Синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр


 


Владельцы патента RU 2528745:

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа B вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала. Предложенные праймеры используются для идентификации вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) методом ОТ-ПЦР. 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК вируса блютанга генетической группы (нуклеотипа В), объединяющей 3, 13 и 16 серотипы.

Известно, что вирус блютанга (ВБ) генетически высоко гетерогенен, по данным на 2012 г. выделяют 25 (1-24, 26) серотипов [9] и один генетический вариант, так называемый «25 серотип» - Toggenburg orbivirus [7, 8]. Детерминирует серотип в основном VP2 белок, который содержит большинство нейтрализующих эпитопов вируса [1, 2, 4].

С 2009 г. за рубежом для идентификации серотипа ВБ начали широко применять средства, основанные на ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени (ОТ-ПЦР РВ), что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип [6].

Целью являлась разработка пары олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга нуклеотипа B методом ОТ-ПЦР.

Изобретение - олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа B, а именно участка нуклеотидной последовательности 2 сегмента генома вируса блютанга 3, 13 и 16 серотипов методом ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Процедура анализа включает следующие этапы:

1. Денатурация дцРНК вируса блютанга.

2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.

3. ПЦР.

4. Электрофоретическая детекция продуктов амплификации.

Денатурацию дцРНК осуществляют при температуре 95°C в течение 5 минут в реакционной смеси с нуклеотипспецифической парой олигонуклеотидных праймеров, фиксируют денатурированную РНК путем замораживания. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 30 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). Затем реакцию терминируют при 88°C в течение 5-ти минут. Полученную кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, пару олигонуклеотидных нуклеотипспецефических праймеров, и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 95°C - 3 мин; циклирование: 95°C - 15 с, 58°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 45 раз. Анализ результатов ПЦР проводят методом электрофореза в агарозном геле. Готовят 2% ТАЕ-гель с добавлением бромистого этидия - 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Результаты электрофореза учитывают с помощью трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся оранжевых полос, на уровне 134 п.о. относительно маркера молекулярного веса. Для сохранения результатов реакции используются гельдокументирующие системы.

Выбор и анализ нуклеотипспецифических праймеров (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «BioEdit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank.

Нуклеотипспецифические праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы).

Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа B вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных нуклеотипспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР, позволяющую выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы).

Выявление РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) в образцах биологического материала: культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, образцы интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов.

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации дцРНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).

Таблица 1
ПЦР-мишень праймер нуклеотидная последовательность, 5'-3' локализация (RSArrrr/3, AJ585124), (RSArrrr/13, AJ585134), (RSArrrr/16, AJ585137)
2 сегмент прямой CKCgYATYTTRgATATgTCW 239-258
обратный CARWggYTgYACRTCCATSg 353-372

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации дцРНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°C в течение 5 минут. Далее необходимо поместить пробирки в условия с отрицательной температурой, для этого используют штатив с хладагентом.

Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 30-ти минут. После окончания реакции кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки объемом 0,6 или 0,2 см3, на поверхность смеси вносят воск в объеме 25 мкл. В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК.

Профиль реакции:

1. Удержание температуры - 94°C - 3 мин.

2. Циклирование: 94°C - 15 с, 58°C - 15 с,72°C - 15 с.

Цикл повторить 40 раз.

3. Хранение - 4°C.

Анализ продуктов амплификации ПЦР методом электрофореза

Приготовление геля агарозы: взвешивают 2,0 г агарозы, помещают в стеклянную посуду, заливают 100 мл рабочего 1ХТАЕ - буфера и доводят до кипения в микроволновой печи для полного растворения агарозы. Охлаждают раствор агарозы до температуры примерно 60-65°C и заливают в специальную форму с гребенкой, дают гелю затвердеть. После этого гребенку осторожно вынимают и форму с агарозным гелем переносят в камеру для горизонтального электрофореза. Заливают в камеру рабочий 1XTAE-буфер так, чтобы он покрывал гель на 5-10 мм.

