Способ получения препаративных количеств антигенов флоэмно-ограниченных вирусов

Изобретение относится к области биохимии, в частности к cпособу получения препаративных количеств вирусного антигена - белка вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК, PLRV), в составе химерных вирусных частиц, имитирующих вирионы ВСЛК, включающий создание рекомбинантной ДНК, содержащей кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), принадлежащего к тобамовирусам, где кДНК ВПЖТ находится под контролем растительного промотора, на ее конце имеется терминатор транскрипции, а ген белка оболочки ВПЖТ заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК, включающий создание агробактериального вектора (плазмиды) pCambia 1300, способного встраиваться в геном растения-хозяина и вызывать системную инфекцию, перенос созданной рекомбинантной ДНК в агробактериальный вектор pCambia, трансформацию растения-хозяина Nicotiana benthamian агробактериальным вектором pCambia, размножение химерного вируса, состоящего из РНК вируса, в растении-хозяине Nicotiana benthamian, выделение химерного вируса, содержащего кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), ген оболочки которого заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК, из зараженных листьев растения-хозяина Nicotiana benthamian. Раскрыт способ получения антисыворотки к капсидному белку ВСЛК, включающий иммунизацию животных вирусными частицами, полученными указанным способом. Изобретение позволяет получать 2-4 мг вирусной химеры из 11 г зараженных листьев. 2 н. п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и фундаментальной вирусологии.

Объект заявки представляет собой способ получения препаративных количеств вирусных частиц, имитирующих вирионы вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК, Potato leafroll virus - PLRV) для получения антисыворотки к ВСЛК. ВСЛК вызывает снижение урожайности картофеля от 20 до 70%. Клубни, собранные от больных растений, более мелкие и имеют внутренние некрозы, то есть теряют товарный вид и плохо хранятся. Вторичная инфекция, которая происходит при выращивании картофеля из зараженных клубней, приводит к еще большим потерям.

Уровень техники

Вирус передается зеленой тлей Myzus persicae или прививками от зараженного растения, является флоэмно-ограниченным, в связи с чем крайне плохо накапливается в растении и представляет серьезную проблему для выделения в лабораторных условиях. Его выход составляет всего 0.4-1 мг на 1 кг зараженного материала.

Наиболее известный аналог, представляющий эффективный способ выделения ВСЛК - работа, опубликованная в 1979 г.: Y.Takanami, S.Kubo "Enzyme-assisted purification of two phloem-limited plant viruses: tobacco necrotic dwarf and potato leafroll (PLRV)" J.Gen.Virol. (1979), 44, 153-159. Этот способ позволяет выделять до 1,3 мг вируса из 1 кг зараженных листьев картофеля.

Дальнейшие попытки получения препаративных количеств ВСЛК в основном сводились к его пост-экстракционной очистке. Например, в работе A. Poison Purification of Potato Leaf Roll Virus // Preparative Biochemistry, 1993. - V.23, N 1-2. P.267-271 приводятся данные по эффективной очистке ВСЛК, который был выделен из зараженных растений. Эффективность метода заключается в получении препарата вируса со степенью очистки более 20%. При этом общее количество ВСЛК остается на уровне 1,3 мг вируса на 1 кг зараженного растительного материала.

Вирусологами обсуждается другой путь для решения проблемы получения препаративных количеств частиц труднодоступных вирусов. Это создание химер - генноинженерных конструктов, которые содержат РНК (кодирующую последовательность) одного вируса, а в качестве эпитопа (поверхностный белок) - капсид вируса, к которому требуется получать антиген.

На эту тему существует несколько технологических решений. Как правило, все они характеризуют отдельные стороны получения химерных белковых конструктов либо отдельные направления дальнейшего использования таких частиц.

Например, Европейским патентом ЕР 1758925 "RECOMBINANT ICOSAHEDRAL VIRUS LIKE PARTICLE PRODUCTION IN PSEUDOMONADS" защищено право на использование технологии получения рекомбинантных частиц икосаэдрических вирусов в результате клеточной экспрессии капсидных белков таких вирусов в псевдомонадах в условиях in vivo.

