Фитокомплекс из плодов бергамота, способ производства и применение в качестве пищевой добавки и в области фармакологии

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству с антидислипидемическим и обезболивающим эффектом. Способ получения фитокомплекса с антидислипидемическим и обезболивающим эффектом из плодов бергамота, включающий: a) перемалывание плодов бергамота без верхней кожицы и цедры с получением неразложившейся смеси, b) внесение в указанную смесь ферментов для разложения пектина; c) снижение содержания мякоти; d) инактивация указанных ферментов, добавленных на указанной стадии b), с получением разложившейся смеси; e) ультрафильтрация разложившейся смеси через мембраны, отсекающие вещества с молекулярной массой свыше 30000 Да, с получением прозрачного раствора; f) внесение прозрачного раствора на колонку для адсорбции полифенолов;g) промывание колонки с адсорбированными полифенолами водой и повышение рН, с получением водной полифенольной фракции; h) перенесение водной полифенольной фракции на катионную смолу с последующим извлечением фитокомплекса в водной фазе; i) высушивание фитокомплекса в водной фазе. Фитокомплекс в водной фазе с антидислипидемическим и обезболивающим эффектом. Фитокомплекс с антидислипидемическим и обезболивающим эффектом. Фармацевтическая композиция с антидислипидемическим эффектом, содержащая фитокомплекс и фармацевтически приемлемые добавки. Фармацевтическая композиция с обезболивающим эффектом для человека, содержащая фитокомплекс и фармацевтически приемлемые добавки. Вышеописанный фитокомплекс обладает выраженным антидислипидемическим и обезболивающим эффектом. 5 н. и 6 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к фитокомплексу (в частности, сухому экстракту), полученному из альбедо (белого подкожного слоя) плодов бергамота, способу его получения и его применению в области фармакологии и в качестве пищевой добавки. В случае применения посредством перорального приема фитокомплекс обладает отличительным свойством оказания нормализующего и регулирующего действия в отношении уровней холестерина, триглицеридов и глюкозы в крови, обладающих выраженным атерогенным эффектом. Эффективность такого действия представляется даже более интересной ввиду ее прямой зависимости от наличия в организме человека критических факторов, связанных с гипергликемией и избыточной массой тела (метаболическим синдромом). Кроме того, в тестах на животных фитокомплекс оказывает антиоксидантное/противовоспалительное действие, развивающееся совместно с обезболивающим эффектом как после перорального введения, так и в случае местного применения после нанесения на участки кожи с индуцированным воспалением. Наконец, согласно исследованиям, проведенным на линиях опухолевых клеток в культуре, фитокомплекс демонстрирует стойкую способность к подавлению пролиферации клеток.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бергамот (Citrus Bergamia Risso&Poiteau) представляет собой плодовое цитрусовое растение, произрастающее практически исключительно в ограниченных районах полуострова Калабрия, три наиболее известных разновидности которого названы соответственно Femminello, Fantastico и Castagnaro.

Известно, что среди многообразия цитрусовых плодов Калабрии бергамот является особенно драгоценным и нишевым продуктом. Фактически эти цитрусовые плоды произрастают на узкой полосе земли в провинции Реггио Калабрия, протянувшейся от южной стороны Тиррены до южной стороны Ионики, захватывая область пролива Мессина. Таким образом, это полоса протяженностью не более 150 км, пролегающая от непосредственно прибрежной зоны до района предгорья, находящегося в глубине Реггио Калабрия. До настоящего времени бергамот используется исключительно благодаря свойствам его эфирного масла, которое особенно востребовано в парфюмерии, как обладающее уникальным ароматом, и продолжает использоваться наиболее известными производителями парфюмерии в качестве основы для производства многочисленных марок духов, а также для производства "Acqua di Colonia". Это масло получают посредством отслаивания самого верхнего слоя (кожицы) кожуры бергамота.