Проведение электрофореза: из пробирок с исследуемыми образцами после завершения ПЦР отбирают из-под масла по 12 мкл реакционной смеси и вносят в лунки агарозного геля, в последнюю лунку вносят 5 мкл маркера молекулярной массы. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Направление движения образцов в геле от ”-” к ”+”. Длину амплифицированного фрагмента определяют в соответствии с маркером молекулярной массы (100-1000 пар оснований) и положительным контролем.

Результаты электрофореза учитывают на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся полос. Для сохранения результатов реакции используются гельдокументирующие системы. Положительными считаются пробы, полосы в которых располагаются в геле на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. Размер фрагмента, синтезируемого в ПЦР, составляет 134 пар оснований. Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют по размеру фрагмента в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). Результаты ОТ-ПЦР с использованием разработанной нуклеотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа В (3, 13 и 16 серотипы) методом ОТ-ПЦР с использованием разработанной нуклеотипспецифической системы олигонуклеотидов
№ проб Характеристика биоматериала Результаты
1 культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSAnrr/01 (AJ585122) референтный штамм -
2 культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм -
3 культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм +
4 культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм -
5 культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм -
6 культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127) референтный штамм -
7 культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrrr/07 (AJ585128) референтный штамм -
8 культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129) референтный штамм -
9 культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130) референтный штамм -
10 культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм -
11 культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм -
12 культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм -
13 культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм +
14 культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм -
15 культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ585136) референтный штамм -
16 культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137) референтный штамм +
17 культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ585138) референтный штамм -
18 культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ58519) референтный штамм -
19 культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140) референтный штамм -
20 культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (AJ585141) референтный штамм -
21 культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142)референтный штамм -
22 культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (А1585143)референтный штамм -
23 культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSArrrr/23 (AJ585144)референтный штамм -
24 культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145)рефереренторный штамм -
25 культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (НМ590642) -
26 интактная культура клеток Vero -
27 интактная культура клеток ВНК-21 -
28 кровь от интактного животного (корова) -
29 кровь от интактного животного (овца) -
30 культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси», 1 серотип -

Таким образом, разработана нуклеотипспецифическая пара олигонуклеотидных праймеров, позволяющая с помощью классической ОТ-ПЦР выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы).

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

- специфичность и чувствительность способа выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) с помощью ОТ-ПЦР, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга группы серотипов;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода благодаря использованию ОТ-ПЦР для идентификации нуклеотипа.

Источники информации

1. Clinical aspects linked with the emergence of bluetongue in cattle in northern Europe: results of a two month longitudinal study / C. Saegerman, A. Mauroy, H. Guyot // Renc. Rech. Ruminants. -2007. - Vol.l4. - P.215.

2. The dsRNA viruses / P.P.C. Mertens // Virus Res. - 2004. - Vol.101. - P.3-13.

3. Bluetongue virus assembly and morphogenesis / P. Roy, R. Noad // Curr Top MicrobiolImmunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

4. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens // J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 621-630.

5. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode / P.P.C. Mertens, F. Brown, D.V. Sangar // Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-217.

6. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments / J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq // J. Virol. Methods. - 2007. - Vol.140. - P.115-123.

7. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens // Journal of Virological Methods. - 2007. - Vol.145. - P.115-126.

8. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1 : Description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11/ F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq // TransboundEmerg Dis. - 2009. - Vol.56(9-10). - P.346-54.

9. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ B. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer // Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P. 2992-2994.

Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа B (3, 13 и 16 серотипы) для идентификации вируса блютанга нуклеотипа B, используемые для выявления генома вируса блютанга нуклеотипа B, имеющие следующий нуклеотидный состав (5'-3'):
прямой: CKC-GYA-TYT-TRG-ATA-TGT-CW,
обратный: CAR-WGG-YTG-YAC-RTC-CAT-SG.



 

Похожие патенты:

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по DGAT1-гену на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров: DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO:1) DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO:2) DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO:3), а на этапе ПДРФ применяется другая эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp и генотип АК=100/82/18 bp (фиг.1 и 2).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к набору синтетических олигонуклеотидных пар праймеров, и может быть использовано в судебно-медицинской идентификационной экспертизе.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике. Предложен биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител в сыворотке крови человека, содержащий массив дискретно нанесенных и иммобилизованных на поверхности подложки O-антигенов V.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для амплификации и последующего секвенирования ITS1-5.8S-ITS2 сосудистых растений, включающего проведение полимеразой цепной реакции с помощью универсальных праймеров со следующим нуклеотидным составом: primer ITS-for CGTAACAAGGTTTCCGTAG, primer ITS-rew GGAATCCTTGTAAGTTTCTTT.