Известна технология получения РНК вируса скручивания листьев картофеля, которые кодируют его капсидный белок (Европейский патент ЕР 0370710А2 "DNA SEQUENCE ENCODING THE COAT PROTEIN GENE OF POTATO LEAFROLL VIRUS"). В данном случае количественный выход вирусных частиц, которые могут имитировать вирус PLRV для лабораторных целей остается гипотетическим.

Всего на тему получения химерных вирусных частиц, в том числе для разработки иммунохимических технологий диагностики ВСЛК, было обнаружено 9 патентов и 11 печатных работ. Существующие аналоги заявляемого способа получения препаративных количеств антигенов флоэмно-ограниченных вирусов не позволяют получать ВСЛК более 1,3 мг вируса на 1 кг зараженного растительного материала.

В то же время массовую диагностику зараженности сельскохозяйственных растений традиционно проводят методами иммунохимической или иммуноферментной молекулярной диагностики.

Раскрытие изобретения

Поскольку для получения антисыворотки необходимы миллиграммовые количества высокоочищенного вирусного препарата, в данном изобретении решалась задача разработки способов получения вирусных частиц, состоящих из белка оболочки ВСЛК в достаточных количествах для иммунизации лабораторных животных.

Для решения заявленной задачи были использованы генноинженерные подходы, выстроенные в логическую цепочку.

Была разработана оригинальная генноинженерная конструкция.

Для экспрессии белка оболочки ВСЛК используется кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV, родственный ВТМ), который принадлежит к тобамовирусам и способен накапливаться в количестве до 7 г на 1 кг зараженного материала. В кДНК ВПЖТ, которая находится под контролем растительного промотора, на конце имеется терминатор транскрипции.

1. Учитывая вышеизложенное, была произведена замена гена белка оболочки ВПЖТ на ген мажорного белка оболочки ВСЛК.

2. Полученная конструкция была перенесена в агробактериальный вектор (плазмиду) pCambia 1300. Такой плазмидой была трансформирована агробактерия штамма GV3101, способная эффективно встраивать кДНК химерного вируса в хромосому растительной клетки.

3. Новая рекомбинантная ДНК несла антиген ВСЛК (капсидный белок) и была способна встраиваться в геном растения-хозяина и системно размножаться в нем.

4. После транскрипции РНК химерного вируса начала транскрибироваться с помощью тобамовирусной полимеразы, и химерный вирус получил распространение по всем тканям растения, не ограничиваясь флоэмой. За накоплением вируса в зараженном растении мы следили методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, методом иммунной электронной микроскопии, иммуноферментного анализа, просвечивающей электронной микроскопии и УФ-спектроскопии.

Основным результатом работы является то, что технология получения препаративных количеств целевых антигенов флоэмно-ограниченного вируса ВСЛК стала многократно проще и эффективней: нет зависимости от природного переносчика ВСЛК - персиковой тли; выделение химерных вирусных частиц из всего листа растения проще, чем выделение ВСЛК, который нужно экстрагировать из жестких проводящих пучков. Количественным эффектом нашей технологии можно считать то, что выделение 2-4 мг вирусной химеры проводили всего лишь из 11 г, а не килограмма зараженных листьев картофеля. Полученные таким способом препаративные количества вируса получаются химически более чистыми, а их выделение становится менее трудоемким.

Важно, что накопившийся в растении капсидный белок ВСЛК упаковывает РНК вируса ВПЖТ в икосаэдрический вирион. По своим спектрофотометрическим и электронно-микроскопическим характеристикам химерный вирус подобен ВСЛК, стереометрия его антигенных детерминант должна быть близка таковой дикого вируса, поскольку она определяется общим механизмом сборки вирусных частиц, что является необходимым условием для использования такой частицы в качестве антигена для иммунизации лабораторных животных.

Полученный препарат химеры ВСЛК используется для производства антисыворотки, использующейся для диагностического определения растений инфицированных ВСЛК. Двух кроликов иммунизовали трижды препаратами ВСЛК с полным (1 раз) и неполным (1 раз) адъювантами кролика, вводя под кожу по 300-500 мкг препарата ВСЛК. Анализ антисывороток непрямым иммуноферментным анализом (фиг.1) показал, что достоверные отличия иммунологической реакции начинаются после разведения ее в 100-30000 раз.

