Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола



Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола
Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола
Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола
Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола
Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола

 


Владельцы патента RU 2523418:

Федеральное бюджетное учреждение науки "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (ФБУН "ФНЦ медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения") (RU)

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине и предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия фенола, поступающего из среды обитания, на здоровье населения. Для оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола производят отбор пробы крови и ее исследование с использованием опытного и контрольного образцов с предварительным введением в опытный образец токсиканта - фенола в концентрации, соответствующей его региональному фоновому уровню. В качестве критериальных показателей в способе используют индекс специфической чувствительности клеток для цитокина фактора некроза опухолей ФНО-α и индекс специфической чувствительности клеток для цитокина Интерлейкина-10 ИЛ-10, которые определяют следующим образом: опытную и контрольную пробы крови вносят во флакон со стерильной питательной средой ДМЕМ с гепарином и гентамицином в объемном соотношении 1:4 соответственно (в преимущественном варианте содержание в стерильной питательной среде ДМЕМ гепарина составляет 2,5 Ед/мл и гентамицина - 100 мкг/мл), осуществляют при 37°C в течение суток инкубацию этих проб, а затем центрифугирование в течение 3 минут при 1000 об/мин и в отобранном супернатанте опытной пробы определяют уровень фенол-индуцированной продукции цитокинов, а именно уровень ИПЦИЛ-10 фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень ИПЦФНО-α фенол-индуцированной продукции цитокина - фактора некроза опухолей ФНО-α, а в отобранном супернатанте контрольной пробы определяют уровень спонтанной продукции цитокинов, а именно уровень СПЦИЛ-10 спонтанной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень СПЦФНО-α спонтанной продукции цитокина ФНО-α, далее рассчитывают индекс ИСЧфно-α специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α, а также рассчитывают индекс ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 по следующим формулам:

ИСЧФНО-α=(ИПЦФНО-α-СПЦФНО-α):СПЦФНО-α,

ИСЧИЛ-10=(ИПЦИЛ-10-СПЦИЛ-10):СПЦИЛ-10,

где

ИПЦИЛ-10 - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10;

ИПЦФНО-α - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ФНО-α;

СПЦИЛ-10 - уровень спонтанной продукции цитокина ИЛ-10;

СПЦФНО-α - уровень спонтанной продукции цитокина ФНО-α;

и при выполнении одновременного условия ИСЧФНО-α более 10 и ИСЧИЛ-10 более 2 судят о нарушении клеточного иммунитета организма под воздействием фенола. Изобретение обеспечивает повышение достоверности установления оценки влияния фенола на нарушение клеточного иммунитета организма человека. 1 з.п. ф-лы, 8 табл.

 

Изобретение относится к биологическим исследованиям и медицине и предназначено для идентификации неблагоприятного воздействия фенола, поступающего из среды обитания, на здоровье населения, в частности, для установления степени вероятности возникновения изменений клеточного иммунитета населения в условиях неблагоприятной экологической обстановки, которая будет учитываться при проведении мероприятий социально-гигиенического мониторинга.

В настоящее время большое внимание уделяется проблеме изучения влияния вредных химических факторов на формирование здоровья населения. Иммунная система является основной защитной системой организма, которая контролирует поддержание гомеостаза внутренней среды и обеспечивает нормальное функционирование организма в целом.

Клеточный иммунитет - это такой тип иммунного ответа, в котором не участвуют ни антитела, ни система комплемента. В процессе клеточного иммунитета активируются макрофаги, натуральные киллеры, антиген-специфичные цитотоксические Т-лимфоциты, и в ответ на антиген выделяются цитокины («Википедия»). Иными словами клеточный иммунитет - это структурная часть иммунной системы, представляющая собой комплекс взаимодействующих клеток, связанных между собой внутренними регуляторными связями посредством цитокинов.

Цитокины - группа гормоноподобных белков и пептидов - синтезируются и секретируются клетками иммунной системы и другими типами клеток. Цитокины - это небольшие регуляторные пептиды, участвующие в иммунорегуляции, хеморегуляции и биорегуляции в целом, которые секретируются неэндокринными клетками (в основном, иммунными) и оказывают местное воздействие на соседние клетки-мишени.

Известен способ оценки влияния химических токсикантов, в частности фенола, на состояние иммунного статуса населения (Патент РФ №2180116). Согласно этому способу, устанавливают в пробе венозной крови содержание токсиканта, обусловленного экологической средой обитания населения, выделяют из пробы лимфоциты (мононуклеарные клетки) и добавляют к ним установленный токсикант в концентрации, соответствующей норме, полученную смесь инкубируют при температуре, соответствующей нормальной температуре организма человека, далее методом иммунологического анализа устанавливают в пробе количество лимфоцитов, содержащих дифференцировочные антигены, обусловленных воздействием токсиканта, и при снижении количества соответствующих кластеров лимфоцитов в пробе под воздействием токсиканта не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контрольной пробой без введенного в нее дополнительно токсиканта, при одновременном обнаружении токсиканта в пробе крови в концентрации, превышающей норму судят об ухудшении состояния иммунитета. Этот известный способ является наиболее близким к предлагаемому изобретению и использован в качестве прототипа.

Указанный известный способ повышает точность и достоверность установления оценки влияния химического токсиканта на состояние иммунного статуса населения.

