Иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений


 


Владельцы патента RU 2524434:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова Российской академии наук (ИНЭОС РАН) (RU)
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Центр "Биоинженерия" Российской академии наук (Центр "Биоинженерия" РАН) (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений содержит клетки микроорганизма, обладающего 1,2-дегидрогеназной активностью, включенные в матрицу криогеля поливинилового спирта. В качестве обладающих 1,2-дегидрогеназной активностью клеток иммобилизованный биокатализатор содержит биомассу актинобактерий Pimelobacter simplex. Соотношение компонентов в биокатализаторе составляет (мас.%): клетки актинобактерий Pimelobacter simplex - 1-5 (на сухое вещество), поливиниловый спирт - 7-20, водная фаза - до 100. Изобретение обеспечивает осуществление стерео/региоселективной биотрансформации соответствующих стероидных субстратов при повышенной их исходной концентрации, получение целевого продукта с высоким выходом, а также возможность осуществлять многократное, не менее 30 циклов, использование биокатализатора без потери активности. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам (ИБК) на основе клеток микроорганизмов, помещенных в гелевый носитель, а также к процессам получения продуктов микробиологического синтеза или трансформации с использованием иммобилизованных биокатализаторов, в данном случае - к получению фармакологически значимых стероидов.

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в фармацевтической промышленности, поскольку достаточно большое число природных и полусинтетических стероидных соединений применяется при производстве многочисленных фармпрепаратов для современной медицинской практики, в том числе и на основе модифицированных стероидов (например, галогенированных производных, в частности, фторированных кортикоидов: триамцинолона, дексаметазона, бетаметазона, флуоцинолона, мометазона, флутиказона и др.), обладающих высокой антиаллергической, противошоковой, противовоспалительной, канцеролитической и другими видами активности [М.Д.Машковский «Лекарственные средства», Москва «Медицина», 1993 г., стр. 665]. Получение подобных соединений осуществляется микробиологической модификацией фитостеринов, источником сырья для выделения которых служат отходы деревообрабатывающей, сельскохозяйственной и пищевой промышленности, доступные в неограниченном количестве. При этом интермедиатами в синтезе высокоактивных противовоспалительных и антиаллергических стероидных производных являются 17-кетоандростаны: андростендион, андростадиендион и 9α-гидроксиандростендион, которые регио- и стереоселективно можно производить из фитостеринов с помощью определенных штаммов микроорганизмов [W.F.Wang; C.G.Zhang; B.Li. New microbiological transformations of steroids by Streptomyces virginiae IBL-14 // Environ. Sci. Techn. (2009) V.43 (15) 363-365; В.А.Андрюшина, H.E. Войшвилло, К.Н.Габинская, Т.С.Савинова, Т.С.Стыценко, К.Г.Скрябин, Ю.Э. Бартошевич, А.Г.Домрачева. Способ получения АД из стеринов растительного и животного происхождения или их производных. // Евразийский Патент №003019, 12.26.2002].

