Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени



Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени
Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени
Способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени

 


Владельцы патента RU 2528866:

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (RU)
Федеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" (RU)

Изобретение относится к медицине и микробиологии. Предложен способ определения микобактерий туберкулеза генотипа Beijing в режиме реального времени путем определения вставки элемента IS6110 в локусе генома dnaA-dnaN, отличающийся тем, что применяют ПЦР в режиме реального времени с использованием двух специфических праймеров 5`-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA и 5`-CGCCGGGACTGTATGAGTCT и флуоресцентно-меченого зонда R6G-5`-TGTGCACAGCGACACTCACAGCCA-3`-BHQ2, оценку результата производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналу R6G с длиной волны 555нм, причем при наличии в образце ДНК штамма микобактерий туберкулеза генотипа Beijing экспоненциальный рост сигнала флуоресценции ПЦР при анализе чистой ДНК происходит между 10-15 циклами, а при анализе клеточных лизатов - между 15 и 20 циклами. Изобретение может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза генотипа Beijing. 3 ил., 2 пр.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для лабораторного определения микобактерий туберкулеза, относящихся к генотипу Beijing.

Возбудитель туберкулеза человека - Mycobacterium tuberculosis имеет клональную структуру популяции, представленную отдельными генетическими семействами. При этом генетическое семейство (далее - генотип) Beijing характеризуется достаточной однородностью по многим генетическим маркерам и широким географическим распространением (Bifani et al., 2002; Mokrousov, 2008). Впервые этот генотип был выявлен у штаммов, выделенных в Пекинском регионе Китая, что и объясняет его название (van Soolingen et al., 1995). Последующие исследования показали эндемичность генотипа Beijing в странах бывшего СССР, Южной Африке и Восточной Азии (Нарвская и др., 2002, Шемякин и др., 2003; Bifani et al., 2002; Marais et al., 2006; Millet et al., 2007) и его нарастающее проникновение в новые удаленные регионы (Glynn et al., 2005; Lavender et al., 2005; Garcia de Viedma et al., 2006). В отличие от многих других генетических семейств М. tuberculosis, для идентификации которых необходимо применение достаточно сложных и не всегда очевидных биоинформационных алгоритмов (Sebban et al., 2002; Ferdinand et al., 2002), генотип Beijing имеет характерную особенность генома, а именно «усеченный» локус DR (локус прямых повторов), состоящий из девяти спейсеров (с 35 по 43) и легко выявляемый при стандартном сполиготипировании (англ. spoligotyping [spacer oligonuceleotide typing]) в виде характерного профиля гибридизации (Kremer et al., 2004) (Фиг.1). У штаммов генотипа Beijing большинство спейсеров в локусе DR, вероятно, было утрачено в результате малого количества делеционных событий, по крайней мере, одно их которых было связано с рекомбинацией и транспозицией IS 6110.

Генотип Beijing привлекает внимание и с клинической точки зрения, поскольку его штаммы демонстрируют патогенные свойства: повышенную вирулентность на мышиной модели (Вишневский и др., 2002; Lopez et al., 2003) и на модели макрофагов (Zhang et al., 1999; Черноусова и др., 2008; Lasunskaia et al., 2010), ассоциацию с лекарственной устойчивостью (Нарвская, 2003; Toungoussova et al., 2002; Сох et al., 2005; Mokrousov et al., 2009) и высокую трансмиссивность (Андреевская и др., 2006; Caminero et al., 2001; Narvskaya et al., 2002). Неблагоприятная ситуация по туберкулезу в России в значительной степени связана с распространением мультирезистентных штаммов генотипа Beijing в популяции иммунизированных БЦЖ (Bifani et al., 2002). Таким образом, наблюдаемое сейчас широкое распространение штаммов Beijing представляет серьезную угрозу успешной реализации национальных программ борьбы с туберкулезом.

Учитывая клиническую и эпидемиологическую значимость генотипа Beijing М. tuberculosis, необходимо наличие простого метода его детекции. Стандартным методом определения штаммов Beijing является сполиготипирование, которое основано на анализе структуры хромосомы М. tuberculosis в области прямых повторов (DR-локус), разделенных вариабельными спейсерами (Kamerbeek et al., 1997). Метод требует проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующей ДНК-гибридизации с иммобилизованными на мембране 43 зондами в специальном приборе (миниблоттере) и выявления сигналов хемилюминесценции на светочувствительной пленке (Фиг.1).