В указанном известном способе анализируется динамика количества мононуклеарных клеток (лимфоцитов CD3 и CD4) после инкубации с референтной концентрацией токсиканта - фенола. Но это идентифицируемое количество указанных клеток не отражает их функционального состояния. Тогда как в предлагаемом способе спонтанный и, прежде всего, индуцированный уровень цитокинов демонстрирует функциональные возможности иммуноцитов и конкретизирует влияние на выработку цитокинов конкретного токсиканта - фенола. То есть в новом способе используются показатели более чувствительные по сравнению с клетками маркеров в известном способе. Эти показатели по цитокинам отражают не только и не столько количественное (как в известном способе), сколько качественное состояние иммунитета, т.е. его функционал.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в повышении достоверности установления оценки влияния фенола на нарушение клеточного иммунитета организма человека, за счет использования в качестве информативного критерия - уровень цитокинов клеток иммунной системы.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола, включающим отбор пробы крови, ее исследование с использованием опытного и контрольного образцов с предварительным введением в опытный образец токсиканта - фенола в концентрации, соответствующей его региональному фоновому уровню, и установление критериальных показателей, по которым судят о нарушении клеточного иммунитета, при этом новым является то, что в качестве метода исследования используют тесты ex vivo влияния токсиканта на продукцию цитокинов клетками иммунной системы, а в качестве критериальных показателей используют индекс специфической чувствительности клеток для цитокина фактора некроза опухолей ФНО-α и индекс специфической чувствительности клеток для цитокина Интерлейкина-10 ИЛ-10, которые определяют следующим образом: опытную и контрольную пробу крови вносят во флакон со стерильной питательной средой ДМЕМ с гепарином и гентамицином в объемном соотношении 1:4 соответственно, осуществляют при 37°C в течение суток инкубацию этих проб, а затем - центрифугирование в течение 3 минут при 1000 об/мин, и в отобранном супернатанте опытной пробы определяют уровень фенол-индуцированной продукции цитокинов, а именно уровень ИПЦИЛ-10 фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень ИПЦФНО-α фенол-индуцированной продукции цитокина - фактора некроза опухолей ФНО-α, а в отобранном супернатанте контрольной пробы определяют уровень спонтанной продукции цитокинов, а именно уровень СПЦил-10 спонтанной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень СПЦФНО-α спонтанной продукции цитокина ФНО-α, далее рассчитывают индекс ИСЧФНО-α специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α, а также рассчитывают индекс ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 по следующим формулам:

ИСЧФНО-α=(ИПЦФНО-α-СПЦФНО-α): СПЦФНО-α,

ИСЧИЛ-10=(ИПЦИЛ-10-СПЦИЛ-10): СПЦИЛ-10,

где:

ИПЦИЛ-10 - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10;

ИПЦФНО-α - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ФНО-α;

СПЦил-α - уровень спонтанной продукции цитокина ИЛ-10;

СПЦФНО-α - уровень спонтанной продукции цитокина ФНО-α;

и при выполнении одновременного условия ИСЧФНО-α более 10 и ИСЧИЛ-10 более 2 судят о нарушении клеточного иммунитета организма под воздействием фенола.

Содержание в стерильной питательной среде ДМЕМ гепарина составляет 2,5 Ед/мл и гентамицина - 100 мкг/мл.

Указанный технический результат обеспечивается за счет следующего.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала пробы венозной крови обеспечивается простота и надежность исследований, а также получение нужной информативности, т.к. главный информативный показатель - цитокины - играют главную роль в регуляции иммунного ответа. Цитокины - продуцируемые клетками крови белково-пептидные факторы, осуществляющие регуляцию межклеточных и межсистемных взаимодействий.

Большинство цитокинов являются растворимыми циркулирующими медиаторами и их концентрацию легко можно определить в биологических жидкостях. Полученные при этом данные отражают текущее состояние иммунной системы, тогда как в ситуациях, сопряженных с дефицитом или дисбалансом регуляторных факторов необходимо оценить способность клеток крови к секреции цитокинов. В последние годы для такого рода исследований широко используется метод ex vivo, в котором для анализа используют пробы цельной крови без выделения мононуклеарных клеток. Результаты определения уровня спонтанной продукции цитокинов при этом позволяют оценить активацию клеток крови в организме обследуемого, а установление уровня индуцированной продукции - их потенциальную способность к секреции цитокинов.

Химические факторы окружающей среды, оказывая влияние на регуляторные механизмы иммунной системы, могут выступать в качестве индукторов синтеза цитокинов мононуклеарными клетками крови. В связи с этим актуальным является исследование продукции цитокинов, стимулированной органическими соединениями, в частности, фенолом. Это позволяет воспроизвести и усилить функциональные реакции клеточной системы иммунитета ех vivo.

Фенолы - одна из наиболее распространенных в мегаполисах группа токсикантов, это выбросы химических предприятий, питьевая вода поверхностных водотоков, бытовые средства - моющие, чистящие и дезинфицирующие вещества, клеи, смолы, краски, лекарства (карболовая кислота, аспирин).

Для обоснования изобретательского уровня предлагаемого изобретения следует указать, что из уровня техники известен «Способ прогнозирования длительности периода антигенемии вируса клещевого энцефалита» (Патент РФ №2439566), согласно которому до введения противоклещевого иммуноглобулина у инфицированных лиц определяют уровень спонтанной и индуцированной митогеном продукции цитокинов IFN-γ и IL-4. В случае если уровень спонтанной продукции IFN-γ выше 59,7 пг/мл, а митоген-индуцированной - выше 122,2 пг/мл и уровень спонтанной продукции IL-4 ниже 23,5, а митоген-индуцированной ниже 25,3 пг/мл, прогнозируют быструю элиминацию антигена.

