Питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала содержит глюкозу, агар бактериологический, пептон мясной, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, хлористый натрий, углекислый натрий, L-цистин, тиогликолевую кислоту и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала. 1 табл., 2 ил., 4 пр.

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для выделения из клинического материала наиболее значимых возбудителей - патогенных грибов-дерматомицетов, возбудителей микозов человека и животных.

Суть изобретения заключается в составлении эффективной плотной полусинтетической питательной среды для получения первичных культур грибов-дерматомицетов из клинического материала с учетом их потребностей в элементах питания и физиологических особенностей.

Для выделения и идентификации грибов в настоящее время в клинической микробиологии используют плотные и жидкие питательные среды Сабуро, рекомендованные министерством здравоохранения СССР приказом №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». По своему составу она относится к полусинтетическим средам, в состав которых, наряду с веществами неопределенного состава, входят соединения известной химической природы. Среда Сабуро: пептон - 10 г, глюкоза (или мальтоза) - 40 г, агар - 18… 20 г, вода дистиллированная - 1 л, pH 5,6… 5,8, бульон готовят аналогично, но без агара [2].

Однако на сегодняшний день процент положительных результатов культурального исследования дерматомицетов на среде Сабуро при положительном ответе в прямой микроскопии и несомненной клинической картине остается невысоким. По сообщениям А.Ю. Сергеева, выделить культуру возбудителя в 1994-1996 гг. удавалось в 36% случаев [3], что не может считаться оптимальным для лабораторной диагностики. Существуют зарубежные фирменные среды для трихофитонов (Mycosel, Mycobiotic) с аналогичными показателями по высеваемости грибов из первичного клинического материала. Это, вероятно, связано с рядом особенностей данного рода грибов. Во-первых, сравнительно медленным ростом - в отличие от большинства мицелиалькых грибов, рост трихофитонов начинается на 5-7 день после посева (плесневых грибов на 2 день), во-вторых, более высокими пищевыми потребностями трихофитонов. Большинство видов дерматомицетов для начала роста требует наличия в питательной среде полного набора витаминов и белков животного происхождения.

Целью заявленного изобретения является разработать плотную полусинтетическую питательную среду для получения первичных культур грибов-дерматомицетов из клинического материала, удовлетворяющую установленным критериям эффективности, что является необходимым условием надежных результатов любого клинического микробиологического исследования, и обеспечивающую получение точных и объективных результатов.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в получении плотной полусинтетической питательной среды для получения первичных культур грибов-дерматомицетов из клинического материала.

Осуществление изобретения достигается приготовлением питательной среды, содержащей на 1 литр дистиллированной воды: глюкоза - 30,0 г, агар бактериологический - 20,0 г, пептон мясной - 5,0 г, гидролизат казеина - 2,5 г, дрожжевой экстракт - 0,8 г, хлористый натрий - 0,4 г, углекислый натрий - 0,16 г, L-цистин - 0,12 г, кислота тиогликолевая - 0,08 г, pH среды - 6,5.

Компоненты последовательно растворяют в воде, вносят агар и подогревают до расплавления агара. При необходимости среду фильтруют. Затем добавляют глюкозу, тщательно перемешивают и устанавливают pH 6,5. После этого разливают в стерильную посуду и стерилизуют 60 мин при 120°С.

Пример 1. Способ получения композиции. В 1 л дистиллированной воды растворяли навески: пептон мясной - 5,0 г, гидролизат казеина - 2,5 г, дрожжевой экстракт - 0,8 г, хлористый натрий - 0,4 г, углекислый натрий - 0,16 г, L-цистин - 0,12 г, кислота тиогликолевая - 0,08 г. Перемешивали полученный раствор. К растворенным компонентам добавляли агар бактериологический - 20,0 г и подогревали до расплавления агара. Фильтровали при необходимости (в случае присутствия нерастворимых частиц). Затем добавляли глюкозу - 30,0 г и тщательно перемешивали. Устанавливали pH 6,5.

Готовую среду разливали в стерильную посуду и стерилизовали 60 мин при 120°С.

Свежеприготовленную среду разливали в чашки Петри в количестве не менее 20 мл и в тот же день производили посев материала.