Большинство стероидных лекарственных препаратов, используемых в настоящее время в медицине и ветеринарии, представляет собой структурные модификации природных соединений, по сравнению с которыми модифицированные производные обладают более высокой биологической активностью и меньшими побочными эффектами. В синтезе многих препаратов используется способность микроорганизмов с высокой специфичностью осуществлять нужную трансформацию стероидных молекул заданной структуры, не требующую предварительной защиты имеющихся функциональных групп, и в экологически чистых условиях. Более того, такие трансформации стероидов, как гидроксилирование, в частности гидроксилирование в положение С9 полициклической системы стероидной молекулы, химическим способом в промышленных масштабах практически не осуществимы [A.Zaks, D.R.Dodds. Application of biocatalysis and biotransformations to the synthesis of pharmaceuticals // Drug Discov. Today (1997) V.2 (12) 513-531; H.L.Holland. Recent advances in applied and mechanistic aspects of the enzymatic hydroxylation of steroids by whole-cell biocatalysts // Steroids (1999) V.64 (3) 178-186; R.Breslow, J.Jan, S.Belvedere. Catalytic hydroxylation of steroids by cytochrome P-450 mimics hydroxylation at C-9 with novel catalysts and steroid substrates. // Tetrahedron Lett. (2002) V.43 (3) 363-365]. Интерес к 9α-гидрокси-стероидам обусловлен тем, что они используются в качестве исходных продуктов для синтеза 11β-гидрокси-9α-галоид-стероидов ряда прегнана, обладающих высокой антиаллергической, противошоковой и противовоспалительной активностью, например таких, как триамцинолон, дексаметазон, синафлан и др. [Н.В.Родина, В.А.Андрюшина, Т.С.Стьщенко, Т.П.Турова, З.В.Баслеров, А.Н.Пантелеева, Н.Е.Войшвилло. Введение 9α-гидрокси-группы в андрост-4-ен-3,17-дион с помощью нового штамма актинобактерии. // Прикл. биохим. микробиол. (2009) Т. 45 (4) 1-7]. Эти вещества могут быть использованы как самостоятельные физиологически активные соединения, так и в качестве интермедиатов при синтезе новых препаратов.

Собственно биотрансформация фитостеринов в целевое производное с помощью обладающих требуемой ферментативной активностью свободных клеток является очень сложным и длительным процессом ввиду низкой растворимости стероидных субстратов и соответствующих продуктов в водных средах, что сильно мешает транспорту данных веществ в клетку и из нее. При этом реакционная система гетерофазна и многокомпонентна, она представляет собой суспензию клеток и образующегося со временем клеточного дебриса, частиц кристаллического субстрата и in situ кристаллизующегося продукта в сложной по составу буферной среде, что по окончании процесса требует удаления компонентов биомассы и многостадийной очистки конечного продукта. В результате клетки работают лишь однократно, большой процент полученного ценного вещества теряется безвозвратно во время его выделения. Поэтому перспективным приемом повышения технологичности процесса микробной биотрансформации является использование клеток в иммобилизованном состоянии, что позволяет упростить операции по выделению целевого вещества и удлинить сроки продуктивного функционирования биомассы [А.П.Синицын, Е.И.Райнина, В.И.Лозинский, С.Д.Спасов. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. // 2-е изд., МГУ, Москва, 1994, 288 с.].

Однако когда при биотрасформации стероидных субстратов используют иммобилизованные клетки, то возникает проблема абразивного износа материала носителя, поскольку в реакторах с перемешиванием кристаллы субстрата и продукта действуют на носитель как частицы твердого абразива, поэтому необходим адекватный выбор материала носителя. Хотя разработки по иммобилизации клеток, применяемых для биотрансформации стероидных субстратов, ведутся уже достаточно давно, с 70-х годов прошлого века, многие сложности с носителями еще окончательно не преодолены. В частности, для бактерий Arthrobacter globiformis, обладающих способностью к дегидрированию стероидных соединений, описаны различные варианты иммобилизации с использованием таких носителей, как полиакриламидный гель [G.K.Skryabin, K.A.Koscheenko. Immobilization of living microbial cells in polyacrylamide gel // Meth. Enzymol. (1978) V. 135B, 198-216], альгинатные гели [Г.В.Суходольская, Н.Г.Винокурова, С.А.Гулевская, К.А.Кощеенко, Г.К.Скрябин. Конструирование носителей на основе природных полисахаридов для клеток Arthrobacter globiformis с 1,2-стероиддегидрогеназной активностью.// Прикл. биохим. микробиол. (1991) Т.27 (4) 514-521], фотосшиваемые полимеры [K.Somomoto, M.D.M.Hoq, A.Tanaka, S.Fukui. Growth of Curvularia lunata cells, and steroid 11-beta-hydroxylation by the entrapped mycelia // J. Ferment. Techn. (1981) V.59 (6) 465-469] и др.

