Способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы



Способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы
Способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы
Способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы
Способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы
Способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы

 


Владельцы патента RU 2528748:

Вафин Рамиль Ришадович (RU)

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ проведения ПЦР для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники использованием прямого праймера 4F-c: 5'-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3'. Также описан способ ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. Способ отличается от известных из уровня техники тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI. Цель изобретения - разработка способов проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

 

Описание изобретения

Изобретение относится к области биохимии, а также селекции и семеноводства, в частности к молекулярной идентификации генотипов пшеницы по аллельным вариантам Waxy-генов для маркер-вспомогательной селекции сортов с высокими мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна.

Одним из подходов к идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы является способ проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) с праймерами: 4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3/ и 4R: 5/-TCGTACCCGTCG-ATGAAGTCGA-3/, инициирующими амплификацию соответствующих аллель-специфичных продуктов Wx-Al-, Wx-Bl- и Wх-Dl-локусов. [1].

Существенным недостатком данного способа проведения ПЦР [1] является невозможность идентификации нуль-аллеля Wx-Blb от активного аллеля Wx-Ble, а также трудность дискриминации Wx-Ala от Wx-Alg.

Цель изобретения - разработка способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Нами разработан способ проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, схожий с прототипом [1], включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из dH2O, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, с тем отличием, что на этапе ПЦР используется прямой праймер: 4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ /(SEQ ID NO: 1), а процедура ПДРФ-анализа проводится с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI.

Условия проведения реакции

Выделение геномной ДНК из зерновок растений яровой пшеницы осуществляли сорбционным способом («ДНК-сорб С», ЦНИИЭМ, Россия).

ПЦР и ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколам идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, представленным в табл.1-2.

Детекцию результатов ДНК-анализа проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере TBE (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).

Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.

Выравнивание частичных нуклеотидных последовательностей аллелей Waxy-генов пшеницы: CLUSTAL W (v.1.83).

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

Заключение

По результатам практических исследований, направленных на апробацию предложенного способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, ввиду корректной интерпретации генерируемых ПЦР-продуктов (фиг.3) и ПЦР-ПДРФ-фрагментов (фиг.4), сопоставимых с расчетными данными (фиг.1-2).

Источники информации

1. Vanzetti, L.S. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm / L.S. Vanzetti, L.A. Pfluger, M. Rodriguez-Quijano, J.M. Carrillo, M. Helguera // Electronic Journal of Biotechnology. - 2009. - V.12. - N.1. - P.1-9.

Табл.1
Протокол ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (прототип)
Протокол ПЦР
Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба (мкл) 10 проб (мкл)
dH2O 13,4 134
dNTPs 2,5 мМ 0,25 мМ 2 20
Буфер 10× 2 20
Taq ДНК полимераза 5 ед 1 ед 0,2 2
4F 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2
4R 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2
Проба ДНК 2
ВСЕГО 20
Нуклеотидные последовательности праймеров:
4F: 5/-AAGAGCAACTACCAGT-3/ (16 н.)
4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3/ (22 н.)
Режим амплификации:
×1: 94°C - 4 мин
×40: 94°C - 30 сек, 58°C - 30 сек, 72°C - 30 сек
×1: 72°C - 7 мин
ХРАНЕНИЕ +10°C
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 257 (261) bp=Wx-Ala или Wx-Alg (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb
Наличие 227 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 299 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb
Табл.2
Протокол ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (предлагаемый способ)
Протокол ПЦР
Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба (мкл) 10 проб (мкл)
dH2O 13,4 134
dNTPs 2,5 мМ 0,25 мМ 2 20
Буфер 10× 2 20
Taq ДНК полимераза 5 ед 1 ед 0,2 2
4F-c 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2
4R 50 мкМ 0,5 мкМ 0,2 2
Проба ДНК 2
ВСЕГО 20
Нуклеотидные последовательности праймеров:
4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ (21 н.)
4R: 5/-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3/ (22 н.)
Режим амплификации:
×1: 94°C - 4 мин
×40: 94°C - 30 сек, 64°C - 30 сек, 72°C - 30 сек
×1: 72°C - 7 мин
ХРАНЕНИЕ +10°C
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg
Наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb
Протокол ПДРФ
Реагенты Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба (мкл) 10 проб (мкл)
dH2O 1,75 17,5
BSA 10 мг/мл 0,1 мг/мл 0,25 2,5
SE-буфер W 10× 2,5 25
AcsI 20 U 10 U 0,5 5
ПЦР-проба 20
ВСЕГО 25
Инкубация при 50°C в течение 3 часов
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg
Наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 266 bp=Wx-Ble
Наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb

Краткое описание графических материалов

Пояснение к фиг.1.

Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Пояснение к фиг.2.

Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F-c+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.

Пояснение к фиг.3.

Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР и прототипа для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Обозначения: A) прототип (праймеры 4F+4R). B) предложенный способ проведения ПЦР (праймеры 4F-c+4R). M) ДНК-маркеры 100-1500 bp (СибЭнзим). 1-9) генотипы пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 1-4) Wx-Ala/Bla/Dla; 5-7) Wx-Alg/Bla/Dla. 8-9) Wx-Ala/Blb/Dla.

Пояснение к фиг.4.

Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.

Обозначения: M) ДНК-маркеры 50-100 bp (СибЭнзим). 1) ПЦР-профиль генотипа пшеницы с комбинацией аллелей Wx-Ala/Bla/Dla (304/262/232 bp). 2-7) AcsI-ПЦР-ПДРФ-профили генотипов пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 2) Wx-Ala/Bla/Dla (156/148/114/84 bp); 3-5) Wx-Alg/Bla/Dla (156/148/84 bp); 6-7) Wx-Ala/Blb/Dla (156/148/114 bp).