Указанный известный способ предполагает определение тяжести и длительности антигенемии путем оценки иммунологических показателей. При этом способ основан на изучении доминирующего участия Th1- или Th2-популяций лимфоцитов при развитии иммунного ответа на инфекцию через оценку спонтанного и индуцированного уровней продукции цитокинов с использованием универсального митогена - конканавалина А. Однако отличием предлагаемого способа является то, что в качестве митогена используется сам антиген (фенол), а по индуцированной продукции цитокинов можно судить о его непосредственном влиянии на клетки иммунной системы. Кроме того, использование цитокинового ряда в виде ФНО-α и ИЛ-10 в заявляемом способе позволяет провести оценку функционального состояния иммунитета не только с точки зрения соотношения Th1/Th2 (термины "Th1-цитокины" и "Тh2-цитокины" отражают происхождение цитокинов, секретируемых этими двумя популяциями Т-хелперов), но и с позиции детализации сочетания про-, противовоспалительных цитокинов и состояния факторов запрограммированной клеточной гибели, к которым относятся ФНО-α и ИЛ-10. Все это делает предлагаемый способ более точным и специфичным по идентификации иммунотропного эффекта конкретного антигена - фенола.

Благодаря тому, что при реализации заявляемого способа в опытную пробу дополнительно добавляют фенол в фоновой концентрации, т.е. концентрации, соответствующей региональной норме содержания фенола в крови, обеспечивается возможность усилить и идентифицировать эффект воздействия этого токсиканта на цитокины ex vivo, т.к. чем выше содержание этого токсиканта над нормальной, так называемой "допустимой", концентрацией (а это содержание на этапе идентификации в предлагаемом способе будет складываться из базового, ранее содержащегося в пробе крови фенола, и из дополнительно введенного фенола), тем значительнее повреждающее его действие на клетки иммунной системы, а значит, благодаря внесению фиксированной нетоксичной концентрации фенола, повысится точность определения влияния указанного токсиканта - фенола - на нарушение клеточного иммунитета.

Использование в предлагаемом способе в качестве сопоставительной базы контрольной пробы, без введенного в нее дополнительного фенола, позволяет с большой долей достоверности установить при сопоставлении данных опытной и контрольной проб влияние именно неблагоприятного экологического фактора - фенола - на нарушение клеточного иммунитета.

Использование в качестве метода исследования - иммуноферментного метода ех vivo позволяет воспроизвести условия in vivo, искусственно усилить их и количественно идентифицировать результат.

Выполнение исследования с использованием стерильной питательной среды ДМЕМ с гепарином и гентамицином, при заявленных режимах инкубации пробы крови и центрифугирования, позволяют получать супернатанты контрольного и опытного образцов для установления в них уровня спонтанной продукции цитокинов ФНО-α и уровня фенол-индуцированной продукции цитокинов Интерлейкина-10 (далее ИЛ-10) соответственно. Выбор показателей ФНО-α и ИЛ-10 обусловлен следующим.

ФНО-α- основной цитокин провоспалительного ряда является позитивным регулятором воспалительной реакции и пусковым фактором в цепи продукции цитокинов воспалительного каскада.

ИЛ-10 - противовоспалительный цитокин, тормозит пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и ингибирует клеточный иммунитет. Одновременное определение уровня как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов может в полной мере характеризовать интенсивность иммунного ответа и системность воспалительной реакции.

Использование при реализации предлагаемого способа двух индексов: ИСЧФНО-α - индекса специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α и ИСЧИЛ-10 - индекса специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 позволяет оценить состояние специфической чувствительности иммуноцитов к конкретному химическому токсиканту по интенсивности индуцированной экспрессии приоритетных для клеточного иммунитета цитокинов.

Экспериментальным путем было установлено, что при выполнении одновременного условия ИСЧФНО-α более 10 и ИСЧил-10 более 2 активность воздействия фенола на продукцию цитокинов клетками крови иммунной системы оценивается как повышенная, приводящая к нарушению клеточного иммунитета под воздействием фенола.

Предложенные диагностические (критериальные) индексы позволяют точечно ориентировать на характер нарушений в зависимости от конкретики и сочетания нарушений индуцированной экспрессии ФНО-α и ИЛ-10. Так как каждый из них несет уникальную функциональную ответственность в иммунной регуляции. ФНО-α - отвечает за контроль жизненного цикла клетки, прежде всего его финальной фазы - апоптоза (программированная клеточная гибель). ИЛ-10 - цитокин, при его повышенной экспрессии, курирующий атопические процессы - аллергия, аутоиммунитет.

Таким образом, оценка ex vivo предлагаемым способом позволит охарактеризовать иммунотропный эффект поступления фенола в организм из внешней среды на уровне всего организма в целом и принимать решения о коррекционных и профилактических мероприятиях по снижению экзогенной контаминации фенолом как на индивидуальном, так и на популяционном уровнях.

Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

1. 1 мл отобранной утром, натощак, периферической крови вносили во флакон, содержащий 4 мл стерильной питательной среды ДМЕМ с гепарином (2,5 Ед/мл) и гентамицином (100 мкг/мл).

2. Для определения фенол-индуцированной продукции цитокинов ФНО-α и ИЛ-10 клетками крови, 1 мл крови (опытная проба) в среде ДМЕМ инкубировали с референтной концентрацией фенола (0,05 мг/дм3) в течение суток при 37°C.

3. Для определения уровня спонтанной продукции исследуемых цитокинов клетками крови 1 мл крови (контрольная проба) в указанной среде ДМЕМ инкубировали при таких же условиях без добавления фенола.

4. После инкубации образцы указанных проб центрифугировали в течение 3 минут при 1000 об/мин.