Также известно, что бергамот обладает настолько выраженными антисептическими свойствами, что в течение многих лет продукт бергамота, Bergamon, производят и используют в качестве дезинфицирующего средства в операционных палатах. Кроме того, в традиционной медицине известны расслабляющие свойства экстрактов бергамота и его важные нутрицевтические свойства. Наконец, водно-спиртовой раствор эссенции бергамота используют для получения ряда продуктов (в частности, один из них называется Bergarytal), которые предлагаются в качестве спрея, обладающего противоотечным действием на коже и особенно эффективного в целях защиты от комаров. Однако обнаружение того, что некоторые компоненты эссенции бергамота, такие как бергаптен, потенциально проявляют токсическое действие, ограничило ее применение для поиска способов удаления этого составляющего с целью безопасного использования экстрактов эфирного масла.

В документе Gardana Claudio et al. "Evaluation of flavonoids and furanocumarins from Citrus Bergamia (Bergamot) juice and identification of new compounds" MOLECULES (Базель, Швейцария) 2008, т.13, №9, 18 сентября 2008 (2008-09-18), страницы 2220-2228 посвящены исключительно изучению содержания флавоноидов и фуранокумаринов в образце сока бергамота.

Патент WO2008/061536 (COSMEDICAL APS (Дания)) описывает, помимо прочего, композиции для лечения глазных болезней посредством композиций, содержащих также биофлавоноиды, и способ для выделения таких биофлавоноидов из бергамота. Такой способ не подразумевает использования пектинолитических ферментов или выделения с помощью катионных смол и не указывает на содержание фурокумарина в полученном продукте.

Статья Mandalari Giuseppina et al. "Enzymatic hydrolysis of flavonoids and pectic oligosaccharides from bergamot (Citrus bergamia Risso) peel" Journal of Agricultural and Food Chemistry, Американское химическое общество, Вашингтон, США т.54, №21, 1 октября 2006, страницы 8307-8313, описывает выделение флавоноидов и других соединений - производных кожуры плодов бергамота, при этом кожура расценивается в качестве побочного продукта производства эфирного масла.

Статья Gattuso Giuseppe et al. "Flavonoid glycosides in bergamot juice (Citrus bergamia Risso)" Journal of Agricultural and Food Chemistry, т.54, №11, май 2006, описывает исследование, проведенное с единственной целью разделения двух обработанных диметилформамидом гликозилированных флавоноидов, содержащихся в соке бергамота промышленного происхождения, или, другими словами, описывает растворитель, который может не найти своего применения в продуктах, представляющих интерес для медицины и/или косметологии.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что из плодов бергамота, в частности из альбедо, можно получать концентрированный фитокомплекс, проявляющий мощное лечебное действие за счет положительного влияния на метаболизм, а также за счет нормализации липидного и гликемического профилей у индивидуума, страдающего соответствующими заболеваниями. В плодах цитрусовых альбедо представляет собой слой, лежащий между эпидермисом, включающим цедру, и мякотью, он образован клетками трубчатой структуры, образующими настоящую сеть с заключением большей части объема ткани в межклеточном пространстве. Фитокомплекс, получаемый предпочтительно в виде сухого экстракта, благодаря специфическому способу выделения и очистки, характеризуется в своих компонентах существенным снижением (практически до полного удаления) содержания присутствующих в плодах и считающихся потенциально токсическими фурокумаринов (бергаптена и бергамоттина), но в то же время сохраняет и даже обладает усиленным описанным лечебным действием.

Таким образом, объект настоящего изобретения представляет собой способ, заявленный в пункте 1 формулы изобретения.

Способ будет подробнее описан в дальнейшем в настоящем документе.

Стадия а (перемалывание частично обезмасленного плода):

Плод, без самого наружного слоя (цедры) и частично обезмасленный для удаления верхней кожицы, измельчают предпочтительно посредством мельницы на маленькие полоски длиной менее 1 см.

Стадия b (уменьшение содержания пектина):

В смесь, полученную согласно пункту 1, вносят пригодные для разрушения пектина пектинолитические ферменты и спустя 20-40, предпочтительно 30 минут при температуре, зависящей от вида используемого фермента, получают более жидкий и, таким образом, лучше работающий продукт.

