Способ получения комплексного иммунометаболического препарата с антиинфекционной активностью
Владельцы патента RU 2527329:
Государственное научное учреждение Курский научно-исследовательский институт агропромышленного производства Россельхозакадемии (RU)
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (RU)
Группа изобретений относится к ветеринарии и предназначена для нормализации обменных процессов, стимуляции иммунной системы и блокирования механизмов развития инфекционного процесса при риске активации эндогенной инфекции. Способ получения комплексного иммунометаболического препарата с антиинфекционной активностью включает растворение в деминерализованной воде янтарной кислоты и левамизола с добавлением раствора формалина. В другом аспекте в состав иммунометаболического препарата дополнительно вводят полиэтиленгликоль. Компоненты используются в заявленном соотношении. Использование группы изобретений обеспечивает получение инъекционной формы иммунометаболического препарата с антиинфекционной активностью. 2 н.п. ф-лы, 3 табл.
Изобретение относится к ветеринарии и касается способа получения комплексного препарата на основе янтарной кислоты, левамизола, формалина и полиэтиленгликоля, предназначенного для нормализации обменных процессов, стимуляции иммунной системы и блокирования механизмов развития инфекционного процесса при риске активации эндогенной инфекции, в том числе и для лечения инфекционных заболеваний вирусно-бактериальной этиологии.
Известен способ получения препарата «янтарный биостимулятор» для повышения резистентности организма животных (патент РФ №2303979, 2007 г). Сочетание янтарной кислоты и антисептика стимулятора Дорогова второй фракции (АСД-Ф №2) дает возможность получить препарат, обладающий выраженной иммунометаболической активностью. Однако янтарная кислота нейтрализует антисептическую активность АСД-Ф №2, которая обеспечивалась высокой щелочной реакцией.
В качестве наиболее близкого аналога выбран способ получения иммунотропного антисептического препарата для лечения и профилактики инфекционных заболеваний животных (патент РФ №2361579, 2009 г.). Данный препарат содержит в своем составе янтарную кислоту, АСД-Ф№2 и формалин (формол-янтарный биостимулятор).
Помимо иммунометаболического действия препарат обладает выраженной антисептической активностью. Однако недостатком данного препарата является использование в качестве иммуностимулятора АСД-Ф№2. АСД Ф-№2 получают путем высокотемпературной возгонки мясокостной муки. Получаемый препарат имеет весьма вариабельный химический состав, что затрудняет его использование в качестве лекарственной субстанции. Кроме того, используемое для изготовления АСД-Ф№2 сырье - мясокостная мука - может содержать высокое количество тяжелых металлов, в том числе радионуклеидов, которые накапливаются при жизни животных в костной ткани.
Задачей изобретения является получение инъекционной формы иммунометаболического препарата с антиинфекционной активностью.
Предлагается в качестве иммуностимулятора включить в состав заявляемого препарата стандартную субстанцию левамизола.
Левамизол давно известен и достаточно широко применяется в медицине для стимуляции клеточной системы иммунитета. В ветеринарии он применяется в качестве антигельминтного препарата. Однако левамизол обладает выраженным побочным, преимущественно судорожным действием на организм.
Новым является то, что комплексный препарат включает в своем составе в качестве иммуностимулятора левамизол; стабилизатора и пролонгатора - полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Комбинация метаболика (янтарная кислота), иммуномодулятора левамизола и формалина является вполне допустимой ввиду разного механизма их действия.
Формалин обладает исключительно высокой антисептической активностью. Так, в концентрации 1:6000 он прекращает рост тифозных бацилл, а в абсолютно низкой концентрации 1:30000 останавливает гниение бульона.
По данным Ласкавого В.Н. (1997 г.), внутримышечное введение 0,2% формалина позволяет обеспечить снижение вирулентности возбудителя вирусного трансмиссивного гастроэнтерита и одновременно стимулировать специфическую иммунную защиту. Формальдегид оказывает защитное действие на живые клетки органов и тканей, сдерживает повреждающие процессы перекисного окисления липидов, присутствует в нормально функционирующей ткани, способен продлевать время умирания сердца и головного мозга.
Вышеуказанные эффекты послужили основанием для включения формалина в состав нами ранее разработанного иммунометаболического препарата - янтарный биостимулятор (Патент РФ №2303979).
Включение в состав препарата ПЭГ обеспечивает его стабильность и пролонгированность действия. Очень важно, что полиэтиленгликоли с молекулярной массой до 600 хорошо смешиваются с водой в любых отношениях и обладают выраженной низкой токсичностью. В фармакологии полиэтиленгликоли рассматриваются как практически нетоксичные вещества. В настоящее время полиэтиленгликоли широко используются в фармакологической, косметической, продовольственной промышленности.
