Вакцина для защиты от lawsonia intracellularis
Группа изобретений относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использована для применения композиции для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis. Для этого применяют неживую композиции, содержащую углевод, который также обнаруживается в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток. Вакцина находится в форме, подходящей для внутримышечного введения, и включает в себя адъювант типа «масло в воде», содержащей капли масла со средним размером около 400 нм. Использованием данной неживой композиции приводит к эффективной иммунизации при внутримышечном введении с применением небольших капель адъюванта типа «масло в воде», что обеспечивает защиту животных от Lawsonia intracellularis. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 9 табл., 4 пр.
Данное изобретение относится к вакцине для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis, вакцине, в указанном смысле представляющей собой композицию, которая, по меньшей мере, обеспечивает снижение негативного влияния инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis, где указанное негативное влияние представляет собой, например, повреждение тканей и/или клинические признаки, такие как снижение прироста массы, диарея и т.д.
Пролиферативная энтеропатия (также называемая энтеритом или илеитом) у многих животных, в особенности у свиней, представляет собой клинический признак или патологический синдром с гиперплазией незрелых эпителиальных клеток крипт слизистой оболочки, главным образом в терминальном отделе подвздошной кишки. Другие участки кишечника, которые могут быть поражены, включают в себя тонкую кишку, слепую кишку и толстую кишку. Поражаются, главным образом, поросята-отъемыши и молодые взрослые свиньи с типичным клиническим проявлением быстрой потери массы и дегидратации. Природное клиническое заболевание свиней встречается повсеместно. Заболевание неизменно ассоциировано с присутствием внутриклеточной бактерии изогнутой формы, в настоящее время известной как Lawsonia intracellularis.
В целом показано, что пероральная вакцинация против Lawsonia intracellularis является экономически эффективной мерой контролирования илеита и обеспечения наилучшего использования генетического потенциала роста свиньи (Porcine Proliferative Enteropathy Technical manual 3.0, July 2006; доступно в Boehringer Ingelheim). Кроме того, пероральная вакцинация скорее, чем парентеральная, уменьшает передачу переносимых с кровью инфекций, таких как PRRS, через многоразовые иглы и обеспечивает уменьшение побочных реакций от инъекций и числа игл, оставляемых в теле животного. Пероральная вакцинация снижает стресс у животного и у человека, время, затраты на оплату труда и усилия, по сравнению с индивидуальной вакцинацией (McOrist: "Ileitis - One Pathogen, Several Diseases" at the IPVS Ileitis Symposium in Hamburg, June 28th, 2004).
В целом, само собой разумеется, что преимущество подхода с использованием ослабленной живой вакцины состоит в том, что эффективность иммунитета обычно является сравнительно хорошей, поскольку иммунная система хозяина подвергается воздействию всех антигенных свойств микроорганизма более "естественным" образом. Считают, в частности, что для внутриклеточных бактериальных агентов, таких как Lawsonia intracellularis, подход с использованием живой ослабленной вакцины обеспечивает наилучшую доступную защиту вакцинированных животных благодаря полному и адекватному Т-клеточному иммунному ответу. Указанный иммунный ответ отличается с вариациями от слабого иммунитета, ассоциированного с типами субъединичной или убитой вакцины против внутриклеточных бактерий. Данное утверждение также является верным, в частности, для облигатных внутриклеточных бактерий, таких как Lawsonia intracellularis или Chlamydia sp, которые вызывают патогенные инфекции слизистой оболочки. Исследования показывают, что полные живые ослабленные формы обсуждаемых внутриклеточных бактерий наилучшим образом доставляются к мишени - слизистой оболочке, что они необходимы в виде целых живых бактериальных форм для получения полностью защищающего иммунного ответа мишени - слизистой оболочки, и также что они иммунологически лучше вакцин, приготовленных с использованием отдельных бактериальных компонентов.
Стало общепринятой практикой, что вакцину против Lawsonia intracellularis следует вводить перорально (см. Technical Manual 3.0, как указано в настоящем документе выше). Указанный путь введения обусловлен тем фактом, что основой устойчивости организма к илеиту является местный иммунитет кишечника, который представляет собой продукт клеточно-опосредованного иммунитета и местной обороны посредством антител, в особенности IgA. Согласно современным данным сывороточные антитела (IgG) не обеспечивают защиту, просто потому что они не достигают просвета кишечника. В исследованиях было показано, что пероральная вакцинация вызывает клеточный иммунитет, а также местную продукцию IgA в кишечнике (Murtaugh, in Agrar- und Veterinar-Akademie, Nutztierpraxis Aktuell, Ausgabe 9, Juni 2004; and Hyland et al. in Veterinary Immunology and lmmunopathology 102 (2004) 329-338). Напротив, внутримышечное введение не приводит к формированию защиты. Кроме того, наряду с общепринятым представлением, что удачная вакцина против внутриклеточных бактерий должна индуцировать клеточный иммунитет, а также продукцию местных антител, специалисту в данной области техники известно, что только очень небольшой процент перорально поступивших антигенов действительно абсорбируется энтероцитами, и что внедрение Lawsonia intracellularis внутрь клетки является активным процессом, инициируемым бактерией. Таким образом, инактивированная вакцина обеспечивала бы кишечник неполным иммуногенным антигеном (Haesebrouck et al. in Veterinary Microbiology 100 (2004) 255-268). Поэтому полагают, что только ослабленные живые вакцины индуцируют достаточную клеточно-опосредованную защиту клеток кишечника (см. Technical Manual 3.0, как отмечено в настоящем документе выше). В настоящее время на рынке представлена только одна вакцина для защиты от Lawsonia intracellularis, а именно Enterisol® Ileitis, предлагаемая Boehringer Ingelheim. Указанная вакцина действительно представляет собой живую вакцину для перорального введения.