Отличие предлагаемого состава среды заключается в том, что с целью повышения эффективности высева дерматомицетов в среду добавляются L-цистин и углекислый натрий для нейтрализации свободных радикалов и снижения окислительно-восстановительного потенциала среды и тиогликолевую кислоту, способствующую высвобождению элементов гриба из кератиновых масс за счет разрушения дисульфидных связей в кератине патогенного материала (кожные чешуйки, ногти, волосы), что обеспечивает контакт элементов гриба с питательными веществами среды и более быстрое начало роста дерматомицетов.

Для лучшего понимания изобретения приводим примеры эффективности предлагаемой среды.

Исследование эффективности предлагаемой среды, в отличие от среды Сабуро, проводили методом сравнительного анализа роста грибов-дерматомицетов как в модельных опытах, так и на клиническом материале. В модельных опытах учитывали скорость и характер роста колонии и проявления морфологических особенностей грибов дерматомицетов. Исследование проводилось в течение 21 суток с 3 видами грибов (Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Epidermophyton floccosum). Данные виды грибов являются наиболее часто выделяемыми от больных возбудителями микозов. Штаммы были получены из коллекции типовых и патогенных культур микологической лаборатории Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора. В работе использовались как музейные штаммы, так и выделенные от больных с диагнозом микоз.

Пример 2. Питательная среда, способствующая ускорению роста грибов дерматомицетов, позволяет добиться большей эффективности выявления дерматомицетов, поскольку скорость роста дерматомицетов - важный фактор в характеристике эффективности среды в связи с частой контаминацией клинического материала быстрорастущими плесневыми грибами. Известно, что грибы дерматомицеты растут в 2, а иногда и в 4 раза медленнее плесневых грибов [4]. Для проявления типичных признаков дерматомицетов - ветвления, спороношения, пигментации в настоящее время рекомендуется выдерживать время инкубации посевов до 1 месяца [6].

Для исследования влияния состава среды на линейный рост колоний музейные тест-штаммы грибов Trichophyton rubrum и Epidermophyton floccosum высевали в центр плотной питательной среды немногочисленным инокулюмом одной плотности. Диаметр колонии измеряли в двух взаимно перпендикулярных направлениях в двух-трех повторностях через каждые 24 часа [5]. Посев тест-штаммов на предлагаемую нами среду показал увеличение скорости роста в 1,5 -2 раза, по сравнению с посевами на среду Сабуро (Рисунок 1, 2). Однако учитывая, что данные виды грибов на поверхности некоторых лимитирующих рост плотных сред образуют широко распространенную, но тонкую пленчатую колонию, а при росте на плотной оптимальной среде колония гриба может достигать такого же диаметра, но быть высокой, пушистой, иметь обильно развитый воздушный мицелий, то помимо скорости роста колоний определяли также плотность гиф колонии [5]. Плотность гиф определяли их общей длиной, представляющей суммарную длину главной гифы и ее ответвлений всех порядков, в одном поле зрения под микроскопом при увеличении 20х20. Плотность определяли в разных участках растущей части колонии. На шестой день длина гифы (Н) Trichophyton rubrum на среде Сабуро и на предлагаемой среде составила 648 и 817 мкм соответственно. Длина гифы Epidermophyton floccosum составила 547 мкм на среде Сабуро и 651 мкм на предлагаемой среде.

Пример 3. Получение питательной среды, на которой грибок давал бы типичную колонию и более дифференцированные органы плодоношения, является важной задачей для идентификации дерматомицетов. Анализ дифференциально-диагностических особенностей штаммов грибов Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, выращенных на предлагаемой среде и среде сравнения Сабуро, показал эффективность предлагаемой среды. В десяти случаях из десяти штамм Trichophyton rubrum выделял в среду яркий пигмент насыщенно красного цвета, что является одним из основных диагностических признаков данного вида (таблица 1). Тогда как штаммы, выращенные на среде Сабуро, выделяли в среду пигмент бледно-розового цвета, а в 3-х случаях пигмент отсутствовал.

Микроскопическая картина у разных штаммов Trichophyton mentagrophytes, выращенных на среде Сабуро, отличалась от выращенных на предлагаемой среде. Семь из десяти штаммов не имели спороносные гифы, микроконидии отсутствовали.