Стадия c (выделение волокнистого компонента из жидкой фракции):

Продукт согласно пункту 2 преимущественно посредством последовательного перенесения из фильтра-отстойника в центрифугу очищают до конечного содержания мякоти менее 0,5%.

Стадия d (инактивация пектинолитических ферментов):

Этого можно будет добиться путем пастеризации жидкости согласно пункту c, и в качестве сопутствующего эффекта пастеризация будет способствовать удалению значительной части оставшихся эфирных масел посредством их выпаривания.

Стадия e (осветление водного раствора):

Это достигается посредством способа ультрафильтрации на установке, оборудованной полупроницаемыми мембранами с селективной проницаемостью по молекулярному весу ниже 12000 Да (частицы с весом менее 12000 Да проходят через мембраны). Также возможен и составляет часть по изобретению вариант способа, в котором осветляющий эффект осуществляется посредством обработки бентонитовой глиной.

Стадия f (адсорбция прозрачного раствора на колонке, содержащей полистирольную адсорбирующую смолу):

Выделение полифенолов из оставшегося раствора производят посредством их захватывания порами полистирольный адсорбирующей смолы, имеющей поры с диаметром, равным 100-150 ангстрем (например, SEPEABEAD SP 207 Mitsubishi). Согласно варианту способа по изобретению полифенолы можно также выделять посредством смеси этилового или метилового спирта с этилацетатом в соотношении 3:1 и затем извлекать посредством последующего концентрирования растворителя (например, посредством выпаривания и дальнейшего высушивания).

Стадия g (извлечение фракции полифенолов, захваченных порами смолы согласно пункту f, и одновременное снижение содержание фурокумарина в сухом продукте до 400 мг/кг):

После промывания поверхности смолы горячей водой с температурой 40°C с целью удаления содержащихся в растворе после стадии 5 сахаров и кислот производят извлечение полифенольной фракции посредством раскрытия цикла органических соединений, характеризующихся кольцевой пространственной структурой, тем самым придавая им линейную конфигурацию для высвобождения из полостей, в которых они заключены. Такой эффект достигается посредством увеличения pH до сильноосновных значений (pH 12-14). Это производят предпочтительно за счет применения гидроксидов щелочных металлов, которые также разрушают бергаптен и бергамоттин. Подобного эффекта можно достичь в случае использования этилового или метилового спирта вместо раствора щелочи. В этом случае не будет происходить разрушение бергаптена и бергамоттина.

Стадия h (химическая стабилизация фитокомплекса в водной фазе): полифенолы в (открытой) линейной форме чрезвычайно нестабильны и обычно являются объектом окислительно-восстановительных реакций. Необходимо как можно быстрее вернуть их обратно в циклическое состояние. Такой результат получают посредством снижения pH со значения 14 до сильнокислотных значений (pH около 3). Такой эффект получают посредством удаления из раствора катионов K+, Na+ и т.д. Это осуществляют посредством применения сильных катионных смол (например, Relite CF H+ Mitsubishi). Они замещают существующие катионы положительно заряженными водородами (H+). Суммарный эффект заключается в закислении раствора до pH=3 и удалении катионов используемых гидроксидов щелочных металлов. Результатом является продукт, более ценный с точки зрения питательных свойств.

Стадия i (физическая стабилизация продукта; «высушивание»):

Этого достигают посредством удаления воды, преимущественно за счет выпаривания в высоком вакууме и затем при температуре ниже 60°C до полного высушивания (за счет достижения остаточной влажности ниже 14%). При таком значении влажности подавляется рост любых органических загрязнителей (дрожжей, бактерий и т.д.). Получают сухой продукт.

Необходимо подчеркнуть, что способ выделения и очистки позволяет существенным образом снижать содержание фурокумаринов (бергаптен и бергамоттин), создающих определенные проблемы ввиду их потенциальной токсичности, однако обнаруженной только на уровне их содержания в кожице и в существенно более высоких дозах, чем в соке.