Задачей настоящего изобретения является предоставление альтернативной вакцины для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis. С этой целью разработали для использования неживую композицию, содержащую углевод, указанный углевод также обнаружен в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток, при производстве вакцины для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis, вакцина находится в форме, подходящей для системного введения. Неожиданно, вопреки устойчивому общепринятому представлению о том, как бороться с Lawsonia intracellularis, обнаружили, что при использовании неживой композиии, содержащей углевод, например, экстрагированный из внешней клеточной мембраны Lawsonia intracellularis, в качестве антигена в вакцине, углевод может индуцировать защиту от Lawsonia intracellularis, которая аналогична или превосходит защиту, обеспечиваемую с помощью живой вакцины Enterisol® Ileitis (вводимой согласно соответствующим инструкциям), если антиген вводят системно, т.е. способом, при котором он достигает системы кровообращения организма (включая сердечно-сосудистую и лимфатическую систему), воздействуя, таким образом, на организм в целом, а не на определенный участок, например на желудочно-кишечный тракт. Системное введение может быть осуществлено, например, путем введения антигенов в мышечную ткань (внутримышечно), в кожу (внутрикожно), под кожу (подкожно), под слизистую (субмукозно), в вены (внутривенно) и т.д. Помимо получения хорошей защиты, важным преимуществом настоящей неживой вакцины является то, что она обладает пресущей внутренней безопасностью, по сравнению с живой вакциной.
В целом, композиция, содержащая углевод, может быть применена для производства вакцины с помощью известных в данной области техники способов, которые, в основном, включают в себя смешивание композиции, содержащей антигенный углевод (или композиции, полученной из нее, например, разведение или концентрат оригинальной композиции или экстракт, один или более очищенных компонентов и т.д.) с фармацевтически приемлемым носителем, например с жидким носителем, таким как (при желании забуференная) вода или с твердым носителем, таким как носитель, обычно используемый для получения лиофилизированных вакцин. По существу производство вакцины может происходить в промышленной среде, но также антигены могут быть смешаны с другими компонентами вакцины in situ (т.е. у ветеринаров, на ферме и т.д.), например, (непосредственно) перед фактическим введением животному. В вакцине антигены должны быть представлены в иммунологически эффективном количестве, т.е. в количестве, способном стимулировать иммунную систему мишени - животного по меньшей мере для снижения отрицательных эффектов после вакцинации при контрольном заражении микроорганизмами дикого типа. По желанию другие вещества, такие как адъюванты, стабилизаторы, модификаторы вязкости или другие компоненты добавляют в зависимости от предполагаемого использования или требуемых свойств вакцины. Для системной вакцинации подходят многие формы, в особенности жидкие препараты (с растворенными, эмульгированными или суспендированными антигенами), а также твердые препараты, такие как импланты, или промежуточная форма, такая как твердый носитель для антигена, суспендированного в жидкости. Системная вакцинация, в особенности парентеральная вакцинация (т.е. не через пищеварительный тракт), и подходящие (физические) формы вакцин для системной вакцинации известны уже более 200 лет.
Отмечают, что субъединицы клеток Lawsonia intracellularis описаны в качестве антигенов в вакцине для защиты от указанной бактерии. Однако указанные антигены представляют собой преимущественно рекомбинантные белки и до настоящего времени ни один из них не был способен обеспечить хорошую защиту. Убитые бактерии (которые по своей природе содержат углевод, который также обнаруживают в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной) также предложены в качестве антигенов в вакцинах против Lawsonia intracellularis, но фактически вакцины на основе убитых целых клеток не были тестированы и описаны для обеспечения хорошей защиты. Помимо этого системное введение не использовали в сочетании с указанными убитыми клетками, исходя из общего представления, что нет достаточных оснований для успешного системного введения антигенов для местного (т.е. в кишечнике) противодействия Lawsonia intracellularis.
В связи с этим отмечается, что в WO 97/20050 (Daratech PTY Ltd) упоминается использование убитых бактерий Lawsonia intracellularis для иммунизации свиней. Однако системное введение не упоминается. Исходя из современных знаний об эффективности вакцинации только после перорального введения, обычно понимают, что пероральный путь был путем введения, выбранным для экспериментов, описанных в патентной заявке Daratech. Другой патентной заявкой, в которой упоминаются убитые бактерии, является WO 2005/011731 (Boehringer Ingelheim). Однако фактически раскрытым является только применение живой вакцины, вводимой перорально. Не показано, что убитая вакцина может быть эффективной, тем более что убитая вакцина может быть введена системно. EP 843818 (Boehringer Ingelheim) описывает внутримышечное введение убитой вакцины (параграф [01 15] в сочетании с параграфом [01 19]). В параграфе [01 15] утверждается, что бактерии убивали путем их хранения при 4°C при нормальных атмосферных условиях. Однако общеизвестно, что при указанных условиях бактерии Lawsonia intracellularis остаются живыми. Таким образом, указанный документ не сообщает о предмете рассмотрения настоящего изобретения. Также отмечается, что композиция, содержащая углевод, где углевод также обнаруживают в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток, известна из Kroll et al. (Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, June 2005, 693-699). Однако указанную композицию используют для диагностики. Указанную композицию не тестировали в качестве защитного антигена по причинам, которые изложены выше.
В одном из вариантов осуществления содержащая углевод композиция представляет собой материал, полученный при уничтожении бактерий Lawsonia intracellularis. Обнаружили, что очень удобным способом получения углевода для применения по настоящему изобретению является уничтожение клеток Lawsonia intracellularis и применение полученного в результате материала в качестве источника углевода. Теоретически также возможно экстрагирование углевода из живых клеток (аналогично получению "теней" живых клеток путем удаления клеточной стенки), но оно требует более сложных и, следовательно, более дорогих технологий. Материал может быть использован в целом виде, например в виде суспензии целых клеток, или в виде лизата клеток Lawsonia intracellularis, или углевод может быть очищен или даже выделен из материала. Указанный способ может быть осуществлен путем использования относительно простых технологий, известных в данной области техники.