Являясь «золотым стандартом» выявления принадлежности изолята М. tuberculosis к генотипу Beijing, метод неприменим для использования в практических бактериологических лабораториях. Кроме того, формат этого метода подразумевает одновременный анализ 40 штаммов, что не всегда экономично при необходимости анализа единичных изолятов. Сполиготипирование не требует получения очищенной ДНК М. tuberculosis, но тем не менее этот метод требует специального оборудования и достаточно сложной процедуры выявления профилей гибридизации. Другие методы, основанные на компьютерном сравнении профилей IS6770-RFLP с референс-профилями и повторной гибридизации мембраны с Beijing-специфическими пробами на локусы NTF и dnaA-dnaN (Kurepina et al., 2005), еще более трудоемки, чем классический анализ IS6770-RFLP. Кроме того, эти методы требуют проведение дополнительных экспериментов для исследования только штаммов Beijing.

Особенностью структуры генома штаммов генотипа Beijing является наличие вставки элемента IS6110 в локусе dnaA-dnaN, расположенном вблизи от oriC (Bifani et al., 2002). Выявление этой характерной вставки IS 6110 методом ПЦР в формате «реального времени» составляет основу предложенного нами способа детекции штаммов М. tuberculosis генотипа Beijing.

В качестве прототипа предлагается метод блот-гибридизации хромосомной ДНК М. tuberculosis с мечеными зондами на основе элемента IS6110 и локуса dnaA-dnaN (van Embden et al., 1993; Kurepina et al., 2005). Фрагменты гидролиза ДНК рестриктазой PvuII, разделенные при электрофорезе в агарозном геле, переносят на нейлоновую мембрану и подвергают последовательной гибридизации со специфическими зондами: меченым фрагментом инсерционного элемента IS6110 (van Embden et al., 1993) и dnaA-dnaN (Kurepina et al., 2005). Профили гибридизации выявляют колориметрически или хемилюминесценцией и подвергают компьютерной обработке. Метод требует выделения большого количества очищенной ДНК и длительных процедур рестрикции ДНК, разделения в агарозном геле, переноса на мембрану по Саузерну и собственно гибридизации. В целом процедура занимает не менее 5-6 дней. Кроме того, метод требует использования соответствующих компьютерных программ для обработки и анализа сканированных профилей гибридизации.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа быстрой и надежной детекции микобактерий туберкулеза генотипа Beijing посредством амплификации и флуоресцентно-гибридизационного выявления специфической для штаммов этого генотипа инсерции IS6110 в участке генома dnaA-dnaN.

Задача реализуется за счет того, что применяют ПЦР в режиме реального времени с использованием двух специфических праймеров и флуоресцентно-меченого зонда, и при экспоненциальном накоплении сигнала флуоресценции между 10-15 циклами ПЦР при анализе чистой ДНК и 15-20 циклами при анализе клеточных лизатов судят о принадлежности М. tuberculosis к генотипу Beijing.

Преимущества предлагаемого способа:

- быстрота (один день от момента выделения ДНК);

- простая и однозначная интерпретация результатов;

- возможность быстрого анализа больших коллекций штаммов М. tuberculosis для оценки их принадлежности к генотипу Beijing с целью диагностики и при популяционных исследованиях;

- возможность использования неочищенных препаратов ДНК (клеточных лизатов) для быстрой диагностики.

Изобретение поясняется чертежами, где Фиг.1 - Примеры профилей сполиготипирова-ния микобактерий туберкулеза (генотип Beijing отмечен звездочкой). Фиг.2 - Схема ПЦР (не в масштабе). Крупная стрелка показывает ориентацию элемента IS6110, короткие стрелки - позиции праймеров и зондов. Фиг.3 - Профили - накопление сигнала флуоресценции: (а) по контрольному (FAM/Green) каналу детекции, на М. tuberculosis complex и (б) специфическому (R6G/Yellow) каналу детекции, на генотип Beijing. ОКО - отрицательный контрольный образец (вода).

Способ осуществляется следующим образом.

Выделение и очистку ДНК из культуры М. tuberculosis, выращенной на среде Левенштейна-Йенсена, проводят по van Embden et al. (1993). Суспендируют 1 стандартную бактериологическую петлю культуры в 400 мкл буфера ТЕ x1 и инкубируют 20 мин при 85°С. Дальнейшую обработку проводят с использованием лизоцима, протеиназы К, додецилсульфата натрия и цетилтриметиламмонийбромида. Полученный лизат обрабатывают смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), центрифугируют, осаждают изопропанолом, промывают 70% этанолом, осадок высушивают и растворяют в 30-50 мкл ТЕ х0.5. При получении грубого препарата ДНК (клеточного лизата) 1 петлю культуры суспендируют в 100 мкл буфера ТЕ x1, кипятят 20 мин на водяной бане, центрифугируют 15 мин (12000 об/мин) и полученный супернатант используют для ПЦР.

