Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей



Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей
Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей

 


Владельцы патента RU 2526146:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и инфекционным болезням, и может быть использовано для профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей. Для этого одновременно подавляют ген p респираторно-синцитиального вируса (далее - РСВ) и провоспалительный ген il-4 мыши, при этом для подавления гена p РСВ, необходимого для его репликации в клетке, используют создаваемую молекулу малой интерферирующей РНК (миРНК) - SEQ ID NO 1 (siP1), а для подавления провоспалительного гена il-4 мыши используют создаваемую молекулу миРНК - SEQ ID NO 15 (siIL4-408). На их основе создают препараты, содержащие терапевтически эффективное их количество, после чего вводят интраназально. Способ позволяет ослабить признаки аллергического воспаления и тяжесть течения РСВ-инфекции за счет подавления провоспалительного гена il-4 мыши и подавления репликации вируса РСВ. 1 з.п. ф-лы, 17 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицины.

За последние годы была разработана эффективная противовирусная терапия для многих вирусных инфекций, однако количество заболевших остается высоким. Наиболее частыми, до 90% всех случаев инфекционных заболеваний, являются острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ). Ведущую роль в структуре заболеваемости ОРВИ занимает респираторно-синцитиальный вирус (далее - РСВ). РСВ (англ. RSV, Human respiratory syncytial virus) - вирус, вызывающий инфекции дыхательных путей.

Несмотря на десятилетия исследований РСВ, эффективных и широкодоступных терапевтических средств против данной инфекции в настоящее время не существует. В 60 гг. были разработаны первые вакцины для профилактики РСВ-инфекции, в том числе живая, на основе температуро-чувствительных штаммов РСВ, а также инактивированная формалином вакцина. Эти препараты не обеспечивали достаточного протективного эффекта. Более того, у привитых детей, в поствакцинальном периоде развивались более тяжелые формы естественной РСВ-инфекции, чем в контрольной группе. Печальный опыт формалин-инактивированной РСВ-вакцины показал, что на фоне естественной РСВ-инфекции у вакцинированных развивались более тяжелые поражения нижнего дыхательного тракта, чем в контрольной группе. Предполагают, что причиной этого явилась иммунологическая сенсибилизация, связанная с клеточно-опосредованными иммунными механизмами, что наблюдается при многих аллергических состояниях, в частности при бронхиальной астме (далее - БА). Предполагается при этом, что у привитых при последующей естественной инфекции происходит высвобождение воспалительных факторов и других молекул, увеличивающих локальный воспалительный процесс. Вакцины, созданные спустя 30 лет, не показали эффективности. Разработка терапевтических средств, направленных против РСВ, также не принесла ожидаемых результатов. В настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется рибавирин - простейший нуклеозидный аналог, вызывающий многочисленные побочные эффекты. Накапливается опыт применения средств против РСВ на основе нейтрализующих поликлональных и моноклональных антител - RSV-IGIV (Respigam), palivizumab (Synagis), MEDI-524 (Numab), однако очевидно, что их применение будет ограничено из-за очень высокой стоимости.

Респираторные вирусные инфекции зачастую связаны с развитием обострений у больных бронхиальной астмой (БА), в частности вирусы поражают эпителий дыхательных путей, клетки которого выделяют большое количество провоспалительных цитокинов и медиаторов, усиливающих воспалительный процесс. К таковым относятся цитокины, продуцируемые Th2 клетками: ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13 и ИЛ-10. Они связаны с аллергическими заболеваниями и дисфункцией респираторного тракта.

Вышеупомянутые цитокины относятся к типичным Th2-цитокинам, их эффекты сильно перекрываются, однако между ними есть и определенное «разделение труда». Считается, что именно ИЛ-4 играет ключевую роль в подготовке аллергических процессов. Он имеет широкий спектр биологической активности, в частности усиливает пролиферацию B-лимфоцитов после распознавания антигена, а также регулирует синтез определенных классов антител (у человека - IgE и IgG4), участвующих преимущественно в развитии аллергии. В частности известно, что ИЛ-4 связан с переключением синтеза тяжелых цепей молекул иммуноглобулинов от IgM в направлении IgE либо IgG4. Благодаря множеству биологических функций IL-4 может считаться одним из главных регуляторов развития аллергических реакций и аллергического воспаления в тканях, так как помимо индукции синтеза указанных классов антител этот цитокин является ростовым фактором для базофилов, тучных клеток и эозинофилов и усиливает экспрессию в этих клетках рецепторов. Был выявлен гаплотип гена ИЛ-4, ассоциированный с тяжелой респираторно-вирусной инфекцией. В других исследованиях также показана связь вариантов ИЛ-4 с более тяжелым течением РС-вирусной инфекции. В связи с этим ген ИЛ-4 представляет собой перспективную мишень для разработки новых терапевтических средств.

Осуществлялись попытки подавить активность ИЛ-4 с помощью моноклональных антител, хотя доклинические исследования с использованием лабораторных мышей были успешными, однако последующее фазы испытаний с участием пациентов, страдающих БА, не подтвердили этих обнадеживающих результатов. Все вышеперечисленное указывает на то, что к настоящему времени появилась необходимость разработать принципиально новый подход к разработке широкодоступных лечебно-профилактических средств против аллергической БА и осложняющих ее респираторных вирусных инфекций.