В предпочтительном воплощении композиция, содержащая углевод, содержит целые клетки убитых бактерий Lawsonia intracellularis. Доказано, что указанная композиция представляет собой наиболее удобный способ предоставления углевода в качестве антигена в вакцине. Кроме того, эффективность вакцины еще более увеличивается, возможно, в связи с тем, что представление антигена иммунной системе животного-мишени наилучшим образом имитирует природное окружение углевода.
В воплощении вакцина содержит адъювант типа "масло в воде", содержащий капли масла субмикронного размера. В целом, адъювант представляет собой неспецифический иммуностимулирующий агент. В принципе, любое вещество, которое способно поддерживать или усиливать определенный процесс в каскаде иммунологических событий, приводящих в конечном итоге к усилению иммунологического ответа (т.е. интегральный системный ответ на антиген, в особенности ответ, опосредованный лимфоцитами и обычно включающий в себя распознавание антигенов специфическими антителами или предварительно сенсибилизированными лимфоцитами), может быть обозначено как адъювант. Показано, что использование адъюванта типа "масло в воде", содержащего капли масла субмикронного размера, обеспечивает очень хорошую защиту от Lawsonia intracellularis. Действительно, включение масла в водные адъюванты по существу обычно применительно к неживым антигенам. Однако, в целом, известно, что наилучшие иммуностимулирующие свойства получают, если капли масла имеют большой диаметр. В частности, капли масла диаметром менее 1 микрометра применяют, если полагают, что важным вопросом является безопасность. В таком случае можно было бы использовать небольшие капли, поскольку известно, что они вызывают меньше повреждений тканей, клинических симптомов и т.д. Однако в случае получения защиты от заболевания, ассоциированного с кишечником, с помощью системной вакцинации (как в случае настоящего изобретения), можно было бы выбрать большие капли, поскольку предполагалось бы, что иммунный ответ значительно усилился. Напротив, авторы изобретения обнаружили, что применение небольших капель масла в композиции обеспечивало очень хорошие результаты в отношении защиты от Lawsonia intracellularis.
В еще одном предпочтительном воплощении адъювант включает в себя капли биодеградируемого масла и капли минерального масла, капли биодеградируемого масла имеют средний размер, который отличается от среднего размера капель минерального масла. Показано, что применение смеси биодеградируемого масла и минерального масла дает очень хорошие результаты в отношении эффективности и безопасности. В дополнение к этому, стабильность композиции очень высока, что является важным экономическим преимуществом. Доказано, что стабильность является очень хорошей, в особенности если средний размер (взвешенный по объему) капель биодеградируемого масла или минерального масла составляет менее 500 нм (предпочтительно около 400 нм).
В воплощении вакцина далее включает в себя антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней. Ранее комбинированные вакцины Lawsonia intracellularis были предложены в известном уровне техники. Однако немногие из таких комбинаций действительно были проверены на эффективность. Причиной этого является то, что, в целом, понимают, что комбинация антигенов с антигенами Lawsonia intracellularis может привести к успешной защите, только если антигены Lawsonia представлены в виде живых (ослабленных) клеток. В связи с этим авторы изобретения ссылаются на WO 2005/011731, который также предлагает все виды комбинированных вакцин на основе Lawsonia intracellularis. Однако принимая во внимание структуру описания и формулы патентной заявки, патентовладелец (Boehringer Ingelheim), по-видимому, уверен, что комбинированные вакцины только предположительно имеют обоснованный шанс на успех, если антигены Lawsonia представлены в них в виде живых клеток. Данное утверждение справедливо и для WO 2006/099561, также закрепленной за Boehringer Ingelheim. Действительно, исходя из общедоступных сведений, вышеуказанное мнение является очевидным соображением.
Далее изобретение будет объяснено с использованием следующих Примеров.
Пример 1 описывает способ получения в основном безбелковой композиции, содержащей углевод, и вакцину, которую создают при использовании указанной композиции. Пример 2 описывает эксперимент, в котором вакцину по настоящему изобретению сравнивают с вакциной, представленной в настоящее время на рынке, и с экспериментальной вакциной, включающей в себя субъединицы белков Lawsonia intracellularis. Пример 3 описывает эксперимент, в котором две различные вакцины по настоящему изобретению сравнивают с вакциной, представленной в настоящее время на рынке. Пример 4 описывает эксперимент, в котором устанавливают воздействие дозировки вакцины по настоящему изобретению.
ПРИМЕР 1
В настоящем примере описан способ получения композиции в основном свободного от белка углевода, ассоциированного с наружной мембраной клеток Lawsonia intracellularis и вакцины, которая может быть получена с применением данной композиции. В целом, углевод представляет собой органическое соединение, которое включает в себя углерод, водород и кислород, обычно в отношении 1:2:1. Примерами углеводов являются сахара (сахариды), крахмалы, целлюлозы и смолы. Обычно они служат главными источниками энергии в питании животных. Lawsonia intracellularis представляет собой грам-отрицательную бактерию, которая, таким образом, имеет наружную мембрану, которая построена не только из фосфолипида и белка, но также включает в себя углеводы, в частности полисахарид (обычно полисахариды, такие как липополисахарид, липоолигосахарид, или даже полисахариды в нелипидной форме).