Материалом для ПЦР служит чистая ДНК или клеточный лизат. ПЦР проводят в мультиплексном формате в режиме реального времени. Во-первых, амплификацию специфического для генотипа Beijing фрагмента ДНК, расположенного между элементом IS6110 и прилегающим к нему участком локуса dnaA-dnaN, проводят методом ПЦР с использованием двух праймеров (Фиг.2). Продукты амплификации выявляют с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотиднного зонда в ПЦР в формате реального времени. Во-вторых, для контроля качества ДНК одновременно используют специфические праймеры, для амплификации внутреннего фрагмента элемента IS6110, присутствующего во всех штаммах микобактерий туберкулезного комплекса (М. tuberculosis complex); продукты амплификации также выявляют в режиме реального времени по другому каналу детекции флуоресценции (Фиг.3а). В качестве контрольных используют: ДНК известного штамма Beijing и ДНК штамма H37R.V (не-Beijing). Накопление сигнала флуоресценции определенной длины волны специфического олигонуклеотидного зонда свидетельствует о принадлежности изучаемых ДНК к генотипу Beijing (Фиг.36).

Были использованы следующие сконструированные нами праймеры и зонды для ПЦР в реальном времени (Фиг.2). Для детекции генотипа Beijing использовали праймеры BGF (5'-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA) и BGR (5'-CGCCGGGACTGTATGAGTCT) и зонд BGP (R6G-5'-TGTGCACAGCGACАСТСACAGCCA-3'-BHQ2). Зонд BGP мечен флуорофром R6G по 5'-концу и гасителем флуоресценции BHQ2 по 3'-концу; детекцию сигнала проводили по «желтому» (R6G/Yellow) каналу детекции в термоциклере Ro-torGene6000 (длина волны 555 нм).

Для детекции М. tuberculosis complex использовали праймеры MTF (5'-CCATCGACCTACTACGACCACAT), MTR (5'-CGGCTGATGTGCTCCTTGAGT) и зонд МТР (FAM-5' CAGCCGCCGCGAGCTGC-3'-RTQ-1). Зонд МТР мечен флуорофором FAM по 5'-концу и гасителем флуоресценции RTQ-1 (Синтол, Москва) по 3'-концу; детекцию сигнала проводили по «зеленому» (FAM/Green) каналу (длина волны 510 нм) (Фиг.3).

Очищенная ДНК (0.1-0.5 мкл) или клеточный лизат (супернатант, 4 мкл) добавляется к смеси ПЦР (конечный объем 30 мкл), содержащей 1,5 mM MgCl2, 1 U Tag ДНК полимеразы для ПЦР в реальном времени (Синтол, Москва), 200 µМ каждого из дНТФ, праймеры BGF, BGR, MTF и MTR (по 10 пмоль), зонды МТР и BGP (по 3 пмоль). Добавляли: чистой ДНК - 0.1 мкл, лизата - 4 мкл. ПЦР проводили в термоциклере Rotorgene6000 (Corbette Research) в следующих условиях: 95°С, 8 мин; далее 40 циклов 94°С, 15 с, 60°С, 50 с. Считывание флуоресценции - при 60°С.

Оценка результатов.

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализируют с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР в формате реального времени. По каналу FAM/Green - регистрируется накопление продукта амплификации фрагмента ДНК, специфического для М. tuberculosis complex (Фиг.3а), по каналу R6G/Yellow - фрагмента ДНК, специфического для генотипа Beijing М. tuberculosis (Фиг.3b). Результаты интерпретируют по наличию (отсутствию) пересечения нормализованной кривой флуоресценции с установленной на заданном уровне (как правило, 0,1) пороговой линией, что соответствует наличию (отсутствию) значению порогового цикла Ct.

При наличии в образце ДНК штамма Beijing экспоненциальный рост сигнала флуоресценции начинается на 10-15 циклах ПЦР при анализе чистой ДНК и на 15-20 циклах при анализе клеточных лизатов («желтый» канал). При отсутствии сигнала флуоресценции по обоим каналам (т.е. и по контрольному «зеленому» каналу) делается вывод о недостаточном количестве и/или качестве ДНК или ингибировании реакции ПЦР и невозможности какого-либо вывода о наличии или отсутствии ДНК штамма Beijing в образце.