Известен иммобилизованный биокатализатор (ИБК), представляющий собой клетки бактерии Arthrobacter globiformis ИБФМ 193, включенные в частицы полиакриламидного геля [А.Ю.Аринбасарова, К.А.Кощеенко, В.А.Андрюшина, Г.С.Гриненко, Г.К.Скрябин. Способ получения 1,2-дегиро-производных кортикостероидов // Пат.РФ №1830949 (1988); C12P 33/00; Б.И. №19 (1995)]. С помощью такого ИБК в сочетании с использованием β-циклодекстрина (солюбилизирующий агент) и определенных аминокислот (агентов, снижающих трансмембранный потенциал), растворенных в культуральной среде, удается при трансформации гидрокортизона в преднизолон заметно повысить исходную концентрацию субстрата и поднять эффективность его дегидрирования по сравнению с процессом на свободных клетках, т.е. улучшить технологичность подобной биотрасформации. Такое техническое решение обеспечивает достаточно продолжительное функционирование ИБК в случае работы с однофазными жидкими культуральными средами, но не с гетерогенными суспензиями малорастворимых субстратов, поскольку главным недостатком используемого носителя - полиакриламидного геля - является его низкая абразивная устойчивость в таких условиях [Н.С.Егоров, А.В.Олескин, В.Д.Самуилов. «Биотехнология» Учебное пособие для вузов в 8-ми книгах. Под редакцией Н.С.Егорова, В.Д.Самуилова. Книга 1. Проблемы и перспективы. М.: Высшая школа, 1987. С. 159]. Например, при гетерофазной биотрансформации стероидных субстратов потери ИБК на основе клеток, включенных в полиакриламидный гель, достигают 15-20% за цикл [А.Ю.Аринбасарова. Трансформация гидрокортизона свободными и иммобилизованными клетками Arthrobacter globiformis 193. Дисс.канд. биол. наук, Пущино, 1985 г., стр. 15]. Кроме того, для приготовления такого ИБК используется токсичный мономер - акриламид, что существенно ухудшает санитарно-гигиенические показатели процесса в целом.

Включение обладающих стероид-трансформирующей активностью клеток в такую нетоксичную гелевую матрицу, как часто применяемый для иммобилизации микробных клеток Ca-альгинатный гидрогель, позволяет при формировании ИБК исключить использование вредных веществ. Известен ИБК на основе включенных в Ca-альгинат клеток Arthrobacter globiformis, при использовании которого для 1,2-дегидрирования гидрокортизона в трансформационную среду вводят до 10 ммоль/л хлорида кальция, чтобы сохранялась целостность ионотропного геля [Г.В.Суходольская, Н.Г.Винокурова, С.А.Гулевская, К.А.Кощеенко, Г.К.Скрябин. Конструирование носителей на основе природных полисахаридов для клеток Arthrobacter globiformis с 1,2-стероиддегидрогеназной активностью. // Прикл. биохим. микробиол. (1991) Т.27 (4) 514-522]. Необходимость использования кальцийсодержащих сред при работе с подобными гелевыми носителями и с соответствующими ИБК, где клетки включены в такой гель, является их недостатком, поскольку сильно ограничивает круг жидких сред, в которых подобные биокатализаторы могут функционировать в течение достаточно длительного времени, т.е. для иммобилизованных биокатализаторов, у которых функцию носителя выполняет Ca-альгинатный гель, характерна малая универсальность в отношении состава рабочей среды. Так, например, в ходе проверки авторами заявляемого технического решения операционной стабильности ИБК на основе биомассы актинобактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632, включенных в гранулы Ca-альгинатного гидрогеля (получены традиционным для данного носителя методом), было найдено, что в трансформационной среде (кукурузно-глюкозная среда, содержащая гидрокортизон) очень быстро в течение нескольких часов частицы носителя теряли свою целостность и распадались, вследствие обмена ионов кальция из геля на ионы натрия и калия из среды, вызывая тем самым солюбилизацию ИБК.

