Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro


 


Владельцы патента RU 2527888:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) клетками костного мозга, и может быть использовано в медицине. Прилипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в питательной среде с добавлением стимулятора - ингибитора протеинкиназы p38. Изобретение позволяет повысить выработку Г-КСФ клетками прилипающей фракции миелокариоцитов. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и техническому результату прототипом является способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с помощью липополисахаридов, которые добавляют в необходимой концентрации в культуру ткани и инкубируют при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов [1].

Недостатком данного способа является незначительная стимуляция выработки колониестимулирующего фактора под действием данного митогена.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что к адгезирующей фракции костного мозга, которую культивируют в CO2-инкубаторе при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов в полувязкой культуральной среде, добавляют ингибитор протеинкиназы p38 (300 мкМ), определяющей функциональную активность гемопоэтических клеток.

Новым в предлагаемом изобретении является применение ингибитора протеинкиназы p38 в качестве стимулятора продукции гемопоэтина.

На сегодняшний день среди разнообразных фармакологических средств, используемых в качестве гемостимуляторов, наиболее значимой группой являются препараты на основе эндогенных стимуляторов кроветворения (эритропоэтин и колониестимулирующие факторы), которые, связываясь со специфическими рецепторами, запускают многочисленные сигнальные механизмы, участвующие в реализации ключевых функций клетки - дифференцировки, пролиферации, старения, опухолевой трансформации. Особого внимания заслуживает препарат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, способный модулировать всю цитокиновую сеть и выступать в качестве плейотропного регулятора [2]. Учитывая перспективность разработки лекарственных препаратов с таргетным действием для модуляции выработки эндогенных гемопоэтинов путем активации/ингибирования внутриклеточного сигналинга, исследование синтеза и специфических биологических свойств данного гемопоэтина в системе in vitro ляжет в основу методологии создания данной группы фармсредств.

Известно, что наряду с классическими STAT-путями, в проведении сигналов от ростовых факторов в клетку могут быть задействованы MAP- и PI3K/Akt-сигнальные каскады [3, 4, 5]. Следует отметить, что данные пути также играют важную роль и в контроле продукции гемопоэтинов клетками кроветворного микроокружения [6]. Однако работ, результаты которых позволили бы вскрыть конкретную роль данных сигнальных путей (их активация либо ингибирование) в продукции гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в изучаемой нами литературе, не найдено. Таким образом, исследования, направленные на изучение путей контроля уровня гемопоэтинов, являются, несомненно, актуальными и помогут в разработке новых препаратов для стимуляции кроветворения.

Факт применения ингибитора протеинкиназы p38 с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора in vitro, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом

Взвесь клеток костного мозга мышей (5×106 клеток/мл) разделяют на адгезирующую и неадгезирующую фракции. Для получения супернатантов прилипающих нуклеаров среда с неадгезирующими элементами удаляются, а прилипающие клетки инкубируются в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640, 10% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 300 мкМ ингибитора протеинкиназы p38, в CO2-инкубаторе при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности воздуха в течение 24 часов. По окончании инкубации собирают кондиционные среды после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут и хранят не более месяца при - 26°C.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 2 шт., массой 20-22 г. Животные получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1

Суспензию костномозговых клеток, полученную в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром), инкубировали в течение 45 мин в среде RPMI-1640 ("Sigma", США), содержащей 10% ЭТС («Sigma», США), в 90 мм пластиковых чашках Петри («Corning», США) диаметром 35 мм в течение 40-50 мин при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности для выделения адгезирующей фракции миелокариоцитов. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты, а прилипающие клетки инкубировались в течение 24 часов в полной культуральной среде следующего состава: 90% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 300 мкМ ингибитора протеинкиназы р38 («Calbiochem», США), при 37°C, 5% CO2 и 100% влажности. По окончании инкубации собирали кондиционные среды и определяли в них уровень Г-КСФ методом ИФА с помощью набора фирмы «R&D systems» (USA) согласно методическим указаниям производителя.

При этом контролем и группой сравнения служили кондиционные среды от прилипающих клеток костного мозга без добавления ингибитора и с добавлением липополисахаридов соответственно, полученных по способу-прототипу аналогичным описанному выше путем.

В ходе эксперимента показано, что добавление ингибитора протеинкиназы p38 в культуру прилипающих миелокариоцитов значительно повышало уровень Г-КСФ в кондиционных средах по сравнению с таковым в супернатантах, полученных при культивировании адгезирующих миелокариоцитов без ингибитора и с добавлением липополисахаридов (табл.1).

Таблица 1
Уровень гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, pg/mL) в кондиционных средах от прилипающих миелокариоцитов мышей линии CBA/CaLac культивированных без ингибитора (1), с добавлением липополисахаридов (2) либо ингибитора p38 (3), (X±m)
Группы Г-КСФ
1 58,40±13,30
2 166,22±9,40*
3 358,84±46,06*#
* - отмечена достоверность различий с показателями в 1-ой группе при p<0,05;
# - отмечена достоверность различий с показателями во 2-ой группе при p<0,05.

Таким образом, инкубация прилипающей фракции гемопоэзиндуцирующего микроокружения с ингибитором протеинкиназы р38 приводит к стимуляции выработки Г-КСФ in vitro.

Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать выработку гранулоцитарного колониестимулирующего фактора адгезирующими миелокариоцитами in vitro.

Источники информации

1. Hofer М., Vacek A., Lojek A., Hola J., Streitova D. Ultrafiltered pig leukocyte extract (IMUNOR) decreases nitric oxide formation and hematopoiesis-stimulating cytokine production in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. // Immunopharmacol. 2007, 7(10), P. 1369-74.