Недавнее открытие интерференции рибонуклеиновой кислоты (далее - РНК) (далее - РНКи) - одного из основных механизмов посттранскрипционной регуляции генов - дало возможность использовать данный феномен для разработки новых средств, способных эффективно и безопасно подавлять как репродукцию вирусных инфекций, так и провоспалительных генов. РНКи позволяет специфически «выключать» экспрессию, теоретически любых генов-мишеней при помощи молекул малых интерферирующих РНК (миРНК или siRNA). Главными преимуществами использования препаратов на основе РНКи являются их высокая специфичность и эффективность подавления экспрессии гена-мишени (до 90%). Кроме того, привлекательной является сравнительная дешевизна методики. Синтез олигонуклеотидов в настоящее время вполне доступен и прост. Этот факт дает препаратам, созданным на базе миРНК, важное конкурентное преимущество, например, по сравнению с моноклональными антителами.

Хотя препараты миРНК уже активно внедряются в медицинскую практику, все еще не описано эффективного совместного воздействия антивирусных и противовоспалительных препаратов миРНК на модели бронхиальной астмы, осложненной инфекцией вирусом РСВ.

Аналогов предлагаемого изобретения не выявлено.

Задачей данного изобретения является разработка способа лечения и профилактики бронхиальной астмы, осложненной инфекцией вирусом РСВ.

Для решения данной задачи были разработаны противовирусные и противовоспалительные препараты, работающие на основе механизма интерференции РНК (РНКи), а также разработан способ их совместного воздействия на мышиной модели БА, осложненной инфекцией вирусом РСВ.

Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей, заключающийся в одновременном подавлении гена р респираторно-синцитиального вируса (далее - РСВ) и провоспалительного гена il-4 мыши, при этом для подавления гена p РСВ, необходимого для его репликации в клетке, используют создаваемую молекулу малой интерферирующей РНК (миРНК) - siP1, а для подавления провоспалительного гена il-4 мыши используют создаваемую молекулу миРНК - siIL4-408, на их основе создают препараты, содержащие терапевтически эффективное их количество, после чего полученные препараты вводятся млекопитающим.

Преимущественно, в способе профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний полученные препараты миРНК вводят интраназально.

Предлагаемое изобретение поясняется следующими графическими материалами: приложение с перечнем последовательностей в виде SEQ ID NO, в таблице 1 представлены последовательности молекул миРНК, направленные против мРНК гена il-4 мыши и контрольные миРНК, в таблице 2 представлены способы введения и дозы препаратов, содержащих миРНК (siP1 и siIL4-408), при использовании препаратов siGFP и siRV в качестве неспецифического контроля, на рисунке 1 представлено изменение интенсивности флуоресценции GFP+-клеток 293T после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP, на рисунке 2 - изменение экспрессии il-4 в клетках 293T после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP, на рисунке 3 - изменение концентрации ИЛ-4 мыши в супернатантах клеток 293T после ко-трансфекции молекул миРНК и рекомбинантной плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP, на рисунке 4 представлено изменение уровней сывороточных anti-OVA-IgE у животных при интраназальном введении препаратов миРНК, на рисунке 5 представлено изменение уровней сывороточных anti-OVA-IgG2a у животных при интраназальном введении препаратов миРНК, на рисунке 6 представлено изменение удельной сопротивляемости дыхательных путей у животных при интраназальном введении препаратов миРНК, на рисунке 7 представлено изменение количества копий мРНК-il-4 в ткани легких, на рисунке 8 представлено количество вирусной РНК в гомогенатах легких мышей, сенсибилизированных овальбумином и обработанных специфическими и неспецифическими миРНК, на рисунке 9 представлены изменения относительного количества эозинофилов в бронхо-альвеолярном лаваже мышей, обработанных препаратами миРНК.

Разработка способа лечения и профилактики РСВ-инфекции и связанных с ней заболеваний дыхательных путей, работающего на основе механизма РНК-интерференции, проводилась с использованием мышиных моделей.

Для проектирования молекул миРНК, обладающих противовирусной активностью, были проанализированы доступные в базе данных GeneBank нуклеотидные последовательности генома вируса РСВ. Было установлено, что перспективным является ген p вируса РСВ, который необходим для его репликации в клетке. Белок P, кодируемый геном p необходим для фермента РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP), и отвечает за его отхождение промотора и формирование комплекса, ответственного за элонгацию. При инфицировании клетки вирусом новообразованная RdRP осуществляет первые этапы транксрипции, обозначаемые как первичная транксрипция. В «состоянии транскрипции» вирусная RdRP запускается и выключается в начале и в конце каждого вирусного гена, что приводит к синтезу отдельных мРНК. Трансляция этих мРНК приводит к синтезу вирусных белков de novo. Из вышеуказанного следует, что сайленсинг гена p должен приводить к подавлению репликации вируса РСВ. В базе данных GenBank обнаружено несколько геномных последовательностей РСВ: AF013254, AF035006, AY353550, AY911262, U39662, U50362, U50363, U63644, NC_001781. Они были выравнены с использованием программы Vector NTI Suite V6 с целью определить консервативные участки в геноме РСВ, в частности в интервале, кодирующем ген p.

Данный анализ позволил спроектировать и в дальнейшем синтезировать 6 молекул миРНК, направленных против различных участков мРНК данного гена (SEQ ID NOS 1-6):

(SEQ ID NO 1),

(SEQ ID NO 2),

(SEQ ID NO 3),

(SEQ ID NO 4),

(SEQ ID NO 5),

(SEQ ID NO 6).

Возможность успешного использования молекул миРНК в качестве высокоспецифичного средства «выключения» экспрессии вирусных генов была доказана экспериментально. В ходе экспериментов in vitro репликация РСВ была специфично подавлена молекулами миРНК.