Известен ИБК для биотрансформации стероидов, представляющий собой клетки бактериального штамма Arthrobacter globiformis ИБФМ 193, включенные в сферические гранулы абразивно- и ионно-устойчивого носителя - криогеля поливинилового спирта (ЛВС) [В.В.Фокина, А.Ю.Аринбасарова, А.Л.Зубов, В.И.Лозинский, К.А.Кощеенко. Дегидрирование стероидных субстратов бактериальными клетками Arthrobacter globiformis 193, включенными в криогель поливинилового спирта.// Прикл. биохим. микробиол. (1995) Т.31 (2) 213-219]. С помощью такого ИБК при проведении 1,2-дегидрирования гидрокортизона, метилгидрокортизона и прогестерона осуществляют превращение субстрата в гетерофазной системе «жидкость - клетки - малорастворимый стероид», где ИБК сохраняет целостность и может быть использован в нескольких последовательных циклах получения соответствующих стероидных дегидропроизводных [V.Fokina, N.Susina, A.Arinbasarova, A.Zubov, V.Lozinsky, K.Koshcheenko. Immobilization of Arthrobacter globiformis 193 cells into PVA cryogel. Dehydrogenation of steroid substrates. // In: "Immobilized Cells: Basics and Applications". R.H.Wijffels, R.M.Buitelaar, C.Bucke, J.Tramper eds., Elsevier Sci. B.V., Amsterdam e.a., 1996, Р. 90-97]. Однако при этом для улучшения растворимости субстрата и повышения скорости дегидрирования было необходимо вводить в исходную культуральную среду определенное количество органического растворителя, например, до 10% метилового спирта, что в случае масштабирования процесса является негативным моментом ввиду высокой токсичности данного солюбилизатора стероидов.

Известен ИБК, применяемый в процессах биотрансформации стероидных субстратов, где механическую прочность носителя на основе криогеля ПВС дополнительно повышают, подвергая систему в ходе включения клеток в криогель гамма-облучению, приводящему к радиационной сшивке полимерных цепей ПВС [N.Naim, N.Z.Adham, Н.А.Еl-Rehim, A.A.El-Hady. Prednisolone production using Pseudomonas fluoresceins cells immobilized with polymer carrier produced by radiation polymerization. // Proc. Biochem. (2003) V.38 (9) 1083-1089]. Однако 1,2-дегидрогеназная активность иммобилизованных клеток в таком ИБК низкая, что является следствием бактерицидного действия облучения [А.А.Еl-Hady, H.A.El-Rehim. Production of prednisolone by Pseudomonas oleovorans cells incorporated in radiation crosslinked hydrogels. // J.Biomed. Biotechnol. (2004) V.4 (4) 219-226]. Наиболее близким к заявляемому техническому решению по природе используемого носителя иммобилизованных клеток является принимаемый за прототип ИБК, содержащий клетки культуры актинобактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740, включенные в криогель ПВС при соотношении компонентов (мас.%): клетки (на сухое вещество) - 1, поливиниловый спирт - 10, водная фаза - 89 [Н.В.Карпова-Родина, В.А.Андрюшина, В.В.Ядерец, А.В.Дружинина, Т.С.Стыценко, Б.Л.Шаскольский, В.И.Лозинский, Лью Дык Хи, Н.Е.Войшвилло. Трансформация Δ4-3-кето-стероидов свободными и иммобилизованными клетками актинобактерии Rhodococcus erythropolis II Прикл. биохим. микробиол. (2011) Т. 47 (4) 429-435]. Данный биокатализатор позволяет осуществлять 9α-гидроксилирование субстратов андростанового и прегнанового ряда, в частности проводить гидроксилирование андростендиона в семи последовательных циклах продолжительностью по 22-24 ч каждый с получением 9α-гидрокси-андростендиона с выходом до 98%.

Данный биокатализатор-прототип имеет следующие недостатки. Во-первых, клетки Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740, включенные в криогель ПВС, осуществляют трансформацию исходного субстрата с высоким выходом практически чистого конечного продукта на протяжении, как указывалось выше, не более 7-9 последовательных циклов, а далее выход продукта прогрессивно снижается и содержание примеси нетрансформированного исходного субстрата повышается, что приводит к необходимости осуществления дополнительных операций по очистке целевого вещества. Во-вторых, для проведения трансформации клетками Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740, включенными в криогель ПВС, используется питательная среда, способствующая образованию эмульсии и усложняющая процесс выделения целевого продукта. В-третьих, применение такого ИБК позволяет эффективно, т.е. регио/стереоселективно, осуществлять процесс биотрансформации лишь при невысоких (не более 4 г/л) нагрузках стероидного субстрата, поэтому производительность соответствующего биотрасформационного процесса также невысокая.