Пример 1. Анализ 265 проб ДНК штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в 1997-2007 гг. в России, Китае и Вьетнаме, был проведен методами сполиготипирования (использован в качестве «золотого» стандарта идентификации генотипа Beijing) и методом ПЦР в реальном времени, предлагаемым в настоящей заявке в качестве способа быстрой детекции М. tuberculosis генотипа Beijing. Была определена принадлежность 143 штаммов М. tuberculosis к генотипу Beijing. При этом результаты анализа обоими методами полностью совпали. Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокую чувствительность определения штаммов микобактерий туберкулеза генотипа Beijing.

Пример 2. Анализ проб из 70 клеточных лизатов штаммов микобактерий туберкулеза, выделенных в Санкт-Петербурге и ранее отнесенных к генотипу Beijing в результате сполиготипирования. В результате применения метода ПЦР в реальном времени для 67 образцов был получен специфический сигнал микобактерий туберкулеза генотипа Beijing. Отсутствие сигнала для 3 лизатов может быть связано с ингибированием ПЦР и/или недостаточным количеством ДНК, поэтому эффективность метода применительно к клеточным лизатам составила 95,7%.

Литература:

1. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. Трансмиссия штаммов микобактерий туберкулеза, обусловленная миграционными процессами в Российской Федерации (на примере миграции населения из Кавказского региона в Москву и Московскую область) // Пробл. туб. и болезней легких. - 2006. - №1. - С.29-35.

2. Вишневский Б.И., Нарвская О.В., Васильева С.Н., Сапожникова Н.В., Мокроусов И.В., Оттен Т.Ф. Вирулентность микобактерий туберкулеза // Пробл. туб. - 2002. -№10. - С.33-36.

3. Нарвская О.В. Геномный полиморфизм Mycobacterium tuberculosis и его роль в эпидемическом процессе: Дис. д-ра мед. наук. - СПб., 2003.

4. Нарвская О.В., И.В. Мокроусов, Е.В. Лимещенко, Л.Н. Стеклова, Т.Ф. Оттен, Б.И.Вишневский. 2002. Характеристика циркулирующих на Северо-Западе России штаммов Mycobacterium tuberculosis с использованием сполиготипирования // Пробл. туб. - №4. - С.44-47.

5. Черноусова Л.Н., Андреевская С.Н., Смирнова Т.Г., Земскова З.С., Ларионова Е.Е. Биологические свойства штаммов М. tuberculosis кластера W // Пробл. туб. и болезней легких. - 2008. - №10. - С.45-50.

6. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Иванов И.Ю., Липин М.Ю., Коробова О.В., Анисимова В.А. Характеристика клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis с использованием молекулярно-биологических методов // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. - 2003. - №1. - С.32-40.

7. Bifani P.J., Mathema В., Kurepina N.E., Kreiswirth B.N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends Microbiol. - 2002. - Vol.10. - P. 45-52.

8. Caminero J.A., Pena M.J., Campos-Herrero M.I., Rodriguez J.C., Garcia I., Cabrera P., Lafoz C., Samper S., Takiff H., Afonso O., Pavon J.M., Torres M.J., van Soolingen D., Enarson D.A., Martin C. Epidemiological evidence of the spread of a Mycobacterium tuberculosis strain of the Beijing genotype on Gran Canaria Island // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2001. - Vol.164. - P. 1165-1170.

9. Сох Н.S., Kubica Т., Doshetov D., Kebede Y., Riisch-Gerdess S., Niemann S. The Beijing genotype and drug resistant tuberculosis in the Aral Sea region of Central Asia // Respir. Res. - 2005. - Vol.6. - P. 134.

10. Ferdinand S., Valetudie G., Sola C, Rastogi N. Data mining of Mycobacterium tuberculosis complex genotyping results using mycobacterial interspersed repetitive units validates the clonal structure of spoligotyping-defined families // Res. Microbiol. - 2004. - Vol.155. - N8.- P. 647-654.

11. Gagneux S. Small P.M. Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development // Lancet Infect. Dis. - 2007. - Vol.7. -P. 328-337.

12. Garcia de Viedma D., Chaves F., Inigo J. New route of importation of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype // Emerg. Infect. Dis. - 2006. - Vol.12. - P. 169-170.

13. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S., Bunschoten A., Molhuizen H., Shaw R., Goyal M., van Embden J.D.A. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol.35. - P. 907-914.

14. Kremer K., Glynn J.R., Lillebaek Т., Niemann S., Kurepina N.E., Kreiswirth B.N., Bifani P.J., van Soolingen D. Definition of the Beijing / W lineage of Mycobacterium tuberculosis on the basis of genetic markers // J. Clin. Microbiol. - 2004.- Vol.42. - P.4040-4049.

15. Kurepina N., Likhoshvay E., Shashkina E., Mathema В., Kremer K., van Soolingen D., Bifani P., Kreiswirth B.N. Targeted hybridization of IS6110 fingerprints identifies the W-Beijing Mycobacterium tuberculosis strains among clinical isolates // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol.43(5). - P. 2148-54.

16. Lasunskaia E., Ribeiro S.C., Manicheva O., Gomes L.L., Suffys P.N., Mokrousov I., Fer-razoli L., Andrade M.R., Kritski A., Otten Т., Kipnis T.L., da Silva W.D., Vishnevsky В., Gomes H.M., Baptista I.F., Narvskaya O. Emerging multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype circulating in Russia express a pattern of biological properties associated with enhanced virulence // Microbes Infect. - 2010. - Mar 6.

17. Lavender C., Globan M., Sievers A., Billman-Jacobe H., Fyfe J. Molecular characterization of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates collected in Australia // Antimicrob. Agents Chemother. - 2005. - Vol.49. - P. 4068-4074.

18. Lopez В., Aguilar D., Orozco H., Burger M., Espitia C, Ritacco V., Barrera L., Kremer K., Hernandez-Pando R., Huygen K., van Soolingen D. A marked difference in pathogenesis and immune response induced by different Mycobacterium tuberculosis genotypes // Clin. Exp.Immunol. - 2003. - Vol.133. - P. 30-37.

19. Marais B.J., Victor T.C., Hesseling A.C., Barnard M, Jordaan A., Brittle W., Reuter H., Beyers N., van Helden P.D., Warren R.M., Schaaf H.S. Beijing and Haarlem genotypes are overrepresented among children with drug-resistant tuberculosis in the Western Cape Province of South Africa // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol.44. - P. 3539-3543.

20. Millet J., Miyagi-Shiohira C., Yamane N., Sola C, Rastogi N. Assessment of mycobacterial interspersed repetitive unit-QUB markers to further discriminate the Beijing genotype in a population-based study of the genetic diversity of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from Okinawa, Ryukyu Islands, Japan // J. Clin. Microbiol. - 2007. - Vol.45. - P. 3606-3615.

21. Mokrousov I. Genetic geography of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multifacet mirror of human history // Infect. Genet. Evol. - 2008. -Vol.8. - P. 777-785.

22. Mokrousov I., Otten Т., Zozio Т., Turkin E., Nazemtseva V., Sheremet A., Vishnevsky В., Narvskaya O., Rastogi N. At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2009. - Vol.55. - P. 13-22.

23. Narvskaya O., Otten Т., Limeschenko E., Sapozhnikova N., Graschenkova O., Steklova L., Nikonova A., Filipenko M.L., Mokrousov I., Vyshnevskiy B. Nosocomial outbreak of multidrug-resistant tuberculosis caused by a strain of Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family in St. Petersburg, Russia // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2002. -Vol.21. - P. 596-602.

24. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis II Bioinformatics. - 2002. - Vol.18. - N2. - P. 235-243.

25. Sola C., Filliol I., Legrand E., Mokrousov I., Rastogi N. Mycobacterium tuberculosis phylogeny reconstruction based on combined numerical analysis with IS/087, IS6//0, VNTR, and DR-based spoligotyping suggests the existence of two new phylogeographical clades // J. Mol. Evol. - 2001. - Vol.53. - P. 680-689.

26. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A., Nizovtseva N., Bjune G., Caugant D.A. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol.40. - P. 1930-1937.

27. Van Embden J.D.A., Cave M.D., Crawford J.T., Dale J.W., Eisenach K.D., Gicquel В., Hermans P., Martin C., McAdam R., Shinnik T.M., Small P.M. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol.31. - P. 406-409.

28. Van Soolingen D., Qian L., de Haas P.E.W., Douglas J.Т., Traore H., Portaels F., Quing Z., Enkhasaikan D., Nymadawa P., van Embden J.D.A. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of East Asia // J. Clin. Microbiol. -1995. - Vol.33. - P. 3234-3238.