Наблюдаемый неспецифический фон при малых разведениях антисыворотки мы объясняем примесью антител на хозяйские антигены. Эту проблему обычно снимают истощением антисыворотки соком растения-хозяина. Несмотря на то, что мы этого не делали, результаты ИФА однозначно говорят о высоком титре целевых антител в антисыворотке.

Фрагмент длиной 627 нуклеотидов (3572-4199), содержащий ген белка оболочки PLRV, был амплифицирован с матрицы pBNUPHO, содержащей инфекционную копию канадского штамма PLRV GenBank: D 13954.1, с помощью праймеров:

5' TTCTCGAG3572ATGAGTACGGTCGTGGTTAAAGGAAACGTCAACGG-3' PLRV-CPΔ4-p 5' -TTGGTACC4199CTATTTGGGGTTTTGCAAAGCCA-3' PLRV-CP-m

Дополнительно был инактивирован транспортный ген PLRV р4, который находится полностью внутри гена белка оболочки р3 экспрессируется с той же субгеномной РНК, но находится в другой рамке. Для этого в праймер PLRV-CPA4-p были внесены замены Т на С (подчеркнуты), которые элиминировали два стартовых ATG кодона в р4, но не изменяли аминокислотный состав р3. (N Asp aat-aac)

Полученный PCR фрагмент был порезан по сайтам XhoI-Acc65I и заклонирован в плазмиду pCambia-4351 по сайтам рестрикции XhoI-BsrGI, полученную конструкцию назвали pCambia-4351-PLRV-CP (фиг.2).

Описание плазмиды pCambia-4351

Инфекционная копия тобамовируса TVCV50 (NCBI Reference Sequence: NC_001873.1) р1С4351, содержащая репортерный ген GFP вместо белка оболочки, поставленная под контроль промотора гена актина 2 из Arabidopsis thaliana (GenBank accession no. BRU 03387), (Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., and Gleba, Y. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 6852-6857), была переклонирована из бинарного вектора BV1 в другой бинарный вектор pCambia 1300 и названа pCambia-4351.

Затем конструкцией pCambia-4351-PLRV-CP трансформировали агробактерии штамма GV 3101, наращивали ее в среде 2YT, содержащей антибиотики (Rif 50, Gent 25 и Km 100 мкг/мл), при температуре 28°С в течение ночи. Клетки высаживали и ресуспендировали в буфере для инфильтрации (10 mM MgCL2+10mM MES рН6.5) до плотности 0.2 при OD600. Суспензию агробактерии впрыскивали шприцом в межклетники листьев растения Nicotiana benthamiana в присутствии агробактерии с антисайленсинговыми генами р19 (TBSW) Р1-HcPro (PVA) или без них. Вектор оказался способен системно заражать N. benthamiana и показывать высокий титр белка оболочки ВСЛК в верхних листьях растения (фиг.3: 1 - зона инфильтрации, 2 - некротизация флоэмы, 3 - накопление вируса). На фотографии можно увидеть, что в молодых листьях развиваются симптомы накопления вирусной химеры. Кроме того, в растениях некротизируются стебли листьев из-за закупорки флоэмных проводящих пучков каллозой, что свойственно настоящему ВСЛК.

В зараженных листьях первого, второго и третьего ярусов, начиная с верхушки, делали высечки одинаковой площади, растирали зеленый материал в 3 объемах 10 mM TrisHCl pH 7.5. Стрелочкой обозначена зона, соответствующая подвижности белка оболочки PLRV (фиг.4). Количество белка оболочки оценивали денситометрически относительно известного количества BSA. Получилось, что листья верхнего яруса содержат белка оболочки PLRV больше 1 mg/ml, а второго яруса уже в 4 раза меньше.