Фитокомплекс по изобретению в виде сухого экстракта выглядит как мелкодисперсный, водорастворимый порошок с желто-коричневым цветом, характерным запахом и горьким вкусом. Его можно заключить в капсулу, поместить в оболочку, смешать с маслами для приготовления кремов и т.д. и, таким образом, объединить с фармацевтически пригодными наполнителями, обычными в составе пищевых добавок.

Дополнительным объектом по настоящему изобретению является фитокомплекс, предпочтительно в форме сухого экстракта, полученный из альбедо плода бергамота согласно способу по изобретению.

Авторы настоящего изобретения дополнительно установили - и это также составляет объект по изобретению, что фитокомплекс можно использовать в клинической практике и/или в качестве пищевой добавки, поскольку он содержит достаточное количество как питательных веществ (фолиевой кислоты, витаминов и т.д.), так и антиоксидантов (в частности, флавоноидов), которые позволяют применять его в качестве антидислипидемического и антиатерогенного средства. Также объектами по настоящему изобретению являются композиции сухого экстракта бергамота, которые, в зависимости от назначения в качестве антидислипидемического, и/или антиатерогенного, и/или противовоспалительного/обезболивающего местного и системного средства, и/или противоопухолевого препарата, содержат фитокомплекс по настоящему изобретению, преимущественно в виде сухого экстракта, совместно с добавками и/или наполнителями, широко применяемыми в фармацевтической промышленности.

Композиции можно применять как в жидких, так и в других формах - лиофилизат, гранулы, порошок. Было показано, что фитокомплекс оказывает свое лечебное воздействие на воспалительные заболевания кожи в случае местного применения, противовоспалительное/обезболивающее действие после системного введения экспериментальным животным и антипролиферативное действие на опухолевые клетки человека в культуре. Предпочтительно предлагаются дозировки в диапазоне от 20 до 40, преимущественно 30 мг/кг массы тела.

Дополнительными объектами по настоящему изобретению являются лечебные пищевые добавки антидислипидемического, и/или антиатерогенного типа, и/или для защиты сосудов, в зависимости от вспомогательных компонентов фитокомплекса по изобретению.

Фитокомплекс по настоящему изобретению представляет собой продукт натурального происхождения для пищевой добавки или фармацевтического препарата, демонстрирующего способность к нормализации уровней холестерина, жиров и глюкозы в крови посредством комбинированного эффекта подавления всасывания предшественников холестерина на уровне желудочно-кишечного тракта, происходящего благодаря наличию полифенольной фракции, а также подавления активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-СоА (HMG-CoA) редуктазы у млекопитающих.

Кроме того, при изучении эффектов фитокомплекса по изобретению в экспериментах на животных с целью доказательства отсутствия токсических эффектов было установлено полное сохранение в пределах нормы основных биохимических показателей крови (общий анализ крови, уровень печеночной трансаминазы, азотемия и гиперкреатинемия). Эти данные были подтверждены микроскопией аутопсийного материала получавших лечение животных, выявившей отсутствие жировой дистрофии или некротических явлений в печени и почках. Кроме того, патогистологическое исследование ткани мозга и периферических нервов подтвердило отсутствие индуцированных аксонопатий или миелинопатий. Изучение токсичности фитокомплекса показало следующий результат: «токсикологический анализ не выявил факторов токсичности согласно действующей нормативной базе». В частности, вместе с отсутствием обычных примесей цитрусовых плодов было также установлено отсутствие патологических концентраций или, по меньшей мере, значений, выходящих за пределы нормальных показателей, в отношении тяжелых металлов, пестицидов, полихлорированных дифенилов, нитритов и нитратов, красителей, плесени, наряду с отсутствием охранотоксинов, бактериальных эндотоксинов, анаэробных возбудителей и плесневых грибов. При исследовании органов морских свинок (печень, почки) после перорального введения количества вещества, равного 80 мг/кг массы тела/день, не обнаружили никакого токсического эффекта.