29. Zhang M., Cong J., Yang Z., Samten В., Barnes P.F. Enhanced capacity of a widespread strain of Mycobacterium tuberculosis to grow in human macrophages // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol.179. - P. 1213-1217.

Способ определения микобактерий туберкулеза генотипа Beijing в режиме реального времени путем определения вставки элемента IS6110 в локусе генома dnaA-dnaN, отличающийся тем, что применяют ПЦР в режиме реального времени с использованием двух специфических праймеров 5`-AGATCAGAGAGTCTCCGGACTCA и 5`-CGCCGGGACTGTATGAGTCT и флуоресцентно-меченого зонда R6G-5`-TGTGCACAGCGACACTCACAGCCA-3`-BHQ2, оценку результата производят путем регистрации сигнала флуоресценции по каналу R6G с длиной волны 555нм, причем при наличии в образце ДНК штамма микобактерий туберкулеза генотипа Beijing экспоненциальный рост сигнала флуоресценции ПЦР при анализе чистой ДНК происходит между 10-15 циклами, а при анализе клеточных лизатов между 15 и 20 циклами.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ проведения ПЦР для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа B вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по DGAT1-гену на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Разработанный способ проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и К гена DGAT1, отличающийся от ближайшего прототипа [1] тем, что на этапе ПЦР используются другие последовательности олигонуклеотидных праймеров: DGAT1-1: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTCGAAGGTAACGC-3' (SEQ ID NO:1) DGAT1-2: 5'-CCGCTTGCTCGTAGCTTTGGCAGGTAACAA-3' (SEQ ID NO:2) DGAT1-3: 5'-AGGATCCTCACCGCGGTAGGTCAGG-3' (SEQ ID NO:3), а на этапе ПДРФ применяется другая эндонуклеаза рестрикции - TaqI, с генерацией генотип-специфичных фрагментов: генотип АА=82/18 bp, генотип КК=100 bp и генотип АК=100/82/18 bp (фиг.1 и 2).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к набору синтетических олигонуклеотидных пар праймеров, и может быть использовано в судебно-медицинской идентификационной экспертизе.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину (IC50), а также набор для осуществления данного способа.

Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической лабораторной диагностике. Предложен биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител в сыворотке крови человека, содержащий массив дискретно нанесенных и иммобилизованных на поверхности подложки O-антигенов V.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору синтетических олигонуклеотидов для амплификации и последующего секвенирования ITS1-5.8S-ITS2 сосудистых растений, включающего проведение полимеразой цепной реакции с помощью универсальных праймеров со следующим нуклеотидным составом: primer ITS-for CGTAACAAGGTTTCCGTAG, primer ITS-rew GGAATCCTTGTAAGTTTCTTT.

Группа изобретений относится к области микробиологии и биотехнологии. Способ детекции живых клеток микроорганизма в тестируемом образце путем отличия живых клеток от мертвых клеток или поврежденных клеток предусматривает добавление в тестируемый образец средства, способного к ковалентному связыванию с ДНК или РНК при облучении светом с длиной волны от 350 нм до 700 нм; облучение тестируемого образца; амплификацию мишеневой области ДНК или РНК микроорганизма, содержащегося в тестируемом образце, способом амплификации нуклеиновых кислот в присутствии средства подавления действия вещества, ингибирующего амплификацию нуклеиновых кислот, соли магния, соли органической кислоты или соли фосфорной кислоты, без выделения нуклеиновых кислот из клеток и анализа продукта амплификации.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии. Предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации штаммов и изолятов бактерии Pasteurella multocida серогруппы A у крупного рогатого скота и способ их применения.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается видовой и штаммовой идентификации бифидобактерий филотипа Bifidobacterium longum. Представленный способ основан на комбинации и полиморфизме генов токсин-антитоксин суперсемейства RelBE и характеризуется тем, что для идентификации проводят амплификацию с геномной ДНК с использованием набора видо- и штаммоспецифичных олигонуклеотидов, ПЦР продукты анализируют в агарозном геле, а размер полученного фрагмента определяют с помощью ДНК-маркера.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к выявлению рака легкого с помощью аптамеров, и может быть использовано в диагностике. Аптамеры получают в результате селекции, включающей чередование раундов позитивной селекции аптамеров к измельченным опухолевым тканям легкого человека, забиравшимся после операции у онкологических больных, и негативной селекции к здоровым тканям легкого и цельной крови здоровых людей, с выявлением пула аптамеров с наибольшей аффинностью, его клонирования, секвенирования, проверки на специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого. Полученные аптамеры обладают высокой чувствительностью к продуктам распада опухоли и циркулирующим раковым клеткам в периферической крови больных раком легкого, что позволяет повысить эффективность диагностики рака легкого человека. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан набор праймеров для амплификации фрагментов гена CFTR. Представлены биочип и набор мишеней для биочипа. Описан способ идентификации мутаций в гене CFTR человека, вызывающих муковисцидоз, включающий использование описанных праймеров. Представлена тест-система, которая содержит описанные праймеры и биочип. Изобретение расширяет арсенал технических средств, используемых для диагностики муковисцидоза, позволяя быстро и специфично диагностировать соответствующие мутации. 5 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил, 4 табл., 6 пр.
Изобретение относится к области биотехнологии и касается олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов. Охарактеризованные праймеры комплементарны участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы) используются в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов и имеют следующий состав (5'-3'): Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC Представленное изобретение позволяет определить генетическую группу нуклеотипа C вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала с помощью ОТ-ПЦР в короткие сроки. 2 табл., 1 пр.