Результаты тестирования различных растительных препаратов на содержание белка оболочки PLRV в листьях твердофазным ИФА
Объект исследования Концентрация PLRV мкг/г сырого веса
1 Листья картофеля 0,12-0,32
2 Накопление белка оболочки PLRV в зоне агроинфильтрации листьев N.benthamiana плазмидой pBNUP 110 0,1-0,6
3 Накопление белка оболочки PLRV в зоне агроинфильтрации листьев N.benthamiana, pCambia-4351-PLRV-CP 2,4
4 Накопление белка оболочки PLRV в самых верхних листьях N.Benthamiana при системном заражении растения pCambia-4351-PLRV-CP 100

Выделение вирусного препарата

С 30 растений собирали 10-11 г зараженных листьев и выделяли 2-4 мг химерного вируса по методу (Takanami & Kubo, 1979a).

Листья с симптомами гомогенизировали в коммерческом блендере в 0.1 М цитратном буфере, доведенном до рН 7.5 с помощью 0.5 М Na2HPO4 с 0.1% 2 - меркаптоэтанолом и 1% Triton Х-100. Гомогенат листьев перемешивали в этом буфере 30 мин. Дебрис откручивали при 10.000 G, а супер осветляли 1/4 V хлороформа. Вирус высаживали на ультрацентрифуге при 40.000g в течение 90 мин. Осадок растворяли в 1 ml 10 mM TrisHCl pH 7.5 Количество вируса определяли спектрометрически фиг.5 (А260/А280: 1.78; А260/А240: 1.43 (Takanami & Kubo, 1979a). A(0.1%;1 cm) at 260 nm: 8.6 (Takanami & Kubo, 1979a).)

Чистоту вирусного препарата оценивали с помощью электофореза по Лемли (фиг.6).

Электронная микрофотография вирусного препарата

Вирусный препарат разводили в 100 раз, наносили на формваровую подложку и контрастировали 2% уранилацетатом. Ниже приведены электронные микрофотографии химерного вируса, снятые при разном увеличении. Видны икосаэдричекие вирионы размером 25 нм, такие же, как и у настоящего PLRV (фиг.7а и 7в).

1. Способ получения препаративных количеств вирусного антигена - белка вируса скручивания листьев картофеля (ВСЛК, PLRV), в составе химерных вирусных частиц, имитирующих вирионы ВСЛК, включающий следующие стадии:
а) создание рекомбинантной ДНК, содержащей кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), принадлежащего к тобамовирусам, где кДНК ВПЖТ находится под контролем растительного промотора, на ее конце имеется терминатор транскрипции, а ген белка оболочки ВПЖТ заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК;
б) создание агробактериального вектора (плазмиды) pCambia 1300, способного встраиваться в геном растения-хозяина и вызывать системную инфекцию;
в) перенос созданной на стадии (а) рекомбинантной ДНК в агробактериальный вектор pCambia, созданный на стадии (б);
г) трансформацию растения-хозяина Nicotiana benthamian агробактериальным вектором pCambia, полученным на стадии (в);
д) размножение химерного вируса, состоящего из РНК вируса, в растении-хозяине Nicotiana benthamian;
е) выделение химерного вируса, содержащего кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), ген оболочки которого заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК, из зараженных листьев растения-хозяина Nicotiana benthamian

2. Способ получения антисыворотки к капсидному белку ВСЛК, включающий иммунизацию животных вирусными частицами, полученными способом по п.1.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения одноцепочечной кольцевой РНК. Способ включает синтез смысловой цепи и антисмысловой цепи, содержащих нуклеотидную последовательность с неспаренными нуклеотидами на 5'-конце и 3'-конце, и одновременно лигирование нуклеотида на 5'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в смысловой цепи с нуклеотидом на 3'-конце нуклеотидной последовательности с неспаренными нуклеотидами в антисмысловой цепи и, наоборот, с использованием лигазы.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения дрожжевого экстракта, содержащего биологически активную высокополимерную РНК.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Способ определения уровня экспрессии гена МСР1 (CCL2) предусматривает оценку количества его мРНК методом полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с детекцией сигнала в реальном времени в образцах клеток, тканей и биологических жидкостей человека.

