Способ экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции в полиакриламидном геле. Способ заключается в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере. Экстракцию саркоплазматических белков проводят с использованием буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris). Для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris). После этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5% концентрирующем и 11% разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов. Способ позволят улучшить разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков, сократить длительность процесса электрофракционирования и дает возможность разделять саркоплазматические и миофибриллярные белки свинины и говядины. 2 ил., 1 пр.

 

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции в полиакриламидном геле.

Метод зонального электрофореза в полиакриламидном геле широко используется при исследовании биологических макромолекул. Его высокая разрешающая способность позволяет не только разделять смеси, содержащие большое число разных видов макромолекул, но и характеризовать их по заряду, молекулярной массе и конфирмации (Гааль Э. Электрофорез в разделении биологических макромолекул: Пер. с англ. / Э.Гааль, Г.Медьеши, Л.Верецкеи - М.: Мир, 1982. С.74) [1].

Наиболее близким к заявляемому является способ экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков свинины на фракции методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле предложенный Aro A. Juan М. (Aro A. Juan М. Влияние времени обработки органическими кислотами на протеолитические изменения в сухих и полусухих колбасах / Aro A. Juan М., Chaina S. Amelia, Segura P. Roger, Sekikava Mitsuo // Материалы 56-го Международного конгресса по вопросам науки и технологии мясной промышленности. Пер. ВНИИМП. (15-20 августа, 2010 г., Джеджу, Корея). - М.: Изд-во ВНИИИМ - 2010. С.610.) [2].

Согласно данному способу четыре грамма исследуемого образца свинины гомогенизировали в 40 мл 0,03 М калий-фосфатного буфера (pH 7,4) в течение 2 мин при 13500 об/мин. Гомогенат центрифугировали при 10000 об/мин и температуре 4°C. Полученный супернатант содержал саркоплазматические белки. Из оставшегося осадка путем гомогенизации в течение 2 мин в растворе, содержащем 2 М молярную мочевину и 1% 2-меркаптоэтанол, экстрагировали миофибриллярные белки. Гомогент центрифугировали в тех же условиях, полученный супернатант содержал миофибриллярные белки.

Образцы саркоплазматических белков разводили 1:1 с помощь буфера для электрофореза и нагревали при 100°C в течение 5 мин. Электрофорез проводили в 12,5% разделяющем и 6% концентрирующем геле, при напряжении 120-150 В, в течение 4-6 часов. В каждую электрофоретическую ячейку было закапано по 10 мкл исследуемых образцов. Окраску проводили с помощью кумасси бриллиантового голубого R-250, 30% метанола и 10% уксусной кислоты. Молекулярные массы белков определяли с помощью пропускания через гель белков с известной массой. Гель после электрофореза отмывали и фотографировали.

Полученные согласно данному способу электрофореграммы не дают четкой картины разделения белковых треков из за неэффективной экстракции белков и чрезмерной плотности геля. Также необходимо отметить длительность процесса фракционирования - 4-6 часов, селективность способа - возможность электрофракционирования только белков свинины.

Недостатками данного способа являются:

- недостаточно четкое разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков;

- длительность процесса электрофоретического фракционирования;

- возможность фракционирования только белков свинины.

Задачей изобретения является улучшение разделения белковых зон мясных экстрактов, уменьшение длительности процесса электрофракционирования и унификации исследований различных видов и качественных групп мяса.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в известном способе экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле, заключающемся в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере, согласно изобретению проводят экстракцию саркоплазматических белков, используя буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), а для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6 в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), после этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5% концентрирующем и 11% разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов.

Разработанные условия экстракции с использованием 0,3 М сахарозы 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6 и 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6 позволяют полностью экстрагировать саркоплазматические и миофибриллярные белки свинины и говядины из исследуемого материала. Хорошая экстракция дает возможность получить более четкое и воспроизводимое разделение белковых зон мясных экстрактов, чем при использовании распространенных способов экстракции, например, с использованием неионных детергентов и хаотропов (мочевина, гуанидиния хлорид), а также позволяет отказаться от нагрева пробы перед анализом.

Проведенными исследованиями установлено, что при использовании 5% концентрирующего геля при напряжении 90 В и разделяющего 11% геля при напряжении 300 В улучшается подвижность белковых макромолекул, а также уменьшается время электрофоретического фракционирования. Это происходит за счет уменьшения плотности геля и усиления напряжения, приходящегося на гель. Таким образом, подобранные условия являются оптимальными для электрофоретического разделения белков мяса.

