Способ восстановления чувствительного слоя биосенсора

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-НСl 50 мМ, СаСl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С. Процесс ведут в несколько последовательных стадий раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в указанном растворителе при температуре в диапазоне 35-40°С с последующей экспозицией. Затем чувствительный слой биосенсора последовательно промывают додецилсульфатом, растворенным в том же буфере в концентрации 0,1%, а затем водой на каждой стадии. При этом процесс обработки проводят трижды. Изобретение позволяет сократить продолжительность процесса. 1 з.п. ф-лы.

 

Изобретение относится к области биосенсорного анализа и касается способа восстановления чувствительного слоя биосенсора.

Чипы биосенсоров являются продуктом высоких технологий, что приводит к тому, что незаводское их изготовление невозможно. В то же время они являются принципиально одноразовыми изделиями, повторного использования которых не предусматривается, хотя стоимость чипа достаточно высока, и расходы на один анализ могут быть весьма значительными. Во многих случаях это не является препятствием для использования биосенсоров, поскольку при выполнении жизненно важных анализов или при разработке новых лекарств цена анализа не является определяющим фактором. В то же время существуют исследования, для выполнения которых нужно потратить десятки и даже сотни чипов. Во многих случаях это невозможно по экономическим причинам.

В подавляющем большинстве случаев, если иммобилизированным компонентом при изучении взаимодействия является белок или полипептид, то его иммобилизация на чип производится пользователем. С завода чипы выпускаются без иммобилизированной компоненты, а только подготовленными для иммобилизации. Это связано с тем, что белок и полипептиды, иммобилизованные на поверхности чипа хуже хранятся, чем отдельно чипы и пришиваемые компоненты, для которых раздельно можно обеспечить оптимальные условия хранения для каждого.

Иммобилизированный компонент должен прочно удерживаться на поверхности чипа. В противном случае, если этот компонент смывается с чипа, наблюдается сильный дрейф, мешающий измерениям. Кроме того, потеря иммобилизированного компонента приводит к непрерывному снижению чувствительности биосенсора. Поэтому обычно для иммобилизации используют необратимую пришивку, приводящую к образованию ковалентной связи между подложкой чипа и иммобилизированной молекулой. Чаще всего применяется иммобилизизация за аминогруппу на карбоксиметилированную декстрановую подложку, активированную смесью EDC/NHS (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide\N-hydroxysuccinimide). Кроме того, возможна фиксация макромолекул за карбоксильную группу, за сульфгидрильную группу и т.п. Применение любого из этих способов приводит к необратимой фиксации макромолекул, после которой они остаются на поверхности чипа и не могут быть смыты с нее детергентами, растворителями и прочими моющими агентами. Поэтому, со временем, после деградации иммобилизированного компонента использованный чип уже не пригоден для любого дальнейшего применения. В то же время подложка такого чипа вполне пригодна для иммобилизации других макромолекул, однако использовать ее для повторной иммобилизации в большинстве случаев не удается, поскольку часть мест (обычно карбоксильных групп) иммобилизации дезактивирована или занята в результате предыдущей посадки, а оставшиеся от предыдущей иммобилизации молекулы могут дать непредсказуемые артефакты и ошибки измерения.

Чтобы привести использованный чип в состояние, близкое к тому, в котором он поступает с завода-изготовителя, необходимо по возможности более полно устранить с его поверхности остатки ранее иммобилизованных макромолекул и, при необходимости, восстановить до исходного значения поверхностную плотность карбоксильных групп. На настоящий момент не существует способа прицельно разорвать ковалентную связь, образовавшуюся в процессе иммобилизации, однако есть возможность удалить все элементы пришитой макромолекулы кроме того, который непосредственно пришит к подложке.

Для этого можно привести поверхность чипа в контакт с раствором фермента, способного гидролизовать связи между компонентами макромолекул. Для протеинов и белков следует использовать протеазы, а для нуклеиновых кислот - нуклеазы - РНКзы и ДНКзы [1, 2, 5].

Имеется большой выбор протеолитических ферментов, но не все они подходят для проведения регенерации [3], так как большинство протеаз разрезают пептидную связь только по определенным аминокислотам, которые, кроме того, должны быть доступны для воздействия фермента, то есть находиться снаружи белковой глобулы. Такие протеазы не способны полностью гидролизовать пришитые белки. Всегда остаются участки, которые не содержат нужных аминокислот, и которые не будут гидролизованы и удалены. Кроме того, даже если белковая молекула будет разрезана в нескольких местах, отрезанные куски не отделятся от глобулы, поскольку белковая цепочка в глобуле сильно переплетена сама с собой, и отрезанные куски не могут покинуть глобулу.