Методом световой микроскопии установлено, что в клетках, обработанных неспецифическими миРНК и необработанных миРНК, через 48 часов после заражения на монослое клеток МА-104 наблюдалось выраженное цитопатическое действие (ЦПД), которое выражалось в формировании характерных крупных синцитиев в монослое. Через 72-96 часов после инфицирования в этих лунках оставалось около 50% прикрепленных клеток, из них примерно половина в составе обширных синцитиев, остальные клетки находились в составе всплывших синцитиев. Напротив, через 48, 72 и 96 часов после заражения в лунках, обработанных специфическими миРНК, визуально синцитии не определялись. В клетках, обработанных специфическими миРНК, признаков ЦПД не наблюдали до 7-10 суток.

Наибольшую активность проявила siP1. Так, методом титрования по Риду-Менчу показано, что через 48 часов после инфицирования в лунках, обработанных siP1 (SEQ ID NO 1), обнаружено снижение титра РСВ по сравнению с контролем в 54 раза. Через 72 часа величина разницы между титром вируса в лунках, обработанных siP1, и в контрольных лунках составила 280 раз. Через 96 часов титр вируса в лунках, обработанных siP1, был в среднем в 125 раз меньше титра в контрольных лунках.

Аналогичные результаты были получены методом количественной ПЦР. Через 48 часов после инфицирования в лунках, обработанных siP1, обнаружено снижение количества специфической вирусной РНК по сравнению с контролем в 7 раз. Через 72 часа эта разница между количеством специфической вирусной РНК в лунках, обработанных siP1, и в контрольных лунках составила 19 раз. Через 96 часов количество специфической вирусной РНК в лунках, обработанных siP1, было в 38 раз меньше, чем в контрольных лунках.

Помимо молекул миРНК к некоторым из выбранных участков внутри гена p вируса РСВ были спроектированы и сконструированы три молекулы кшРНК. Ниже приведены готовые последовательности сконструированных кшРНК в составе ДНК-кассеты shRNAmir3 (SEQ ID NOS 7-9).

shP1 (SEQ ID NOS 7):

shP2 (SEQ ID NOS 8):

shP4 (SEQ ID NOS 9):

Чтобы оценить способность этих молекул кшРНК (shP1, shP2, shP4) проявлять антивирусную активность против РСВ, проведены наблюдения за изменением вирусной нагрузки на клетки МА-104 в течение 96 часов после их заражения низкой (MOI=0,0004) и высокой дозами (MOI=0,01) вируса. Интенсивность нагрузки определялась, во-первых, путем титрования вирусного материала на монослое клеток МА-104 по методу Рида-Менча. Данный способ позволяет оценивать количество сформировавшихся вирионов, способных инфицировать клетки МА-104 и образовывать специфические синцитии, видимые в световой микроскоп. Во-вторых, методом количественной ПЦР.

После заражения клеток МА-104, постоянно экспрессирующих молекулы shP1, shP2, shP4, и контрольную shCD43 низкой и высокой дозами РСВ происходило увеличение вирусной нагрузки на все штаммы клеток в течение наблюдаемого периода. При этом абсолютные значения титра вируса были в 3,4-7,3 раза выше при инфицировании клеток высокой дозой РСВ, о чем свидетельствуют данные титрования по методу Рида-Менча. Однако вирусная нагрузка на клетки, экспрессирующие shP1, shP2 и shP4, была значительно ниже в сравнении с клетками, экспрессирующими контрольную shCD43. Противовирусный эффект shP1, shP2 и shP4 был заметен уже спустя 48 часов после заражения клеток вирусом и проявлялся на протяжении всего наблюдаемого срока как при высокой, так и при низкой инфекционных дозах. Это свидетельствует о том, что изучаемые молекулы кшРНК обеспечивают специфический сайленсинг вирусного гена p по механизму интерференции РНК и, как следствие, приводят к подавлению репликации РСВ. В то время как экспрессия shCD43, не имеющей гомологии с геном p, не оказывает противовирусного эффекта.

Проведенные эксперименты подтвердили, что ген p является удобной мишенью для разработки противовирусных как миРНК, так и кшРНК.

Для проектирования молекул миРНК, обладающих противовоспалительной активностью, были проанализированы доступные в базе данных GeneBank нуклеотидные последовательности гена il-4 мыши. Известно, что повышенная активность этого гена приводит к синтезу интерлейкина-4 (далее - ИЛ-4), одного из основных провоспалительных факторов, что в итоге приводит к более тяжелому течению РСВ-инфекции. Кроме того, сама РСВ-инфекция способна провоцировать формирование сильной воспалительной реакции в дыхательных путях и, таким образом, провоцировать развитие приступов бронхиальной астмы. Таким образом, у больных с бронхиальной астмой тяжесть течения РСВ-инфекции определяется не только болезнетворной активностью самого вируса, но и повышенной воспалительной реакцией самого макро-организма на РСВ, что многократно утяжеляет течение инфекционного процесса.

