Новый пептид и его применение

Настоящее изобретение относится к пептиду, представленному формулой (I) X₁-Leu-X₂-Leu-X₃, где X₁ представляет Glu или Asp, X₂ представляет His, Lys или Arg, X₃ представляет Asp или Glu, при этом Glu, Asp, Leu, His, Lys и Arg или его фармацевтически приемлемой соли и его композициям для лечения или профилактики повреждения хряща и/или артрита. Предложенный пептид может влиять на регенерацию хрящевой ткани, ингибирование экспрессии фермента, вызывающего деградацию матрикса хрящевой ткани, и/или ингибирование окостенения хрящевой ткани. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 2 табл., 11 ил., 15 пр.

 

Область техники

Настоящее изобретение относится к новому пептиду. В частности, настоящее изобретение относится к новому пептиду, который является эффективным для лечения и/или профилактики повреждения хряща или артрита.

Уровень техники

Хрящевая ткань состоит из матрикса и хондроцитов. Наряду с ними коллагеновые волокна (коллаген, протеогликан) матрикса вместе с неколлагеновыми белками поглощают и выпускают воду в/из хряща, чтобы, таким образом, играть важную роль в поддержании физических свойств, уникальных для хряща. Повреждение хрящевой ткани наблюдается большей частью при заболеваниях суставов, и хрящевая ткань суставов приблизительно подразделяется на четыре зоны, которыми являются наиболее удаленная поверхностная тангенциальная зона, переходная зона, глубокая зона и кальцифицированная зона (Clouet J et al., Drug Discovery Today (2009) 14:19/20, 913-925). Поверхностная тангенциальная зона является областью с относительно низкой долей матрикса, в которой коллагеновые волокна густо расположены вдоль поверхности сустава, и присутствуют хондроциты, имеющие тонкослойную и плоскую клеточную морфологию, и которая поглощает силу сдвига при движении в суставе. Переходная зона толще, чем поверхностная тангенциальная зона, состоит из толстых коллагеновых волокон и сферических хондроцитов и служит для того, чтобы выдерживать нагрузку, поскольку имеет высокую долю матрикса, содержащего протеогликан и воду. Глубокая зона богата протеогликаном и неколлагеновыми белками в сочетании с наиболее высоким содержанием компонентов матрикса, но с наиболее низким содержанием воды, и служит для придания стабильности ткани посредством вертикального расположения относительно небольших количеств хондроцитов, близких к сферической форме, и коллагеновых волокон. Кальцифицированная зона имеет особую структуру, известную как демаркационная линия, и функционирует для закрепления хрящевой ткани на костной ткани.

Повреждение хрящевой ткани, составляющей суставы, приводит в результате к проявлению артрита, который сопровождается припухлостью, местным повышением температуры и болью. Проявление артрита не зависит от расы и классифицируется приблизительно по 100 типам в зависимости от его болезнетворной причины. Наиболее распространенной формой артрита является остеоартрит, дегенеративное заболевание суставов, которое, в основном, вызывается старением. Другие примеры артрита включают ревматоидный артрит и псориатический артрит, которые являются аутоиммунными заболеваниями, и септический артрит, вызываемый инфекциями. В частности, дегенеративный артрит представляет собой характерное заболевание в группах пожилого возраста, и старение суставов, главным образом, ответственно за патогенез дегенеративного артрита. Кроме того, поскольку заболеваемость дегенеративным артритом также связана с сочетанным взаимодействием различных факторов, таких как генетические факторы, несбалансированное питание, недостаток двигательной активности, чрезмерная двигательная активность или повреждения, поведение, при котором имеет место применение тяжелой нагрузки на суставы, например, чрезмерная работа или привычная неправильная осанка, и перегрузка вследствие ожирения, дегенеративный артрит также является заболеванием, наблюдаемым с высокой частотой среди молодых людей (Gegout PP et al., Joint Bone Spine (2008) 669-671).

Ослабление поддерживающей сустав ткани вследствие травмы или дегенеративного изменения приводит к повреждению хрящевой ткани, которая служит для поглощения толчков, таким образом увеличивая трение между костями, что вызывает боль и воспаление. Воспаление ускоряет образование остеофитов вокруг суставов, что ограничивает подвижность суставов и вызывает более сильную боль.

Артрит является заболеванием с высокой частотой заболеваемости среди групп с широкими возрастными интервалами, и поврежденные ткани с трудом подвергаются самопроизвольной регенерации или восстановлению. Следовательно, артрит ответственен за длительное ограничение социальной деятельности пациентов и ухудшение качества жизни пациента.

Существующие в настоящее время терапевтические мероприятия в широком смысле подразделяются на консервативные методы лечения, такие как лечебная физкультура, включающая контроль веса, диетотерапия, инъекционная терапия и медикаментозное лечение; и хирургические методы лечения, такие как регенерация ткани с применением факторов роста, имплантация с применением искусственно культивируемых клеток и замена сустава на искусственный, которую применяют, когда суставы тяжело повреждены (Clouet J et al., Drug Discovery Today (2009) 14:19/20, 913-925).

Лечебная физкультура в пределах применения нетяжелых нагрузок на суставы оказывает укрепляющее воздействие на окружающую сустав ткань для замедления дополнительного обострения симптомов, но не обеспечивает существенную регенерацию поврежденной ткани, и существует сложность ее выполнения вследствие боли, когда состояние заболевания является тяжелым.

С целью стимулирования регенерации тканей суставов или ослабления воспаления применяли глюкозамин или хондроитин, который является составным компонентом хряща, рыбий жир, имеющий противовоспалительное действие, и другие фармацевтические композиции на основе трав (Derfoul A et al., Osteoarthritis Cartilage (2007) 15, 646-655; Tiraloche G et al., Arthritis Rheum. (2005) 52, 1118-1128; McAlindon TE et al., JAMA (2000) 283 (11): 1469-147; и Zainal Z et al., Osteoarthritis Cartilage (2009) 17(7): 896-905).

Кроме того, также применяли способ инъекционного введения гиалуроновой кислоты (HA), которая является компонентом синовиальной жидкости суставов, для ослабления боли и профилактики обострения симптомов путем сокращения трения поврежденных областей (Waddell DD et al., Arthroscopy (2010) 26(1):105-11; и Wang CT et al., J. Bone Joint Surg. Am. (2004) 86-A 538-545).

Хотя некоторые из этих консервативных методов лечения, как сообщалось, оказывают полезные терапевтические эффекты, обусловленные ими ослабление боли или терапевтические эффекты являются несущественными, или их механизм не понятен в полной мере. Следовательно, существует потребность в дополнительном критическом рассмотрении с точки зрения терапевтических применений таких методов лечения (McAlindon TE et al., JAMA (2000) 283 (11): 1469-147).