Пример 4. Оценка эффективности предлагаемой среды на клиническом материале, полученном от больных с ограниченными дерматомикозами-онихомикозами. Критерии включения в исследование: наличие у больных онихомикоза, подтвержденного положительными результатами микологического обследования (микроскопией ногтевых пластин в 20% КОН или люминисцентная микроскопия с калькофлюором белым).

Крупные кусочки ногтей разрезались на несколько частей в стерильных условиях. Затем равное количество материала одновременно засевали на исследуемые среды. На седьмые сутки после посева из 25 образцов, посеянных на среду Сабуро, рост дерматомицетов был выявлен в 44% (11 образцов). Культуральный посев на предлагаемую среду выявил грибы дерматомицеты в 18 образцах, что составило 72%. При этом контаминация плесневыми грибами не препятствовала идентификации дерматомицетов.

Таким образом, предлагаемая нами питательная среда позволяет выполнить поставленную задачу - получить ускоренный рост дерматомицетов, обладающих характерными признаками (пигментация, спорообразование), позволяющими проводить их выявление и идентификацию в первичной культуре.

ЛИТЕРАТУРА

1. Приказ Министерства здравоохранения СССР №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».

2. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник. - М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.

3. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции. Руководство для врачей. 2 изд. - М.: Изд-во БИНОМ, 2008. - 480 с.

4. Сергеев А.Ю. Грибковые заболевания ногтей. 2 изд. - М.: Национальная академия микологии, 2007. - 164 с.

5. Методы экспериментальной микологии. Справочник (Дудка И.А., Васер С.П., Элланская И.А. и др.). - Киев.: Наукова думка, 1982. - 550 с.

6. Медицинская микология: руководство / В.А. Андреев, А.В. Зачиняева, А.В. Москалев, В.Б. Сбойчаков; под ред. В.Б. Сбойчакова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 208 с.

Таблица 1
Формирование дифференциально-диагностических элементов у грибов дерматомицетов при культивировании на исследуемых средах.
Штаммы Рост штаммов грибов на среде Сабуро, сутки Рост штаммов грибов на предлагаемой среде, сутки
1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7
Т. rubrum П П М, А
Т. rubrum П П М
Т. rubrum П П М, А
Т. rubrum П П
Т. rubrum П
Т. rubrum П
Т. rubrum П П
Т. rubrum П
Т. rubrum П П М
Т. rubrum П П М, А
Т. mentagrophytes П, З П З
Т. mentagrophytes П П, З
Т. mentagrophytes П З М
Т. mentagrophytes П З
Т. mentagrophytes П З П З
Т. mentagrophytes П, З П, З
Т. mentagrophytes П, З
Т. mentagrophytes П П З, М
Т. mentagrophytes П З
Т. mentagrophytes П З
П - образование пигмента, М - микроконидии, А - артроконидии, З - завитки или узелки.

Питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала, содержащая на один литр дистиллированной воды: глюкоза - 30,0 г, агар бактериологический - 20,0 г, пептон мясной - 5,0 г, гидролизат казеина - 2,5 г, дрожжевой экстракт - 0,8 г, хлористый натрий - 0,4 г, углекислый натрий - 0,16 г, L-цистин - 0,12 г, кислота тиогликолевая - 0,08 г, pH среды - 6,5.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии. Способ предусматривает обработку чувствительного слоя биосенсора раствором общей фракции протеаз гепатопанкреаса камчатского краба в буфере состава трис-НСl 50 мМ, СаСl2 3 мМ, NaCl 100 мМ, рН 8,0 при температуре раствора в диапазоне 35-40°С.
Группа изобретений относится к фармацевтической промышленности, а именно противовирусному средству. Способ получения противовирусного средства проводят путем приготовления посевного мицелия базидиомицета опенок зимний Flammulina velutipes (Curtis) Singer, приготовления жидкой питательной среды, содержащей воду, в качестве источников углерода - растительное масло и мелассу, в качестве источника азота - кукурузную муку, в качестве минеральных солей дигидрофосфат калия и сульфат магния, ее стерилизации, засева приготовленным посевным мицелием стерильной жидкой питательной среды, культивирование в ней базидиомицета в аэробных условиях, полученную погруженную культуру разделяют на биомассу базидиомицета и культуральную жидкость, из которой выделяют сгусток посредством добавления к последней этилового спирта, который отжимают, высушивают и измельчают с получением противовирусного средства, при определенных условиях.
Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм гриба Aspergillus oryzae Аmу Т-52-3-21 продуцирует мальтогенную α-амилазу и депонирован в ВКМ ИБФМ им.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен штамм Fusarium sambucinum, депонированный в коллекции ВКПМ под номером F-1161.
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения пищевой грибной биомассы с высоким содержанием белка.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается мутантного штамма Glarea lozoyensis и его применения. Мутантный штамм получен путем воздействия на штамм Glarea lozoyensis АТСС 20957 нитрозогуанидином и депонирован в CGMCC под №CGMCC 2933.
Способ обнаружения микроскопических грибов рода Coccidioides posadasii 36 S и Coccidioides immitis C-5 in vitro включает предварительное выращивание культуры в мицелиальной фазе, приготовление взвеси, соответствующей 5ЕД стандартного образца мутности, обеспечение возможности формирования сферул и обнаружение сферул, заполненных эндоспорами.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению препаратов кератиназы, и может быть использовано для получения препаратов кератиназ, применяемых в медицине, косметологии, легкой промышленности и сельском хозяйстве.
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ предусматривает приготовление посевного мицелия базидиомицета, выбранного из группы Flammulina velutipes (Curtis) Singer и/или Hericium erinaceus (Bull.) Pers.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Aspergillus oryzae RCAM01135 - продуцент протеолитических и амилолитических ферментов - обладает способностью продуцировать протеолитические и амилолитические ферменты.
Изобретение относится к области биохимии и касается применения концентрата культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ F-180, в качестве ингибитора Андийского вируса крапчатости картофеля. Изобретение позволяет снизить потери картофеля от заражения растений Андийским вирусом крапчатости. 2 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при заживлении раневых повреждений кожного покрова. Ранозаживляющее средство представляет собой концентрат культуральной жидкости штамма Trichoderma harzianum Rifai, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № ВКПМ: F-180, в качестве продуцента L-лизин-альфа-оксидазы и может быть применен как ранозаживляющее средство при повреждении кожного покрова. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, обеспечивающих заживление раневых повреждений кожи. 1 табл., 2 пр.

Группа изобретений относится к биохимии. Предложено устройство для поверхностного выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде. Устройство включает кювету с поддоном для выращивания микроорганизма, снабженную свободно опущенной на ее дно транспортной сеткой. Транспортная сетка выполнена из нейтрального материала и закреплена своими концами на приводных барабанах, обеспечивающих поднятие транспортной сетки со дна кюветы. Также устройство содержит приемное устройство с клапаном для присоединения к смесителю-дозатору и подачи смеси жидкой питательной среды с маточной культурой в кювету, поворотные заслонки, установленные по торцам кюветы для регулирования обмена воздуха в кювете, сливное устройство для слива культуральной жидкости. патрубок для подачи сушильного агента под сетку, пробоотборник и сменные светофильтры в фонарях для регулирования освещенности, расположенные на боковых стенках кюветы, крышку, герметично закрывающую кювету, выполненную с возможностью ее открывания и/или снятия, снабженную форсунками для распыления раствора ПАВ над поверхностью выращиваемой в кювете биомассы и моющими головками для осуществления санитарной обработки устройства. Также предложен способ поверхностного выращивания микроорганизма на жидкой питательной среде с использованием вышеуказанного устройства. Предложенные изобретения обеспечивают выращивание микроорганизмов на жидкой питательной среде с минимальным применением ручного труда. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.
Группа изобретений относится к биотехнологии. Способ получения биологического средства для защиты растений от фитопатогенов и нематод на основе штамма гриба рода Trichoderma осуществляют путем приготовления посевного материала штамма гриба, приготовления препарата в жидкой либо сыпучей форме на основе посевного материала, а также перемешивания препарата с минеральным, органическим или бактериальным удобрением. Полученное в результате способа биологическое средство обладает высокой антагонистической активностью по отношению к широкому кругу фитопатогенов и нематод. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 5 пр.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Способ получения гранулированного продукта предусматривает выращивание нитчатых грибов семейства Monilialeae, предпочтительно Arthrobotrys conoides Dreschsler в пригодной жидкой культуральной среде. Полученную культуру нитчатого гриба смешивают по меньшей мере с одним видом модифицированного крахмала и крахмальной муки, причем модифицированный крахмал и крахмальная мука присутствуют в массовых соотношениях, составляющих от 30:70 до 60:40. К полученной смеси добавляют наполнители и при необходимости питательные вещества, получая пасту. Осуществляют грануляцию пасты. Полученные при этом гранулы сушат до достижения уровня влаги менее чем 13%, предпочтительно до уровня, составляющего от 9 до 10%. Гранулированный продукт, полученный вышеуказанным способом, используют для применения в пестицидной композиции. Группа изобретений обеспечивает получение целевого продукта с высокой диспергируемостью и высоким процентом выживаемости пропагул нитчатых грибов. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 1 ил., 4 пр.
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения протеиназы - активатора протеина С плазмы крови предусматривает твердофазное культивирование штамма гриба Aspergillus ochraceus BKM F-4104D на питательной среде. При этом питательная среда содержит при определенном соотношении следующие компоненты: твердый субстрат или носитель, глюкозу, крахмал, гидролизат рыбной муки, пептон, NaCl, KH2PO4, MgSO4·7H2O, воду. В качестве твердого субстрата или носителя используют вермикулит, пенополиуретан, силикагель или пшеничные отруби. Изобретение позволяет получить целевой продукт с повышенной активностью. Активность протеиназы составляет до 300 Е/мл. 5 табл., 15 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве. Штамм Trichoderma harzianum Rifai депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под регистрационным номером ВКПМ F-180. Штамм обладает способностью продуцировать L-лизин-альфа-оксидазу и может быть использован, в частности, в качестве ингибитора возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур, вызываемых бактериями Acidovorax citrulli. Изобретение позволяет снизить потери тыквенных культур.