В ходе анализа было построено выравнивание на основе известных в базе данные GeneBank последовательностей гена il-4 мыши. Номера последовательностей: M13238.1, M25892.1, AB174765.1, AF352783.1, NM_021283.2, X03532.1, BC027514.1. На основе полученного выравнивания было выбрано 6 участков в гене il-4 мыши в качестве мишеней для молекул миРНК и, соответственно, было спроектировано и сконструировано 6 молекул миРНК против гена il-4 мыши (SEQ ID NOS 10-15). Последовательности миРНК, направленных против мРНК-il-4, представлены в таблице 1, в которой «*» обозначена последовательность миРНК, направленная против мРНК гена gfp (SEQ ID NO 16), используемая в качестве положительного контроля, а «**» - последовательность миРНК, направленная против мРНК гена p респираторно-синцитиального вируса (РСВ) (SEQ ID NO 17), используемая в качестве отрицательного контроля. В качестве положительного контроля использовали siGFP, которая по нашим данным подавляла экспрессию ИЛ-4 до 10 раз. В качестве положительного контроля использовали siP4, направленную против гена p респираторно-синцитиального вируса, последовательность данной миРНК не имеет 100% сходства ни с последовательностью il-4 мыши, ни с последовательностью gfp. Более того, для тестирования спроектированных молекул миРНК в экспериментах in vitro была создана экзогенная модель экспрессии этого гена в хорошо трансфецируемых клетках 293T.

Эффективность спроектированных молекул миРНК была оценена с использованием данной модели различными методами. Для этого 1×105 клеток 293T трансфецировали смесью, состоящей из 0,5 мкг плазмиды pUCHR IL4 IRES GFP, экспрессирующей ИЛ-4, и 1 мкг соответствующей миРНК. Сутки после ко-трансфекции методом проточной цитометрии было оценено количество GFP+-клеток, а также средняя интенсивность их флуоресценции. Как оказалось, вариант миРНК (siIL4-408) приводил к заметному снижению интенсивности флуоресценции CFP+-клеток в 5 раз, в сравнении с отрицательным контролем (рисунок 1). На рисунке 1 представлена средняя интенсивность флуоресценции клеток 293T в % относительно контроля (siP4). Интенсивность флуоресценции клеток при ко-трансфекции siP4 и pUCHR IL4 IRES GFP принято за 100%. Представлены средние результаты двух независимых экспериментов.

Результаты, полученные в ходе количественного ПЦР анализа и ИФА, показали сходную картину. В клетках, взятых через сутки после ко-трансфекции, наблюдается снижение количества копий мРНК-il-4. Наиболее эффективное снижение обеспечивала также siIL4-408 до 3 раз (рисунок 2). На рисунке представлено количество копий мРИК-il-4 относительно контроля (siP4). Количество мРНК-il-4 при ко-трансфекции siP4 и pUCHR IL4 IRES GFP принято за 100%. Представлены средние результаты двух независимых экспериментов.

В клеточных супернатантах в этот же период времени происходит снижение концентрации секретированного клетками ИЛ-4 до 10 раз (рисунок 3).

Помимо молекул миРНК к выбранным участкам в мРНК гена il-4 мыши были спроектированы 2 молекулы кшРНК, направленные против мРНК-il-4 (SEQ ID NOS 18-19). Их последовательности представлены ниже (shIL4-267 и shIL4-408). Молекула кшРНК (shIL4-OB2), доступная на сайте производителя «OpenBiosystems» (SEQ ID NO 20) и также направленная на подавление мРНК гена il-4 мыши, использовалась в качестве положительного контроля.

shIL4-267 (SEQ ID NO 18)

shIL4-408 (SEQ ID NO 19)

shIL4-OB2 (SEQ ID NO 20)

Эффективность подавления экспрессии мышиного il-4 с использованием полученных кшРНК была оценена в экспериментах in vitro. Для этого клетки эмбриональной почки человека 293T в количестве 100 тыс. клеток были трансфецированы смесью, состоящей из 0,5 мкг рекомбинантной плазмидой плазмиды pUCHR IRES IL4 GFP, способной экспрессировать ИЛ-4 мыши, и 1 мкг плазмиды, несущей спроектированную кшРНК. Трансфекция клеток осуществлялась с использованием коммерческого реагента Lipofectamine2000 (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве контроля специфичности использовали shP4, направленную против мРНК гена p вируса РСВ и не имеющую сходства с последовательностью il-4 мыши. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, не обработанные какими-либо плазмидами. Сутки после ко-трансфекции смесью плазмид была определена концентрация ИЛ-4 в клеточных супернатантах. Как оказалось, наибольшей эффективностью обладала shIL4-OB2, снижая экспрессию гена il-4 в 5 раз (до 20%) в сравнении с shP4. Вариант shIL4-267 также достоверно снижал уровень экспрессии гена-мишени, но снижение было менее значительным до 50%.

Таким образом, были спроектированы варианты молекул миРНК и кшРНК, способные эффективно подавлять экспрессию провоспалительного гена il-4 мыши.

Был разработан режим введения препаратов миРНК и кшРНК модельным животным (мыши самки линии BALB/c с признаками бронхиальной астмы, осложненной вирусом РСВ).

Для оценки противовирусной и противовоспалительной эффективности совместного воздействия siP1 и siIL4-408 экспериментальные животные были разделены на 5 групп, у первых 4-х групп проводилось моделирование экспериментальной бронхиальной астмы (БА). Группам №2, 3 и 4 интраназально (и/н) вводили вирус РСВ, при этом группе 3 вводили миРНК против гена И-4 и миРНК против гена p вируса РСВ. В то же время группа 4 получала контрольные неспецифичные миРНК против гена gfp и против риновируса siRV. Группа №5 никаким манипуляциям не подвергалась (интактные животные) (таблица 2).

После каждого этапа (сенсибилизации и ИНА) был осуществлен забор крови и оценены уровни сывороточных антител класса IgE и субклассов IgG2a и IgG1.