Все это отрицательно сказывается на экономических показателях производства стероидных производных с использованием данного иммобилизованного биокатализатора, который не обеспечивает достаточно хорошей технологичности процесса в целом.

Задачей предлагаемого технического решения является разработка высокопродуктивного иммобилизованного биокатализатора на основе клеток стероидтрансформирующих микроорганизмов, способных в иммобилизованном состоянии в течение большого числа последовательных циклов с высоким выходом целевого продукта осуществлять стерео/региоселективную биотрансформацию соответствующих стероидных субстратов при повышенной их исходной концентрации.

Указанная задача решается тем, что заявляемый иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений содержит обладающие 1,2-дегидрогеназной активностью клетки актинобактерий, относящихся к виду Pimelobacter simplex, включенные в матрицу криогеля поливинилового спирта при следующем соотношении компонентов (мас.%): клетки - 1-5 (на сухое вещество), поливиниловый спирт - 7-20; водная фаза - до 100.

В состав заявляемого ИБК в качестве каталитически активного действующего начала входят обладающие 1,2-дегидрогеназной активностью клетки актинобактерий, относящиеся к виду Pimelobacter simplex. Использование именно таких клеток, концентрация которых в ИБК найдена экпериментально, обусловлено высокой стероид-1,2-дегидрогеназной активностью актинобактерий Pimelobacter simplex. Поскольку клетки этого вида ранее не использовались в иммобилизованном состоянии для биотрансформации стероидов, то не была очевидной их длительная работоспособность при иммобилизации включением в матрицу криогеля ПВС из-за возможного негативного влияния криогенного воздействия, которому подвергается суспензия микроорганизмов в растворе ПВС при формировании таких ИБК. Так, например, при разработке заявляемого ИБК было обнаружено, что включение в криогель ПВС клеток другой культуры, а именно Culvularia lunata, которые в свободном состоянии также обладали высокой стероид-трансформирующей активностью, приводило к получению биокатализатора, фактически работоспособного только в первом цикле биотрансформации субстрата, а далее наблюдалось прогрессивное снижение активности иммобилизованных клеток.

Таким образом, подтверждается неочевидность предлагаемого технического решения, т.к. достижение целей заявляемого изобретения сочетанием относящихся к виду Pimelobacter simplex клеток и использование криогеля ПВС в качестве носителя при их иммобилизации до выполнения соответствующих исследований не было однозначно вытекающим из уровня знаний в этой области.

Нижний предел концентрации клеток в заявляемом составе ИБК определяется тем, что при использовании меньшей чем 1 мас.% концентрации биомассы в расчете на сухой вес клеток получаемый иммобилизованный биокатализатор обладает заметно меньшей стероид-трансформирующей активностью, а верхний предел концентрации клеток определяется тем, что при использовании их концентрации больше 5 мас.% (на сухой вес) происходит неполное включение всех клеток, введенных в исходную смесь с раствором полимера, в формирующийся криогель ПВС и затем наблюдается их вымывание при помещении полученных гранул в культуральную среду для проведения биотрансформации стероидных субстратов. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.

Применение в качестве носителя иммобилизованных клеток криогеля ПВС, формируемого при замораживании-оттаивании раствора данного полимера [В.И.Лозинский. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта. // Успехи химии (1998) Т.67 (7) 641-655], обусловлено высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками материала такого носителя, в частности его высокой абразивной устойчивостью и стабильностью в жидких средах разного состава.