5. Полученные супернатанты отбирали для определения уровня цитокинов ФНО-α и ИЛ-10. При этом в супернатанте опытной пробы определяли уровень фенол-индуцированной продукции цитокинов, а именно: уровень ИПЦИЛ-10 фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень ИПЦФНО-α фенол-индуцированной продукции цитокина - фактора некроза опухолей ФНО-α, а в отобранном супернатанте контрольной пробы определяли уровень спонтанной продукции цитокинов, а именно: уровень СПЦИЛ-10 спонтанной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень СПЦФНО-α спонтанной продукции цитокина ФНО-α.

6. Количественное определение исследуемых цитокинов проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа на микропланшетном анализаторе «Elx808IU» («Bio-Tek Instruments», США) с использованием иммуноферментных наборов реагентов альфа-ФНО-ИФА-БЕСТ, интерлейкин-10-ИФА-БЕСТ («Вектор-Бест», Россия).

7. Рассчитывали индекс специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α (ИСЧФНО-α) по отношению разницы уровня фенол-индуцированной и спонтанной продукции цитокина ФНО-α к уровню его спонтанной продукции

8.Рассчитывали индекс специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 (ИСЧИЛ-10) по отношению разницы уровня фенол-индуцированной и уровня спонтанной продукции цитокина ИЛ-10 к уровню спонтанной продукции цитокина ИЛ-10.

9. В тех опытах, где индекс ИСЧФНО-α был более 10 и одновременно ИСЧИЛ-10 был более 2, прогнозировали у пациентов нарушение клеточного иммунитета за счет повышенной активности воздействия фенола на продукцию цитокинов клетками крови иммунной системы. Используя эту информацию, в дальнейшем осуществляли в отношении пациентов дополнительные иммунологические исследования, а также элиминационные и корректирующие иммунитет программы.

В процессе экспериментов было обследовано 30 детей для доказательства правильности выбранных пределов вышеуказанных индексов, для характеристики степени влияния фенола на продукцию цитокинов клетками иммунной системы, за счет чего у пациентов диагностировали отклонения в иммунной регуляции клеточного иммунитета. Из указанных детей 15 чел. проживали на территории, измененной повышенной экспозицией фенолом, а 15 детей - из сельской местности, характеризующейся отсутствием техногенной (антропогенной) экспозиции фенолом.

В качестве группы населения были выбраны здоровые на момент обследования дети в возрасте 3-6 лет, постоянно проживающие на указанной территории. Выбор контингента предусматривал такой возрастной ценз обследуемых, который, с одной стороны, позволял до определенной степени избежать влияния на здоровье вредных привычек (например, курение), с другой стороны, обеспечивал необходимую для корректности исследования зрелость формирующейся иммунной системы. У всех детей была взята венозная кровь, исследование которой проводилось по вышеуказанной схеме.

Данные, полученные в результате исследований, приведены в таблицах 1-4.

В таблицах 1 и 3 приведены данные об индексе ИСЧФНО-α специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α и об индексе ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 соответственно для детей, проживающих на экологически благополучной территории и в крови которых концентрация фенола не превышала региональный фоновый показатель (<0,05±0,017).

В таблицах 2 и 4 приведены данные об индексе ИСЧФНО-α специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α и об индексе ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 соответственно для детей, проживающих на экологически неблагополучной территории и в крови которых концентрация фенола превышала региональный фоновый показатель (>0,05±0,017). Причем приведенные значения индуцированной продукции цитокинов и предлагаемых индексов достоверно отличались от аналогичных данных в группе детей, проживающих на территории без техногенной экспозиции фенолом (р<0,05).

Для обоснования пороговости индекса ИСЧФНО-α специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α и индекса ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10, которые бы характеризовали нарушение клеточного иммунитета, исходили из следующего принципа.

Для обоснования минимальных значений этих индексов использовали среднее число по показателям индексов двух детей из таблиц 1 и 13, в крови которых было установлено максимальное количество фенола (т.е. вредного действующего фактора) по сравнению с другими детьми из группы с содержанием фенола в крови на уровне региональных фоновых значений. Такой подход обусловлен тем, что при этом выбирается для этой группы детей максимально недействующая концентрация фенола, которая может характеризовать границу влияния этого химического фактора на возможный переход от здорового состояния к нарушению клеточного иммунитета у ребенка.

Исходя из приведенных данных было установлено следующее:

- минимальный индекс ИСЧФНО-α составляет величину 10 (данные таблицы 1 показывают, что у пациентов №1 и №13 содержание в крови фенола 0,067 и 0,059 мг/дм соответственно является наиболее высоким по сравнению с другими детьми. Индексы ИСЧФНО-α для указанных пациентов составляют величину 12,47 и 8,39 соответственно. Среднее значение индекса ИСЧФНО-α равно 10,43. Но принимая во внимание математическую погрешность, минимальное значение ИСЧфФНО-α выбирается равным 10. То есть при значении ИСЧФНО-α более 10 можно говорить о нарушении клеточного иммунитета на ранней стадии);

- минимальный индекс ИСЧИЛ-10 составляет величину 2 (данные таблицы 3 показывают, что у пациентов №1 и №13 содержание в крови фенола 0,067 и 0,059 мг/дм3 соответственно является наиболее высоким по сравнению с другими детьми. Индексы ИСЧИЛ-10 для указанных пациентов составляют величину 2,21 и 1,83 соответственно. Среднее значение индекса ИСЧИЛ-10 равно 2,02. Но, принимая во внимание математическую погрешность, минимальное значение ИСЧИЛ-10 выбирается равным 2. То есть при значении ИСЧИЛ-10 более 2 можно говорить о нарушении клеточного иммунитета организма на ранней стадии).