Как и ожидалось, после этапа сенсибилизации уровни анти-OVA IgE антител были незначительно выше у животных, получавших аллерген внутрибрюшинно, т.е. у животных, подвергавшихся моделированию БА, чем у интактных мышей. Однако после этапа ИНА уровни специфических IgE антител возрастали в 2 раза, причем рост происходит как у модельных животных, так и у животных, получавших интраназально препараты миРНК. Несмотря на то что группа №3 получала миРНК против гена il-4, вовлеченного в IgE антителообразование, какого-либо понижения уровня данного класса антител не наблюдалось (рисунок 4). На рисунке представлены средние концентрации сывороточных анти-AVA IgE антител и ошибки средних.

При этом на рисунке приняты следующие условные обозначения:

× - достоверно отличается от группы «БА»,

# - достоверно отличается от группы «БА+RSV»,

• - достоверно отличается от группы «siGFP+siRV»,

где отличия считаются достоверными при p≤0,05, N=8.

Вероятно, это связано с тем, что животным миРНК вводилась локально (интраназально в ткань легких), а не системно (в кровоток), поэтому препарат не оказал влияния на уровни IgE в сыворотке крови.

Изменения уровней сывороточных анти-OVA IgG2a антител имели иной характер. В отличие от IgE, после ИНА не происходило какого-либо существенного роста специфических IgG2a антител во всех экспериментальных группах. Этот факт хорошо согласуется с современными представлениями об аллергических процессах, которые связаны с продукцией специфичных IgE антител Th2-клетками при снижении или, по крайней мере, неизменной продукции IgG2a антител Th1-клетками. Также как и в случае IgE не наблюдается изменений уровней IgG2a у животных, получавших миРНК против il-4, что еще раз подтверждает невозможность регулирования антителообразования посредством локального введения препаратов миРНК (рисунок 5). На рисунке представлены средние концентрации сывороточных анти-AVA IgG2a антител и ошибки средних. При этом приняты условные обозначения:

× - достоверно отличается от группы «БА»,

# - достоверно отличается от группы «БА+RSV»,

• - достоверно отличается от группы «siGFP+siRV»,

где отличия считаются достоверными при p≤0,05, N=8.

О превалировании Th2-ответа над Th1 у всех животных, подвергшихся моделированию аллергической БА, свидетельствуют также изменения индекса IgE/IgG2a, который увеличивается у всех животных после ИНА. Данный индекс IgE/IgG2a показывает соотношение уровней аллерген-специфичных антител IgE и IgG2a в сыворотке крови. Известно, что при аллергических состояниях уровень IgE возрастает и, соответственно, этот индекс принимает значения больше единицы. Что касается изменений уровней anti-OVA-IgG1 антител, то наблюдается картина, сходная с таковой для anti-OVA-IgG2a антител.

Через сутки после заключительной интраназальной апликации OVA у животных была оценена удельная сопротивляемость дыхательных путей (sRaw). Как оказалось у модельных животных (группа «БА») и у модельных животных, инфицированных РСВ (группа «БА+RSV»), сопротивляемость дыхательных путей была значительно выше, чем у интактных при использовании всех концентраций метахолина (MX) (6,25, 12,5, 25 и 50 мг/мл). Животные, получавшие неспецифические миРНК (siGFP и siRV), имели сопротивляемость дыхательных путей, сходную с таковой у модельных животных, однако при интраназальном введении siIL4-408 и siP1 в суммарной дозе 100 мкг/мышь удельная сопротивляемость существенно снижалась и принимала значения ниже, чем в интактной группе (рисунок 6).

Животным группы №3 вводился препарат siIL4-408, который, согласно нашим предположениям, должен подавлять экспрессию ИЛ-4 в органе-мишени, т.е. в легких. Для проверки нашей гипотезы у экспериментальных животных в ткани легких был оценен уровень экспрессии гена il-4 методом количественной ПЦР. Согласно проведенным расчетам уровень экспрессии il-4 в ткани легких снижался в 3 раза в сравнении с модельными животными (группа «БА») и в 2 раза в сравнении с животными, получавшими неспецифические миРНК (группа «БА+RSV+siMock») (рисунок 7). На рисунке 7 представлено изменение количества копий мРНК-il-4 в ткани легких на грамм ткани легкого. При этом приняты условные обозначения, где:

× - достоверно отличается от группы «БА»,

# - достоверно отличается от группы «БА+RSV»,

* - достоверно отличается от группы «БА+RSV+siMock».

Отличия достоверны при p≤0,05; N=8.

Оценка изменения вирусной нагрузки в легких осуществлялась также методом количественной ПЦР. В группе мышей, обработанных молекулами миРНК, направленными против РСВ, наблюдалось снижение вирусной нагрузки в 6,3 раза по сравнению с группой «БА+RSV» и в 3 раза по сравнению с группой «БА+RSV+siMock». Вероятно, снижение количества вирусной РНК в группе, обработанной неспецифическими миРНК, может быть связано с неспецифическим иммунным ответом, вызванным обработкой мышей большими количествами миРНК (100 мкг/мышь) (рисунок 8). При этом указано количество вирусной РНК в гомогенах легких мышей, сенсибилизированных овальбумином и обработанных специфическими и неспецифическими миРНК, где

# - достоверно отличается от группы «БА+RSV»,

* - достоверно отличается от группы «siMock».

Отличия достоверны при p≤0,05 (N=8).