ФРАКЦИЯ УГЛЕВОДА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ
Брали двадцать миллилитров забуференной воды (0,04 M PBS, забуференный фосфатом физиологический раствор), содержащей клетки Lawsonia intracellularis в концентрации 3,7E8 (=3,7×108) клеток/мл. Клетки лизировали путем выдерживания их при 100°C в течение 10 минут. Добавляли протеазу K (10 мг/мл) в 0,04 M PBS в конечной концентрации 1,7 мг/мл. Данную смесь инкубировали при 60°C в течение 60 минут, чтобы разрушить все белки и сохранить углеводы интактными. Затем смесь инкубировали при 100°C в течение 10 минут, чтобы инактивировать протеазу K. Полученный в результате материал, который представлял собой композицию, содержащую углевод, в частности содержащую углеводы, которые представлены в живых бактериях Lawsonia intracellularis в ассоциации с их внешней мембраной (см. нижеприведенный параграф), хранили при 2-8°C до дальнейшего использования. Композицию получали в адъюванте Дилувак форте. Данный адъювант (см. также EP 0 382 271) включает в себя 7,5 процентов по весу капель витамина Е ацетата со средним объемным взвешенным размером приблизительно 400 нм, суспендированного в воде и стабилизированного 0,5 процентами по весу Твина 80 (полиоксиэтиленсорбитан моноолеат). Каждый миллилитр вакцины содержал материал, который был экстрагирован из 1,2E8 клеток Lawsonia intracellularis.
ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ УГЛЕВОДНЫХ АНТИГЕНОВ LAWSONIA
Две партии моноклональных антител (MoAb's), полученных против целой клетки Lawsonia intracellularis, преципитировали сатурированной Na2SO4 при комнатной температуре в соответствии со стандартными способами. Преципитат осаждали центрифугированием (10000 g в течение 10 минут). Осадок отмывали 20% Na2SO4 и ресуспендировали в 0,04 M PBS. Активированные тилозилом бусины Dynal (DynaBeads, DK) предварительно отмывали 0,1 M NaPO4 (pH 7,4), согласно инструкции производителя. Из каждой партии MoAb брали 140 мкг и добавляли к 2E8 предварительно отмытых бусин и инкубировали в течение ночи при 37°C. Бусины осаждали центрифугированием и несвязанные MoAb удаляли аспирацией супернатанта. Спектрофотометрические измерения показали, что от 20 до 35% добавленных MoAb связывались с бусинами.
Две партии клеток Lawsonia intracellularis объемом по 1 мл (3,7E8/мл) в 0,04 M PBS обрабатывали ультразвуком в течение 1 минуты. Полученные клеточные лизаты добавляли к тилозил-активированным бусинам - моноклональным комплексам и инкубировали в течение ночи при 4°C. Тилозил-активированные бусины - моноклональные комплексы отмывали три раза 0,1 M NaPO4 (pH 7,4). Связанные соединения элюировали путем отмывки бусин в 0,5 мл 8 M мочевины в 0,04 M PBS (E1); 0,5 мл 10 мМ глицина pH 2,5 (E2); и 0,5 мл 50 мМ HCl (E3), последовательным образом. После элюирования E2 и E3 нейтрализовали 100 мкл и 200 мкл 1 M Tris/HCl (pH 8,0).
Образцы брали на каждой стадии и помещали на гели ДСН-ПААГ. Гели окрашивали кумасси бриллиантовым голубым (CBB) и серебром или блотировали. Блоты проявляли с помощью аналогичных MoAb, которые упоминались выше. Проверка гелей и блотов показала, что полоски, выявленные с помощью MoAb, с кажущейся молекулярной массой 21 и 24 кДа, которые невидимы на гелях CBB, были видимы на гелях, окрашенных серебром. Кроме того, установили, что фракция клеток, которая связывалась с MoAb, была устойчива к протеазе K. Таким образом, исходя из результатов можно заключить, что указанная фракция включает в себя углеводы (т.к. белок лизируется, и обработанные ультразвуком фракции ДНК не проявляются в виде четкой полосы при окраске серебром), и что углеводы находятся в ассоциации (т.е. формируют часть или связаны) с внешней клеточной мембраной Lawsonia intracellularis (т.е. MoAb, индуцированные против указанной фракции, также распознавали целые клетки Lawsonia intracellularis). Учитывая, что Lawsonia intracellularis является грам-отрицательной бактерией, полагают, что углеводная композиция включает в себя полисахарид(ы).
ПРИМЕР 2
Данный эксперимент проводили, чтобы тестировать удобный способ получения углеводного антигена в вакцине, а именно с помощью убитой целой клетки (известной также в качестве бактерина). В качестве контролей применяли коммерчески доступную вакцину Enterisol® ileitis и экспериментальную субъединичную вакцину, содержащую белковые субъединицы. Наряду с этим использовали невакцинированных животных в качестве контроля.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН ПРИМЕРА 2
Инактивированную цельноклеточную вакцину изготавливали следующим образом. Собирали живые клетки Lawsonia intracellularis, полученные из кишечника свиней с PPE. Клетки инактивировали 0,01% BPL (бета-пропиолактон). Полученный в результате материал, который по существу является неживой композицией, содержащей углевод, по настоящему изобретению (в частности, поскольку он включает в себя углеводы, которые представлены в живых бактериях Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной), получали в адъюванте Дилувак форте (см. Пример 1) в концентрации приблизительно 2,8×108 клеток на мл вакцины.
Субъединичная вакцина содержала рекомбинанты P1/2 и P4, которые известны из EP 1219711 (белки 19/21 и 37 кДа, соответственно), и рекомбинантные белки, экспрессированные генами 5074, 4320 и 5464, как описано в WO2005/070958. Белки получали в адъюванте Дивалис форте. Вакцина содержала приблизительно 50 мкграммов каждого белка на миллилитр.