Существуют ферменты, способные отрезать от белковой цепочки аминокислоту за аминокислотой с С или N конца (это разные ферменты - соответственно С-пептидазы и N-пептидазы), которые в принципе могут гидролизовать весь белок без остатка. Однако такие ферменты все равно не решают проблему по нескольким причинам. Есть белки в которых С-конец, или N-конец или оба спрятаны внутри глобулы [3].

Такие белки неуязвимы для соответствующего типа концевых протеаз или для обоих типов сразу. Поскольку в большинстве случаев иммобилизация белковой глобулы происходит не за конец цепи, а за какое либо внутреннее звено, для полной очистки чувствительной поверхности биосенсора необходимо присутствие в регенерирующем растворе обоих типов концевых протеаз. В то же время сами эти протеазы обычно устойчивы к своему собственному воздействию, но уязвимы для протеаз другого типа. И, наконец, это довольно дорогие белки, не всегда доступные для приобретения. В то же время удельная активность таких ферментов обычно невысокая, и для эффективного удаления белков за приемлемое время их нужно применять в большом количестве.

Известен способ регенерации оптических элементов биосенсора путем гидролиза иммобилизованного протеина с помощью раствора протеолитического фермента Проназа Е. Раствор указанного фермента с концентрацией 1 мг/мл готовился на буферном растворе состава - 20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлористого натрия, рН 7,2.

Чип помещали в раствор примерно на 15-17 часов при комнатной температуре. После этого его промывали в дистиллированной воде. Был получен удовлетворительный уровень восстановления свойств чипа, однако основным недостатком описанного метода является большой расход протеолитического фермента, его высокая стоимость (http://www.sigmaaldrich.com/life-science/biochemicals/biochemical-products.html?TablePage=16410626) и отсутствие в России производства этого препарата. В связи с этим, стоимость восстановления работоспособности оптического чипа по данному методу получается слишком высокой [4].

В соответствии с изобретением описывается способ восстановления чувствительного слоя биосенсора путем многостадийной обработки его раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буферном растворе состава трис-HCl 50 мМ, CaCl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, Рн 8,0 при температуре раствора 35-40 С° с последующей экспозицией и последовательной промывкой чувствительного слоя сначала додецилсульфатом и затем водой после каждой стадии.

Общая фракция протеаз из гепатопанкреаса камчатского краба представляет собой весьма эффективный набор ферментов, предназначенный и высоко адаптированный для разрушения и превращения в олигопептиды и одиночные аминокислоты любых белковых молекул. Эта смесь способна гидролизовать любые белки вне зависимости от их первичной и вторичной структуры, с весьма высокой скоростью и при температуре от +2°С и выше. Эти свойства обусловлены условиями обитания и физиологией камчатского краба и оптимизированы за миллионы лет эволюции. Общая фракция протеаз является побочным результатом при переработке камчатского краба в пищевые продукты, поэтому стоимость ее не высока [7].

Согласно литературным данным [6], оптимальными условиями для хранения и действия ферментного препарата коллагеназы краба являются следующие: для хранения - фосфат калия 100 мМ, цитрат калия 50 мМ (рН 4,8); а для работы трис-HCl 50 мМ, CaCl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, (рН 8,0). Наилучшая активность препарата достигается при температуре 35-40°С.

Задачей изобретения является разработка способа восстановления чувствительного слоя биосенсора.

Непосредственно процедура регенерации чувствительного слоя биосенсора производится следующим образом.