Более того, исследование бронхо-альвеолярного лаважа мышей, одновременно обработанных молекулами миРНК против гена il-4 и против гена p вируса РСВ, показало существенное уменьшение количества эозинофилов (до 5 раз), являющихся маркерами аллергического воспаления (рисунок 9). При этом изменения относительного количества эозинофилов в бронхо-альвеолярном лаваже мышей, обработанных препаратами миРНК, условно обозначены:

# - достоверно отличается от группы «БА+RSV»

* - достоверно отличается от группы «БА+RSV+siMock»

Отличия достоверны при p≤0,05, N=8.

Таким образом, результатом данного изобретения устанавливается успешное совместное использование двух препаратов миРНК, один из которых (siIL4-408) подавляет провоспалительный ген il-4, а второй препарат миРНК (siP1) подавляет репликацию вируса РСВ. Согласно полученным данным оба препарата способны одновременно оказывать свой эффект и приводить к ослаблению признаков аллергического воспаления и тяжести течения РСВ-инфекции у млекопитающих.

Таблица 1
SEQ ID NO Название миРНК Последовательности смысловых цепей миРНК (5′-3′)
1 SEQ ID NO 10 siIL4-127
2 SEQ ID NO 11 siIL4-174
3 SEQ ID NO 12 siIL4-267
4 SEQ ID NO 13 siIL4-280
5 SEQ ID NO 14 siIL4-373
6 SEQ ID NO 15 siIL4-408
7 SEQ ID NO 16 siGFP*
8 SEQ ID NO 17 siP4**
Таблица 2
Название группы Препарат/доза Режим введения
1 БА - -
2 БА+RSV - -
3 БА+RSV+siRNA siIL4-408; 100 мкг/мышь siIL4-408 - три и/н введения: за 2 сут до 1-й ИНА, за 5 ч до 1-й ИНА, за 5 ч до 2-й ИНА.
siP1-1; 70 мкг/мышь
siRSV-1 - одно и/н введение за 3 ч до введения РСВ.
4 БА+RSV+siMock siIGFP; 100 мкг/мышь siIGFP - три и/н введения: за 2 сут до 1-й ИНА, за 5 ч до 1-й ИНА, за 5 ч до 2-й ИНА.
siRV; 70 мкг/мышь
siRV - одно и/н введение за 3 ч до введения РСВ.
5 Интактные - -

1. Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний дыхательных путей, заключающийся в одновременном подавлении гена p респираторно-синцитиального вируса (далее - РСВ) и провоспалительного гена il-4 мыши, при этом для подавления гена p РСВ, необходимого для его репликации в клетке, используют создаваемую молекулу малой интерферирующей РНК (миРНК) - SEQ ID NO 1 (siP1), а для подавления провоспалительного гена il-4 мыши используют создаваемую молекулу миРНК - SEQ ID NO 15 (siIL4-408), на их основе создают препараты, содержащие терапевтически эффективное их количество, после чего полученные препараты вводятся млекопитающим.

2. Способ профилактики и лечения бронхиальной астмы, осложняющих ее респираторных вирусных инфекций и других воспалительных заболеваний по п.1, отличающийся тем, что полученные препараты миРНК вводят интраназально.



 

Похожие патенты:

Настоящее изобретение относится к новым производным фенилпиримидона формулы I, обладающим свойствами ингибитора фосфодиэстеразы типа V (PDE5). Соединения формулы I могут использоваться для лечения различных сосудистых нарушений, таких как эректильная дисфункция, легочная артериальная гипертензия и т.п.
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и описывает фармацевтический ингаляционный препарат для лечения бронхиальной астмы и хронической обструктивной болезни легких, содержащий в качестве активного вещества микронизированный тиотропия бромид, а в качестве носителя содержит лактозу со средним размером частиц 120-200 мкм, натрия бензоат просеянный с насыпной плотностью в пределах 0,30-0,50 г/см3 и натрия бензоат микронизированный со средними размерами частиц 0,5-10 мкм, при определенном содержании компонентов на дозу препарата.

Изобретение относится к средству для профилактики и/или лечения аллергического заболевания, выбранного из поллиноза, аллергического ринита, аллергического конъюнктивита, атопического дерматита и астмы, и представляет собой низкомолекулярное полисульфатированное производное гиалуроновой кислоты.
Изобретение относится к способам лечения пациента, страдающего тяжелой и неконтролируемой астмой, которые включают введение пациенту глюкокортикоида в ингаляционной форме в виде распыленного аэрозоля в газовой фазе и дополнительно включает пероральное введение глюкокортикоида.

Изобретение относится к соединениям общей формулы (I) или (IA) где Ar1 представляет собой фенильную группу, необязательно замещенную одним или несколькими идентичными или неидентичными атомами галогенов; R1 представляет собой атом водорода; R4, R5, R6a, R6b представляют собой атомы водорода; Y, Z независимо представляют собой линейную C1-4 алкиленовую группу, необязательно замещенную одной линейной C1-4 алкильной группой; Ar2 означает конденсированное с бензолом 5-членное гетероциклическое кольцо, содержащее один атом азота и один атом серы, замещенное одной линейной C1-4 алкильной группой, или производное 5- или 6-членного гетероциклического кольца, содержащего один атом азота и один атом серы, конденсированного с гетероароматическим 6-членным кольцом, содержащим один или два атома азота, замещенным одной линейной C1-4 алкильной группой, линейной C1-4 алкоксигруппой или группой -NR7R8, где R7 и R8 независимо означают атом водорода, линейную или разветвленную C1-4 алкильную группу, или R7 и R8 совместно с атомом азота образуют группу общей формулы (a), где R2, R3 представляют собой линейные C1-4 алкильные группы, A означает группу -CHR12, атом кислорода или группу -NR9, где R12 и R9 означают атом водорода или линейную C1-4 алкильную группу, m имеет значение 1 или 2, n имеет значение 1 или 2, o имеет значение 0 или 1, p имеет значение 0 или 1; Q представляет собой группу -О-, группу -N--Н или группу -N--CO-R10, где R10 означает линейную C1-4 алкильную группу или -NH-R11 группу, где R11 представляет собой линейную C1-4 алкильную группу; и к их солям.
Изобретение относится к медицине, в частности к педиатрии, аллергологии и пульмонологии, и может быть использовано для лечения бронхиальной астмы (БА) с персистенцией цитомегаловируса (ЦМВ) у детей.
Группа изобретений относится к медицине, а именно к клинической аллергологии, и может быть использована для денатурирования аллергенов вне организма. Для этого обрабатывают поверхности предметов аллерген-денатурирующей композицией.

