Способ получения высокотитражной антимикробной сыворотки для оценки антигенной активности противостафилококковых вакцин


 


Владельцы патента RU 2525661:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИВС им. И.И. Мечникова" РАМН) (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения высокотитражной антимикробной сыворотки. Способ включает использование штамма S.aureus №1991, характеризующийся иммуногенностью ED50=(50-100)×106 микробных клеток, слабой вирулентностью LD50=(0,5-2,0)×109 микробных клеток. Его инактивацию и высушивание диметилкетоном путем 2-кратной обработки 3 объемами диметилкетона. Далее проводят иммунизацию животных: двукратно подкожно и двукратно внутривенно. В заключение осуществляют выделение сыворотки. Изобретение может быть использовано в медицине для оценки антигенной активности противостафилококковых вакцин. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к противостафилококковым вакцинным препаратам и методам оценки их антигенной активности. Целью изобретения является создание наиболее иммуногенного слаботоксичного противостафилококкового препарата для получения высокотитражных иммунных сывороток, пригодных для оценки антигенной активности стафилококковых вакцин различного антигенного состава на всех этапах их приготовления, контроля конечного продукта и стабильности в процессе хранения.

Преимущество изобретения заключается в стандартизации методов контроля противостафилококковых препаратов, предназначенных для активной специфической профилактики и терапии стафилококковой инфекции, путем использования серологических методов на основе применения высокотитражных антимикробных противостафилококковых сывороток, для получения которых предлагается способ приготовления иммуногенного, слаботоксичного и слабоаллергенного препарата.

Известны способы получения антистафилококковой плазмы и сывороток крови. Недостатком этих методов является индукция антител к отдельным факторам патогенности Staphylococcus aureus и невысокий уровень антител [2, 3, 4, 9, 10].

Во всем мире ведется разработка стафилококковых вакцин нового поколения. Значительные усилия научно-исследовательских и коммерческих организаций были направлены на получение и испытание моновалентных вакцин, состоящих из капсульных полисахаридов (Staphvax), альфа-токсина, других факторов патогенности [5] стафилококка. Исследование большинства этих препаратов было остановлено на этапе доклинических испытаний. Наиболее полно изучена вакцина Staphvax, эффективность которой при клинических испытаниях не подтвердилось. Эти данные привели авторов к выводу о необходимости разработки поливалентных стафилококковых вакцин с оптимальным набором антигенов [6, 7, 8].

В России проводятся исследования по разработке бесклеточной поливалентной антистафилококковой вакцины на основе водорастворимых белково-полисахаридных антигенов клеточной стенки S.aureus. Доклинические исследования установили слабую токсичность и существенную протективную активность этого препарата [1]. Однако даже использование многокурсовых сложных схем иммунизации этой вакциной не обеспечивает получения высокотитражных сывороток. В то же время была выявлена корреляция между титрами антител и выживаемостью кроликов на модели генерализованной стафилококковой инфекции у кроликов (табл.1), что определяет возможность использования серологических методов для оценки иммуногенной активности стафилококковых препаратов.

Таблица 1
Иммуногенная активность сухой стафилококковой вакцины в опытах на кроликах (титры антител и защита на модели генерализованной стафилококковой инфекции)
№№ опыта №№ серии Кратность иммунизации Иммунизирующая доза, мг Привитые Непривитые
Обратный ср. титр АТ±m Выжило из числа кроликов, взятых в опыт Обратный ср. титр АТ±m Выжило из числа кроликов, взятых в опыт
1 69а 2 4 84±19,8 4/5 0 0/5
69б 2 4 11±2,9 1/5
2 70 3 4 106±22,3 3/5 3±0,33 0/5
70 2 4 48,4±4,3 2/5
73 3 2 3±0,21 0/5
3 76 3 4 80±5,7 5/5 2±0,25 0/5
4 15 3 4 147±21 3/5 6±0,4 0/5