Изобретение относится к способу идентификации улучшенных вариантов белка. Способ включает тестирование множества вариантов белка с единичными заменами в первом тесте первого свойства и во втором тесте второго свойства.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой выделенную полинуклеотидную молекулу с функцией rEVE, рекомбинантный вектор экспрессии, экспрессионный шаттл-вектор, клетку-хозяина, а также способы с использованием вышеуказанной выделенной полинуклеотидной молекулы.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ мультиплексной детекции представителей родов Aeromonas и Flavobacterium предусматривает постановку ПЦР в один этап с использованием двух пар синтезированных праймеров к участкам гена малой субъединицы рибосомальной РНК (16S rRNA) в режиме реального времени к участку гена малой субъединицы рРНК Aeromonas: А1 - 5'-TTCGGGCCTTGCGCGATTGG-3' и А2 - 5'-CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3', обеспечивающие амплификацию фрагмента размером 920 п.н.

Изобретение относится к области биотехнологии и сельского хозяйства. В способе растения обрабатывают раствором биологически активного вещества, в качестве которого используют 24-эпибрассинолид.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения неприродных искусственных олигонуклеотидов, потенциально способных образовывать стабильные в физиологических и близких к физиологическим условиях неканонические структуры - несовершенные G-квадруплексы (ImGQ), включающие одну нуклеотидную замену в G4 плоскости в G-квадруплексах (GQ).

Настоящее изобретение относится к иммунологии. Предложен способ получения вакцины против ВИЧ-1 с использованием метода обратного панинга на фаг-презентированной библиотеке ВИЧ-1-специфических антител scFv, полученной на основе мРНК В-лимфоцитов больных, инфицированных ВИЧ-1, и обогащенной с помощью панинга на пептидах ВИЧ-1, и индуцируемых систем экспрессии рекомбинантных белков с эукариотическим гликозилированием.

Изобретение относится к области иммунологии. Предложено антитело, которое специфически связывает гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF), и его антигенсвязывающий фрагмент.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетической инженерии. Предложен способ селекции эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей желаемый уровень интересующего полипептида, включающий трансфекцию клеток гетерологичной нуклеиновой кислотой, содержащей по меньшей мере одну кассету, содержащую по меньшей мере первый полинуклеотид, кодирующий интересующий полипептид, стоп-кодон, расположенный по направлению экспрессии относительно первого полинуклеотида, второй полинуклеотид, расположенный по направлению экспрессии относительно стоп-кодона, кодирующий иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, культивирование клеток-хозяев для экспрессии интересующего полипептида так, чтобы по меньшей мере часть рассматриваемого полипептида экспрессировалась в виде слитого полипептида, содержащего иммуноглобулиновый трансмембранный якорный домен, причем такой слитый полипептид экспонируется на поверхности указанной клетки-хозяине, селекцию клетки по наличию или количеству слитого полипептида, экспонируемого на клеточной поверхности. Изобретение может быть использовано в биотехнологии для селекции высокопродуктивных клеточных линий. 6 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 табл., 11 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа прогнозирования длины тела человека в рамках русской популяции. Представленный способ основан на исследовании ДНК, в котором с помощью метода ПЦР и при использовании определенных праймеров проводят исследование участков генов амелогенина (AML), используя локусы генов секреторного рецептора гормона роста (GSHR), ко-репрессороподобного лигандзависимого ядерного рецептора (LCORL) и связывающего белка циклин-зависимых киназ (CABLES1) в образцах ДНК мужского пола и генов хейджхок-взаимодействующего белка (HHIP) и ядерного белка с цинковыми пальцами (JAZF1) в образцах ДНК женского пола. Вывод о длине тела делается путем подставления полученных значений в определенную формулу и математической обработки результатов исследования. Охарактеризованное решение может быть использовано в геномной дактилоскопии, медицинской генетике, молекулярно-биологических исследованиях в области прогнозирования фенотипических признаков на основании генетических данных в популяции. 7 ил., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой плазмиду pET40CmAP/MBL-T, определяющую синтез гибридного бифункционального полипептида CmAP/MBL-T со свойствами высокоактивной щелочной фосфатазы морской бактерии Cobetia marina (CmAP) и маннан-связывающего лектина С-типа дальневосточного трепанга Apostichopus japonicus (MBL-T). Плазмида включает NcoI/SalI - фрагмент плазмиды рЕТ-40b(+) (Novagen) и фрагмент ДНК размером 2034 пар оснований, который является химерным геном, кодирующим структурные гены щелочной фосфатазы CmAP и маннан-связывающего лектина С-типа MBL-T, соединенных между собой полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность линкера (G)4S(G)4S(G)4SEL. Описан рекомбинантный штамм E.coli Rosetta(DE3)/pET40CmAP/MBL-T, трансформированный указанной плазмидой, - продуцент гибридного бифункционального белка CmAP/MBL-T. Предложен также способ получения гибридного бифункционального белка CmAP/MBL-T c использованием заявленного штамма. Изобретение позволяет получать высокоочищенный препарат гибридного белка CmAP/MBL-T со свойствами рекомбинантной высокоактивной щелочной фосфатазы CmAP и высокоспецифичного маннан-связывающего лектина С-типа MBL-T по отношению к углеводным компонентам гликопротеинов раковых клеток шейки матки и может быть использован для высокочувствительного лектин-иммунноферментного метода ранней дифференциальной диагностики рака шейки матки.3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и генетической инженерии. Предложен геном фага, фагмида и нитчатый фаг для использования в фаговом дисплее, система фагового дисплея, набор и фаговая библиотека для определения продукта экзогенного гена. Изобретение может быть использовано в исследованиях белков и при разработке диагностических и терапевтических средств на основе белков. 6 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии, в частности к автоматическому устройству и способу очистки и выделения целевой нуклеиновой кислоты из биологического образца, причем устройство обеспечивает возможность предотвратить загрязнение выделенной целевой нуклеиновой кислоты от аэрозоля и которое может быть применено ко всем видам оборудования выделения и очистки нуклеиновых кислот из множества биологических образцов, использующего магнитный стержень или мультипипеточный блок, движущийся в двух или трех осевых направлениях. Группа изобретений обеспечивает повышение качества очистки выделенных из биологического образца целевых нуклеиновых кислот от загрязнения их аэрозолем, образующимся из биологического образца, содержащего целевую нуклеиновую кислоту в высокой концентрации, для обеспечения более точных результатов последующих исследований выделенных целевых нуклеиновых кислот. 2 н. и 17 з.п. ф-лы, 19 ил.