Настоящее изобретение относится к производным изохинолинона формулы (I) или к его фармацевтически приемлемой соли, где R1 представляет собой (С1-С5)алкил, который возможно замещен 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из групп -(С1-С6)алкил, -(С1-С6)алкокси, -ОН или -(С1-С6)алкил-гидрокси, и где один независимый заместитель радикала R1, представляющий собой -(С1-С6)алкил, возможно может быть сконденсирован с другим независимым заместителем радикала R1, представляющим собой -(С1-С6)алкил, с образованием насыщенного (С3-С4)циклоалкила; R2 представляет собой Н; R3 представляет собой (CH2)d-Y и R3 независимо возможно замещен одной или двумя группами -(С1-С6)алкил, -NH2, -HN(С1-С6)алкил, -N-ди-(С1-С6)алкил, -(С1-С6)алкил-NH2, -(С1-С6)алкил-гидрокси; Y выбран из гетероциклоалкила, S-(O)е-гетероциклоалкила, S-(O)e-(C1-С6)алкил-гетероциклоалкила, -SO2NH-(С1-С6)алкила; d равно 0, 1 и 2; е равно 0, 1 или 2; R4 и R5 независимо выбраны из (С1-С6)алкила и галогено; R6 представляет собой Н; гетероциклоалкил представляет собой С- или N-связанное 5-7-членное неароматическое циклическое кольцо, которое, когда оно является С-связанным, содержит один NR7 атом, и когда оно является N-связанным, содержит один N-атом, или один N-атом и один NR7 атом; R7 представляет собой Н или (С1-С6)алкил.
Изобретение относится к медицине и фармацевтической промышленности и касается сухого порошкообразного препарата, содержащего формотерола фумарат дигидрат, находящийся в микронизированой форме, позволяющей проникать в бронхи и альвеолы легких и подготовленные особым образом вспомогательные вещества, а именно смесь лактозы и натрия бензоата, позволяющие эффективно дозировать и дезагрегировать активный компонент.

Изобретение относится к соединению формулы (I): где R1 представляет собой NR7C(O)R8 или NR9R10; R2 представляет собой водород; R3 представляет собой галоген; R4 представляет собой водород, галоген, циано, гидрокси, С1-4алкил, C1-4алкокси, CF3, OCF3, С1-4алкилтио, S(O)(С1-4алкил), S(O)2(С1-4алкил), СО2Н или CO2(С1-4алкил); R5 представляет собой C1-6алкил (замещенный NR11R12 или гетероциклилом, который представляет собой неароматическое 5-7-членное кольцо, содержащее 1 или 2 гетероатома, независимо выбранные из группы, содержащей азот, кислород или серу); R6 представляет собой водород, галоген, гидрокси, С1-4алкокси, CO2H или C1-6алкил (возможно замещенный группой NR15R16, морфолинилом или тиоморфолинилом); R7 представляет собой водород; R8 представляет собой С3-6циклоалкил (возможно замещенный группой NR24R25), фенил или гетероарил, который представляет собой ароматическое 5- или 6-членное кольцо, содержащее от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из группы, содержащей азот, кислород и серу, и которое возможно конденсировано с одним 6-членным ароматическим или неароматическим карбоциклическим кольцом или с одним 6-членным ароматическим гетероциклическим кольцом, где указанное 6-членное ароматическое гетероциклическое кольцо содержит от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из группы, содержащей азот, кислород и серу; R9 представляет собой водород или C1-6алкил (возможно замещенный пиразолилом); R10 представляет собой C1-6алкил (возможно замещенный группой фенил или гетероарил, который представляет собой ароматическое 5- или 6-членное кольцо, содержащее 1 или 2 гетероатома, независимо выбранные из группы, содержащей азот, кислород или серу, и которое возможно конденсировано с одним 6-членным гетероциклическим кольцом, где указанное 6-членное ароматическое гетероциклическое кольцо содержит 1 или 2 гетероатома, независимо выбранные из группы, содержащей азот, кислород или серу; где вышеуказанные фенильные и гетероарильные группировки в R8, R9 и R10 независимо возможно замещены группой: галоген, гидрокси, C(O)R42, C1-6алкил, C1-6гидроксиалкил, C1-6галогеноалкил, С1-6алкокси(С1-6)алкил или С3-10циклоалкил; если не указано иное, то гетероциклил возможно замещен группой C1-6алкил, (С1-6алкил)ОН, (С1-6алкил)С(O)NR51R52 или пирролидинилом; R42 представляет собой C1-6алкил; R12, R15 и R25 независимо представляют собой C1-6алкил (возможно замещенный группой гидрокси или NR55R56); R11, R16, R24, R51, R52, R55 и R56 независимо представляют собой водород или C1-6алкил; или к его фармацевтически приемлемым солям.