При разработке противостафилококковых вакцин и при проведении доклинических исследований оценку препаратов производят в опытах на экспериментальных животных (мыши, кролики, редко обезьяны). Эти исследования трудоемки. При повторных исследованиях часто получают разные результаты вследствие различной чувствительности мышей, их сложно использовать на этапах производства, и, как показали многие исследования, протективная активность, установленная на мышах, не подтвердилась при клинических испытаниях [5]. Заявленный способ получения иммуногенного слаботоксичного противостафилококкового препарата для иммунизации животных с целью получения высокотитражных иммунных сывороток позволит использовать их для оценки иммунных стафилококковых препаратов в серологических (конкурентный ИФА и др.) и иммунохимических (иммуноблот, иммунодиффузия) реакциях.

Для достижения указанной цели используют: 1) штамм S.aureus 1991, выделенный от больного пневмонией, характеризующийся высокой внутривидовой протективной активностью ED50=(20-100)×106 микробных клеток и при этом слабой вирулентностью - LD50>1×109 микробных клеток; 2) наиболее щадящий метод инактивации микробной массы диметилкетоном; 3) короткая схема иммунизации, состоящая из двух подкожных и двух внутривенных ведений (табл.2).

Таблица 2.
Сравнительные данные протективной и сенсибилизирующей активность препаратов, полученных из разных штаммов стафилококка
Штамм Протективная активность Сенсибилизирующая активность
№№ LD50, микр. кл. ×109 штамм для заражения мыши кролики Морские свинки
выжило/всего %±m выжило/всего ср. продол. жизни, сут±m препарат из штамма кратность п/к введения индекс анафилактического шока, %±m
6 0,1 6 1/24 4,0±3,0 0/8 6,2±2,5 6 1-крат 70±4,8
2003 0,2 -«- 4/20 20,0±8,9 н.о. н.о. 2003 3-крат 75,0±5,8
-«- -«- 1986 6/28 21±7,6 н.о. н.о. н.о. н.о. н.о.
1986 0,18 -«- 18/45 40±7,2 2/4 27,0±7,6 н.о. н.о. н.о.
1991 1,0 6 13/20 65±10 6/10 20,0±4,5 1991 1-крат 27,5±2,9
1991 1,0 1986 23/45 51±7,0 4/4 60 (срок наблюдения) -«- 3-крат 28,5±4,0
Контроль интактн.) - 6 0/25 0 0/10 2,0±0,05 Интак. 14,2±3,6
- 1986 2/25 8±5,0 0/4 4,0±3,0 Интак. 12,0±3,2

Выделение антигенных компонентов производится инактивацией и высушиванием микробной массы клеток диметилкетоном путем 2-кратной обработки в количестве 3 объемов по отношению к объему микробной массы.

Пример осуществления способа.

Штамм S.aureus 1991 (депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича) культивируют на плотной агаровой среде на основе панкреатического гидролизата казеина при температуре 37°C в течение 16-18 часов. Культуру смывают дистиллированной водой. Возможно культивирование в реакторах путем глубинного культивирования в течение 7-8 часов при температуре 37°C или путем управляемых процессов культивирования (сливно-доливной, непрерывный) на полисинтетической среде. Например, среда из солей КН2РО4, К2НРО4, (NH4)2SO4, MgSO4, цитрат натрия, с добавлением глюкозы. и дрожжевого экстракта.

При культивировании в реакторах отделение микробной массы от культуральной среды производят центрифугированием или сепарированием, возможно также микрофильтрацией в тангенциальном потоке.

Инактивацию микробной массы производят путем 2-кратной обработки диметилкетоном в течение 18-24 часов в количестве 3 объема по отношению к объему микробной массы. После 2-й обработки получают сухую микробную массу, стандартизуемую по весу.