Пример. Два грамма измельченного на часовом стекле мяса гомогенизировали в 5 мл 0,3 М сахарозы 0,05 М EDTA, 0,1 М Трис, pH 7,8. Экстракт перемешивают в течение 1 ч при 4°C на шейкере, затем центрифугировали при 2500 об/мин при 4°C в течение 10 минут. Полученный в результате центрифугирования супернатант содержит саркоплазматические белки. Осадок ресуспендировали в 5 мл 0,05 М EDTA, 0,15 М Трис, pH 7,6, перемешивали в течение 10 минут при 4°C, гомогенат фильтровали через три слоя марли, чтобы удалить остатки соединительнотканного белка. Неочищенный миофибриллярный белок очищали путем диализа против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCl) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris). Каждый очищенный миофибриллярный белок центрифугировали при 2500 об/мин при 4°C 10 минут. Окончательно миофибриллярные белки растворяли в 0,6 М KCl, 0,1 М Трис, pH 7,8. Миофибриллярные и саркоплазматические белки хранят при -18…-20°C.

Готовят блок-пластины полиакриламидного геля толщиной 1 мм, размером 125×125 мм, состоящие из 11% разделительного геля высотой 100 мм и 5% концентрирующего геля высотой 25 мм. В качестве состава для буфера нанесения используют - 1 М Трис-HCl, pH 6,8, 10%-ный раствор DS-Na, глицерин, вода, 2-мсркаптоэтанол и 0,5%-ный раствор бромфенолового синего. Буфер нанесения и экстракты белков наносят на гребенку с двадцатью ячейками и количестве 6 мкл каждого образца.

Электрофорез проводят в ТРИС-глициновом буфере pH 8,3. В качестве стандарта белков на гелевых пластинах с исследуемыми пробами используют коммерческий препарат белков с известными молекулярными массами.

Прибор для электрофореза с нанесенным белком и камерами, заполненными электродным буфером, устанавливают в холодильник и подключают к источнику питания в соответствии с инструкцией. Устанавливают напряжение 90 В на гель 125×125×1 мм. Когда белок войдет в разделяющий гель, напряжение увеличивают до 300 В на пластину и поддерживают его на таком уровне до окончания электрофореза. Контроль за движением белка осуществляют по движению бромфенолового синего, который идет впереди белкового фронта. При описанном режиме электрофореза время деления белка составляет 2 часа.

По окончании электрофоретического разделения белков полученную гелевую пластину окрашивают раствором Кумасси R-250 в течение 15 мин. Отмывку геля от красителя проводят в уксусно-спиртовой смесь, завершают отмывку в 10% уксусной кислоте.

Отмытый гель фотографируют. На фиг.1 представлены электрофореграммы саркоплазматических (а) и миофибриллярных (б) белков говядины. На фиг.2 представлены электрофореграммы саркоплазматических (а) и миофибриллярных (б) белков свинины. Полученные электрофореграммы свидетельствуют о высокой разделяющей способности заявляемого способа.

Таким образом, заявляемый способ позволят улучшить разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков, сократить длительность процесса электрофракционирования и дает возможность разделять саркоплазматические и миофибриллярные белки как свинины, так и говядины.

Способ экстракции и разделения саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции, заключающийся в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере, отличающийся тем что, для экстракции саркоплазматических белков используют буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), а для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 0,15 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия (KCI) и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан (Tris), после этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5% концентрирующем и 11% разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно биологически активным добавкам (БАД), и в частности к пищевым продуктам на основе БАД. Пищевой продукт для питания лиц, подверженных интенсивным физическим нагрузкам содержит следующие компоненты, масс.%: пептиды гидролизата головного мозга КРС с молекулярной массой от 0,2 до 10 кДа - 0,5-10,0, белки сыворотки молока - 5,0-30,0, гидролизаты белков сыворотки молока - 5,0-20,0, гемоглобин - 0,5-5,0, сухой концентрат куриного бульона - 1,0-5,0, среднецепочечные триглицериды - 1,0-10,0, линолевую кислоту - 1,0-10,0, лецитин - 0,5-5,0, янтарную кислоту - 0,05-0,5, фумаровую кислоту - 0,025-0,25, инулин - 1,0-10,0, лактит - 1,0-10,0, стевиозид - 0,01-0,1, комплекс витаминов В - 0,01-0,1, топинамбур пищевой сушеный - 1,0-10,0, аскорбиновую кислоту -0,05-0,5, йодированные молочные белки - 0,002-0,015, обогатитель - минеральный кальциевый - 0,5-5,0.
Изобретение относится к области клеточной технологии, биотехнологии, пищевой промышленности. Предложен способ культивирования миобластов in vitro для получения биомассы миоцитов, где в качестве культивируемых клеток используют иммортализованные миобласты животного, клетки выращивают с использованием питательной среды с белками неживотного происхождения, а также содержащей гемоглобин, при этом клетки поддерживают в пролиферативном состоянии с помощью факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов для образования биомассы, а затем вызывают дифференцировку миобластов в миоциты путем удаления из среды факторов роста фибробластов и/или гепатоцитов, а в случае нормальных по экспрессии миостатина клеток в среду добавляют ингибитор миостатина.