Таким образом, согласно предлагаемому способу, о нарушении клеточного иммунитета можно судить при выполнении одновременного условия: ИСЧФНО-α более 10 и ИСЧИЛ-10 более 2. В таблицах 2 и 4 приведены данные по указанным индексам для детей, которые характеризуются повышенным содержанием фенола в крови. У всех исследованных детей эти индексы достоверно выше указанных пороговых.

Повышенный индекс отношения индуцированной экспрессии цитокинов к спонтанной отражает степень экспозиции (концентрация) митогеном (стимулятором), в качестве которого в нашем случае выступает фенол. Чем выше имеющаяся нагрузка фенола в крови, тем выше определяемый индекс стимуляции продукции цитокинов.

Таким образом, рекомендуемые к определению индексы (их величины) позволяют диагностировать наличие, степень и направленность нарушений здоровья при экспозиции фенола по изменению самой чувствительной из систем - иммунной, и, в свою очередь, по изменению самых чувствительных показателей иммунной системы - продукции цитокинов.

Установленные значения индекса позволят не только определить степень выраженности интоксикации и нарушений клеточного иммунитета, но и вовремя провести лечебные и профилактические мероприятия как на индивидуальном (программа по детоксикации и иммуномодуляции), так и на популяционном уровнях (мероприятия на источниках и реабилитационные мероприятия в организованных и других группах населения).

Реализация способа основана на установленной закономерности - внесение фоновой (региональной) концентрации фенола в клеточную культуру будет индуцировать экспрессию цитокинов тем выраженнее, чем выше начальная концентрация фенола в крови, обусловленная экспозицией в месте проживания, а величина и характер индуцированных изменений будут отражать особенности иммунных нарушений на клеточном уровне.

Для доказательства воздействия фенола на нарушение клеточного иммунитета в таблицах 5-8 приведены данные по содержанию CD4-лимфоцитов, являющихся основными показателями клеточного иммунитета (Т-хелперы). Данные, приведенные в этих таблицах, показывают, что у детей, имеющих высокие уровни контаминации фенола и индексов ИСЧФНО-α и ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности (таблицы 6 и 8), наблюдается иммунодефицитное состояние по данному фактору, а достоверно значимый (р<0,05) средний уровень относительного (37,74±0,86 и 36,73±1,24) и абсолютного (1,10±0,09 и 1,17±0,09) содержания Т-хелперов у них достоверно ниже по сравнению с показателями (40,73±0,94 и 40,73±0,94) и (1,37±0,05 и 1,37±0,05) детей с содержанием фенола в крови, не превышающим референтную концентрацию (таблицы 5 и 7). А согласно сведениям, приведенным в книге «Иммунология» А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл, 2000, Т-хелперы (СD4-лимфоциты) являются общепринятым показателем клеточного иммунитета, снижение которого свидетельствует о состоянии иммунодефицита.

Следует отметить, что показатели по СD4-лимфоцитам (таблицы 5 -8) для всех детей не выходят за пределы нормы, т.к. определение нарушения клеточного иммунитета предлагаемым способом проводится на раннем этапе, на котором отсутствуют клинические проявления такого нарушения. Норма - понятие соответствующее здоровому состоянию организма, а показатели вне нормы соответствуют уже состоянию болезни, т.е. должны быть клинические проявления. Иммунные нарушения и иммунодефицитные состояния - своеобразная предболезнь. Согласно закону Либиха - есть состояние оптимума, а за его пределами - зоны стресса (показатели выше среднего и ниже среднего), которые ограничены двумя точками - пределами устойчивости, в сумме это и есть норма. Но зоны стресса или компенсации, пусть и входят в диапазон нормы, характеризуются опасностью перехода в разряд болезни или гибели. И поэтому, исходя из этого закона и того, что для обоснования доказательств в науке всегда оценивается разница объекта с воздействием (т.е. группа детей с неблагополучной в отношении фенола территории) с объектом вне такого воздействия (т.е. группа детей с территории без антропогенного воздействия фенола), было проведено сопоставление достоверно значимых показателей (р<0,05), характеризующих нарушения клеточного иммунитета у детей с экспозицией фенола, с детьми без этой экспозиции.

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам одного возраста и пола из группы детей с повышенным содержанием фенола в крови и с содержанием фенола в пределах фоновой концентрации.

Пример 1. Девочка, 4 года. Химико-аналитический анализ крови показал увеличение в крови фенола до 0,257 мг/дм3. Иммунологические показатели в анализе крови имели следующие значения: CD4+-лимфoциты - 32%; 1,29×109дм3 (норма 31-60% и 0,410-1,590×109дм3); CD3+-лимфоциты - 69%; 2,78×l09/дм3 (норма 55-84% и 0,690-2,540×l09дм3); СD3+CD8+-лимфоциты - 29%; l,17×l09/дм3 (норма 13-41% и 0,190-1.140×109/дм3); CD19+-лимфoциты - 16%; 0,65×109/дм3 (норма 6-25% и 0,090-0,660×109дм3); СD16+-лимфоциты - 7%; 0.28×109/дм3 (норма 5-27% и 0,090-0,590×109/дм3); CD3+CD95+-лимфoциты - 17%; 0,69×109/дм3; CD3+CD25+-лимфoциты - 4%; 0,16×109/дм3; IgG - 11,04 г/дм3 (норма 9,26-10,00 г/дм3); IgA - 0,90 г/дм3 (норма 0,98-1,12 г/дм3); IgM - 1,09 г/дм3 (норма 1,32-1,56 г/дм3). Установленные индексы ИСЧФНО-α и ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности были равны: ИСЧФНО-α=94,92; ИСЧИЛ-10=74,14. Анализируя представленные данные, необходимо отметить что представленный ребенок относился к группе длительно и часто болеющих детей (ОРЗ 3 раза в год, бронхопневмония в анамнезе), из чего можно сделать вывод, что у пациента имеются изменения в иммунной системе, в частности, иммунодефицитное состояние. Такой вывод подкрепляется тем, что наблюдается дефицит иммуноцитов с фенотипом хелперов (СD4+лимфоциты), функцией которых является продукция цитокинов, то есть участие в иммунной регуляции, а также активация факторов, повышение которых носит компенсаторный характер, не восполняющий дефекты иммунорегуляции (например, иммуноглобулины - IgG, IgM, IgA).