Для ослабления воспаления или боли применяли аспирин, ацетаминофен или различные нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) и стероидные лекарственные средства, такие как кортизон. Однако эти методы медикаментозного лечения не являются основными методами лечения, которые способны к достижению восстановления поврежденной ткани. В дополнение, длительный прием таких лекарственных средств оказывает, как сообщается, неблагоприятные побочные эффекты, такие как повреждения желудочно-кишечного тракта, повреждения ткани или кости (Clouet J et al., Drug Discovery Today (2009) 14:19/20, 913-925; Glass GG Dis. Mon. (2006) 343-362; Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. (2004) 63, 901-907); Frampton JE et al., Drugs (2007) 67(16):2433-72; и McDonough AL. Phys Ther. (1982) 62(6): 835-9.).

С целью регенерации или восстановления поврежденной хрящевой ткани рассматривалось применение композиции, содержащей апигенин или фактор роста или его часть, такой как FGF, BMP (BMP7/OP-1) или TGFβ1 (Clouet J et al., Drug Discovery Today (2009) 14:19/20, 913-925; Shi S et al., J. Biol. Chem. (2009) 284 (1): 6697-6704; и Moore EE et al., Osteoarthritis Cartilage (2005) 13, 623-631). Однако, поскольку существует ограничение по осуществлению прямой и повторной инфузии фактора роста, состоящего из белка с высоким молекулярным весом, пациентам с артритом, практическое применение такого фактора роста в отношении пациентов требует дополнительного исследования способа его доставки.

Если вышеупомянутые консервативные методы лечения не обеспечивают терапевтических эффектов или продолжается сильная боль, применяется хирургическая терапия, включающая замену поврежденных суставов на искусственные. Однако искусственный сустав имеет ограниченную продолжительность эксплуатации около 10 лет, так что восстановительная хирургия необходима там, где она уместна. В этом случае восстановительная хирургия имеет ограничения вследствие сложности удаления искусственных суставов, суженных к кости, потребностью имплантации больших искусственных суставов и потребностью в более обширной периферической костной ткани. Касательно этих проблем, применение замены сустава на искусственный в отношении людей младшего возраста следует производить с большей осторожностью.

С прогрессом методик искусственного культивирования клеток недавно сообщалось о способах, включающих искусственное культивирование хондроцитов из мультипотентных стволовых клеток или аутогенных мезенхимальных стволовых клеток и имплантацию культивированных хондроцитов (Csaki C et al., Ann Anat. (2008) 190(5): 395-412). К сожалению, при имплантации хондроцитов все еще возникает большое число проблем, которые нужно решить, в том смысле, что получить значительное число аутогенных клеток нелегко, в сочетании с техническими проблемами и проблемами затрат, связанными с применением ее в отношении большого числа пациентов, как, например, адгезия имплантированных клеток, эффективность регенерации и безопасность.

По мере того как мы вступаем в стареющее общество, группа населения пожилого возраста, страдающего от артрита, неизменно увеличивается. Кроме того, частота возникновения заболеваний суставов вследствие чрезмерной двигательной активности, несбалансированного питания, ожирения и т.п. также увеличивается среди групп младшего возраста. С целью сокращения вытекающего экономического ущерба и социальных затрат, а также улучшения качества жизни группы населения пожилого возраста, существует острая необходимость в разработке усовершенствованного лекарственного средства против артрита, которое способно достигать более подходящей, безопасной и существенной регенерации и восстановления поврежденной артритом хрящевой ткани, вместо общепринятой консервативной диетотерапии или медикаментозного лечения для ослабления воспаления или боли, хирургической терапии, такой как замена сустава на искусственный, или имплантации искусственно культивированных хондроцитов.

РАСКРЫТИЕ

Техническая проблема

Настоящее изобретение, как предполагается, обеспечивает новый пептид или его фармацевтически приемлемую соль.

Кроме того, настоящее изобретение, как предполагается, обеспечивает композицию для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного, выбранного из повреждения хряща и артрита.

Кроме того, настоящее изобретение, как предполагается, обеспечивает композицию, которая является терапевтически эффективной в отношении повреждения хряща или артрита.

Техническое решение

Настоящее изобретение обеспечивает пептид, представленный формулой (I):

X₁-Leu-X₂-Leu-X₃ (I),

где X₁ представляет Glu или Asp, X₂ представляет His, Lys или Arg, X₃ представляет Asp или Glu, при этом Glu, Asp, Leu, His, Lys и Arg представляют собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, лейцин, гистидин, лизин и аргинин, соответственно; или его фармацевтически приемлемую соль.

Пептид предпочтительно является пептидом (SEQ ID NO:1; Glu-Leu-His-Leu-Asp), где X₁ представляет Glu, X₂ представляет His, и X₃ представляет Asp.

Аминокислоты классифицируют в зависимости от свойства R-группы (переменная группа, отличная от карбоксильной группы, аминогруппы и атома водорода, присоединенных совокупно к аминокислотам). Glu или Asp классифицируют как кислые аминокислоты (отрицательно заряженные (кислые) R-группы), а His, Lys или Arg классифицируют как основные аминокислоты (положительно заряженные (основные) R-группы). Кислая аминокислота имеет R-группу, которая является отрицательно заряженной при pH 7,0, и также имеет карбоксильную группу. Основная аминокислота имеет R-группу, которая является положительно заряженной при pH 7,0. Аминокислоты, принадлежащие к одной и той же классификационной группе, имеют сходные свойства.

Каждая из составных аминокислот пептида может находиться в L-форме, D-форме и/или DL-форме, все из которых охватываются в составных аминокислотах пептида согласно настоящему изобретению.

Примеры фармацевтически приемлемой соли включают гидрохлорид, сульфат, фосфат, лактат, малеат, фумарат, оксалат, метансульфонат и пара-толуолсульфонат.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает применение пептида согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для лечения и/или профилактики повреждения хряща или артрита.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую пептид согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного, выбранного из повреждения хряща и артрита.

«Лечение и/или профилактика» может осуществляться посредством по меньшей мере одного, выбранного из регенерации хрящевой ткани, ингибирования экспрессии фермента, вызывающего деградацию матрикса хрящевой ткани, и ингибирования окостенения хрящевой ткани, и артрит предпочтительно является заболеванием суставов, которое сопровождается дегенерацией хряща и субхондральной кости.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую пептид согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль и трансформирующий фактор роста бета 1 (TGFβ1).