Изобретение относится к пищевой и биотехнологической промышленности, а именно к получению белково-пептидных модулей, используемых для производства продуктов функционального и специализированного питания для лиц, подверженных интенсивным физическим нагрузкам.
Изобретение относится к способу сохранения влаги в приготовленной пище с помощью пептида. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности. .

Изобретение относится к способу регенерации белка из мышц животных и к получаемому таким образом продукту. .

Изобретение относится к пищевой и мясной промышленности, а именно к производству белково-жировых эмульсий (БЖЭ) и мясопродуктов с их использованием. .

Изобретение относится к мясоперерабатывающей промышленности, в частности к предварительной обработке сырья в колбасном и консервном производствах. .

Изобретение относится к мясоперерабатывающей промышленности. Для получения белковой композиции, имеющей пониженное содержание кальция и натрия по сравнению с исходными уровнями кальция и натрия, из полученного обвалкой мяса птицы, содержащего жир, костную массу и белок, где содержание постного мяса составляет от 65 до 85 мас.%, способ реализуют следующим методом. Измельчают мясо птицы в воде. Добавляют кислоту пищевого качества к измельченному мясу птицы для доведения pH до уровня от 3,6 до 4, в результате чего белок солюбилизируется, а кальций остается в нерастворимой форме. Отделяют твердый жир от солюбилизированного белка, причем кальций отделяется вместе с твердым жиром от белка. Добавляют щелочь пищевого качества к жиру для нейтрализации кислоты в жире и к солюбилизированному белку для нейтрализации кислоты в белке и осаждении белка, в результате чего натрий остается в растворимой форме. Выделяют из осадка белковую композицию, имеющую пониженное содержание кальция и натрия по сравнению с исходными уровнями кальция и натрия, причем в белковой композиции содержание белка составляет 14 мас.% или более, а содержание жира составляет менее 10 мас.%, причем менее 10 мас.% жира стабилизируется против окисления. Изобретение обеспечивает высокий выход белка, пониженное содержание кальция и натрия в продукте по сравнению с исходным их содержанием, продукт удовлетворительного цвета с одновременным предотвращением проблемы, обусловленной присутствием микроорганизмов. 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к мясной промышленности, а именно к производству белково-жировых эмульсий и мясопродуктов с ее использованием. Способ предусматривает обработку в устройстве для тонкого измельчения клейковины белка пшеницы и жирного сырья с добавлением воды. В качестве жирного сырья используют внутренний жир, прирези и обрезки шпика, полученные при разделке и жиловки мясного сырья для мясных изделий. Клейковина белка пшеницы, вода и жирное сырье взяты при следующем соотношении 1:4:3 соотвественно. Клейковину белка пшеницы используют в охлажденном состоянии при температуре 10-15°C, измельчают в куттере со скоростью движения ножей 3000 об/мин, одновременно добавляют воду с температурой не ниже 20°C, вводят охлажденное жирное сырье с температурой до 4-8°C и продолжают куттеровать до температуры 27±2°C. Полученную смесь выгружают слоем, не превышающим 40 см, для более быстрого остывания и охлаждают до температуры 4±2°C. Обеспечивается повышение функционально-технологических показателей продукта, обогащение макро-, микроэлементами и витаминами и расширения ассортимента группы вареных колбасных изделий. 12 ил., 3 табл.

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение при разделении саркоплазматических и миофибриллярных белков мяса на фракции в полиакриламидном геле. Способ заключается в экстракции белков путем гомогенизации и центрифугирования образцов мяса в буферах-экстрагентах и последующем фракционировании полученных экстрактов в концентрирующем и разделяющем полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в электродном буфере. Экстракцию саркоплазматических белков проводят с использованием буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,3 М сахароза, 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота, 0,15 М трисгидроксиметиламинометан. Для экстракции миофибриллярных белков используют буфер-экстрагент pH 7,6, в состав которого входит 0,05 М этилендиаминтетрауксусная кислота, 0,15 М трисгидроксиметиламинометан, с последующим диализом экстракта миофибриллярных белков против раствора pH 7,8, содержащего 0,6 М хлорид калия и 0,1 М трисгидроксиметиламинометан. После этого проводят электрофракционирование экстрактов саркоплазматических и миофибриллярных белков в 5 концентрирующем и 11 разделяющем полиакриламидном геле при напряжении 90 В на концентрирующий гель и 300 В на разделяющий гель в течение 2-2,5 часов. Способ позволят улучшить разделение саркоплазматических и миофибриллярных белков, сократить длительность процесса электрофракционирования и дает возможность разделять саркоплазматические и миофибриллярные белки свинины и говядины. 2 ил., 1 пр.

Наверх