Пример 2. Девочка, 5 лет. В химико-аналитическом анализе крови показатель по фенолу ниже фоновых значений: 0,013 мг/дм3. В иммунологическом анализе значения показателей были следующими:CD4+-лимфoциты - 45%; l,09×10/дм3 (норма 31-60% и 0,410-l,590×109/дм3); СD3+-лимфоциты - 77%; 1,87×109/дм3 (норма 55-84% и 0.690-2,540×109/дм3); CD3+CD8+-лимфoциты - 27%; 0,66×109/дм3 (норма 13-41% и 0,190-1,140×109/дм3); CD19+-лимфоциты - 14%; 0,34×109/дм3 (норма 6-25% и 0,090-0,660×109/дм3); СD16+56+-лимфоциты - 5%; 0,12×109/дм3 (норма 5-27% и 0,090-0,590×109/дм3); CD3+CD95+-лимфoциты - 26%; 0,63×109/дм3; CD3+CD25+-лимфoциты - 6%; 0,15×109/дм3; IgG - 10,29 г/дм3 (норма 9,26-10,00 г/дм3); IgA - 0,92 г/дм3 (норма 0,98-1,12 г/дм3); IgM - 0,87 г/дм3 (норма 1,32-1,56 г/дм3). Установленные индексы ИСЧФНО-α и ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности были равны: ИСЧФНО-α=7,34; ИСЧИЛ-10=1,30. Анализируя представленные данные, необходимо отметить, что ребенок относится к 1 группе здоровья и за последний год не обращался к врачу по поводу острых заболеваний. Иммунологические показатели соответствуют возрастному диапазону нормы. Нарушение клеточного иммунитета отсутствует.

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа обеспечивается его назначение.

1. Способ оценки нарушений клеточного иммунитета при воздействии фенола, включающий отбор пробы крови, ее исследование с использованием опытного и контрольного образцов с предварительным введением в опытный образец токсиканта - фенола в концентрации, соответствующей его региональному фоновому уровню, и установление критериальных показателей, по которым судят о нарушении клеточного иммунитета, отличающийся тем, что в качестве метода исследования используют тесты ex vivo влияния токсиканта на продукцию цитокинов клетками иммунной системы, а в качестве критериальных показателей используют индекс специфической чувствительности клеток для цитокина фактора некроза опухолей ФНО-α и индекс специфической чувствительности клеток для цитокина Интерлейкина-10 ИЛ-10, которые определяют следующим образом: опытную и контрольную пробу крови вносят во флакон со стерильной питательной средой ДМЕМ с гепарином и гентамицином в объемном соотношении 1:4 соответственно, осуществляют при 37°C в течение суток инкубацию этих проб, а затем центрифугирование в течение 3 минут при 1000 об/мин и в отобранном супернатанте опытной пробы определяют уровень фенол-индуцированной продукции цитокинов, а именно уровень ИПЦИЛ-10 фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень ИПЦФНО-α фенол-индуцированной продукции цитокина - фактора некроза опухолей ФНО-α, а в отобранном супернатанте контрольной пробы определяют уровень спонтанной продукции цитокинов, а именно уровень СПЦИЛ-10 спонтанной продукции цитокина ИЛ-10 и уровень СПЦФНО-α спонтанной продукции цитокина ФНО-α, далее рассчитывают индекс ИСЧФНО-α специфической чувствительности клеток для цитокина ФНО-α, а также рассчитывают индекс ИСЧИЛ-10 специфической чувствительности клеток для цитокина ИЛ-10 по следующим формулам:
ИСЧФНО-α=(ИПЦФНО-α-СПЦФНО-α): СПЦФНО-α,
ИСЧИЛ-10=(ИПЦИЛ-10-СПЦИЛ-10): СПЦИЛ-10,
где
ИПЦИЛ-10 - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ИЛ-10;
ИПЦФНО-α - уровень фенол-индуцированной продукции цитокина ФНО-α;
СПЦИЛ-10 - уровень спонтанной продукции цитокина ИЛ-10;
СПЦФНО-α - уровень спонтанной продукции цитокина ФНО-α;
и при выполнении одновременного условия ИСЧФНО-α более 10 и ИСЧИЛ-10 более 2 судят о нарушении клеточного иммунитета организма под воздействием фенола.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что содержание в стерильной питательной среде ДМЕМ гепарина составляет 2,5 Ед/мл и гентамицина - 100 мкг/мл.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицине. Более подробно изобретение относится к диагностике ревматоидного артрита.
Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования наступления беременности у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в результате лечения методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Изобретение относится к иммунологии, аналитической биохимии и диагностике и представляет собой тест-полоску для высокочувствительного иммунохроматографического анализа.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено однодоменное мини-антитело, специфически связывающее белок-рецептор эпидермального фактора роста HER2/ERBB2/neu человека, полученное при иммунизации двугорбого верблюда (Camelus bactrianus) препаратом опухолевых клеток SKBR3, и охарактеризованное аминокислотной последовательностью.

Изобретение относится к диагностическим методам в медицине и может быть использовано в онкологии при адъювантной терапии опухолей, а также при длительном наблюдении за пациентами после оперативного удаления опухолей.
Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, гинекологии, биофизике, и касается способа оценки риска развития папилломавирус-ассоциированного канцерогенеза шейки матки.