Использованный чип биосенсора освобождают от защитной оболочки, если она имеется. Затем чип помещают в герметически закрываемый контейнер минимального объема, достаточного, чтобы чип уместился в нем целиком. Готовят раствор общей фракции протеаз гепетопанкреаса камчатского краба в буферном растворе состава трис-HCl 50 мМ, CaCl2 3 мМ, NaCl 100 мМ (рН 8,0). Температуру раствора поддерживают в диапазоне 35-40°С. Для этого навеску сухого лиофилизированного препарата растворяют до концентрации 0,1-0,01 мг/мл. Меньшие значения приводят к увеличению длительности процедуры, а большие к перерасходу препарата. Полученный раствор заливают в контейнер с помещенным в него чипом так, чтобы чувствительная поверхность чипа была полностью покрыта полученным раствором, и крышку контейнера герметически закрывают. Контейнер помещают в термостат при температуре 35-40°С. Через 24 часа экспозиции чип извлекают из контейнера с раствором протеаз и промывают в растворе додецилсульфата натрия в течение одного часа, затем 5 минут в проточной дистиллированной воде и опять помещают в раствор протеаз. Такой цикл повторяют три раза, после чего чип промывают один час в проточной дистиллированной воде. Таким образом, общая длительность восстановления чипа составляет около 76 часов. Раствор протеаз гепатопанкреаса камчатского краба сохраняет пригодность для работы в течение одного месяца с момента растворения при условии хранения при температуре не выше 8°С [6, 7].

После окончательной промывки оптические поверхности чипа продувают очищенным сжатым воздухом для удаления пылевых загрязнений, возвращают чип в защитную оболочку и помещают в пластиковый пакет для хранения. Для оценки качества восстановления чип помещают в биосенсор и убеждаются в том, что положения линий сенсограмм соответствуют по положению линиям, характерным для интактного декстрана или приближается к таковому. Для оценки количества карбоксильных групп проводят контроль преконцентрации какого либо эталонного липида. Если скорость преконцентрации липида заметно снижена, можно восстановить количество карбоксильных групп следующей процедурой:

Вся процедура регенерации чувствительной поверхности может производиться непосредственно в биосенсоре, поскольку применяемые растворы (раствор протеаз, раствор додецилсульфата и вода) не вызывают коррозии и не разрушают пластики, или проводиться отдельно, во вспомогательных пробирках или специально приспособленных емкостях. При проведении регенерации вне прибора снимаются ограничения на длительность операций и снижаются требования к удельной активности комплекса протеаз. Длительность процедур при этом можно доводить до нескольких суток без ущерба для производительности.

Экспериментальная проверка показала, что общая фракция протеаз гепатопанкреаса камчатского краба быстро и эффективно удаляет с чувствительной поверхности чипа биосенсора более 99% ранее иммобилизированного белка. При этом на освобожденный от результатов предыдущей посадки чип можно посадить новую порцию белка в количестве не менее 90% от того, который садится на новый чип.Дополнительного увеличения числа карбоксильных групп на декстране чипа не понадобилось.

Используемая в описываемом способе общая фракция протеаз гепатопанкреаса камчатского краба имеет высокую протеолитическую активность и низкую цену, поскольку производится в большом количестве как побочный продукт пищевой промышленности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Патент RU №2027181.

2. maxXbond: Первая система регенерации для переплетенных ДНК-колонок https://www.applichem.com/ru/o-produktakh/maxxbond-pervaja-sistema-regeneracii-dnk-kolonok/.

3. Handbook of Proteolytic Enzymes / Eds Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. London: Acad. Press, 1998.

4. Ronald С. Chatelier, Thomas R. Gengenbach, Hans J. Griesser, Michael Brigham-Burke, t and Daniel J. O'Shannessyt'(1995). A General Method to Recondition and Reuse BIAcore Sensor Chips Fouled with Covalently Immobilized Protein/Peptide. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 229, 112-118.

5. Патент RU №2239827.

6. ТУ 2639-001-45554109-98. Препарат ферментный коллагеназа из гидробионтов.

7. Патент RU №2280076.

1. Способ восстановления чувствительного слоя биосенсора путем обработки его раствором фермента, отличающийся тем, что в качестве раствора фермента используют раствор общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-HCl 50 мМ , CaCl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С, и процесс ведут в несколько последовательных стадий путем обработки чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в указанном растворителе при температуре в диапазоне 35-40°С с последующей экспозицией и последовательной промывкой чувствительного слоя додецилсульфатом, растворенным в том же буфере в концентрации 0,1 %, а затем водой на каждой стадии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что цикл обработки проводят трижды.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения разжиженной биомассы, предусматривающий получение материала биомассы из сахарной свеклы и/или сахарного тростника, разжижение упомянутой биомассы ферментной смесью.

Изобретение относится к способу идентификации улучшенных вариантов белка. Способ включает тестирование множества вариантов белка с единичными заменами в первом тесте первого свойства и во втором тесте второго свойства.