Соотношение пептида или его фармацевтически приемлемой соли и TGFβ1 в композиции может находиться в диапазоне 1:20 - 40 по весу.

Композиция согласно настоящему изобретению может быть фармацевтической композицией, которая может быть составлена с добавлением фармацевтически приемлемого носителя.

Пептид согласно настоящему изобретению можно получить с помощью способов, обычно применяемых при синтезе пептида. Например, пептид можно получить с помощью таких способов, описанных в Schroder and Lubke, The Peptides, Vol.1, Academic Press, New York, 1965, и т.п., и можно получить либо с помощью жидкофазного синтеза, либо с помощью твердофазного синтеза.

Примеры способов образования пептидных связей включают азидный способ, хлорангидридный способ, способ с применением симметричного ангидрида, способ с применением смешанного ангидрида, карбодиимидный способ, карбодиимид-аддитивный способ, способ с применением активированных сложных эфиров, карбодиимидазольный способ, окислительно-восстановительный способ и способ, в котором используется K-реагент Вудворда.

Перед проведением реакции конденсации карбоксильная группа, аминогруппа и т.п., которые не принимают участие в реакции, могут быть защищены, и карбоксильная группа и аминогруппа, которые принимают участие в реакции конденсации, могут быть активированы способами, известными в уровне техники.

Примеры защитных групп для карбоксильной группы включают группы, образующие сложные эфиры, такие как метил, этил, бензил, пара-нитробензил, трет-бутил и циклогексил.

Примеры защитных групп для аминогруппы включают бензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил и/или (9-флуоренилметилоксикарбонил).

Примеры активированных форм карбоксильной группы включают симметричный ангидрид, азид и активный сложный эфир (сложный эфир со спиртом, например, пентахлорфенол, 2,4-динитрофенол, цианометиловый спирт, пара-нитрофенол, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимид, N-гидроксисукцинимид, N-гидроксифталимид или 1-гидроксибензотриазол).

Примером активированной аминогруппы является амидофосфат.

Реакцию проводят в растворителе, таком как хлороформ, дихлорметан, этилацетат, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин, диоксан, тетрагидрофуран, вода, метанол или их смесь.

Температура реакционной смеси может находиться в диапазоне приблизительно от -30 до 50ºС, что, как правило, используется в реакции.

Реакция удаления защитной группы пептида может изменяться в зависимости от вида защитной группы, но она должна быть такой, которая способна освобождать защитную группу, не оказывая какого бы то ни было влияния на образование пептидной связи.

Защитная группа может быть удалена путем обработки кислотой, например, обработки хлористым водородом, бромистым водородом, фтористым водородом, метансульфоновой кислотой, трифторметансульфоновой кислотой, трифторуксусной кислотой или смесью этих кислот. Кроме того, можно использовать восстановление с металлическим натрием в жидком аммиаке или каталитическое восстановление над палладием на угле.

При проведении реакции удаления защитной группы путем обработки кислотой можно использовать добавку, такую как анизол, фенол или тиоанизол.

После завершения реакции полученный пептид согласно настоящему изобретению можно выделить с помощью общепринятого способа очистки пептидов, например, экстракции, разделения, повторного осаждения, рекристаллизации или колоночной хроматографии.

Кроме того, пептид согласно настоящему изобретению можно преобразовать в его вариант или фармацевтически приемлемую соль с помощью общепринятого способа.

Пептид в соответствии с настоящим изобретением можно синтезировать с помощью автоматизированного пептидного синтезатора или можно производить с помощью методик генной инженерии. Например, необходимый пептид можно производить путем получения гибридного гена, кодирующего гибридный белок, состоящий из партнера слияния и пептида согласно настоящему изобретению посредством манипуляции с генами, трансформации микроорганизма-хозяина гибридным геном, экспрессии необходимого пептида в форме гибридного белка в микроорганизме-хозяине и затем расщепления и отделения пептида согласно настоящему изобретению от гибридного белка с применением протеазы или соединения.

Доза пептида или его фармацевтически приемлемой соли находится в диапазоне от 150 мкг/сутки до 1 мг/сутки, предпочтительно от 0,5 мг/сутки до 1 мг/сутки, для парентерального введения. Для перорального введения доза является в 1,2-1,5 раз большей, чем парентеральная доза.

Пептид или композицию согласно настоящему изобретению вводят в основном парентеральными путями, например, местной инъекцией (инъекция внутрь суставной полости), внутривенной или подкожной инъекцией, или с помощью трансназального введения. Кроме того, при необходимости можно использовать пероральное введение.

Пептид согласно настоящему изобретению, или его фармацевтически приемлемую соль, или композицию согласно настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем можно составить в необходимые лекарственные формы, такие как инъекции, порошки, назальные капли, гранулы или таблетки.

Фармацевтически приемлемый носитель можно получить в соответствии с рядом факторов, хорошо известных специалистам в данной области техники, например, принимая во внимание следующие неограничивающие факторы: конкретное физиологически активное вещество, которое нужно применять, и его концентрация, стабильность и предполагаемая биологическая доступность; заболевание, расстройство и состояние, которые лечат; субъект, которого лечат, и его возраст, рост и общее состояние; и предполагаемый путь введения композиции, например, местный, внутривенный, внутримышечный, трансдермальный, пероральный или назальный. Как правило, примеры фармацевтически приемлемого носителя, применяемого для введения физиологически активного вещества путем, отличным от перорального введения, могут включать D5W (5% глюкоза в воде), водный раствор, содержащий 5% по объему или менее декстрозы, и физиологический раствор. В случае местной инъекции, вводимой внутрь пораженных тканей, можно использовать разнообразные инъекционные гидрогели для усиления терапевтических эффектов и повышения продолжительности действия лекарственного средства. В дополнение, фармацевтически доступный носитель может содержать дополнительные ингредиенты, которые могут повышать стабильность активных ингредиентов, такие как консерванты или антиоксиданты. Пептид или композиция согласно настоящему изобретению можно предпочтительно составить в необходимой лекарственной форме в зависимости от заболеваний, которые нужно лечить, и ингредиентов с применением любого соответствующего способа, известного в уровне техники, например, как раскрыто в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA (последнее издание).

Пептид согласно настоящему изобретению можно хранить в физиологическом солевом растворе и можно лиофилизировать в ампуле после добавления маннита или сорбита. Лиофилизированный пептид можно растворить в физиологическом солевом растворе и т.п. для восстановления перед применением.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения и/или профилактики повреждения хряща или артрита, при котором вводят пептид согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль млекопитающему, включая человека, нуждающегося в этом.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает медицинское применение пептида согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли предпочтительно для лечения и/или профилактики повреждения хряща или артрита.