Изобретение относится к микробиологии. Предложен штамм Trametes versicolor, используемый для получения противоплесневых препаратов в отношении грибов рода Penicillium. Штамм депонирован в ВКПМ под номером F-1024. Штамм обладает высокими хитиназной и фунгицидной активностями. 4 ил., 1 табл., 5 пр.

Изобретение относится к способу получения 9-децен-2-она. Способ предусматривает культивирование указанной плесени, относящейся к семейству Aspergillaceae или Mortierellaceae, добавление ундециленовой кислоты в качестве субстрата в среду ферментации с расходом от 0,1 до 0,9 г/л/час в присутствии масла, биоконверсию субстрата в 9-децен-2-он, его экстракцию и очистку. При этом в качестве масла используют масло, выбранное из группы, содержащей традиционные пищевые масла или триглицериды, содержащие жирные кислоты короткой цепи, или белые масла. Изобретение позволяет получить 9-децен-2-он с выходом 8-16,5 г/л и высокой степенью очистки 99%. 12 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 пр.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к защите растений от инвазивной и многолетней сорной растительности класса Dicotyledones. Примененяют суспензию на основе вегетативного мицелия фитопатогенных микромицетов с химическими гербицидами в сублетальных дозах. Обрабатывают растения опрыскиванием водным раствором гербицида с действующим веществом глифосат и суспензией мицелия фома-подобных грибов. Обработку ведут на всех стадиях развития растений, сначала гербицидом при норме расхода по действующему веществу глифосату 0,02-0,32 кг/га, а затем суспензией на основе фрагментов мицелия фома-подобных грибов в концентрации от 25 до 100 г/л. Норма расхода рабочей жидкости от 50 до 300 л/га. Предлагаемый способ позволяет снизить химическую нагрузку на экосистему в 1,5-10 и более раз, инфекционную нагрузку (концентрацию мицелия фитопатогенных грибов) в 1,5-4 раза. Способ может быть применен на всех стадиях развития растений, не требуя дополнительной защиты возделываемой культуры. 10 табл., 5 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала содержит глюкозу, агар бактериологический, пептон мясной, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, хлористый натрий, углекислый натрий, L-цистин, тиогликолевую кислоту и дистиллированную воду в заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет сократить сроки выращивания мицелиальных грибов-дерматомицетов из клинического материала. 1 табл., 2 ил., 4 пр.

Наверх