В предварительных опытах на белых мышах было установлено, что внутрибрюшинное введение в объеме 0,25 мл состава, включающего стандартный 10% раствор левамизола, в который добавили 1% янтарной кислоты, обусловило выражено низкую токсичность на организм. Еще более выраженное редуцирование побочного действия наблюдалось при добавлении до 1,5 и 2% янтарной кислоты в 10% раствор левамизола. В свою очередь, состав, включающий от 1 до 2% янтарной кислоты и 2-3% левамизола, не вызывал никакого побочного действия на организм при трехкратном с интервалом 24 часа внутрибрюшинном введении. Более того, подопытные животные (белые мыши) становились бодрее, и у них улучшался аппетит.
Поставленная задача достигается включением в состав комплексного препарата янтарной кислоты, левамизола, формалина и полиэтиленгликоля при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Янтарная кислота - 1,0-1,5
Левамизол - 2-3
Формалин - 0,3-0,4
Полиэтиленгликоль - 7-8
Пример 1 осуществления способа приготовления образцов препарата.
Для приготовления комплексного препарата использовали 950 мл деминерализованной воды, в которой при нагревании последовательно растворили 10,0 г янтарной кислоты и 20 г левамизола (1-й вариант); 15 г янтарной кислоты и 30 г левамизола (2-й вариант). В остывший до 40-50°С состав каждого образца добавили 10,0 мл формалина (39% концентрации). Добавление в растворы полиэтиленгликоля до 7-8% обеспечило повышение их плотности. Общий объем доводили до 1000 мл добавлением деминерализованной воды. Полученные растворы имели рН=4,5-4,7.
Подобным образом были приготовлены образцы аналогичных составов, но без добавления полиэтиленгликоля.
Стерилизация автоклавированием не изменила прозрачности растворов, что свидетельствовало о полной совместимости компонентов.
Испытание безвредности. Опыты провели на белых мышах. Ежедневное, на протяжении 3 дней внутрибрюшинное введение в объеме 0,25 мл вышеуказанных образцов испытуемого препарата не сопровождалось угнетением общего состояния подопытных животных. Напротив, введение левамизола в аналогичной концентрации сопровождалось выраженным угнетением продолжительностью от 20-30 минут до 2-3 часов.
Эффективность заявляемого препарата проверена в тестах антиинфекционного и иммунометаболического действия.
Испытание протективных свойств
Объектом для проведения опытов служили белые мыши со средней массой 18-20 г. В предварительных опытах на белых мышах были определены минимальные летальные дозы культур E.coli и S. cholerae suis. При этом минимальная LD100 для E.coli составляла 500 тыс. микробных тел (м.т.) в 1 мл, а для S. suis - 400 тыс. м.т.
Было проведено две серии испытаний двух образцов комплексного препарата, приготовленных согласно описанию в примере, отличающихся янтарной кислоты и левамизола. Каждый образец испытывался в двух вариантах: с пролонгатором ПЭГ и без ПЭГ.
Первая серия. В данной серии был испытан состав препарата, включающий: 1% янтарной кислоты; 2% левамизола; 0,3% формалина; 7% полиэтиленгликоля (ПЭГ) и без ПЭГ. Препараты вводились внутрибрюшинно в объеме 0,25 мл.
Порядок проведения опыта был следующий. Мышам первой группы испытуемый препарат (без ПЭГ) в объеме 0,25 мл был введен за 6 часов до заражения культурой E.coli. Мышам второй группы вводили аналогично испытуемый препарат с ПЭГ и через 6 часов провели заражение. Мышей третьей и четвертой групп вначале заразили культурой E.coli. Через 6 часов мышам 3 группы был введен испытуемый препарат без ПЭГ, а мышам 4 группы - испытуемый препарат с ПЭГ. Контрольной группе мышей ввели физиологический раствор за 3 часа до заражения. Результаты исследования (Протективная активность иммунометаболического препарата при моделировании смертельного инфекционного процесса культурой E.coli в дозе 1 LD100) представлены в таблице 1.
Наблюдение за подопытными мышами осуществлялось в течение трех суток. За этот период времени все мыши контрольной группы пали. При вскрытии у них были выявлены изменения, характерные для острого септического процесса.
При наблюдении за мышами, которых обрабатывали препаратом в сочетании с ПЭГ, показали, что показатель выживания был значительно выше. Так, в 4 группе показатель выживаемости составил 85,7% против 42,9% по отношению к животным 3 группы.
Результаты первого экспериментального опыта свидетельствовали о том, что метаболический состав обладает определенным защитным действием при заражении мышей заведомо смертельной дозой. Защитный эффект в отдаленные периоды от заражения значительно повышался при включении в состав препарата ПЭГ.