Изобретение относится к молекулярной биологии, генной инженерии, медицине и онкологии. Предложен способ детекции стволовых раковых клеток, основанный на инкубации образцов клеток с флуоресциентными красителями и последующей идентификации раковых клеток в ультрафиолетовом свете, где при инкубации образцов клеток, которая проводится с флуоресцентным красителем, ковалентно инкорпорированным во фрагменты двуцепочечной ДНК, обеспечивается интернализация экстраклеточных экзогенных фрагментов двуцепочечной ДНК во внутриклеточное пространство стволовых клеток, входящих в состав образцов клеток, путем проведения инкубации образцов клеток в растворе препарата фрагментированной двуцепочечной ДНК в соотношении 0.5-1 мкг ДНК на 1000000 клеток, находящихся в суспензии или на срезе ткани в течение 60-120 минут, а идентификацию раковых клеток в качестве стволовых осуществляют в ультрафиолетовом свете с длиной волны, соответствующей максимуму поглощения введенного в молекулы фрагментов двуцепочечной ДНК флуорохрома, причем, в качестве фрагментов двуцепочечной ДНК используют фрагменты ДНК Alu повтора человека, энзиматически меченые предшественником, содержащим ковалентно пришитый флуорохромный краситель, или меченые прямым химическим введением флуорохрома. Благодаря увеличению эффективности выявления раковых стволовых клеток в инициирующем состоянии изобретение может быть использовано в медицине. 1 з.п. ф-лы, 11 ил.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и вирусологии. Предложены праймеры, зонды и их наборы, для амплификации и обнаружения HPV типа 52 в исследуемом образце. Изобретение может быть использовано в медицинских целях для обнаружения вирусов папилломы человека. 8 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 табл., 5 пр., 4 ил.