Сведения, упомянутые относительно пептида согласно настоящему изобретению, или его фармацевтически приемлемой соли, или композиции согласно настоящему изобретению будут распространяться и на применение, и на способ лечения и/или профилактики в соответствии с настоящим изобретением при условии, что между ними нет противоречий.

Полезные эффекты

Пептид согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль является эффективным при лечении и/или профилактике повреждения хряща или артрита, и может влиять на регенерацию хрящевой ткани, ингибирование экспрессии фермента, вызывающего деградацию матрикса хрящевой ткани, и/или ингибирование окостенения хрящевой ткани.

Описание графических материалов

На фиг. 1 проиллюстрирована фотография, на которой показаны изменения поврежденной хрящевой ткани, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 2 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию хрящевой ткани, наблюдаемые при окрашивании гематоксилином и эозином, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 3 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию хрящевой ткани, наблюдаемые при окрашивании коллагена, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 4 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию хрящевой ткани, наблюдаемые при окрашивании гематоксилином и эозином, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 5 проиллюстрированы результаты изменений экспрессии гена коллагена II типа в культивированных клетках хрящевой ткани в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 6 проиллюстрированы результаты изменений экспрессии гена MMP13 в культивированных клетках хрящевой ткани в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 7 проиллюстрированы результаты изменений экспрессии гена коллагена X типа в культивированных клетках хрящевой ткани в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 8 проиллюстрирована фотография, на которой показаны результаты влияния на регенерацию хряща, подтвержденные визуальным наблюдением, в модели дегенеративного артрита в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 9 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию хряща, подтвержденные окрашиванием гематоксилином и эозином, в модели дегенеративного артрита в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 10 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию хряща, подтвержденные окрашиванием сафранином О, в модели дегенеративного артрита в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

На фиг. 11 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию хряща, подтвержденные окрашиванием трихром по Массону, в модели дегенеративного артрита в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

Принцип изобретения

Теперь настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие примеры. Эти примеры обеспечены только для иллюстрирования настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничивающие объем и сущность настоящего изобретения.

Пример 1: Получение пептида

Пептид (Glu-Leu-His-Leu-Asp: SEQ ID NO: 1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, был получен в Peptron Inc. (Южная Корея) по заказу авторов настоящего изобретения. В частности, аминокислотные единицы были последовательно связаны с C-конца с помощью Fmoc SPPS (твердофазного пептидного синтеза с применением 9-флуоренилметилоксикарбонила) с применением автоматизированного пептидного синтезатора (ASP48S, Peptron Inc.).

Применяли NH₂-His(Trt)-2-хлортритиловую смолу, в которой первая аминокислота с C-конца пептида была присоединена к смоле. Все аминокислоты, применяемые в синтезе пептида, были защищены тритилом (Trt), трет-бутилoксикарбонилом (Boc), трет-бутилом (t-Bu) и т.п., в силу чего N-конец защищен Fmoc, и все остатки были перемещены в форму кислоты. В качестве связующего реагента применяли 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат (HBTU)/гидроксибензотриазол (HOBt)/N-метилморфолин (NMM). (1) Защищенную аминокислоту (8 эквивалентов) и связующий реагент HBTU (8 эквивалентов)/HOBt (8 эквивалентов)/NMM (16 эквивалентов) растворяли в диметилформамиде (DMF) и добавляли с последующей реакцией при комнатной температуре в течение 2 часов. (2) Удаление Fmoc проводили путем добавления 20% пиперидина в DMF с последующей реакцией при комнатной температуре в течение 5 минут дважды. Реакции (1) и (2) повторяли с получением основного пептидного остова, и пептид отделяли от смолы с помощью трифторуксусной кислоты (TFA)/1,2-этандитиола (EDT)/тиоанизола/триизопропилсилана (TIS)/H₂O=90/2,5/2,5/2,5/2,5. Пептид очищали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ с применением C18 колонки Vydac Everest (250 мм×22 мм, 10 мкм), и затем отделяли с помощью линейного градиента вода-ацетонитрил (10-75% (об./об.) ацетонитрила), содержащего 0,1% (об./об.) трифторуксусной кислоты. Молекулярный вес очищенного пептида подтверждали с помощью ЖХ/МС (серия Agilent HP1100) с последующей лиофилизацией.

Примеры 2-12: Получение пептидов

Пептиды примеров 2-12 получали таким же образом, как и в примере 1, за исключением того, что аминокислотные последовательности, приведенные в таблице 1 ниже, применяли вместо аминокислотной последовательности по примеру 1.

Таблица 1

№ примера	Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO
Пример 2	Glu-Leu-His-Leu-Glu	2
Пример 3	Glu-Leu-Lys-Leu-Asp	3
Пример 4	Glu-Leu-Lys-Leu-Glu	4
Пример 5	Glu-Leu-Arg-Leu-Asp	5
Пример 6	Glu-Leu-Arg-Leu-Glu	6
Пример 7	Asp-Leu-His-Leu-Asp	7
Пример 8	Asp-Leu-His-Leu-Glu	8
Пример 9	Asp-Leu-Lys-Leu-Asp	9
Пример 10	Asp-Leu-Lys-Leu-Glu	10
Пример 11	Asp-Leu-Arg-Leu-Asp	11
Пример 12	Asp-Leu-Arg-Leu-Glu	12

Пример 13: Подтверждение влияния на регенерацию хряща с применением эксплантатов поврежденной хрящевой ткани

Эксплантаты суставных хондроцитов получали из суставов копыт коров возрастом менее 3 лет в течение часа после того, как их умерщвляли на региональной бойне (расположенной в Оджон-дон, Тэджон, Южная Корея). С этой целью часть хряща, отличную от кости, равномерно отрезали от сустава и нарезали на части размерами приблизительно 3 мм×3 мм с помощью хирургического ножа с получением эксплантатов хрящевой ткани. С применением шприца (21G), кончик которого был усечен и сточен, получали поврежденные области путем проделывания вертикальных отверстий на поверхности равномерно в центре эксплантата.