Вторая серия. В данной серии был испытан состав препарата, включающий: 1,5% янтарной кислоты; 3% левамизола; 0,3% формалина; 7% полиэтиленгликоля (ПЭГ) и без ПЭГ. Препараты вводились внутрибрюшинно в объеме 0,25 мл за 6 часов до заражения. Результаты исследований (Защитная активность метаболического препарата при моделировании смешанного инфекционного процесса на белых мышах культурой E.coli (2LD50) и S. cholerae suis (2LD50) представлены в таблице 2.
Полученные в двух сериях результаты свидетельствуют о том, что испытуемый препарат оказывает вполне определенное антиинфекционное действие. При этом антиинфекционная активность выражено повышается в отдаленные временные периоды после заражения при включении в состав препарата ПЭГ.
Изучение метаболической активности
В данной серии опытов был использован иммунометаболичекий состав препарата, включающий: 1% янтарной кислоты; 2% левамизола; 0,3% формалина; 7% полиэтиленгликоля и без ПЭГ. Объектом для проведения опытов являлись подсосные поросята-гипотрофики 6-7 дневного возраста, имевших массу тела до 1000 г.
В соответствии с принципом аналогов отобранных для опыта поросят разделили на 2 группы. Поросятам опытной группы (n=8) внутримышечно вводился иммунометаболический состав без ПЭГ с кратностью раз в 7 дней. Объем вводимого препарата составлял 1,0 мл - 1,5-2,0-2,5 мл. На поросятах второй группы (n=8) в аналогичном порядке и объеме применяли препарат с ПЭГ.
При клиническом наблюдении установлено, что уже на 2 сутки после введения состояние подопытных поросят обеих опытных групп стало заметно отличаться от сверстников из контрольной группы. Во-первых, они стали бодрее; во-вторых - у них стала проявляться более выраженная пищевая потребность. Эти различия у поросят опытных групп по отношению к особям из контрольной группы возрастали с каждым днем.
Изучение влияния на гематологическое и иммунобиохимическое состояние подопытных поросят провели на 7-14-21 и 28 сутки. Результаты исследований отражены в таблице 3.
На основании проведенного опыта и результатов изучения гематологического и иммунобиохимического состояния подопытных поросят сделано следующее заключение.
Парентеральное применение испытуемого препарата на поросятах-гипотрофиках обеспечивает выраженную стимуляцию метаболических процессов, что благоприятным образом отразилось на ускорении их физиологического развития и устранении состояния иммунодефицита.
| Таблица 1 | |||||||
| Группа | Препарат | Обработка | Гибель мышей спустя (часы) | Выживаемость | |||
| 12-24 | 24-38 | 48-72 | абс. | % | |||
| 1 (n=7) | Иммунометаболический препарат без ПЭГ | За 6 часов до заражения | 1 | 3 | - | 3 | 42,8 |
| 2 (n=7) | Иммунометаболический препарат +ПЭГ | За 6 часов до заражения | 1 | 2 | - | 4 | 67,0 |
| 3 (n=7) | Иммунометаболический препарат без ПЭГ | Через 6 часов после заражения | 2 | 2 | - | 3 | 42,9 |
| 4 (n=7) | Иммунометаболический препарат +ПЭГ | Через 6 часов после заражения | 1 | 6 | 85,7 | ||
| 5 (n=5) | Физиологический раствор | За 3 часа до заражения | 3 | 2 | - | - |
| Таблица 2 | ||||||||
| Группа | Препарат | Гибель мышей спустя (часы) | Выживаемость | |||||
| 12-24 | 24-48 | 48-72 | 72-98 | 98-120 | абс. | % | ||
| 1 (n=10) | Иммунометаболический препарат без ПЭГ | 2 | 1 | 2 | - | 5 | 50 | |
| 2 (n=10) | Иммунометаболический препарат +ПЭГ | 1 | 2 | 7 | 70 | |||
| 3 (n=5) | Физ. раствор | 2 | 1 | 2 | 0 | 0 |
1. Способ получения комплексного иммунометаболического препарата с антиинфекционной активностью, включающий растворение в деминерализованной воде янтарной кислоты, добавление раствора формалина, отличающийся тем, что в качестве иммуностимулятора используют левамизол при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Янтарная кислота | 1,0-1,5 |
| Левамизол | 2,0-3,0 |
| Формалин | 0,3-0,4 |
| Дистиллированная вода | Остальное |
2. Способ получения комплексного иммунометаболического препарата с антиинфекционной активностью, включающий растворение в деминерализованной воде янтарной кислоты, добавление раствора формалина, отличающийся тем, что в качестве иммуностимулятора используют левамизол и дополнительно вводят полиэтиленгликоль при следующем соотношении компонентов, мас.%:
| Янтарная кислота | 1,0-1,5 |
| Левамизол | 2,0-3,0 |
| Формалин | 0,3-0,4 |
| Полиэтиленгликоль | 7-8 |
| Дистиллированная вода | Остальное |