Группа изобретений относится к области микробиологии и биотехнологии. Способ детекции живых клеток микроорганизма в тестируемом образце путем отличия живых клеток от мертвых клеток или поврежденных клеток предусматривает добавление в тестируемый образец средства, способного к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм; облучение тестируемого образца; амплификацию мишеневой области ДНК или РНК микроорганизма, содержащегося в тестируемом образце, способом амплификации нуклеиновых кислот в присутствии средства подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, соли магния, соли органической кислоты или соли фосфорной кислоты, без выделения нуклеиновых кислот из клеток и анализа продукта амплификации.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы A у крупного рогатого скота и способ их применения.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий филотипа Bifidobacterium longum. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейства RelBE и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора видо- и штаммоспецифичных олигонуклеотидов, ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.

Изобретение относится к иммунологии. Предложены варианты применения вариантов набора генов (фармакодинамических (ФД) маркеров) с повышенной регуляцией экспрессии или действия, индуцируемых интерфероном альфа (ИФНα).

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа идентификации лактобацилл. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейств RelBE и MazEF и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию геномных ДНК с использованием набора олегонуклеотидов определенной структуры, ПЦР-продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ проведения ПЦР для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники использованием прямого праймера 4F-c: 5'-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3'. Также описан способ ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI. Цель изобретения - разработка способов проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