Следует подчеркнуть, что использование гидроксидов щелочных металлов, в частности KOH, в значительной мере снижает количество содержащихся фурокумаринов, и получаемые фитокомплексы представляются значительно более полноценными в функциональном отношении. Объект фитокомплекса по настоящему изобретению характеризуется биологической простотой полифенольного профиля, включающего основные биофлавоноиды в следующих соотношениях:

Неоэриоцитрин 29,6%+/-6,0
Нарингин 32,4%+/-4,0
Неоэсперидин 38,0%+/-6,0
Общее 100,0%

Согласно изобретению после стадии i способа получают фитокомплекс в виде сухого экстракта, который имеет минимальное содержание неоэриоцитрина, нарингина, неоэсперидина не ниже 250 г/кг, что составляет 25%. Кроме того, фурокумарины, под которыми подразумевают бергаптен и бергамоттин, присутствуют в концентрации, не превышающей 400 мг/кг.

В отличие от большинства экстрактов флавоноидов на рынке фитокомплекс по настоящему изобретению прекрасно растворим, помимо спирта, также и в воде при комнатной температуре (20°C). Дополнительные исследования сухого экстракта показали его эквивалентность с веществами, содержащимися в соке бергамота.

ПРИМЕРЫ

Эффекты фитокомплекса тестировали на 100 пациентах с простой семейной гиперхолистеринемией в сочетании с или без ассоциированной гипертриглицеридемии. Пациентов равным образом разделили на рандомизированные группы по половой принадлежности (48 мужчин и 52 женщин), средний возраст в которых составил от 45 до 70 лет. Пациентов классифицировали по уровням холестерина ЛНП (хЛНП) в крови согласно категориям риска, определенным Национальной образовательной программой по холестерину (NCEP ATP III) Национального института здоровья (NHI). Всем индивидуумам давали пилюли из расчета 500 мг/сут в течение 30 суток. Для выделения фитокомплекса использовали биологический род цитрусовых Bergamia Risso and Poiteau и использовали плоды культур Castagnaro, Femminello и Fantastico. Лечение продолжалось 1 месяц. Тем пациентам (32 из общей группы), которые на момент исследования принимали статины или другие антидислипидемические лекарственные средства, было предложено продолжать начатое лечение. По окончании лечения индивидуумов наблюдали в течение еще 30 дней после завершения приема фитокомплекса. Полученные данные демонстрируют следующие результаты:

1) У всех индивидуумов отмечалось снижение на 20-32% от уровней общего холестерина и ЛНП в плазме на фоне среднего повышения уровня холестерина ЛВП на 30%.

2) Индивидуумы с семейной гиперхолестеринемией, имеющие исходные уровни холестерина в плазме 230-280 мг/дл и получающие лечение только совместно с диетой, демонстрировали снижение уровня общего холестерина на 34±4%, уровня холестерина ЛНП на 32±5 и повышение уровня холестерина ЛВП на 28±3%.

3) Индивидуумы с семейной гиперхолестеринемией, имеющие исходные уровни холестерина в плазме 200-230 мг/дл и получающие лечение только совместно с диетой, демонстрировали снижение уровня общего холестерина в плазме на 28±4%, холестерина ЛНП на 22±2% и повышение уровня холестерина ЛВП на 24±5%.

4) Индивидуумы двух предыдущих групп, которые до этого принимали статины, демонстрировали дополнительное снижение уровня общего холестерина в плазме на 20±3%, холестерина ЛНП на 20±4% и повышение холестерина ЛВП на 15±3%.

5) Обследованные индивидуумы, имеющие смешанные формы дислипидемий (гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия) и которые составляли 40% от общей группы (40 из 100), демонстрировали снижение уровня триглицеридов в плазме на 38±6%.

6) Антидислипидемический эффект сохранялся на высоком уровне на 60^-- _--е сутки после прекращения приема фитокомплекса при значениях общего холестерина, составляющих в среднем 20±2% от исходных значений до лечения.