Использовали сорок свиней породы SPF в возрасте 6 недель. Свиней распределили по 4 группам, по десять свиней в каждой. Группу 1 вакцинировали однократно перорально (в T=O) 2 мл живой вакцины "Enterisol® ileitis" (Boehringer Ingelheim) согласно инструкциям производителя. Группы 2 и 3 вакцинировали дважды, внутримышечно (в T=O и T=4w) 2 мл инактивированной вакцины из целых клеток Lawsonia и рекомбинантной субъединичной комбинированной вакцины, как описано выше, соответственно. Группу 4 оставляли в качестве невакцинированного контроля. В T=6w всех свиней контрольно заражали пероральным путем с помощью гомогенизированной слизистой оболочки, инфицированной Lawsonia intracellularis. Затем проводили ежедневное наблюдение всех свиней на появление клинических признаков свиной пролиферативной энтеропатии (PPE). Периодически до и после контрольного заражения у свиней брали образцы сыворотки крови (для серологии) и фекалий (для ПЦР). В T=9w ко всем свиньям применяли эвтаназию и вскрывали их. Брали гистологические образцы подвздошной кишки и проводили микроскопическое исследование.
Инокулят для контрольного заражения готовили из инфицированной слизистой: 500 граммов инфицированной слизистой (соскобленной из инфицированных кишечников) смешивали с 500 мл физиологического раствора. Смесь гомогенизировали в смесителе омнимиксер в течение одной минуты на максимальной скорости, на льду. Всех свиней контрольно заражали пероральным путем 20 мл инокулята для контрольного заражения в T=6w.
В моменты времени T=0, 4, 6, 7, 8 и 9 брали образец фекалий (в количестве грамма) и образец сыворотки крови каждой свиньи и хранили в замороженном виде до тестирования. Образцы фекалий тестировали с помощью анализа количественного ПЦР (Q-PCR) и данные выражали в виде логарифма обнаруженного количества в пикограммах (пг). Образцы сыворотки крови тестировали с помощью обычно применяемого теста IFT (реакция иммунофлуоресценции для обнаружения антител против целых клеток Lawsonia intracellularis в сыворотке крови). Для гистологической оценки брали подходящий образец подвздошной кишки, фиксировали в 4% забуференном формалине, заливали обычным путем и готовили микроскопические препараты. Указанные препараты окрашивали гемотоксилином-эозином (краситель HE) и иммуногистохимическим красителем с применением моноклональных антител против Lawsonia intracellularis (краситель IHC). Препараты изучали под микроскопом. Гистологические оценки представлены, как указано ниже.
| Краситель HE | |
| патологии не обнаружено | оценка = 0 |
| сомнительное повреждение | оценка = 1/2 |
| легкие повреждения | оценка = 1 |
| умеренные повреждения | оценка = 2 |
| тяжелые повреждения | оценка = 3 |
| Краситель IHC | |
| нет явных бактерий L. intracelluaris | оценка = 0 |
| сомнительное присутствие бактерий | оценка = 1/2 |
| присутствие единичных/небольшого числа бактерий в препарате | оценка = 1 |
| присутствие умеренного числа бактерий в препарате | оценка = 2 |
| присутствие большого числа бактерий в препарате, тяжелые повреждения | оценка = 3 |
Все данные записывали для каждой свиньи в отдельности. Оценку в группе рассчитывали как среднее значение положительных животных для различных параметров после контрольного заражения. Непараметрический U-критерий Манна-Уитни использовали для оценки статистической значимости (двухсторонний тест, уровень значимости устанавливали 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕРА 2
Серология
Перед первой вакцинацией все свиньи были серонегативными при тестировании IFT титров антител. После вакцинации цельноклеточным бактерином (группа 2) у свиней обнаружили высокие титры антител IFT, тогда как контроли и свиньи, вакцинированные субъединичной вакциной, оставались отрицательными до контрольного заражения (таблица 1). Две из вакцинированных Enterisol® свиней (группа 1) имели средние титры IFT, тогда как все остальные свиньи в данной группе оставались серонегативными. После контрольного заражения у всех свиней обнаружили высокие титры антител IFT. Результаты в виде средних значений описаны в таблице 1 (с использованным разведением предел обнаружения на нижней стороне составлял 1,0).
| Таблица 1 Средние значения IFT титров антител (2log) в сыворотке крови свиней после вакцинации и контрольного заражения |
||||
| Группа | Т=0 недель | Т=4 недель | Т=6 недель | Т=9 недель |
| 1 | <1,0 | 1,1 | 1,7 | >11,4 |
| 2 | <1,0 | 3,7 | >11,8 | >12,0 |
| 3 | <1,0 | <1,0 | <1,0 | >11,6 |
| 4 | <1,0 | <1,0 | <1,0 | >12,0 |
ПЦР в режиме реального времени образцов фекалий
До контрольного заражения все образцы фекалий были отрицательными. После контрольного заражения положительные реакции обнаружили во всех группах. Группа 1 (p=0,02), группа 2 (p=0,01) и группа 3 (p=0,03) имели значительно более низкий уровень снижения массы, по сравнению с контролем. Обзор результатов после контрольного заражения представлен в таблице 2.
| Таблица 2 Результаты в виде средних значений анализа ПЦР образцов фекалий (log пг) после вакцинации и контрольного заражения |
|||||
| Группа | Т=6 недель | Т=7 недель | Т=8 недель | Т=9 недель | Итог после контрольного заражения |
| 1 | 0 | 1,3 | 3,6 | 1,8 | 6,3 |
| 2 | 0 | 0,8 | 2,8 | 1,9 | 5,5 |
| 3 | 0 | 0,5 | 3,8 | 2,0 | 5,9 |
| 4 | 0 | 0,8 | 4,9 | 4,9 | 10,0 |
Гистологические оценки
Группа 2 имела самую низкую гистологическую оценку HE (p=0,05), оценку IHC (p=0,08) и общую гистологическую оценку (p=0,08). Другие группы имели более высокие оценки и не отличались существенно от контрольной группы. См. таблицу 3.