Представленные решения касаются способа генерирования заквасочной культуры, заквасочной культуры и способа ферментации с использованием такой заквасочной культуры. Представленный способ генерирования заквасочной культуры включает воздействие на материнский бактериальный штамм, содержащий, по меньшей мере, часть локуса CRISPR, бактериофагом для получения смеси бактерий, содержащей устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR, содержащий, по меньшей мере, один дополнительный спейсер в указанном модифицированном локусе CRISPR; независимое воздействие на тот же материнский бактериальный штамм тем же бактериофагом для получения смеси бактерий, содержащей другой устойчивый к бактериофагам вариантный штамм, содержащий модифицированный локус CRISPR, содержащий, по меньшей мере, один дополнительный спейсер в указанном модифицированном локусе CRISPR, отличный от дополнительного спейсера в первом устойчивом к бактериофагам вариантном штамме; отбор указанных устойчивых к бактериофагам вариантных штаммов из смесей бактерий и их выделение. Представленные изобретения позволяют получать устойчивые к бактериофагам культуры и могут быть использованы в пищевой промышленности при изготовлении подвергнутых брожению продуктов. 3 н. и 26 з.п. ф-лы, 23 ил., 20 табл., 23 пр.
Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии и представляет собой способ идентификации кластера генов, кодирующих стафилококковые белки, являющиеся экзотоксинами. Для осуществления настоящего способа проводят мультипраймерную полимеразную цепную реакцию в один прием в двух реакционных смесях, первая из которых содержит праймеры к генам, кодирующим такие белки стафилококков, как термонуклеаза, бета-глюкозидаза у видов S.aureus, S.epidermidis, S.haemolyticus, S.lugdunensis, S.saprophyticus, а вторая - к генам set1, set2, set3, set4, set5, кодирующим экзотоксины. Затем проводят анализ путем сравнения амплицированных фрагментов генов, полученных в двух аликвотах образца, с положительным контрольным образцом в соответствии с идентификационной таблицей. Настоящее изобретение также раскрывает тест-систему для осуществления указанного способа, которая содержит компоненты для выделения ДНК, компоненты для проведения ПЦР и компоненты для анализа результатов. При этом компоненты для проведения ПЦР содержат 10-кратный буферный раствор, рН 8,4, деионизированную стерильную воду, один положительный контрольный образец, фермент Taq-полимеразу, смесь четырёх дНТФ, смесь праймеров №1, содержащую epi-F, epi-R, aur-F, aur-R, hae-F, hae-R, lug-F, lug-R, sap-F, sap-R в соотношении 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1, и смесь прамеров №2, содержащую set1-F, set1-R, set2-F, set2-R, set3-F, set3-R, set4-F, set4-R, set5-F, set5-R в соотношении 1:1:1:1:1:1:1:1:1:1. Настоящее изобретение позволяет выявить кластер генов, кодирующих стафилококковые белки, молекулярная масса которых составляет от 25 до 35 кДа, состоящих почти из 200 аминокислотных остатков и имеющих третичную структуру, высокогомологичную с некоторыми суперантигенами стафилококка (энтеротоксины, TSST-1 токсин) и с пирогенным стрептококковым экзотоксином C. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 1 пр.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии и медицины. Способ оценки цитолитической активности единичных эффекторных клеток, при этом определяя профиль секретированного продукта, используя матрицы микролунок, включает мониторинг лизиса инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток в микролунках, где микролунки содержат в среднем одну эффекторную клетку и по меньшей мере одну инфицированную клетку-мишень на микролунку; где мониторинг включает стадию детекции лизиса указанных инфицированных клеток-мишеней с помощью эффекторных клеток, используя флуоресцентный индикатор, при этом определяя профиль одного или более секретированных продуктов. Способ может быть использован в медицине для крупномасштабного скрининга для определения профиля большого числа отдельных клеток в микромассивах. 19 з.п. ф-лы, 10 ил.,7 пр.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для оценки риска развития рака шейки матки при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и носительстве вируса папилломы человека (ВПЧ) у женщин репродуктивного возраста. Для этого берут клетки с поверхности экзоцервикса, выделяют из них РНК и измеряют уровни экспрессии мРНК генов: MKI67, CDKN2A, PGR, ВАХ. На основании соотношений уровней экспрессии мРНК вычисляют значение линейной дискриминантной функции (ЛДФ): ЛДФ=l,2*lg[CDKN2A]/[ВАХ]-lg[PGR]/[MKI67]-1, где [CDKN2A]/[ВАХ] - отношение уровней экспрессии мРНК CDKN2A и ВАХ, [PGR]/[MKI67] - отношение уровней экспрессии мРНК прогестеронового рецептора и MKI67, и если значение ЛДФ≤0, делают заключение о низком риске неопластической трансформации; при значении ЛДФ>0 риск неопластической трансформации определяют как повышенный. Способ позволяет оценить риск развития рака шейки матки по представленности мРНК референсных генов. 2 ил., 1 пр.
Изобретение относится к области генетики безжировой массы тела и ожирения у животных и человека. Изобретение представляет собой комбинацию полинуклеотидов или экспрессируемых из них белков, которые дифференциально экспрессируются в животных, демонстрирующих безжировой фенотип, являющийся результатом одной или нескольких стимулирующих безжировой фенотип обработок, содержащих введение CLA, потребление диеты с высоким содержанием белка и увеличение физических упражнений. При этом полинуклеотиды выбирают из генов, кодирующих белки, дифференциально экспрессирующиеся в ткани печени и мышечной ткани, ID которых приведены в таблице 6F, или из генов, кодирующих белки, дифференциально экспрессирующиеся в жировой ткани, ткани печени и мышечной ткани, ID которых приведены в таблице 6G, или из их фрагментов. Изобретение раскрывает профили экспрессии генов, ассоциированные с улучшенной или поддерживаемой безжировой массой тела или с пониженным содержанием телесного жира. 12 з.п. ф-лы, 13 табл., 3 пр.
Наверх