Перфорированные тканевые эксплантаты делили на 4 группы, включая контрольную группу. Отдельные группы помещали в среду Игла в модификации Дульбекко/F12 (DMEM/F12, 1:1, Welgene), дополненную аскорбатом (50 мкг/мл, Sigma) и 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS, Invitrogen), и затем обрабатывали 25 мкМ пептида по примеру 1, 2 нг/мл трансформирующего фактора роста бета 1 (TGFβ1, Promokine) и смесью 25 мкМ пептида по примеру 1 и 2 нг/мл TGFβ1, соответственно. Отдельные группы вновь делили на две подгруппы с последующей инкубацией в течение 1-6 недель. Для инкубируемой в течение 6 недель группы поврежденную область еженедельно изучали под микроскопом, после чего делали фотографию. В дополнение, инкубируемый в течение 1 недели тканевой эксплантат и инкубируемый в течение 6 недель тканевой эксплантат фиксировали соответственно в системе 3,7% формальдегиде/физиологическом растворе, стабилизированным фосфатным буфером (3,7% формальдегид/PBS). Затем в соответствии с экспериментальным способом стандартного иммуногистохимического окрашивания получали микроскопические препараты парафиновых срезов с последующим окрашиванием гематоксилином и эозином (H&E) и микроскопическое изучение формы и распределения клеток в отношении морфологии. Коллаген подвергали окрашиванию трихромом по Массону и форму и распределение клеток в ткани изучали под микроскопом. Для сравнения контрольную группу обрабатывали таким же образом, как и группу, обрабатываемую пептидом по примеру 1, за исключением того, что пептидом по примеру 1 не обрабатывали.

Результаты показаны на фиг. 1-4.

На фиг. 1 проиллюстрирована микрофотография изменений в хрящевой ткани с течением времени после обработки эксплантатов суставных хондроцитов пептидом по примеру 1 или пептидом по примеру 1+TGFβ1.

Как показано на фиг. 1, когда обрабатывали только пептидом по примеру 1, поврежденная область постепенно уменьшалась спустя 2 недели, клетки вблизи поврежденной области начинали прилипать спустя 4 недели, а поврежденная область заметно сокращалась спустя 6 недель, таким образом демонстрируя, что пептид по примеру 1 проявляет регенерацию поврежденной области (фиг. 1F-J). Кроме того, если пептидом по примеру 1 обрабатывали в сочетании с TGFβ1, клетки вблизи отверстия начинали пролиферировать спустя 3 недели, и поврежденная область полностью заполнялась клетками спустя 6 недель (фиг. 1P-T). По сравнению с обработкой только пептидом по примеру 1, совместная обработка TGFβ1 и пептидом по примеру 1 приводила в результате к регенерации поврежденной области на одну неделю раньше, и клетки, прежде появляющиеся на 3 неделю только вблизи отверстия, полностью заполняли поврежденную область на 4 неделю.

На фиг. 2 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию ткани, наблюдаемые при окрашивании гематоксилином и эозином после одной недели культивирования эксплантатов хрящевой ткани, обработанных пептидом по примеру 1 или пептидом по примеру 1+TGFβ1, и на фиг. 3 проиллюстрированы результаты окрашивания коллагена. На фиг. 4 проиллюстрированы результаты влияния на регенерацию ткани, наблюдаемые при окрашивании гематоксилином и эозином после шести недель культивирования эксплантатов хрящевой ткани, обработанных пептидом по примеру 1 или пептидом по примеру 1+TGFβ1. На фиг. 2 и фиг. 3 стрелкой показаны поверхностный слой эксплантата хрящевой ткани. Каждая из фиг. 4C и 4F являются частично увеличенными изображениями отмеченных квадратом частей фиг. 4B и 4E, где стрелкой показан поверхностный слой эксплантата хрящевой ткани.

Как показано на фиг. 2 и фиг. 3, совместная обработка пептидом по примеру 1 и TGFβ1 приводила в результате к более чем 2-кратному увеличению толщины поверхностного слоя эксплантата хрящевой ткани по сравнению с контрольной группой (фиг. 2D и фиг. 3D), и окраска коллагена была более интенсивной, таким образом демонстрируя, что пептид по примеру 1 приводит к увеличению синтеза коллагена (фиг. 3D).

Кроме того, как показано на фиг. 4, когда пептидом по примеру 1 обрабатывали в течение 6 недель, поврежденная область сужалась, и новые клетки прилипали вблизи поврежденной области (фиг. 4B и 4C). Если пептидом по примеру 1 обрабатывали в сочетании с TGFβ1, можно увидеть, что хрящевая ткань, включающая поверхностный слой (как показано стрелкой на фиг. 4F), регенерировала до первоначальной формы, и поврежденная область эксплантата хрящевой ткани полностью заполнялась регенерированной хрящевой тканью (фиг. 4E и 4F). С другой стороны, контрольная группа и группа, обработанная только TGFβ1, главным образом, не проявляли изменений в поврежденной области эксплантатов (фиг. 4A и 4D).

Исходя из этих результатов, можно увидеть, что пептид по примеру 1 способен обеспечивать регенерацию поврежденного хряща путем стимуляции прикрепления и пролиферации хондроцитов к/в поврежденной области при повышении синтеза коллагена, являющегося главным компонентом матрикса, и также можно увидеть, что TGFβ1 дополнительно повышает скорость регенерации поврежденного хряща. Кроме того, по-видимому, пептиды по примерам 2-12, которые являются вариантами, имеющими аминокислотную последовательность, сходную с таковой пептида по примеру 1, будут оказывать сходное влияние.

Пример 14: Подтверждение влияния на регенерацию хряща с применением осадка суставных хондроцитов

Влияние пептида по примеру 1 на экспрессию гена

Чтобы убедиться, что клеточные свойства суставных хондроцитов сохраняются аналогичными таковым из биологической ткани, клетки осаждали и культивировали.