| Таблица 3 Среднее значение гистологической оценки подвздошной кишки |
|||
| Группа | HE оценка | IHC оценка | Общая оценка |
| 1 | 1,8 | 1,5 | 3,3 |
| 2 | 1,3 | 1,5 | 2,7 |
| 3 | 1,8 | 1,6 | 3,4 |
| 4 | 2,4 | 2,3 | 4,7 |
ЗАКЛЮЧЕНИЯ ПРИМЕРА 2
Из результатов можно сделать заключение, что системное введение неживой цельноклеточной вакцины Lawsonia intracellularis, которая по существу включает в себя углевод, который обнаружен также в ассоциации с наружной мембраной живых клеток Lawsonia intracellularis, индуцировало по меньшей мере частичную защиту. Все исследованные параметры и гистологические оценки были в значительной степени или практически в значительной степени лучше, по сравнению с контролями.
ПРИМЕР 3
Данный эксперимент проводили для тестирования вакцины, включающей в себя композицию, содержащую углевод в качестве антигена. Вторая вакцина, которую тестировали, включала в себя кроме убитых целых клеток Lawsonia intracellularis, антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней (вакцина "комби"). В качестве контроля применяли коммерчески доступную вакцину Enterisol® ileitis. Наряду с этим, в качестве второго контроля использовали невакцинированных животных.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН ПРИМЕРА 3
Вакцину на основе главным образом свободной от белков композиции, содержащей углевод, получали, как описано в примере 1.
Экспериментальная комбивакцина содержала антиген инактивированных целых клеток Lawsonia intracellularis (способ получения инактивированных бактерий см. в примере 2) в концентрации 1,7×108 клеток/мл. Помимо этого, вакцина содержала инактивированный антиген PCV-2 (20 мкграммов/мл белка, кодированного ORF 2, PCV-2; белок, который экспрессируется в бакуловирусной системе экспрессии, которая общеизвестна в данной области техники, например, как описано в WO 2007/028823) и инактивированный антиген Mycoplasma hyopneumoniae (аналогичный антиген в аналогичной дозе, как известно из коммерчески доступной вакцины Porcilis Mhyo®, полученной от Intervet, Boxmeer, The Netherlands). Антигены получали в двойной эмульсии адъюванта "X". Данный адъювант представляет собой смесь 5 объемных частей адъюванта "A" и 1 объемной части адъюванта "B". Адъювант "A" состоит из капель минерального масла со средним размером (объемно взвешенным) приблизительно 1 мкм, стабилизированных Твином 80 в воде. Адъювант "A" включает в себя 25 мас.% минерального масла и 1 мас.% Твина. Остаток представляет собой воду. Адъювант "B" состоит из капель биодеградируемого витамина Е ацетата со средним размером (измеренным в объеме) приблизительно 400 нм, стабилизированных также Твином 80. Адъювант "B" включает в себя 15 мас.% витамина Е ацетата и 6 мас.%. Твина 80, остаток представляет собой воду.
Использовали шестьдесят четыре поросенка породы SPF в возрасте 3-х дней. Свиней распределили по четырем группам из 14 поросят и одну группу из 8 поросят (группа 4). Группу 1 вакцинировали внутримышечно в возрасте 3 дней 2 мл комбивакцины, с последующей повторной вакцинацией в возрасте 25 дней. Группу 2 вакцинировали внутримышечно один раз 2 мл комбивакцины в возрасте 25 дней. Группу 3 вакцинировали перорально 2 мл Enterisol® ileitis (Boehringer Ingelheim) в возрасте 25 дней согласно рекомендациям. Группу 4 вакцинировали внутримышечно в возрасте 3 и 25 дней 2 мл небелковой углеводной вакцины. Группу 5 оставляли невакцинированной, в качестве группы для контрольного заражения. В возрасте 46 дней всех свиней контрольно заражали пероральным путем гомогенизированной инфицированной слизистой. Затем проводили ежедневное наблюдение всех свиней на появление клинических признаков свиной пролиферативной энтеропатии (PPE). Периодически до и после контрольного заражения у свиней брали образцы сыворотки крови для серологии и анализа ПЦР соответственно. В возрасте 68 дней ко всем свиньям применяли эвтаназию и вскрывали их. Проводили гистологическое исследование подвздошной кишки.
Другие вопросы по дизайну эксперимента были аналогичны вопросам, описанным в примере 2, если не указано иначе.
РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕРА 3
Серология
Перед первой вакцинацией все свиньи были серонегативными при тестировании IFT титров антител. После вакцинации комбивакциной (группы 1 и 2) и небелковой углеводной вакциной (группа 4) у большинства свиней обнаружили титры антител IFT, тогда как контроли и свиньи, вакцинированные Enterisol, оставались серонегативными до контрольного заражения. После контрольного заражения у всех свиней (за исключением двух в группе Enterisol) обнаружили титры антител IFT. Обзор полученных средних значений представлен в таблице 4 (ввиду более высокого разведения по сравнению с Примером 2, предел обнаружения составлял 4,0).
