vitro // 2553545

Изобретение относится к области садоводства и может быть использовано для микроразмножения растений гвоздики in vitro. Изобретение представляет собой способ размножения гвоздики in vitro, включающий отделение эксплантов, стерилизацию, посадку на питательную среду Мурасиге-Скуга, дополненную сахарозой 30 г/л и регуляторами роста 1 мг/л 6-бензиламинопурина и 0,2 мг/л нафтилуксусной кислоты, микроразмножение путем отделения побегов от эксплантов, их укоренение на питательной среде Мурасиге-Скуга и дальнейшее укоренение в грунте, отличающийся тем, что при микроразмножении экспланты укореняют на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга, дополненную Рибав-Экстра 0,01-0,1 мг/л, и укореняют в условиях ex vitro в грунте, состоящем из смеси дерновой земли - 50%, торфа низинного с перегноем - 30% и песка 20%. Изобретение позволяет упростить процесс микроразмножения. 1 табл.