Хрящевую ткань получали из суставов копыт коров возрастом менее 3 лет в течение часа после того, как их умерщвляли на региональной бойне (расположенной в Оджон-дон, Тэджон, Южная Корея). С этой целью часть хряща, отличную от кости, отрезали с помощью хирургического ножа и собирали для применения. Хрящевую ткань нарезали на шестигранные части длиной приблизительно 1 мм с каждой стороны и помещали в DMEM/F12 (Welgene), дополненную проназой (1 мг/мл, Roche), с последующей реакцией в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 1,5 часов. Обработанную проназой ткань дважды промывали PBS (физиологический раствор, стабилизированный фосфатным буфером) и затем один раз DMEM/F12. Промытую хрящевую ткань помещали в DMEM/F12, дополненную 5% FBS (фетальная бычья сыворотка) (Invitrogen), коллагеназой P (0,25 мг/мл, Roche) и ДНКазой I (20 мкг/мл, Sigma) и давали возможность реагировать в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 8-12 часов так, чтобы ткань полностью распадалась. После завершения распада клетки собирали центрифугированием при 500 x g в течение 15 минут и дважды промывали PBS. Клетки суспендировали при плотности клеток 2x10⁶ клеток/мл в DMEM/F12, дополненной 10% FBS и аскорбатом (50 мг/мл, Sigma) и эти клетки распределяли в 15 мл конические пробирки по 1 мл/пробирка. Клетки осаждали центрифугированием при 500 x g в течение 10 минут и культивировали в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 2 суток, таким образом получая клеточный осадок, который является твердым. Осадок переносили в 24-луночный планшет и культивировали в течение 5 суток. Затем осажденную массу обрабатывали диметилсульфоксидом (DMSO), 2 нг/мл трансформирующего фактора роста бета 1 (TGFβ1, Promokine), смесью 25 мкM пептида по примеру 1 и 2 нг/мл TGFβ1, и 25 мкM пептидом по примеру 1, соответственно, с последующим культивированием в течение еще 5 суток. На 13 сутки клетки культивировали в бессывороточной среде в течение 24 часов. На 14 сутки клетки культивировали в течение 24 часов в бессывороточной среде, дополненной 2 нг/мл TGFβ1, смесью 25 мкM пептида по примеру 1 и 2 нг/мл TGFβ1 или 25 мкM пептидом по примеру 1, соответственно.

РНК выделяли из культивируемого осадка с помощью TRIZOL (Invitrogen) и определяли количественно по поглощению при 260 нм. Синтезировали кДНК из 2,25 мкг РНК с применением случайного гексамера и 5х мастер-премикса обратной транскриптазы (Elpis Biotech, Южная Корея). Амплификацию проводили с применением 1 мкл синтезированной кДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) для исследования уровней экспрессии генов. Гены, которые нужно исследовать, являются такими, как указано ниже: ген характерного для хондроцитов коллагена II типа (COL2A1), как ген для подтверждения регенерации ткани суставного хряща; ген матриксной металлопептидазы 13 (MMP13), который сверхэкспрессируется в поврежденной хрящевой ткани и вовлечен в деградацию матрикса, как ген для подтверждения того, можно ли или нет предотвращать дополнительное повреждение хряща; и ген коллагена X типа (COL10A1), характерного для гипертрофированных хондроцитов, вовлеченных в окостенение суставной ткани, как ген для подтверждения того, присутствует ли или нет их избыточная активация и может ли она обуславливать развитие окостенения.

Последовательности ПЦР праймеров, применяемые для амплификации отдельных генов, и размеры ПЦР продуктов являются такими, как указано ниже.

Коллаген II типа (размер продукта: 381 п.о.)

Прямой праймер: 5'-CAGGACCAAAGGGACAGAAA-3' (SEQ ID NO:13)

Обратный праймер: 5'-GGTTGCCTTGAAATCCTTGA-3' (SEQ ID NO:14)

MMP13 (размер продукта: 600 п.о.)

Прямой праймер: 5'-ATGGACCCTCTGGTCTGTTG-3' (SEQ ID NO:15)

Обратный праймер: 5'-CGTGTTTTGGAAATCCCAGT-3' (SEQ ID NO:16)

Коллаген X типа (размер продукта: 454 п.о.)

Прямой праймер: 5'-CAGTCAAGGGCCTTAATGGA-3' (SEQ ID NO:17)

Обратный праймер: 5'-CCTGAAGCCTGATCCAGGTA-3' (SEQ ID NO:18)

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) (размер продукта: 345 п.о.)

Прямой праймер: 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3' (SEQ ID NO:19)

Обратный праймер: 5'-CCCAGCATCGAAGGTAGAAG-3' (SEQ ID NO:20)

В частности, ПЦР проводят при следующих условиях реакции. В ПЦР реакции используют 1 мкл кДНК, 10 мкл 2х мастер-микса Taq-полимеразы (Solgent), 0,5 мкл каждого набора праймеров (10 пмоль/мкл) и 8 мкл дистиллированной воды. ПЦР амплификация включает денатурацию при 94ºС в течение 2 минут с последующей реакцией при 94ºС в течение 30 секунд, при 58ºС в течение 45 секунд и при 72ºС в течение 1 минуты, с 32 циклами для коллагена II типа, коллагена X типа и MMP13 и с 26 циклами для GAPDH, соответственно. Продукты ПЦР амплификации подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием (EtBr, 2 мкг/мл) в течение 15 минут с последующим подтверждением в УФ (ультрафиолетовом) свете. С применением программы обработки изображений Image J (NIH) уровни экспрессии отдельных генов нормализовали к уровню экспрессии GAPDH и затем относительные уровни экспрессии сравнивали между собой.

Результаты показаны на фиг. 5-7. На фиг. 5 проиллюстрированы результаты, показывающие изменения экспрессии коллагена II типа (COL2A1) при обработке клеток суставных хондроцитов пептидом по примеру 1. На фиг. 6 проиллюстрированы результаты, показывающие изменения экспрессии MMP13. На фиг. 7 проиллюстрированы результаты, показывающие изменения экспрессии коллагена X типа (COL10A1). На каждой из фиг. 5-7 верхняя секция представляет собой фотографию электрофореграмм продуктов ПЦР амплификации в 1% агарозном геле, а нижняя секция представляет собой количественный график электрофоретических полос, полученный с помощью программы обработки изображений Image J (NIH). На графике ось Y представляет % значение относительной интенсивности полосы образца по примеру в сравнении с контрольной группой, где интенсивность полосы контрольной группы принимается за 100%.

Как показано на фиг. 5-7, пептид по примеру 1 давал в результате повышение экспрессии коллагена II типа, который связан с регенерацией хрящевой ткани, на 55% по сравнению с контрольной группой. Совместная обработка пептидом по примеру 1 и TGFβ1 давала в результате повышение экспрессии коллагена II типа на 27% по сравнению с группой, обрабатываемой только TGFβ1 (фиг. 5). В дополнение, пептид по примеру 1 давал в результате снижение экспрессии матриксной металлопептидазы 13 (MMP13), которая вовлечена в деградацию матрикса хрящевой ткани, на 10% по сравнению с контрольной группой. Совместная обработка пептидом по примеру 1 и TGFβ1 давала в результате снижение экспрессии MMP13 на 150% по сравнению с группой, обрабатываемой TGFβ1 (фиг. 6). Пептид по примеру 1 давал в результате снижение экспрессии коллагена X типа (COL10A1), характерного для гипертрофированных хондроцитов, вовлеченных в окостенение суставной ткани вследствие их избыточной активации, на 69% по сравнению с контрольной группой. Совместная обработка пептидом по примеру 1 и TGFβ1 давала в результате снижение экспрессии COL10A1 на 78% по сравнению с обрабатываемой TGFβ1 группой (фиг. 7).