Концентрация ПВС в составе заявляемого ИБК также найдена экспериментально. Нижний предел содержания поливинилового спирта определяется тем, что при меньшей чем 7 мас.% концентрации этого гелеобразующего полимера заметно снижаются физико-механические характеристики иммобилизованного биокатализатора, а при более чем 20 мас.% содержании ПВС сильно повышается вязкость исходной системы, используемой для приготовления иммобилизованного биокатализатора, что затрудняет равномерное диспергирование биомассы в такой среде, а также в случае необходимости приготовления ИБК в воде сферических гранул существенно усложняет процесс гранулирования.

Получение биомассы клеток каждого конкретного микроорганизма для последующего включения в матрицу гелевого носителя проводится с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками используемого штамма.

После получения клеток их диспергируют в растворе ПВС с последующей криогенной обработкой (замораживанием, выдерживанием в замороженном состоянии и оттаиванием) полученной суспензии, что в результате приводит к образованию полимерного криогеля, содержащего включенные в его матрицу клетки обладающего стероид-трансформирующей активностью микроорганизма.

В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору известными способами [В.И.Лозинский, Е.С.Вайнерман, С.В.Рогожин. Способ получения иммобилизованных клеток микроорганизмов. // А.с. СССР №1400071 (1986); Б.И. №20 (1988)] может быть придана любая необходимая форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, трубок и др. Для этого суспензия биомассы в растворе гелеобразователя замораживается либо в соответствующей форме, либо гранулируется с помощью специального устройства, например криогрануляционных установок [В.И.Лозинский, А.Л.Зубов. Устройство для формирования сферических гранул из материала на основе водных систем. // Пат. РФ №2036095 (1992); Б.И. №15 (1995); В.И.Лозинский, А.Л.Зубов. Устройство для формирования гранул. // Пат. РФ №2104866 (1996); Б.И. №5 (1998)].

Осуществление процесса биотрансформации соответствующего стероидного субстрата с помощью заявляемого ИБК проводят в реакторе с перемешиванием, куда вносят трансформационную среду в смеси с субстратом и необходимое количество ИБК. Ход процесса контролируют с использованием известных приемов, например с помощью тонкослойной хроматографии. По окончании каждого цикла целевой продукт, накопленный в трансформационной среде, выделяют и очищают известными приемами (например, с помощью экстракции, различных видов хроматографии, перекристаллизацией, и др.).

Такой иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений и такое сочетание признаков, как обладающие высокой стероид-1,2-дегидрогеназной активностью клетки актинобактерий, относящихся к виду Pimelobacter simplex, включенные в матрицу именно криогеля ПВС, а также заявляемый качественный и количественный состав заявляемого ИБК, позволяющие в течение большого числа последовательных циклов осуществлять с высоком выходом целевого продукта стерео/регио-селективную биотрансформацию соответствующих стероидных субстратов при повышенной их исходной концентрации, ранее известны не были и являются новыми, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».

Ниже приводится типичный пример реализации заявляемого технического решения, остальные примеры суммированы в таблице, а приводимая ниже диаграмма содержит следующую информацию:

Фиг.1. Конверсия гидрокортизона в преднизолон в последовательных циклах применения ИБК по примеру 1 (исходная концентрация субстрата - 4 г/л).

Пример 1. Иммобилизованный биокатализатор на основе клеток актинобактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 для осуществления биотрансформации гидрокортизона.

Клетки бактерии P. simplex ВКПМ Ас-1632 выращивают на агаровой кукурузно-глюкозной среде (КГС) следующего состава (г/л): кукурузный экстракт - 15.0, глюкоза -10.0, K2HPO4 - 1.0, агар-агар - 25 г/л, pH - 6.8-7.2. Клетки с агара пересевают в жидкую КГС и выращивают культуру в течение 70-72 ч. Полученный посевной материал переносят в свежую КГС и осуществляют культивирование в течение 24 ч. Биомассу, выделенную из культуральной жидкости центрифугированием при 3000 g, используют затем для иммобилизации.