2. Дыгай A.M., Жданов В.В. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Фармакологические аспекты. Москва, 2009, с.18-19.

3. Fischer О.М., Hart S., Gschwind A., Ullrich A. EGFR signal transac-tivation in cancer cells. // Biochemical Society Transactions, 2003, 31, P. 1203-1208.

4. Grimberg A. Mechanisms by which IGF-I may promote cancer. // Cancer Biol Ther, 2003, 2, P.630-635.

5. Whitmarsh A.J., Cavanagh J., Tournier C. et al. A mammalian scaffold complex that selectively mediates MAP kinase activation // Science. 1998, 281, P. 1671-1674.

6. Абатуров A.E., Юлиш Е.И. // Здоровье ребенка. 2007, 1(4). URL: http://www.mif-ua.com/archive/article/840.

Способ стимуляции выработки гранулоцитарного колониестимулирующего фактора клетками костного мозга in vitro, заключающийся в том, что прилипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в питательной среде с добавлением стимулятора, отличающийся тем, что в качестве стимулятора используют ингибитор протеинкиназы p38.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к средству для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющее собой 6-ацетил-7,9-дигидрокси-8,9b-диметил-2-етилид-2,11-ен-1,9b,2,3-тетрагидро-11-N-карбоксифенилметиламино-1,3-диоксодибензофуран общей формулы (I): Данное средство оказывает специфическое ингибирующее действие на фермент поли(АДФ-рибозо)полимераза-1 человека (ПАРП-1) и, являясь дешевым и доступным, расширяет арсенал специфических ингибиторов данного фермента и может быть использовано для разработки лекарственных препаратов, применимых в клинической медицине.

Изобретение относится к средству для ингибирования фермента поли(АДФ-рибозо)полимеразы-1 человека, представляющему собой производные нуклеозидов общей формулы (I), где Х - Н или OR1; один или два из заместителей R1, R 2, R3 - моносахаридные остатки, остальные - протоны водорода; В - азотистое основание, присоединенное в - или -положении.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии и касается соединения 6-амино-4-хлоропиразоло[3,4-d] пиримидин. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к медицине и касается цитозольной изоцитратдегидрогеназы, ее гена и их использования в лечении ожирения, гиперлипидемии и жировой инфильтрации печени.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности касается ингибирования цистеиновых аспартат-специфичных протеаз (каспаз), и может быть использовано в биохимии, клеточной биологии, физиологии и фармакологии для изучения и направленной регуляции процессов, связанных с индукцией, развитием и/или предотвращением программированной клеточной гибели (апоптоза), а также для исследования строения и механизма действия каспаз.

Изобретение относится к биохимии, в частности к применению известных бромпроизводных бензотетразин-1,3-диоксида общей формулы I где R1 и R2 различны и означают водород или Вr, в качестве необратимых ингибиторов Н, К-аденозинтрифосфатазы (Н,К-АТРазы).

Изобретение относится к экспериментальной микробиологии, лазерной медицине и технике, а именно к технологии стабильного "принудительного" прижизненного мечения микроорганизмов "фотосенсибилизатором".

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста.
Группа изобретений относится к медицине, а именно к биотехнологии, и может быть использована для восстановления кожного покрова с обширными травматическими ранами с дефектом мягких тканей.
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Предложен способ повышения иммуносупрессивных свойств мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, включающий культивирование мезенхимальных стромальных клеток человека в среде DMEM/F12, содержащей 100 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина, 2 мМ глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки, в присутствии провоспалительных факторов TNF-α в концентрации 20 нг/мл и IFN-γ в концентрации 30 нг/мл, характеризующийся тем, что культивирование проводят в атмосфере, состоящей из 5% CO2 и 95% воздуха, при температуре 37°С в течение 48 часов.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения моноклональных антител (МКА) к лизостафину. Предложен новый штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 2F9 - продуцент моноклональных антител, специфичных к лизостафину, ингибирующих его литическую активность и пригодных для его количественного определения.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипатентных мезенхимальных клеток (ММСК), включающий культивирование ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани до достижения монослоя при концентрации O2 в среде 5%, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 часов при концентрации O2 в среде 5%, отбор неприкрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации O2 в среде 5%.

Группа изобретений относится к области лекарственных средств и контроля их воздействия. Устройство для определения кардиотоксичности химического соединения содержит подложку (10), несущую деформируемый блок (34), причем блок (34) частично отделен от подложки полостью (32), обеспечивающей внеплоскостную деформацию блока.

Группа изобретений относится к области медицины и касается способов создания зуба, обладающего требуемым размером, и восстановления утраченной части зубов ротовой полости путем трансплантации созданного зуба в область утраты зубов.
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложена композиция, содержащая стволовые клетки из амниотической жидкости человека с фенотипом CD73+/CD90+/CD105+/CK19+, питательную среду, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и коллаген, взятые в эффективном количестве.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средству для лечения ишемических поражений тканей, представляющему собой смесь с соотношением 1÷0,5-3 из двух культур мезенхимальных стволовых клеток, одна из которых модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию фактора роста эндотелия сосудов, а другая модифицирована генетической конструкцией на основе вирусного вектора, обеспечивающего гиперпродукцию ангиопоэтина, а также способу лечения ишемических поражений тканей посредством обкалывания ишемезированной ткани, и может быть использовано в медицине.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ увеличения экспрессии MAFA в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой онколитический аденовирусный вектор, клетку и фармацевтическую композицию, содержащую указанный вектор, а также применение указанных векторов в производстве лекарственного средства для лечения рака у субъекта и к способу лечения рака у субъекта.
Наверх