Полученную сухую инактивированную микробную массу используют для иммунизации животных (мыши, кролики). Высокая протективная активность позволяет существенно сократить схему иммунизации для получения высокотитражных сывороток до 2-3-х курсов:

1 курс - 2-кратно подкожно с интервалом 3-4 дня;

2 курс 2-кратно внутрибрюшинно с интервалом 3-4 дня;

3 курс проводится дополнительно по схеме 2-го курса только при недостаточности 2 курса (табл.3).

Таблица 3
Титр кроличьих сывороток в РПГА в динамике 3-х курсов иммунизации стафилококковым антигеном
Антигенный стафилококковый препарат, приготовленный по заявленному способу №№ сыворотки кроликов Обратный титр антител
до иммунизации после 1 курса п/к иммунизации после 2 курса в/в иммунизации после 3 курса в/в иммунизации
1 2 3 4
1 16 256 1024 5120
2 32 1024 1024 5120
3 32 512 1024 5120
4 32 128 1024 2560
5 16 256 1024 5120
М±m 25,6±3,4 435±159,9 1024±0 4608±512
Р1 и 2<0,05; Р2 и 3<0,01; Р3 и 4<0,001

Литература

1. Егорова Н.Б., Ефремова В.Н., Курбатова Е.А., Грубер И.М. Экспериментальная и клинико-иммунологическая оценка бесклеточной стафиококковой вакцины «Стафиловак». Журн. микробиол. 2008. - №6. - С.101-108.

2. Иванова СП. Метод получения иммунной антистафилококковой сыворотки. Лаб. Дело. 1975. - №5. - 306-308.

3. Михайлова Н.А. и др. Опты применения вакцины «пиопол» для иммунизации доноров-добровольцев. Иммунология. - 2006. - Т.27. - №2. - С.80-83.

4. Федоровская Е.А. и др. Иммунный ответ организма доноров при иммунизации стафилококковым анатоксином. Врачебное дело. 1989. - №2. - С.70-72.

5. Otto М. Novel targeted immunotherapy approaches for staphylococcal Infection. Expert Opin Biol Ther. 2010. - Vol.10. - №7. P - 1049-1059.

6. Poole-Warren LA, Hallett MD, Hone PW, Burden SH, Farrell PC. Vaccination for prevention of CAPD associated staphylococcal infection: results of a prospective multicentre clinical trial. Clin. Nephrol.1991. - Vol.35. №5. P.198-206. [PubMed: 1855327]

7. Schaffer A.C, Lee J.C. Staphylococcal vaccines and immunotherapies. Infect. Dis. Clin. North Am. 2009 - Vol.23. №1. 153-71. [PubMed: 19135920]

8. Stranger-Jones Y.K., Bae Т., Schneewind O. Vaccine assembly from surface proteins of Staphylococcus aureus. Proc. Natl. Acad. Sci. 2006. - Vol.103. - №45. - P16942-7. [PubMed: 17075065]

9. Ekstedt R.D. Ann N.Y. Immune response to surface antigens of Staphylococcus aureus and their role in resistance to staphylococcal disease. N.Y. Acad. Sci., 1974. - Vol.236. - P.203-220.

10. Richter U., Karsch W.Z. Production of diagnostic antisera for the detection of staphylococcal enterotoxins A-E. Gesamte. Hyg. 1980. - Vol.26. - N1. - P.53-55.

Способ получения высокотитражной антимикробной сыворотки для оценки антигенной активности противостафилококковых вакцин, включающий использование штамма S.aureus №1991, характеризующегося высокой иммуногенностью ED50=(50-100)×106 микробных клеток, слабой вирулентностью LD50=(0,5-2,0)×109 микробных клеток, инактивацию его и высушивание диметилкетоном путем 2-кратной обработки 3 объемами диметилкетона с последующим проведением иммунизации двукратно подкожно и двукратно внутривенно и выделением сыворотки.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению питательных сред для культивирования возбудителя листериоза. Питательная среда содержит ферментативный гидролизат бобов сои, ферментативный гидролизат из активированной эмбрионально-яичной массы перепелов, натрий хлористый, калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов.