Группа изобретений относится к многоканальным устройствам, модифицированным нанослоями анилинсодержащих полимеров. Предложен многоканальный наконечник для выделения нуклеиновых кислот, белков, пептидов и способ изготовления многоканального элемента, входящего в состав многоканального наконечника. Наконечник состоит из стеклянного гексагонального многоканального массива, включающего многоканальные элементы из множества параллельных капилляров. На внутренней поверхности капилляров нанесен сорбционный слой, который состоит из от одного до трех полимерных нанослоев. Многоканальный элемент выполнен с защитным обрамлением из нескольких рядов стеклянных стержней. Стеклянный гексагональный многоканальный массив состоит из уложенных многократно вытянутых единичных многоканальных элементов с диаметром капилляров от 1 мкм и более, рабочей поверхностью до 500 см2, объемом до 500 мкл. Способ изготовления многоканального элемента включает сборку стеклянных трубок в многоканальный пакет, закрепление одного его конца в захвате узла подачи, нагревание в печи другого конца с образованием луковицы и вытяжку до требуемого размера. В процессе формования для получения структур с диаметром канала порядка и меньше 1 мкм осуществляют многократную вытяжку многоканальных элементов, предварительно сформированных укладкой элементов шестигранной формы. Изобретения обеспечивают проведение экспресс-выделения и очистки как нуклеиновых кислот, так и белков, пептидов, а также обеспечивают высокую воспроизводимость результатов. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 9 пр.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу выделения микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы. Способ включает последовательное центрифугирование, ультрафильтрацию и ультрацентрифугирование культуральной конденсированной среды. Растворяют полученный осадок в фосфатно-солевом буфере и повторно центрифугируют. Растворяют полученный осадок в воде. Подвергают полученный раствор электрофорезу в свободном потоке на приборе FFE System. Проводят ультрацентрифугирование каждой из полученных фракций. Очищают каждую фракцию от клеточных стенок экзосом посредством фильтрации и центрифугирования. Проводят реакцию обратной транскрипции при помощи обратной транскриптазы. Останавливают реакцию нагреванием до 95°С в течение 5 минут. Предложенное изобретение позволяет выделить микроРНК из биологических жидкостей, содержащих экзосомы, с высоким выходом. 2 ил., 1 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для идентификации гетеромультимерных убиквитинов со способностью связываться с лигандом-антигеном. Способ включает контактирование совокупности гетеродимерных модифицированных убиквитинов, включающих два мономера убиквитина, связанных между собой по схеме голова к хвосту, с потенциальным лигандом дисплейным способом. При этом каждый из упомянутых мономеров модифицирован по-разному и содержит 5-8 замещений в положениях 2, 4, 6, 8, 62, 63, 64, 65, 66 и 68 SEQ ID NO:1. Далее идентифицируют гетеродимерный модифицированный белок, связавшийся с лигандом с сродством связывания Kd в диапазоне 10-7-10-12 М и одновалентной связывающей активностью. Предложены ДНК-библиотеки, отвечающие за получение популяции упомянутых гетеромультимерных убиквитинов, а также библиотеки белков, полученные путем экспрессии упомянутых ДНК-библиотек. Изобретение позволяет получить новые связывающие белки на основе гетеромультимерного убиквитина, способные специфически связываться с высоким сродством с выбранными лигандами. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 17 ил., 4 пр.

Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются олигонуклеотидных праймеров и способа выявления ДНК Mycobacterium avium с их использованием. Охарактеризованные олигонуклеотидные праймеры комплементарны специфичной области mig-гена Mycobacterium avium и имеют следующий нуклеотидный состав: 5'-CGT CAA AAG CGA ACT GCA-3' и 5'-ТАА ТТС GTT GCC CGA СТС-3'. Способ выявления ДНК Mycobacterium avium выключает выделение ДНК, проведение амплификации ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров, перенос продукта амплификации на гель с последующим детектированием результатов анализа на трансиллюминаторе. В случае положительной реакции синтезируется фрагмент, соответствующий размеру 157 п.н. Представленные изобретения могут использоваться в ветеринарных диагностических и научно-практических лабораториях для выявления генетического материала Mycobacterium avium в пробах. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для детектирования количества копий бета-глюкуронидазы в трансгенных растениях, включающему проведение полимеразной цепной реакции с помощью праймеров и разрушаемой пробы. Изобретение позволяет эффективно детектировать количество копий бета-глюкуронидазы в трансгенных растениях. 1 ил., 1 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к cпособу получения препаративных количеств вирусного антигена - белка вируса скручивания листьев картофеля, в составе химерных вирусных частиц, имитирующих вирионы ВСЛК, включающий создание рекомбинантной ДНК, содержащей кДНК вируса просветления жилок турнепса, принадлежащего к тобамовирусам, где кДНК ВПЖТ находится под контролем растительного промотора, на ее конце имеется терминатор транскрипции, а ген белка оболочки ВПЖТ заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК, включающий создание агробактериального вектора pCambia 1300, способного встраиваться в геном растения-хозяина и вызывать системную инфекцию, перенос созданной рекомбинантной ДНК в агробактериальный вектор pCambia, трансформацию растения-хозяина Nicotiana benthamian агробактериальным вектором pCambia, размножение химерного вируса, состоящего из РНК вируса, в растении-хозяине Nicotiana benthamian, выделение химерного вируса, содержащего кДНК вируса просветления жилок турнепса, ген оболочки которого заменен на ген мажорного белка оболочки ВСЛК, из зараженных листьев растения-хозяина Nicotiana benthamian. Раскрыт способ получения антисыворотки к капсидному белку ВСЛК, включающий иммунизацию животных вирусными частицами, полученными указанным способом. Изобретение позволяет получать 2-4 мг вирусной химеры из 11 г зараженных листьев. 2 н. п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

Наверх