Изобретение относится к пептидным производным общей формулы (I), их стереоизомерам, их смесям и/или их фармацевтически приемлемым солям, к способам их получения, к фармацевтическим композициям, содержащим их, и к применению их для лечения, предупреждения и/или диагностики тех состояний, расстройств и/патологий, при которых экспрессируются соматостатиновые рецепторы sstr1, sstr2, sstr3, sstr4 и/или sstr5.

Группа изобретений относится к медицине и касается способов лечения дефицита гормона роста или инсулиноподобного фактора роста 1 у пациента, включающих введение иммуногенного количества вакцины, содержащей химерный полипептид соматостатина-14, связанный с инактивированной хлорамфениколацетилтрансферазой (САТ), и адъювант; вакцины для лечения пациента, имеющего дефицит гормона роста или инсулиноподобного фактора роста 1; способа лечения ожирения у пациента, включающего введение иммуногенного количества вакцины.

Предложены: композиция для лечения рака, включающая (а) конъюгат, содержащий (i) полипетидный вектор, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 70%-ную идентичность по отношению к AngioPep-2 (SEQ ID NO: 97); и (ii) паклитаксел или аналог паклитаксела, конъюгированные с указанным полипетидом; (б) необязательный агент, регулирующий тоничность; (в) буферный агент; (г) наполнитель; (д) полиоксиэтиленовый эфир жирной кислоты; и (е) 0,01-8% DMSO (варианты), способы ее получения (варианты), способ лечения рака, контейнер, содержащий указанную композицию и набор, включающий контейнер с данной композицией.

Изобретение относится к применению пептида, имеющего последовательность, имеющую происхождение из аминокислотной последовательности белка SNAP-25, для лечения боли и/или воспаления.

Группа изобретений относится к области фармакологии и медицины и касается пролонгированной доставки аналога компстатина, и также, возможно, дополнительного активного агента, при высвобождении его из макроскопического гелеподобного включения, формирующегося при введении жидкого состава, содержащего аналог компстатина, во внесосудистое пространство, такое как стекловидная камера глазного яблока, в теле млекопитающего.

Группа изобретений относится к медицине и фармацевтике и касается способа лечения мезотелиомы плевры путем введения конъюгата, содержащего нацеливающий пептид, содержащий мотив NGR и цитокин, представляющий собой TNF, выбранный из группы, состоящей из TNFα, TNFβ, а также относится к фармацевтическому составу, содержащему указанный конъюгат, растворенный в подходящих буферах.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложены соединения лабиринтопептинов А1, А2, или А3 формулы (I), где {A}, {B}, {C}, R1-R6, m и n имеют значения, указанные в формуле изобретения.

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии и стоматологии, и может быть использовано для лечения красного плоского лишая слизистой оболочки полости рта.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к полипептидам и составу для профилактики или лечения гипертрофии миокарда, применению и способам получения указанных полипептидов.
Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано для лечения и тактики ведения беременных с лекарственным гепатитом. Для этого после установления диагноза лекарственного гепатита в 1-м триместре при бессимптомном повышении активности трансаминаз в пределах 3 норм и отсутствии противопоказаний перорально принимают растительные гепатопротекторы карсил или гепабене или эссенциальные фосфолипиды без витаминов эслидин per os или эссенциале форте Н в/в, per os в стандартных дозах при отмене другой медикаментозной терапии. Во 2-ом триместре при уровне сывороточных трансаминаз до 5 норм перорально принимают адеметионин 400 мг в/в N 7-10, затем per os 1600 мг/сут. Курс лечения при этом составляет 1 месяц. При уровне сывороточных трансаминаз от 5 до 10 норм - адеметионин 800 мг в/в N 10 + урсодеоксихолевую кислоту 12 мг/кг/сут. При уровне сывороточных трансаминаз более 10 норм - адеметионин 800 мг/сут в/в + урсодеоксихолевая кислота 12 мг/кг/сут + преднизолон в/в 90 мг/сут. В 3-м триместре при уровне сывороточных трансаминаз до 5 норм перорально принимают адеметионин 800 мг/сут в/в N10 + урсодеоксихолевую кислоту 13 мг/кг/сут. При уровне трансаминаз от 5 до 10 норм - адеметионин 800 мг/сут в/в + урсодеоксихолевую кислоту 13 мг/кг/сут + преднизолон в/в 90 мг/сут. При прогрессивном повышении уровня сывороточных трансаминаз свыше 10 норм на фоне терапии адеметионином 800 мг/сут в/в, урсодеоксихолевой кислотой 13 мг/кг/сут, преднизолоном в/в 120 мг/сут с ожиданием не более 3-х дней, снижения уровня трансаминаз или их стабилизации; терапия продолжается при условии наблюдения за динамикой - показателей печеночного цитолиза - уменьшения показателей печеночного цитолиза или назначается адекватная - при их увеличении. А в послеродовом периоде терапию продолжают в полном объеме до нормализации «печеночных проб». Способ позволяет предотвратить осложнения во время беременности за счет своевременного диагностирования лекарственного гепатита у беременных, проведения адекватной, дифференцированной по срокам беременности и степени выраженности печеночного цитолиза медикаментозной терапии, направленной на купирование патологического процесса в печени. 6 пр.
Наверх