Исходя из этих результатов, было продемонстрировано, что пептид по примеру 1 активирует хондроциты суставной ткани для стимулирования синтеза главных белков матрикса, составляющих хрящ, и ингибирует экспрессию главного фермента, вызывающего деградацию матрикса хрящевой ткани, таким образом эффективно стимулируя регенерацию поврежденной ткани суставного хряща. Кроме того, несмотря на тот факт, что пептид по примеру 1 стимулирует активацию хондроцита, пептид по примеру 1 ингибирует дифференцировку в гипертрофированные хондроциты, которая может развиваться в окостенение суставной ткани (образование остеофитов), и, следовательно, влияет на облегчения регенерации поврежденной ткани в нормальную ткань.

Влияние пептидов по примерам 2-12 на экспрессию генов

Влияние пептидов оценивали таким же образом, как и в разделе «Влияние пептида по примеру 1 на экспрессию гена», за исключением того, что пептиды по примерам 2-12 применяли соответственно вместо пептида по примеру 1. В таблице 2 ниже показаны результаты экспериментов по влиянию пептидов по примерам 1-12 на экспрессию коллагена II типа в клетках хондроцитов хряща.

Таблица 2

Образец	Относительная экспрессия коллагена II типа (%) (среднее значение±стандартное отклонение)
Без обработки	100±10
Пример 1	155±12
Пример 2	163±19
Пример 3	161±29
Пример 4	124±12
Пример 5	149±27
Пример 6	158±38
Пример 7	190±38
Пример 8	115±42
Пример 9	147±41
Пример 10	166±26
Пример 11	157±34
Пример 12	159±28

В таблице 2 показаны результаты сравнительного анализа изменений экспрессии коллагена II типа в клетках культуры хрящевой ткани между пептидами по примерам 2-12, которые являются вариантами, имеющими аминокислотную последовательность, сходную с таковой пептида по примеру 1. Для справки, результаты также обеспечены для проб без обработки. Числовые значения в таблице 2 представлены в виде среднего значения с учетом стандартного отклонения, и число образцов составляет 3 для каждой группы. Данные были подсчитаны с помощью статистической программы PASW Statistics (версия 17.0, SPSS Inc.). Среднее значение ± стандартное отклонение предоставляли при уровне p<0,05 с применением однофакторного дисперсионного анализа, и значимость между средними значениями экспериментальных групп тестировали с помощью наименьшей значимой разности (LSD). Подобно пептиду по примеру 1 пептиды по примерам 2-12 также проявляли значительное повышение экспрессии коллагена II типа по сравнению с группой без обработки. Как следствие, было продемонстрировано, что пептиды по примерам 2-12, которые являются вариантами аминокислотной последовательности пептида по примеру 1, также проявляют воздействия, сходные с таковыми пептида по примеру 1, на экспрессию коллагена II типа, который является главным компонентом внеклеточного матрикса (ECM) хряща (таблица 2). Соответственно, можно увидеть, что все пептиды по примерам 1-12 влияют на регенерацию хряща.

Пример 15: Влияние пептидных соединений на регенерацию хряща в модели дегенеративного артрита

В качестве экспериментальных животных у Orient Bio Inc. (Южная Корея) были приобретены самцы новозеландских белых кроликов (n=10) возрастом 18-22 недели, весящие от 3 до 3,5 кг. Эксперименты на животных осуществляли в соответствии с директивой Института ресурсов лабораторных животных (ILAR), утвержденной Организационным комитетом по содержанию и использованию животных (Institutional Animal Care and Use Committee) Института медико-биологических исследований Самсунг (Samsung Biomedical Research Institute) (SBRI, Сеул, Южная Корея). Дегенерацию суставных хрящей индуцировали путем хирургического рассечения передней крестообразной коленной связки у кроликов и содержания животных в клетке в течение 4 недель. Животных делили на контрольную группу и экспериментальную группу.

Кроликов вводили в общий наркоз с помощью внутримышечной инъекции 2,5 мг/кг ксилазина (Rompun, Bayer) и 8 мг/кг тилетамина/золазепама (Zoletil, Virbac). Затем коленные суставы правых задних конечностей животных выбривали и дезинфицировали. Кожу и суставные сумки колена разрезали, и надколенники смещали для обнажения передних крестообразных связок. Затем связку разрезали с помощью бритвенного лезвия (№11) и суставную сумку и кожу зашивали. После завершения хирургической операции кроликов выращивали в клетке в течение 4 недель, при этом допуская обычное движение. Животных содержали в следующих условиях: температура от 20 до 25ºС, влажность от 10% до 50% и цикл чередования света и темноты (L/D): (свет с 08:00 a.m. до 20:00 p.m.). Всех животных кормили один раз в сутки. На 4 неделю после хирургической операции кроликов делили на две группы с последующей инъекцией внутрь суставной полости. Контрольной группе давали инъекцию среды (5% лактоза/физиологический раствор). Для экспериментальной группы 200 мкл 52,5 мкМ раствора пептида вводили инъекцией группе, которой вводили 30 мкМ пептида по примеру 1, и 200 мкл 157,5 мкM раствора пептида вводили инъекцией группе, которой вводили 90 мкМ пептида по примеру 1. Вышеупомянутый пептид готовили в растворителе из 5% лактозы/физиологического раствора перед применением. Инъекцию давали один раз в неделю в течение 4 недель. Через 1 и 5 недель после конечной инъекции (через 8 и 12 недель после первой операции) экспериментальных животных подвергали эвтаназии путем внутрисосудистой инъекции 1-2 мМ/кг KCl под глубоким наркозом.