| Таблица 4 Средние значения IFT титров антител Lawsonia (2log) в сыворотке крови свиней после вакцинации и контрольного заражения |
||||
| Группа | Т=3 дней | Т=25 дней | Т=46 дней | Т=67 дней |
| 1 | <4,0 | <4,0 | 7,9 | 10,3 |
| 2 | <4,0 | <4,0 | 4,8 | 9,8 |
| 3 | <4,0 | <4,0 | <4,0 | 8,5 |
| 4 | <4,0 | <4,0 | 6,9 | 10,6 |
| 5 | <4,0 | <4,0 | <4,0 | 9,0 |
В отношении Mhyo, в начале эксперимента, а также в день ревакцинации (в возрасте 25 дней) все свиньи были серонегативными по Mhyo. После ревакцинации в группе 1 обнаружили высокие титры антител Mhyo, сравнимые с титрами, получаемыми с помощью коммерчески доступной вакцины. В отношении PCV, в возрасте 3-х дней поросята имели титры материнских антител против PCV. В день ревакцинации (в возрасте 25 дней) вакцинированные животные (группа 1) имели титр, сходный с титром антител группы 2 и титром антител контрольной группы. Титр антител против PCV в возрасте 25 дней был несколько ниже по сравнению с титром, определяемым в возрасте 3 дней. После вакцинации в возрасте 25 дней титры группы 1 (2 вакцинации в дни 3 и 25) и группы 2 (одна вакцинация в день 25) оставались на высоком уровне, тогда как поросята контрольной группы демонстрировали обычное снижение материнских антител. Полученные PCV-титры сравнимы с титрами, получаемыми с коммерчески доступными вакцинами.
ПЦР в режиме реального времени образцов фекалий
Через три недели после контрольного заражения у свиней групп 1, 2 и 4 содержалось меньшее количество Lawsonia (ДНК) в фекалиях по сравнению с группами 3 и 5. Статистически значимыми были только различия между группами 1 и 3 (Enterisol) и между группами 4 и 3 (p<0,05, U-критерий Манна-Уитни). Результаты в виде средних значений представлены в таблице 5.
| Таблица 5 Средние значения результатов анализа ПЦР образцов фекалий (log, пг) после вакцинации и контрольного заражения |
|
| Группа | Среднее значение |
| 1 | 1,0 |
| 2 | 1,2 |
| 3 | 2,0 |
| 4 | 0,6 |
| 5 | 1,8 |
Гистологические оценки
Гистологические оценки групп 1 и 4 были значительно ниже, по сравнению с оценками групп 3 и 5 (p<0,05, двухсторонний U-критерий Манна-Уитни (см. таблицу 6). Число свиней с подтвержденным диагнозом PPE составляло 2/13 в группе 1, 6/12 в группе 2, 12/14 в группе 3, 2/7 в группе 4 и 12/14 в контрольной группе 5. Группы 1 и 4 имели значительно более низкую частоту возникновения PPE, по сравнению с группами 3 и 5 (p<0,05, двухсторонний точный критерий Фишера).
| Таблица 6 Среднее значение гистологической оценки подвздошной кишки |
|||
| Группа | HE оценка | IHC оценка | Общая оценка |
| 1 | 0,4 | 0,6 | 1,0 |
| 2 | 0,7 | 0,7 | 1,4 |
| 3 | 1,6 | 1,4 | 3,0 |
| 4 | 0,4 | 0,4 | 0,8 |
| 5 | 1,9 | 1,5 | 3,4 |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПРИМЕРА 3
Из результатов можно заключить, что системное введение цельноклеточного бактерина Lawsonia, скомбинированного с антигеном PCV и Mhyo, а также вакцины, содержащей (главным образом безбелковый) углевод, примененное в возрасте 3 дней и в возрасте 25 дней, индуцирует частичную защиту от экспериментальной инфекции Lawsonia intracellularis. Особенно неожиданно, что вакцина эффективна, если первичное введение происходит до отъема (в возрасте моложе 21-25 дней). Указано, что в примерах 2 и 3 вакцины, когда речь идет об антигенах Lawsonia, содержат в мл антигенный материал, полученный более чем из 1E8 клеток Lawsonia intracellucaris. Принимая во внимание, что указанные вакцины, несмотря на то, что в них использовали мягкие адъюванты (а именно адъюванты, содержащие небольшие капли и не содержащие или содержащие небольшое количество минерального масла), дают хорошую защиту от илеита, в особенности по сравнению с коммерчески доступной вакциной Enterisol® Ileitis, доза антигенов могла быть уменьшена. Уменьшение могло быть выполнено путем введения меньшего количества вакцины (например, до 0,2 мл, что подходит, например, для внутрикожного применения) или путем снижения антигенного содержимого вакцины. Исходя из аналогов в технологии вакцин, полагают, что с помощью антигенной дозы (на вакцинацию) полученной из или содержащейся в 1E7 клеток, в особенности 2,5E7 клеток или больше, могут быть получены сравнимые или даже лучшие результаты, чем с помощью существующей коммерчески доступной вакцины. Учитывая, что комбинированная вакцина обеспечивает титры антител против Mhyo и PCV в концентрации, сравнимой с концентрациями, получаемыми с помощью коммерчески доступных отдельных вакцин, при этом комбинированная вакцина также обеспечивает защиту от Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней.
ПРИМЕР 4
Данный эксперимент проводили, чтобы установить воздействие дозы вакцины согласно изобретению. В данном эксперименте также использовали невакцинированных животных в качестве контроля.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ДИЗАЙН ПРИМЕРА 4
Инактивированные цельноклеточные вакцины получали как показано в примере 2. Антигенный материал получали в адъюванте Дилувак форте в концентрации приблизительно 2,0×108 клеток на мл вакцины, соответственно, 5,0×107 и 1,25×107 клеток на мл вакцины. Использовали шестьдесят поросят породы SPF в возрасте 3-х дней. Свиней распределяли по четырем группам, по 15 свиней в каждой. Поросят групп 1, 2 и 3 вакцинировали внутримышечно (в шею) в возрасте 3 дней и 25 дней, каждый раз 2 мл вакцины. Группу 4 оставляли в качестве невакцинированного контроля. В возрасте 46-дней всех свиней контрольно заражали пероральным путем бактериями Lawsonia как показано в примере 2. Ко всем свиньям в возрасте 67 дней применяли эвтаназию и вскрывали их. Тесты проводили, как показано в примере 2. Наряду с этим выполняли анализ ПЦР образцов слизистой. Для этого брали образцы подвздошной кишки от каждого животного, в соответствующих случаях из участка, который демонстрирует утолщение.