Изобретение относится к медицине и касается способа выявления групп изоформ тканеспецифического транскрипционного фактора HNF4α в гепатоцеллюлярных карциномах человека.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гепатологии, и может использоваться для прогнозирования эффективности противовирусной терапии у взрослых больных хроническим гепатитом C с генотипом 1b.
Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням и пульмонологии, и может быть использовано для прогнозирования обострения бронхиальной астмы и муковисцидоза у детей при гриппе.

Изобретение относится к медицине, а именно, к области биохимических исследований в нефрологии и может быть использовано для диагностики нефротического синдрома с минимальными изменениями (НСМИ).

Группа изобретений относится к области медицины и может быть использована для получения костного мозга (КМ) от доноров-трупов. Для этого пунктируют крылья подвздошных костей в передней и задней трети крыльев, устанавливая в каждое по два троакара. Сбор КМ выполняют методом простой аспирации, аспирации-промыванием или их комбинированием при разряжении 0,6 Атм при помощи устройства. Устройство для заготовки КМ включает одноразовую многоканальную закрытую систему, модуль аспирации-накопления и модуль перфузии. Группа изобретений также относится к способу оценки заготовленного костного мозга. Использование данного способа получения костного мозга (КМ) обеспечивает заготовку стерильного богатого жизнеспособными мультипотентными мезенхимальными стромальными и гемопоэтическими прогенеторными клетками КМ, при этом результат достигается за счет автоматизации миелоаспирации, путем заготовки биоматериала специальным разработанным устройством для сбора КМ. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 1 пр., 1 ил., 1табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для лечения респираторного дистресс-синдрома у новорожденных детей, находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Для этого на фоне медикаментозной терапии дополнительно определяют уровень глютатионпероксидазы (GSH-Px-3) и, если ее значение менее 2,41 мкмоль/л, в комплекс лечения включают препарат «Селеназа» из расчета 10 мкг/кг/сут, 1 раз/день внутривенно струйно медленно, в течение 10 дней. Способ позволяет повысить выживаемость при снижении числа осложнений и сокращении сроков лечения за счет снижения тяжести течения оксидативного стресса и повышения антиоксидантной защиты организма.1 табл.,3 пр.
Изобретение относится к медицине, в частности к области лабораторной диагностики рака молочной железы, и описывает набор реагентов для иммунногистохимической диагностики рака молочной железы, который позволяет одновременно или раздельно выявлять рецепторы эстрогена, прогестерона и HER2-рецепторы. Набор реагентов включает в себя раствор для обеспечения биодоступности антигена, блокирующий раствор пероксидазы хрена, белковый блокирующий раствор, промывочный раствор, раствор первичных антител HER2-рецепторам, раствор первичных антител к рецепторам эстрогена, раствор первичных антител к рецепторам прогестерона, раствор антивидовых вторичных антител к первичным антителам, раствор стрептавидин-пероксидазы хрена, диаминбензидин, субстратный раствор, отрицательный контрольный образец, три положительных контрольных образца рака молочной железы для определения HER2, рецепторов эстрогена, рецепторов прогестерона. Набор реагентов по данному изобретению обладает повышенной чувствительностью и специфичностью. Изобретение может быть использовано в медицинских лабораториях и научно-исследовательских институтах. 3 пр., 4 табл.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложен L-фукоза α1→6-специфичный лектин, экстрагируемый из базидиального гриба или сумчатого гриба, характеризующийся пиковым значением молекулярной массы около 4500 m/z, определяемым при масс-спектрометрическом анализе MALDI-TOF. Новый L-фукоза α1→6-специфичный лектин обладает высоким сродством к L-фукоза α1→6 сахарной цепи, определяемым константой ассоциации 1,0×104 М-1 или более (при 25ºС), и имеет константу ассоциации 1,0×103 М-1 или менее (при 25ºС) с высокоманнозными сахарными цепями и/или гликолипидами, не содержащими L-фукоза α1→6 сахарную цепь. В одном варианте предложенный L-фукоза α1→6 специфичный лектин представляет собой белок или пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO:2-6. L-фукоза α1→6-специфичный лектин используют для специфического обнаружения L-фукоза α1→6 сахарной цепи и эффективной очистки L-фукоза α1→6 сахарной цепи или сахарной цепи, не содержащей L-фукозу α1→6. 6 н. и 10 з.п. ф-лы, 38 ил., 8 табл., 4 пр.
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Описан химерный пестивирус, где указанный химерный пестивирус включает вирус диареи крупного рогатого скота, который не экспрессирует его гомологичный Erns белок. При этом указанный химерный пестивирус экспрессирует гетерологичный Erns белок, происходящий из другого пестивируса, или природный, синтетический или генетический вариант указанного гетерологичного Erns белка. Также описаны способы и наборы для лечения или предупреждения распространения инфекции, вызванной вирусом диареи крупного рогатого скота, а также способы и наборы для дифференцировки между вакцинированными животными и животными, инфицированными вирусом дикого типа. Изобретение может быть использовано в качестве иммуногенных композиций и вакцин в животноводстве. 12 н. и 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 5 пр.