Изобретение относится к области биохимии и биотехнологии. Проводят дробление, просеивание лигноцеллюлозного материала и отбор гранул с размером частиц от 0,08-0,1 мм.
Изобретение относится к области биохимии и представляет собой способ выделения эндонуклеазы из яда кобры. Сначала проводят гель-фильтрацию раствора яда среднеазиатской кобры (Naja naja oxiana) на сверхмелком сефадексе G-75, затем хроматографию эндонуклеазы на SP-сефадексе C-25, диализ выделенного фермента с добавлением балластного белка, стерилизацию и лиофилизацию.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения глоботриозы заключается в ферментативном переносе галактозного мономера от донора галактозила на лактозу, выполняющую роль акцептора.

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Способ предусматривает использование рибонуклеазы бактериальной 7P для увеличения эффективности подавления размножения РНК- и ДНК-содержащих вирусов для лечения острых вирусных заболеваний млекопитающих и теплокровных животных.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3852 - продуцента фитазы. Рекомбинантный штамм получен путем трансформации штамма Yarrowia lipolytica Polf ATCC MYA-2613 и содержит ген фитазы PhyA Obesumbacterium proteus.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения гидролазы эфиров альфа-аминокислот путем биосинтеза рекомбинантными бактериями. Для осуществления способа сконструирован рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-11271 - продуцент гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, полученный путем трансформации штамма-реципиента Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO 1, содержащей ген aehR гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915, не модифицированный на 5′-конце последовательностью, кодирующей полигистидиновый «хвост», и находящийся под контролем промотора Т7, а также ген устойчивости к канамицину Kan.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам переработки шкур рыб для получения гиалуроновой кислоты и коллагена. Способ предусматривает следующее.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма Escherichia coli ВКПМ В-11246 - продуцента гидролазы эфиров альфа-аминокислот из Xanthomonas rubrilineans ВКПМ В-9915 и способа микробиологического синтеза такой гидролазы.
Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно противовирусному средству. Способ получения противовирусного средства проводят путем приготовления посевного мицелия базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer, приготовления жидкой питательной среды, содержащей воду, в качестве источников углерода - растительное масло и мелассу, в качестве источника азота - кукурузную муку, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия и сульфат магния, ее стерилизации, засева приготовленным посевным мицелием стерильной жидкой питательной среды, культивирование в ней базидиомицета в аэробных условиях, полученную погруженную культуру разделяют на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость, из которой выделяют сгусток посредством добавления к последней этилового спирта, который отжимают, высушивают и измельчают с получением противовирусного средства, при определенных условиях.
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 продуцирует мальтогенную α-амилазу и депонирован в ВКМ ИБФМ им.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Fusarium sambucinum, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения пищевой грибной биомассы с высоким содержанием белка.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутантного штамма Glarea lozoyensis и его применения. Мутантный штамм получен путем воздействия на штамм Glarea lozoyensis АТСС 20957 нитрозогуанидином и депонирован в CGMCC под №CGMCC 2933.
Способ обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 in vitro включает предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, обеспечение возможности формирования сферул и обнаружение сферул, заполненных эндоспорами.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению препаратов кератиназы, и может быть использовано для получения препаратов кератиназ, применяемых в медицине, косметологии, легкой промышленности и сельском хозяйстве.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает приготовление посевного мицелия базидиомицета, выбранного из группы Flammulina velutipes (Curtis) Singer и/или Hericium erinaceus (Bull.) Pers.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов - обладает способностью продуцировать протеолитические и амилолитические ферменты.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм одноклеточных водорослей Dunaliella salina IPPAS 295 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антиоксидантной активностью, депонирован в коллекции культур микроводорослей Института физиологии растений им.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала содержит глюкозу, агар бактериологический, пептон мясной, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, хлористый натрий, углекислый натрий, L-цистин, тиогликолевую кислоту и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала. 1 табл., 2 ил., 4 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-НСl 50 мМ, СаСl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С. Процесс ведут в несколько последовательных стадий раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в указанном растворителе при температуре в диапазоне 35-40°С с последующей экспозицией. Затем чувствительный слой биосенсора последовательно промывают додецилсульфатом, растворенным в том же буфере в концентрации 0,1, а затем водой на каждой стадии. При этом процесс обработки проводят трижды. Изобретение позволяет сократить продолжительность процесса. 1 з.п. ф-лы.

Наверх