7) В конце исследования с помощью ультразвуковой допплерографии изучали реактивность эндотелия сосудов, которая показала у всех получавших лечение пациентов улучшение состояния в среднем 34±5% по сравнению с контрольными значениями.

8) У обследованных индивидуумов не было отмечено никаких существенных различий в отвечаемости на лечение в зависимости от пола и возраста. Кроме того, лечение не вызывало побочных эффектов или патологических различий в параметрах функционирования основных органов, выявляемых клинически или посредством биохимического анализа крови, наряду с достоверным понижением давления и уровня глюкозы в крови у индивидуумов с нарушениями метаболизма глюкозы (21%) или гипертензией (24% от общей группы).

9) Дополнительный эффект изучали в тестах на животных (крысы линии Wistar), у которых посредством введения каррагенина в лапу индуцировали болезненную воспалительную реакцию. У этих животных как местное, так и системное применение фитокомплекса бергамота вызывало уменьшение вызванной каррагенином местной отечной воспалительной реакции совместно со снижением гипералгезии.

10) Наконец, инкубация фитокомплекса по изобретению с клетками астроцитомы человека в культуре снижала пролиферацию клеток, тем самым указывая на его потенциальное применение в качестве противоопухолевого средства.

1. Способ получения фитокомплекса с антидислипидемическим и обезболивающим эффектом из плодов бергамота, включающий следующие стадии:
a) перемалывание плодов бергамота без верхней кожицы и цедры с получением неразложившейся смеси,
b) внесение в указанную смесь ферментов для разложения пектина;
c) снижение содержания мякоти в полученной на стадии b) указанной смеси до значений ниже 0,5%;
d) инактивация указанных ферментов, добавленных на указанной стадии b), с получением разложившейся смеси;
e) ультрафильтрация указанной разложившейся смеси через мембраны, отсекающие вещества с молекулярной массой свыше 30000 Да, с получением прозрачного раствора;
f) внесение прозрачного раствора, полученного на указанной стадии е) на колонку, содержащую полистирольную адсорбирующую смолу для адсорбции полифенолов;
g) промывание указанной колонки с адсорбированными полифенолами водой с температурой в пределах 30-50°С и повышение рН до значений в интервале 12-14 с использованием гидроксидов щелочных металлов, с получением водной полифенольной фракции;
h) перенесение указанной водной полифенольной фракции на катионную смолу с последующим извлечением путем снижения рН до значений ниже 3,0 с получением фитокомплекса в водной фазе;
i) высушивание фитокомплекса в водной фазе с получением фитокомплекса из плодов бергамота в виде сухого экстракта.

2. Способ по п.1, где указанные используемые плоды бергамота принадлежат к разновидностям Femminello, Fantastico и/или Castagnaro.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на указанной стадии b) указанные ферменты относятся к пектинолитическому типу.

4. Способ по п.1, где на указанной стадии е) указанный процесс осветления раствора осуществляют путем обработки бентонитом или путем естественного осаждения.

5. Способ по п.1, где на указанной стадии i) сухой экстракт имеет значения остаточной влажности <14%.

6. Способ по п.1, где после указанной стадии i) указанный сухой экстракт измельчают и/или дополнительно обрабатывают.

7. Фитокомплекс в водной фазе с антидислипидемическим и обезболивающим эффектом, полученный на стадии h) способа по п.1.

8. Фитокомплекс с антидислипидемическим и обезболивающим эффектом, полученный способом по любому из пп.1-6.

9. Фитокомплекс по п.8 в виде сухого экстракта, демонстрирующий минимальное содержание неоэриоцитрина, нарингина и неоэсперидина не ниже 250 г/кг.

10. Фармацевтическая композиция с антидислипидемическим эффектом, содержащая фитокомплекс по любому из пп.7 или 8 и фармацевтически приемлемые добавки.

11. Фармацевтическая композиция с обезболивающим эффектом для человека, содержащая фитокомплекс по любому из пп.7 или 8 и фармацевтически приемлемые добавки.