РЕЗУЛЬТАТЫ ПРИМЕРА 4
Прирост массы
В период времени от 14 дней и далее между группами появлялись существенные различия в общем приросте массы. Группа 1 показала средний общий прирост массы приблизительно 5350 граммов. В группе 2 данный показатель составил 5150 граммов. Группа 3 показала прирост массы 4250 граммов, тогда как группа 4 показала прирост массы 4550 граммов.
ПЦР в режиме реального времени образцов фекалий
Через три недели после контрольного заражения положительные реакции обнаружили во всех группах. Группа 1 и группа 2 имели значительно более низкий уровень снижения массы, по сравнению с контролем. Обзор количества инфицированных животных (которое определяли с помощью анализа ПЦР) после контрольного заражения представлен в таблице 7.
| Таблица 7 Результат анализа ПЦР образцов экскрементов после вакцинации и контрольного заражения |
|
| Группа | Число инфицированных животных после контрольного заражения |
| 1 | 1/15 |
| 2 | 2/15 |
| 3 | 7/15 |
| 4 | 8/15 |
ПЦР в режиме реального времени образцов слизистой оболочки
Через три недели после контрольного заражения положительные реакции обнаружили во всех группах. Группа 1 и группа 2 имели значительно более низкий уровень снижения массы, по сравнению с контролем. Обзор после контрольного заражения числа инфицированных животных (которое определяли с помощью анализа ПЦР) представлен таблице 8.
| Таблица 8 Результат анализа ПЦР образцов слизистой оболочки после вакцинации и контрольного заражения |
|
| Группа | Число инфицированных животных после контрольного заражения |
| 1 | 0/15 |
| 2 | 2/15 |
| 3 | 5/15 |
| 4 | 6/14 (нет образца от свиньи № 8) |
Гистологические оценки
Общая гистологическая оценка и число животных с подтвержденным диагнозом PPE, описаны в таблице 9.
| Таблица 9 Среднее значение гистологической оценки подвздошной кишки |
||
| Группа | Общая оценка | Число животных с PPE |
| 1 | 0,3 | 0/15 |
| 2 | 0,8 | 2/14 |
| 3 | 1,1 | 4/15 |
| 4 | 1,9 | 7/15 |
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПРИМЕРА 4
Вопреки ожидаемому, результаты показывают, что происходит очень неожиданное снижение защитного эффекта при использовании в экспериментах самой низкой дозы.
Хотя доза антигенного материала, полученного из 2,5×107 клеток, все еще обеспечивает защитный эффект, сравнимый с эффектом коммерчески доступной вакцины, тот факт, что уменьшение эффекта по сравнению с дозой, превышающей указанную только на 0,6log, является таким значительным (практически не наблюдают влияние на прирост массы, количество инфицированных животных и результат анализа ПЦР слизистой оболочки; однако по-прежнему наблюдают снижение числа животных с диагнозом PPE), свидетельствует о том, что используемую на практике наименьшую эффективную дозу антигена, как правило, можно установить в соответствии со следующим условием: количество антигена, меньшее, чем количество, полученное из или содержащееся в 1x107 клеток, на практике, в современных рыночных условиях, не приводит к экономически значимым результатам. Причина существования указанного явного порогового значения не ясна на 100%. Обычно ожидают более плавного уменьшения защиты при снижении дозы. Возможно, что для противодействия местной инфекции в слизистой кишечника путем систематически производимого иммунного ответа нужно некоторое минимальное количество антигенов.
Наряду с вышесказанным, неожиданный эффект, наблюдаемый в примере 3, а именно что вакцина на основании углеводного антигена, вводимая систематически, является эффективной, если первичное введение происходит перед отъемом (в возрасте моложе 21-25 дней), подтверждается в указанном эксперименте с использованием другого адъюванта. Следовательно, с достаточным основанием можно полагать, что указанная особенность является генетической особенностью неживой вакцины, содержащей углеводный антиген.
1. Применение неживой композиции, содержащей углевод, который также обнаруживается в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток, при производстве вакцины для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis, где вакцина находится в форме, подходящей для внутримышечного введения, и включает в себя адъювант типа «масло в воде», содержащей капли масла со средним размером 400 нм.
2. Применение по п.1, характеризующееся тем, что композиция, содержащая углевод, представляет собой материал, полученный из убитых бактерий Lawsonia intracellularis.
3. Применение по п.2, характеризующееся тем, что композиция, содержащая углевод, включает в себя целые клетки убитых бактерий Lawsonia intracellularis.
4. Применение по пп.1-3, характеризующееся тем, что адъювант включает в себя капли биодеградируемого масла и капли минерального масла, где капли биодеградируемого масла имеют средний взвешенный по объему размер, который отличается от среднего взвешенного по объему размера капель минерального масла.
5. Применение по любому из пп. 1-3, характеризующееся тем, что вакцина дополнительно содержит антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней.
6. Применение по п.4, характеризующееся тем, что вакцина дополнительно содержит антигены Mycoplasma hyopneumoniae и цирковируса свиней.
7. Неживая композиция, содержащая углевод, который также обнаруживается в живых клетках Lawsonia intracellularis в ассоциации с наружной клеточной мембраной указанных клеток, для производства вакцины для защиты от инфекции, вызываемой Lawsonia intracellularis, где вакцина находится в форме, предназначенной для внутримышечного введения, и включает в себя адъювант типа «масло в воде», содержащей капли масла со средним размером 400 нм.