Проксимальную часть (бедренную область) кости коленного сустава вырезали. Для сравнения с нормальной тканью левую нормальную область сустава также дополнительно вырезали с последующим изучением невооруженным глазом и фотосъемкой. Вырезанные суставные области фиксировали в 10% формалине, декальцинировали с помощью декальцинирующего раствора (CalciClear Rapid, National Diagnostics) и затем их заливали в парафиновые блоки. Фронтальную плоскость суставной кости нарезали на части толщиной 4 мкм, таким образом получая микроскопический препарат. С целью изучения структуры и распределения клеток проводили окрашивание гематоксилином и эозином (H&E). С целью изучения распределения протеогликана в матриксе проводили окрашивание сафранином O. С целью изучения распределения коллагена проводили окрашивание трихромом по Массону. Окрашивание H&E проводили с применением гематоксилина Харриса (Melrose J. et al., Spine (2002) 1756-1764) после того, как микроскопический препарат последовательно обезвоживали в ксилоле и 100%, 90%, 70% этаноле в течение 10 минут каждый раз. Окрашивание сафранином O проводили путем обезвоживания микроскопического препарата таким же образом, как и при окрашивании H&E, окрашивания микроскопического препарата в 0,02% зеленом прочном в течение 3 минут, 1% уксусной кислоте в течение 30 секунд и 0,1% сафранине О в течение 5 минут и последовательного 10-кратного погружения и обезвоживания микроскопического препарата в 70%, 90%, 100% этаноле и ксилоле. Окрашивание трихромом по Массону выполняли с применением трихрома (Melrose J. et al., Eur. Spine J. (2007) 2193-2205). Микроскопические препараты получали соответственно для нормальной группы, контрольной группы (группы, которой вводили лактозу) и экспериментальной группы (группы, которой вводили пептид по примеру 1) и изучали под микроскопом.

Результаты, наблюдаемые невооруженными глазами, показаны на фиг. 8. Как показано на фиг. 8, ткань суставного хряща нормальной группы была гладкой и блестящей, тогда как контрольная группа (группа, которой вводили лактозу) с моделью дегенеративного остеоартрита имела часть, в которой хрящевая ткань была повреждена и смещена и имела уменьшенный блеск. С другой стороны, ткань суставного хряща экспериментальной группы (группы, которой вводили пептид по примеру 1; 30 мкМ, 90 мкМ) имела гладкую поверхность и блеск, близкий к нормальному состоянию, что является следствием регенерации поврежденной хрящевой ткани.

Результаты окрашивания H&E показаны на фиг. 9. Как показано на фиг. 9, только контрольная группа (группа, которой вводили лактозу) имела фиброхондроциты (интенсивная окраска) на поверхностном слое хрящевой ткани, тогда как экспериментальная группа (группа, которой вводили пептид по примеру 1) имела характер окрашивания, сходный с таковым нормальной группы, и показывала увеличенный размер клеток вследствие активации клеток. Таким образом, можно увидеть, что пептид по примеру 1 активирует суставные хондроциты в экспериментальной группе.

Результаты окрашивания (сафранином O) протеогликана матрикса хряща показаны на фиг. 10. Как показано на фиг. 10, контрольная группа (группа, которой вводили лактозу) имела заметно пониженный синтез протеогликана в переходном слое и глубоком слое по сравнению с нормальной группой. С другой стороны, экспериментальная группа (группа, которой вводили пептид по примеру 1) имела повышенный синтез протеогликана в зависимости от дозы. Таким образом, было продемонстрировано, что в отношении экспериментальной группы, пептид по примеру 1 повышает синтез протеогликана, главного компонента матрикса ткани суставного хряща, таким образом стимулируя регенерацию поврежденной хрящевой ткани.

Результаты окрашивания коллагена (трихромом по Массону) показаны на фиг. 11. Как показано на фиг. 11, нормальная группа и экспериментальная группа (группа, которой вводили пептид по примеру 1) имели сходный характер окрашивания, тогда как поврежденная область у контрольной группы (группы, которой вводили лактозу) имела интенсивное окрашивание, что отражает повышенный синтез коллагеновых фибрилл в поврежденной области. Соответственно, было продемонстрировано, что пептид по примеру 1 стимулирует регенерацию хрящевой ткани, имеющей нормальную поверхность (гиалиновый хрящ, в основном коллаген II типа), тогда как контрольная группа (группа, которой вводят лактозу) имеет повышенный синтез волокнистого хряща (в основном коллаген I типа), который чувствителен к повреждению вследствие ослабления физических свойств в результате процесса адаптации к дегенеративным изменениям.

Повышенный синтез коллагеновых фибрилл наблюдали, исходя из результатов окрашивания коллагена в контрольной группе (группе, которой вводили лактозу), соответствует результатам увеличения числа фиброхондроцитов в поверхностном слое, которое наблюдали в поврежденной области у контрольной группы при проведении окрашивания H&E, таким образом демонстрируя, что нормальная регенерация ткани в процессе адаптации к дегенеративным изменениям не индуцируется, но пептид по примеру 1 индуцирует регенерацию нормальной ткани в экспериментальной группе.

В результате было продемонстрировано, что пептид по примеру 1 стимулирует активацию хондроцитов и синтез компонентов матрикса хряща (протеогликан, коллаген II типа) в экспериментах с применением модели дегенеративного остеоартрита и, следовательно, оказывает отличное влияние на регенерацию поврежденной хрящевой ткани сходно с нормальной тканью.

Промышленная применимость

Настоящее изобретение обеспечивает пептид или его фармацевтически приемлемую соль, композицию, содержащую этот пептид или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, и композицию, содержащую этот пептид или его фармацевтически приемлемую соль и TGFβ1, для лечения и/или профилактики по меньшей мере одного, выбранного из повреждения хряща и артрита. Вышеупомянутый пептид или его фармацевтически приемлемая соль является эффективным для лечения и/или профилактики повреждения хряща и/или артрита, и может влиять на регенерацию хрящевой ткани, ингибирование экспрессии фермента, вызывающего деградацию матрикса хрящевой ткани, и/или ингибирование окостенения хрящевой ткани, и, следовательно, является промышленно применимым.

1. Пептид, представленный формулой (I):

где X₁ представляет Glu или Asp, X₂ представляет His, Lys или Arg, X₃ представляет Asp или Glu, при этом Glu, Asp, Leu, His, Lys и Arg представляют собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, лейцин, гистидин, лизин и аргинин, соответственно; или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Пептид по п.1, где X₁ представляет Glu, X₂ представляет His и X₃ представляет Asp.

3. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики по меньшей мере одного, выбранного из повреждения хряща и артрита, содержащая пептид по п.1 или 2 или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Композиция по п.3, где лечение или профилактика осуществляется посредством по меньшей мере одного, выбранного из регенерации хрящевой ткани, ингибирования экспрессии фермента, вызывающего деградацию матрикса хрящевой ткани, и ингибирования окостенения хрящевой ткани.

5. Композиция по п.3, где артрит является заболеванием суставов, которое сопровождается дегенерацией хряща и субхондральной кости.

6. Композиция по п.3, где композиция является фармацевтической композицией.

7. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики по меньшей мере одного, выбранного из повреждения хряща и артрита, содержащая пептид по п.1 или 2 или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента, трансформирующий фактор роста бета 1 (TGFβ1), и фармацевтически приемлемый носитель.