При получении ИБК к 90 г 11,1%-ного водного раствора ПВС прибавляют 10 г суспензии клеток актинобактерий Pimelobacter simplex ВКПМ Ас-1632 с концентрацией сухих веществ 20% и перемешивают до получения однородной массы, которую затем используют для формирования сферических гранул диаметром 1-2 мм. Гранулирование проводят с помощью криогрануляционной установки по Патенту РФ №2036095 известным методом: замораживание осуществляют при -15°C, продолжительность выдерживания в замороженном состоянии 18 ч, оттаивание гранул проводят при 4°C в течение 6 ч и промывают стерильным физиологическим раствором. Получают 98,7 г гранул криогеля ПВС, содержащего клетки, включенные в гелевую матрицу. Приготовленный таким образом ИБК имеет следующий состав (мас.%): клетки актинобактерий - 2 (на сухой вес), поливиниловый спирт - 10; водная фаза - до 100.

Полученные гранулы инкубируют в среде КГС в течение 24 ч, отделяют от питательной среды с помощью мелкоячеистого сита, суспендируют в 1.8% водном растворе β-циклодекстрина, содержащем 4 г/л гидрокортизона, и помещают на качалку для проведения трансформации. Окончание процесса определяют с помощью ТСХ. После завершения цикла трансформации гранулы отделяют от среды, промывают физиологическим раствором и используют в следующем цикле биотрансформации гидрокортизона. Отделенную водную фракцию трижды экстрагируют этилацетатом до полного извлечения стероида. Экстракт упаривают в вакууме. Сухой остаток промывают эфиром и сушат. С 98%-ным выходом получают преднизолон (т.пл. 230-231°C) с 98%-ным содержанием основного вещества.

Аналогично осуществляют все последующие циклы трансформации, используя ту же самую партию ИБК. В случае невозможности осуществления следующего цикла после окончания предыдущей трансформации гранулы помещают в физиологический раствор и хранят при 4°C. При исходной концентрации субстрата 4 г/л проводят 31 цикл трансформации гидрокортизона. Средняя продолжительность трансформации составляет 30-120 мин. При общем времени использования ИБК 30 суток, время трансформации - 18 ч. В 15 циклах (5-20) выход преднизолона составляет более 98% (фиг.1).

Таким образом, заявляемое изобретение приводит к техническому результату, имеющему следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1. Заявляемый ИБК позволяет осуществлять многократное (не менее 30 циклов) его использование без потери активности, в то время как в случае прототипа - не более 9 циклов.

2. Заявляемый ИБК позволяет проводить трансформацию при повышенных нагрузках стероидного субстрата, а именно до 20 и выше г/л (в прототипе - 4 г/л).

3. При использовании заявляемого ИБК упрощается схема выделения и очистки целевого продукта, так как используемая культура Pimelobacter simplex позволяет проводить трансформацию просто в водном растворе, в то время как в случае ИБК-прототипа и аналогов необходимо использование многокомпонентной питательной среды (в частности, КГС), в которой имеет место образование стойкой эмульсии, сильно затрудняющей выделение целевого продукта и тем самым снижающей его выход из-за потерь в ходе очистки.

4. При использовании заявляемого ИБК выделенный целевой продукт получается достаточно высокого качества и практически не требует последующей очистки, т.к. его характеристики соответствуют требованиям, предъявляемым к стероидным фармацевтическим субстанциям.

5. Использование в качестве матрицы носителя вязкоупругого нехрупкого материала - криогеля поливинилового спирта, практически не подвергаемого абразивному износу, позволяет варьировать форму гранул биокатализатора и использовать его в различных реакторах, в том числе и в реакторах с интенсивным перемешиванием, что существенно увеличивает скорость массообменных биокаталитических процессов. Как результат, заявляемое изобретение позволяет получить ИБК, обладающий существенно улучшенными (по отношению к аналогам) характеристиками, а именно ИБК стабилен на протяжении многократных (30 и более) циклов функционирования в среде, содержащей микрокристаллы стероидных веществ, вызывающих интенсивный абразивный износ (деструкцию) носителей иммобилизованных клеток на основе других известных полимерных гелей.