Изобретение относится к биотехнологии. Иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений содержит клетки микроорганизма, обладающего 1,2-дегидрогеназной активностью, включенные в матрицу криогеля поливинилового спирта.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для приготовления кисломолочных продуктов. Способ предусматривает приготовление питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli - продуцента биологически активного флагеллина. Охарактеризованный штамм получен трансформацией культуры клеток E.
Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Lactobacillus acidophilus №9-ПС обладает биохимической активностью и высокой кислотностью.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Gluconacetobacter sucrofermentans H - 110 является продуцентом бактериальной целлюлозы.

Группа изобретений относится к области микробиологии и может быть использована в пищевой промышленности. Предложены штамм Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 и штамм Lactobacillus plantarum DSM 22064, способные к полному разложению глютена в муке.
Изобретение относится к области микробиологии. Предложен штамм бактерий Exiguobacterium mexicanum ВКПМ B-11011, обладающий способностью быстро утилизировать нефть, дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при очистке мерзлотных почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов. Выращивают штамм бактерий Exguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 и готовят из него суспензию, которую вносят в мерзлотную почву и водную среду.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для рекомбинантного получения 1,2-пропандиола (1,2-PD). В клетку E.coli вводят ген, кодирующий пропандиолоксидоредуктазу, что позволяет продуцировать высокие уровни 1,2-пропандиола, по существу без 1,3-пропандиола, при выращивании на глицерине как единственном источнике углерода.
Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается лечения и профилактики артериальной гипертензии. Для этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую активированные потенцированные антитела к рецептору ангиотензина II и к эндотелиальной NO-синтазе.

Настоящая группа относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается лечения хронической сердечной недостаточности. Для этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую активированные-потенцированные формы антител к рецептору ангиотензина II и к эндотелиальной NO-синтазе.

Изобретение относится к области иммунологии, медицины и биотехнологии. Предложены варианты анти-EPHA2 антител.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложено лекарственное средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, представляющее собой антитело против рецептора IL-6, полученное на основе антитела TOCILIZUMAB.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии. Описаны варианты антител, связывающих молекулу GRM, а также их антигенсвязывающие фрагменты, аминокислотные последовательности вариабельных областей которых представлены в материалах заявки.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой полипептидную конструкцию для лечения, профилактики и облегчения нарушений, связанных с адгезией тромбоцитов и опосредованной тромбоцитами агрегацией или ее дисфункцией, которая включает одно или более однодоменных антител, направленных против фактора фон Виллебранда (vWF), и одно или более однодоменных антител, направленных против сывороточного альбумина (SA).

Изобретение относится к медицине и касается фармацевтической композиции для усиления эффективности лечения рака печени посредством Сорафениба, причем указанная композиция содержит анти-глипикан 3-антитело в качестве активного ингредиента.
Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии и эндокринологии, и касается лечения больных с синдромом диспепсии в сочетании с избыточной массой тела.
Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно к терапии, и касается лечения вегетососудистой дистонии (ВСД). Для этого вводят фармацевтическую композицию, включающую активированные-потенцированные антитела к рецептору ангиотензина II и активированные-потенцированные антитела к эндотелиальной NO-синтазе.

Настоящая группа изобретения относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается лечения хронической сердечной недостаточности. Для этого вводят фармацевтическую композицию, содержащую активированную - потенцированную форму сверхмалых доз антител к рецептору ангиотензина II и активированную - потенцированную форму сверхмалых доз антител к эндотелиальной NO - синтазе.

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии и фармакологии, и касается коррекции эндотелиальной дисфункции. Для этого в организм вводят активированную-потенцированную форму антител к фактору роста сосудистого эндотелия (VEGF) в эффективном количестве. 4 з.п. ф-лы, 1табл., 1 пр.
Наверх