1. Способ проведения ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из деионизированной воды, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, отличающийся тем, что используется прямой праймер 4F-c: 5/-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3/ /(SEQ ID NO: 1) со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-продуктов:
наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,
наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,
наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.

2. Способ проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, включающий п.1, отличающийся тем, что после этапа ПЦР проводят процедуру ПДРФ-анализа с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI, со следующей интерпретацией генерируемых или отсутствующих ПЦР-ПДРФ-фрагментов:
наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg,
наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble,
наличие 266 bp=Wx-Ble,
наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа B вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по DGAT1-гену на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров: DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO:1) DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO:2) DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO:3), а на этапе ПДРФ применяется другая эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp и генотип АК=100/82/18 bp (фиг.1 и 2).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к набору синтетических олигонуклеотидных пар праймеров, и может быть использовано в судебно-медицинской идентификационной экспертизе.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике. Предложен биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител в сыворотке крови человека, содержащий массив дискретно нанесенных и иммобилизованных на поверхности подложки O-антигенов V.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для амплификации и последующего секвенирования ITS1-5.8S-ITS2 сосудистых растений, включающего проведение полимеразой цепной реакции с помощью универсальных праймеров со следующим нуклеотидным составом: primer ITS-for CGTAACAAGGTTTCCGTAG, primer ITS-rew GGAATCCTTGTAAGTTTCTTT.

Группа изобретений относится к области микробиологии и биотехнологии. Способ детекции живых клеток микроорганизма в тестируемом образце путем отличия живых клеток от мертвых клеток или поврежденных клеток предусматривает добавление в тестируемый образец средства, способного к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм; облучение тестируемого образца; амплификацию мишеневой области ДНК или РНК микроорганизма, содержащегося в тестируемом образце, способом амплификации нуклеиновых кислот в присутствии средства подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, соли магния, соли органической кислоты или соли фосфорной кислоты, без выделения нуклеиновых кислот из клеток и анализа продукта амплификации.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы A у крупного рогатого скота и способ их применения.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий филотипа Bifidobacterium longum. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейства RelBE и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора видо- и штаммоспецифичных олигонуклеотидов, ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.

Изобретение относится к иммунологии. Предложены варианты применения вариантов набора генов (фармакодинамических (ФД) маркеров) с повышенной регуляцией экспрессии или действия, индуцируемых интерфероном альфа (ИФНα).

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению антимикробного пептида дефенсина чечевицы обыкновенной Lens culinaris, который может найти применение в качестве лекарственного средства в медицинской и ветеринарной практике, а также средства, повышающего устойчивость растений к инфекции в сельском хозяйстве.

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения генетически модифицированных растений капусты белокочанной. .

Изобретение относится к борьбе с насекомыми-вредителями, в частности с нематодами. .

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и представляет собой способ получения генетически модифицированных древесных растений, включающий: а) получение и подготовку к инокуляции растительных эксплантов штамма А. tumefaciens, содержащего предназначенный для введения в растение селективный, маркерный и/или полезный гены; б) получение и подготовку к инокуляции штаммом A. tumefaciens растительных эксплантов; в) инокуляцию эксплантов штаммом A. tumefaciens в жидкой среде; г) кокультивацию эксплантов с агробактериями на среде без селективных агентов и бактериостатических антибиотиков; д) помещение эксплантов на среду, содержащую селективные агенты и бактериостатические антибиотики, с целью получения регенерантов непосредственно из тканей эксплантов или через стадию каллуса; е) отбор полученных на селективной среде регенерантов путем их тестирования на наличие полноразмерной копии целевого гена, где стадию кокультивации завершают при появлении на питательной среде под одним слоем фильтровальной бумаги с размером пор 5-8 мкм колоний агробактерий в количестве 10-20% растительных эксплантов. Изобретение позволяет определить оптимальный период кокультивации и повысить частоту генетической трансформации растений. 1 з.п. ф-лы, 4ил., 1 табл., 10 пр.

Изобретение относится к медицине и микробиологии. Предложен способ определения микобактерий туберкулеза генотипа Beijing в режиме реального времени путем определения вставки элемента IS6110 в локусе генома dnaA-dnaN, отличающийся тем, что применяют ПЦР в режиме реального времени с использованием двух специфических праймеров 5`-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA и 5`-CGCCGGGACTGTATGAGTCT и флуоресцентно-меченого зонда R6G-5`-TGTGCACAGCGACACTCACAGCCA-3`-BHQ2, оценку результата производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналу R6G с длиной волны 555нм, причем при наличии в образце ДНК штамма микобактерий туберкулеза генотипа Beijing экспоненциальный рост сигнала флуоресценции ПЦР при анализе чистой ДНК происходит между 10-15 циклами, а при анализе клеточных лизатов - между 15 и 20 циклами. Изобретение может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза генотипа Beijing. 3 ил., 2 пр.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выявлению рака легкого с помощью аптамеров, и может быть использовано в диагностике. Аптамеры получают в результате селекции, включающей чередование раундов позитивной селекции аптамеров к измельченным опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции у онкологических больных, и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, его клонирования, секвенирования, проверки на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого. Полученные аптамеры обладают высокой чувствительностью к продуктам распада опухоли и циркулирующим раковым клеткам в периферической крови больных раком легкого, что позволяет повысить эффективность диагностики рака легкого человека. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор праймеров для амплификации фрагментов гена CFTR. Представлены биочип и набор мишеней для биочипа. Описан способ идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, включающий использование описанных праймеров. Представлена тест-система, которая содержит описанные праймеры и биочип. Изобретение расширяет арсенал технических средств, используемых для диагностики муковисцидоза, позволяя быстро и специфично диагностировать соответствующие мутации. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил, 4 табл., 6 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки. 2 табл., 1 пр.
Наверх