6. В отличие от процесса биотрансформации стероидов с использованием известного ИБК (аналог), где требовалось введение в рабочую среду токсичного метанола, в случае применения заявляемого ИБК в этом нет необходимости, т.е. заявляемое техническое решение позволяет улучшить санитарно-гигиенические показатели процесса биотрансформации в целом. Тем не менее, если все же такой солюбилизирующий агент будет нужен в случае очень плохо растворимых в воде стероидных субстратов, то и это, как показали проверочные эксперименты, возможно, т.к. в присутствии добавок метанола заметного снижения активности клеток в составе ИБК не происходило.

Таблица примеров
№ примера Биомасса Pimelobacter simplex Носитель иммобилизованных клеток Процесс биотрансформации
Штамм Содержание в ИБК*) Содержание ПВС в ИБК*) Форма носителя Исходная концентрация субстрата (г/л) Число циклов УВ**) %
1 Pimelobacter simplex ВКПМ Ac-1632 2 10 Гранулы 1-2 мм 4 31 90,6 (95,9)
2 -“- 4 8,5 Гранулы 2,5-4 мм 10 25 90,4 (94,1)
3 -“- 5 7 Цилиндры 2×5 мм 20 20 90 (93,4)
4 Pimelobacter simplex №93 (коллекция Центра "Био-инженерия» РАН) 1 20 Гранулы 2,5-4 мм 2 12 87 (88,1)
5 -“- 3,4 12,6 Кубики 5×5 мм 4 15 86 (87,8)
6 Pimelobacter simplex sp. 1,7 14,3 Гранулы 3-4 мм 2 10 86,8
7 -“- 2,5 16 Цилиндры 3×4 мм 4 9 86
*)В расчете на сухой вес компонента
**) УВ - усредненный выход целевого продукта в расчете на 1 цикл (в скобках - усредненный выход целевого продукта в расчете на 1 цикл за 10 лучших циклов).

Иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений, содержащий клетки микроорганизма, обладающего 1,2-дегидрогеназной активностью, включенные в матрицу криогеля поливинилового спирта, отличающийся тем, что в качестве обладающих 1,2-дегидрогеназной активностью клеток иммобилизованный биокатализатор содержит биомассу актинобактерий, относящихся к виду Pimelobacter simplex, при следующем соотношении компонентов (мас.%):

клетки актинобактерий,
относящихся к виду Pimelobacter simplex 1-5 (на сухое вещество)
поливиниловый спирт 7-20
водная фаза до 100



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления кисломолочных продуктов. Способ предусматривает приготовление питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli - продуцента биологически активного флагеллина. Охарактеризованный штамм получен трансформацией культуры клеток E.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus acidophilus №9-ПС обладает биохимической активностью и высокой кислотностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 является продуцентом бактериальной целлюлозы.

Группа изобретений относится к области микробиологии и может быть использована в пищевой промышленности. Предложены штамм Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 и штамм Lactobacillus plantarum DSM 22064, способные к полному разложению глютена в муке.
Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ B-11011, обладающий способностью быстро утилизировать нефть, дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при очистке мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Exguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и готовят из него суспензию, которую вносят в мерзлотную почву и водную среду.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для рекомбинантного получения 1,2-пропандиола (1,2-PD). В клетку E.coli вводят ген, кодирующий пропандиолоксидоредуктазу, что позволяет продуцировать высокие уровни 1,2-пропандиола, по существу без 1,3-пропандиола, при выращивании на глицерине как единственном источнике углерода.
Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложен штамм бактерий Rhodococcus aetherivorans ВКМ Ac-2610D.

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии. Штамм вируса иммунодефицита человека I-типа ИВ741 выделен на территории РФ от больного не получавшего АРВ-терапию.
Изобретение относится к области биотехнологии. .
Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для синтеза фармакологически активных 19-норстероидов. .
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическому получению андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД). .
Изобретение относится к способу получения производных стероидных гликозидов Ruscus aculeatus (рускосапонинов). .
Изобретение относится к способу получения производных стероидных гликозидов Ruscus aculeatus (рускосапонинов). .

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления кисломолочных продуктов. Способ предусматривает приготовление питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение.
Наверх