Изобретение относится к медицине и микробиологии. Предложен способ определения микобактерий туберкулеза генотипа Beijing в режиме реального времени путем определения вставки элемента IS6110 в локусе генома dnaA-dnaN, отличающийся тем, что применяют ПЦР в режиме реального времени с использованием двух специфических праймеров 5`-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA и 5`-CGCCGGGACTGTATGAGTCT и флуоресцентно-меченого зонда R6G-5`-TGTGCACAGCGACACTCACAGCCA-3`-BHQ2, оценку результата производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналу R6G с длиной волны 555нм, причем при наличии в образце ДНК штамма микобактерий туберкулеза генотипа Beijing экспоненциальный рост сигнала флуоресценции ПЦР при анализе чистой ДНК происходит между 10-15 циклами, а при анализе клеточных лизатов - между 15 и 20 циклами. Изобретение может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза генотипа Beijing. 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выявлению рака легкого с помощью аптамеров, и может быть использовано в диагностике. Аптамеры получают в результате селекции, включающей чередование раундов позитивной селекции аптамеров к измельченным опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции у онкологических больных, и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, его клонирования, секвенирования, проверки на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого. Полученные аптамеры обладают высокой чувствительностью к продуктам распада опухоли и циркулирующим раковым клеткам в периферической крови больных раком легкого, что позволяет повысить эффективность диагностики рака легкого человека. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор праймеров для амплификации фрагментов гена CFTR. Представлены биочип и набор мишеней для биочипа. Описан способ идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, включающий использование описанных праймеров. Представлена тест-система, которая содержит описанные праймеры и биочип. Изобретение расширяет арсенал технических средств, используемых для диагностики муковисцидоза, позволяя быстро и специфично диагностировать соответствующие мутации. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил, 4 табл., 6 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, медицине и онкологии. Предложен способ детекции стволовых раковых клеток, основанный на инкубации образцов клеток с флуоресциентными красителями и последующей идентификации раковых клеток в ультрафиолетовом свете, где при инкубации образцов клеток, которая проводится с флуоресцентным красителем, ковалентно инкорпорированным во фрагменты двуцепочечной ДНК, обеспечивается интернализация экстраклеточных экзогенных фрагментов двуцепочечной ДНК во внутриклеточное пространство стволовых клеток, входящих в состав образцов клеток, путем проведения инкубации образцов клеток в растворе препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в соотношении 0.5-1 мкг ДНК на 1000000 клеток, находящихся в суспензии или на срезе ткани в течение 60-120 минут, а идентификацию раковых клеток в качестве стволовых осуществляют в ультрафиолетовом свете с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения введенного в молекулы фрагментов двуцепочечной ДНК флуорохрома, причем, в качестве фрагментов двуцепочечной ДНК используют фрагменты ДНК Alu повтора человека, энзиматически меченые предшественником, содержащим ковалентно пришитый флуорохромный краситель, или меченые прямым химическим введением флуорохрома. Благодаря увеличению эффективности выявления раковых стволовых клеток в инициирующем состоянии изобретение может быть использовано в медицине. 1 з.п. ф-лы, 11 ил.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии. Предложены праймеры, зонды и их наборы, для амплификации и обнаружения HPV типа 52 в исследуемом образце. Изобретение может быть использовано в медицинских целях для обнаружения вирусов папилломы человека. 8 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 табл., 5 пр., 4 ил.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры. Представленный способ генерирования заквасочной культуры включает воздействие на материнский бактериальный штамм, содержащий, по меньшей мере, часть локуса CRISPR, бактериофагом для получения смеси бактерий, содержащей устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR, содержащий, по меньшей мере, один дополнительный спейсер в указанном модифицированном локусе CRISPR; независимое воздействие на тот же материнский бактериальный штамм тем же бактериофагом для получения смеси бактерий, содержащей другой устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR, содержащий, по меньшей мере, один дополнительный спейсер в указанном модифицированном локусе CRISPR, отличный от дополнительного спейсера в первом устойчивом к бактериофагам вариантном штамме; отбор указанных устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов из смесей бактерий и их выделение. Представленные изобретения позволяют получать устойчивые к бактериофагам культуры и могут быть использованы в пищевой промышленности при изготовлении подвергнутых брожению продуктов. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 23 ил., 20 табл., 23 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами. Для осуществления настоящего способа проводят мультипраймерную полимеразную цепную реакцию в один прием в двух реакционных смесях, первая из которых содержит праймеры к генам, кодирующим такие белки стафилококков, как термонуклеаза, бета-глюкозидаза у видов S.aureus, S.epidermidis, S.haemolyticus, S.lugdunensis, S.saprophyticus, а вторая - к генам set1, set2, set3, set4, set5, кодирующим экзотоксины. Затем проводят анализ путем сравнения амплицированных фрагментов генов, полученных в двух аликвотах образца, с положительным контрольным образцом в соответствии с идентификационной таблицей. Настоящее изобретение также раскрывает тест-систему для осуществления указанного способа, которая содержит компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР и компоненты для анализа результатов. При этом компоненты для проведения ПЦР содержат 10-кратный буферный раствор, рН 8,4, деионизированную стерильную воду, один положительный контрольный образец, фермент Taq-полимеразу, смесь четырёх дНТФ, смесь праймеров №1, содержащую epi-F, epi-R, aur-F, aur-R, hae-F, hae-R, lug-F, lug-R, sap-F, sap-R в соотношении 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1, и смесь прамеров №2, содержащую set1-F, set1-R, set2-F, set2-R, set3-F, set3-R, set4-F, set4-R, set5-F, set5-R в соотношении 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1. Настоящее изобретение позволяет выявить кластер генов, кодирующих стафилококковые белки, молекулярная масса которых составляет от 25 до 35 кДа, состоящих почти из 200 аминокислотных остатков и имеющих третичную структуру, высокогомологичную с некоторыми суперантигенами стафилококка (энтеротоксины, TSST-1 токсин) и с пирогенным стрептококковым экзотоксином C. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии и медицины. Способ оценки цитолитической активности единичных эффекторных клеток, при этом определяя профиль секретированного продукта, используя матрицы микролунок, включает мониторинг лизиса инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток в микролунках, где микролунки содержат в среднем одну эффекторную клетку и по меньшей мере одну инфицированную клетку-мишень на микролунку; где мониторинг включает стадию детекции лизиса указанных инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток, используя флуоресцентный индикатор, при этом определяя профиль одного или более секретированных продуктов. Способ может быть использован в медицине для крупномасштабного скрининга для определения профиля большого числа отдельных клеток в микромассивах. 19 з.п. ф-лы, 10 ил.,7 пр.
Наверх