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, и может быть использовано для диагностики ранней стадии ревматоидного артрита. Для этого производят забор у пациента одновременно образцов костного мозга и синовиальной оболочки, из которых готовят препараты для иммуногистохимического и иммуноцитохимического исследований. После чего определяют долю клеток, синтезирующих белок Mdm2, по формуле: А И M d m 2 = N M d m 2 ⋅ 100 N о б щ , где АИMdm2 - доля клеток, синтезирующих белок Mdm2, %; NMdm2 - количество клеток, синтезирующих белок Mdm2; Noбщ - общее число клеток в поле зрения. В случае, когда в образцах синовиальной оболочки АИMdm2=81,6-88,8%, а в образцах костного мозга АИMdm2=85,0-89,2%, у пациента диагностируют раннюю стадию ревматоидного артрита. Использование данного способа позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии и назначить адекватную базисную терапию для лечения и замедления прогрессирования ревматоидного артрита. 3 пр., 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки чувствительности сосудистого эндотелия к напряжению сдвига. Способ заключается в следующем: до и после окклюзионной пробы определяют уровень нитритов и эндотелина в крови. Чувствительность сосудистого эндотелия к напряжению сдвига определяют по величине коэффициента index(e), который вычисляют по формуле. При величине коэффициента index(e) меньше или равной 0,5 чувствительность сосудистого эндотелия к напряжению сдвига оценивают сниженной, а при величине index(e) больше 0,5 - нормальной. Способ позволяет определить реальное соотношение продуцируемых сосудистым эндотелием вазоактивных факторов (нитритов и эндотелина) при изменении напряжения сдвига, что дает возможность оценить эффективность лечения больных сосудистой патологией непосредственно в процессе лечения. 3 пр.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам оценки влияния неблагоприятных химических факторов антропогенного происхождения на изменение поствакцинального иммунитета у детей к дифтерии. Изобретение включает следующие стадии: на территории проживания определяют перечень химических веществ-загрязнителей среды обитания, для которых иммунная система является мишенью, далее для установленных веществ-загрязнителей осуществляют оценку риска развития нарушений со стороны иммунной системы по критерию индекса опасности HI более 1,0 и проводят отбор проживающих в указанных условиях детей, которым была выполнена плановая вакцинация и/или ревакцинация вакциной АКДС - адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной, и у которых отсутствуют заболевания иммунной системы. Затем у указанных детей выполняют отбор пробы крови, в пробе устанавливают количество выбранных химических веществ-загрязнителей среды обитания и выделяют лиц, у которых это количество превышает фоновый региональный уровень не менее чем на 20%, и в сыворотке крови выбранных лиц методом иммуноферментного анализа со специфическими тест-системами определяют количество поствакцинальных антител класса иммуноглобулина G IgG к дифтерийному анатоксину. Из них выделяют лиц, у которых это количество ниже протективного уровня, устанавливают для этих лиц корреляционную связь снижения количества указанных антител от содержания в крови выбранных химических веществ и при одновременном установлении достоверных зависимостей: повышенное содержание в крови ребенка свинца более 0,04 мг/дм3 и o-крезола более 0 мг/дм3 и пониженное по сравнению с протективным уровнем количество поствакциональных антител класса IgG к дифтерийному анатоксину, диагностируют снижение поствакцинального иммунитета ребенка к дифтерии. Применение изобретения позволяет обеспечить достоверную диагностику нарушения поствакционального иммунитета у детей, подверженных воздействию химических токсикантов среды обитания. 2 ил., 4 табл.

Изобретение относится к способу ранней детекции мышечных дегенеративных заболеваний и к способу прогнозирования и/или определения терапевтической эффективности терапевтического средства и/или способа терапии заболеваний посредством измерения тетранор-PGDM (11,15-диоксо-9α-гидрокси-2,3,4,5-тетранорпростан-1,20-диовой кислоты) в образце мочи субъекта и сравнения его содержания относительно образца, выделенного у здорового индивидуума. Мышечное дегенеративное заболевание у пациента обнаружено, если концентрация или содержание тетранор-PGDM в образце, выделенном у пациента, превышает концентрацию или содержание тетранор-PGDM в образце, выделенном у здорового индивидуума. Определяют эффективность терапевтического средства и/или способа терапии мышечного дегенеративного заболевания путем сравнения содержания тетранор-PGDM в образце, выделенном у пациента с мышечным дегенеративным заболеванием до и после введения терапевтического средства. Если измеренное содержание тетранор-PGDM в образце значительно или незначительно уменьшается после введения терапевтического средства, то способ терапии является эффективным. Изобретение также относится к набору для диагностики мышечных дегенеративных заболеваний, который включает антитело к тетранор-PGDM, меченный тетранор-PGDM и, необязательно, по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из антитела к иммуноглобулину, разбавляющего раствора для образца, разбавляющего раствора для антитела и меченного тетранор-PGDM, стандарта тетранор-PGDM известной концентрации, субстрата для иммуноферментного анализа и останавливающего раствора для иммуноферментного анализа. Изобретение является эффективным и простым в исполнении. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр., 2 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к области медицинской диагностики, и описывает способ диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования и выявления экспрессии антигена микобактерии туберкулеза. Способ характеризуется тем, что исследование биологического материала, нанесенного на предметное стекло, проводится с помощью модифицированного иммуноцитогистохимического метода и включает следующие стадии: получение биологического материала: мазков/соскобов, клеточных осадков биологических жидкостей, фиксацию их в ацетоне; обработку 1% раствором бихромата калия; обработку 3% раствором перекиси водорода; нанесение моноклональных антител к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20; инкубацию при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов; нанесение системы детекции EnVision и инкубацию при комнатной температуре; нанесение диаминобензидина; докрашивание гематоксилином; заключение в бальзам или другую среду, микроскопирование, диагностирование заболевания при выявлении антигена микобактерии туберкулез. Способ обеспечивает повышение точности выявления антигена микобактерии туберкулеза, уменьшение стоимости диагностики и возможность его применения в практическом здравоохранении. 2 ил.
Наверх